Summary
A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.
Abstract
O desenvolvimento de ferramentas de edição de genoma programáveis tem facilitado o uso de genética reversa para entender os papéis sequências genómicas específicas desempenhar no funcionamento das células e organismos inteiros. Esta causa foi tremendamente ajudado pela recente introdução do CRISPR / sistema-a cas9 ferramenta versátil que permite aos pesquisadores para manipular o genoma e transcriptoma, a fim de, entre outras coisas, bater para fora, derrubar ou bater em genes em um alvo maneira. Para o propósito de bater para fora de um gene, CRISPR / cas9 mediada por quebras de cadeias duplas recrutar a via de reparação do ADN-joining final não homóloga para introduzir a inserção de frameshift-causando ou eliminação de nucleótidos no local da fractura. No entanto, um ARN guia individual pode provocar indesejáveis efeitos fora do alvo, e para eliminar essas possibilidades, o uso de vários ARNs de guia é necessário. Esta multiplicidade de alvos também significa que é necessária uma pesquisa de elevado volume de clones, o que por sua vez, levanta a utilização de uma efficiente técnica de alto rendimento para genotipar os clones knockout. técnicas de genotipagem actual, quer sofre de limitações inerentes ou incorrer em elevados custos, por conseguinte, tornando-as inadequadas para fins de alto rendimento. Aqui, nós detalhe o protocolo para a utilização de PCR fluorescente, que utiliza o ADN genómico a partir de lisado celular em bruto como um molde, e em seguida resolver os fragmentos de PCR por meio de electroforese em gel capilar. Esta técnica é preciso o suficiente para diferenciar uma diferença de pares de bases entre os fragmentos e, por conseguinte, é adequado em indicar a presença ou ausência de um desvio de enquadramento na sequência de codificação do gene alvo. Este conhecimento preciso impede efetivamente a necessidade de um passo de procedimento de confirmação e permite aos usuários economizar tempo e custos no processo. Além disso, esta técnica tem provado ser versátil na genotipagem de várias células de mamífero de várias origens de tecido alvo de ARN de guia contra numerosos genes, como mostrado aqui e noutros locais.
Introduction
abordagens de genética reversa permitiram aos cientistas elucidar os efeitos de alterações específicas no genoma da célula ou organismo todo. Por exemplo, a expressão de um gene particular pode ser atenuado pelo gene knockdown 1, 2 (redução parcial) ou nocaute do gene 3, 4 (ablação completa), a fim de determinar o efeito que este possui sobre a função da célula ou sobre a desenvolvimento do organismo.
experimentos gene knockout tornaram-se mais fácil uma vez que a introdução de nucleases programáveis específicas das sequências, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores-like (TALENS). No entanto, a caracterização relativamente recente da agrupado regularmente intercaladas curta repetição palíndromo (CRISPR) / sistema cas9 tornou extremamente fácil para qualquer laboratório em todo o mundo para realizar gene experimentos nocaute. Em essência, o sistema / cas9 CRISPR consiste de dois componentes de um único ARN essenciais guia (sgRNA), que reconhece e liga-se através da complementaridade de base para uma sequência específica no genoma, e uma endonuclease chamado cas9. As consequências da acção de ligação e específico do complexo sgRNA-cas9 no ADN genómico representa a clivagem de cadeia dupla de ADN. Este, por sua vez, acciona o mecanismo de resposta de dano de DNA na célula, a qual é subsequentemente reparadas através das vias (HR) de linha de junção (NHEJ) ou de recombinação homóloga não homólogas. Uma vez que o mecanismo de NHEJ de reparação (mas não o mecanismo de RH) muitas vezes resulta na inserção aleatória ou eliminação de nucleótidos no local de reparação, resultando na inserção / deleção (InDel) mutações, ele pode fazer com que o quadro de leitura de um exão de mudar. Isto pode resultar em seguida, o nocaute do gene devido à terminação prematura da tradução e deterioração mediado por mutações nonsense 5, 6,7.
Apesar da conveniência proporcionada pela introdução do sistema / cas9 CRISPR em batendo para fora de um gene, a genotipagem de clones de células alvo permanece um gargalo, especialmente em um ajuste 8, 9 de alto rendimento. técnicas existentes tanto sofrem grandes limitações inerentes ou são financeiramente caro. Por exemplo, o ensaio inspector ou T7E1, que é um ensaio enzimático que detecta erros de emparelhamento em DNA duplexes 10, não é capaz de distinguir entre os clones de tipo selvagem e mutantes homozigicos (clones cujos alelos s mutados de forma idêntica), uma vez que estes clones têm alelos idênticos e, portanto, não apresentam erros de emparelhamento na sua sequência de ADN 11. Além disso, a utilização de sequenciação de Sanger, que é considerada o padrão de ouro na genotipagem de clones mutantes, em uma instalação de alto rendimento é indesejável devido ao seu elevado custo. Aqui, apresentamos um detailed protocolo da técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente, que pode contornar as limitações das outras técnicas de genotipagem existentes e é particularmente útil na realização de um ecrã de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. Este método é tecnicamente simples de executar e economiza tempo e custo.
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Protocol
1. Obtenção / clones de uma única célula cas9 segmentados CRISPR
- As células HepG2 semente em uma placa de 6 poços a 500.000 células por poço em 2 ml de antibiótico-livre de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS). Incubar durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
- células transfectar com o plasmídeo de co-expressando cas9 e sgRNA específico contra o gene de interesse usando um reagente de transfecção apropriado, conforme as instruções do fabricante.
NOTA: Por exemplo, sgRNA pode ser clonado no pSpCas9 (BB) vetor -2A-GFP, conforme descrito anteriormente 4. - Substituir o meio de cultura de 4-16 horas após a transfecção com 2 mL de meio isento de antibiótico fresco.
- Aproximadamente 48 h após a transfecção, recolher suspensão de uma única célula por trypsinizing as células.
- Tripsinizar as células em 0,2 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C durante 5 min. Adicionar 1 mL de meio e ressuspender absoy.
- Classificar as culas para os clones GFP-positiva, tal como descrito anteriormente 12, e recolher cerca de 3.500 células.
- Placa as células classificadas positivas para GFP em placas de 10 cm a 500, 1.000 e 2.000 células por prato em 8 mL de meio de cultura de penicilina / estreptomicina suplementado com. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2, substituindo o meio a cada cinco dias, até que crescem em colónias de células único suficientemente grande para ser visível a olho nu. Para a maioria das linhas celulares de cancro, este leva cerca de duas semanas a partir de dia de plaqueamento.
- Quando as colónias são de tamanho apropriado (isto é, visível a olho nu), transferência de colónias individuais para poços de uma placa de cultura de 96 poços contendo 200 ul de DMEM suplementado com FBS a 10%.
- Aspirar as colónias de uma única célula utilizando uma pipeta de 200 uL com um pequeno volume de meio. Ressuspender as células cuidadosamente, a empoços dividual por trituração várias vezes.
- Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2, substituindo o meio a cada cinco dias, até se atingir 50-90% de conflucia. Para a maioria das linhas celulares de cancro, este leva cerca de 24-48 h.
2. Extraindo bruto de ADN genómico utilizando um método de lise directa
- Quando as células atingem 50-90% de confluência, remover tanto do meio de cultura das cavidades quanto possível, utilizando multi-canal de sucção de vácuo ou de uma pipeta multi-canal.
- Adicionar 25 uL de 0,05% de tripsina-EDTA (sem vermelho de fenol) em cada cavidade e incuba-se a 37 ° C durante 7 min.
- Volte a suspender as células tripsinizados exaustivamente por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Verifique as células sob um microscópio para se certificar de que eles são destacados a partir da superfície de plástico.
- Criar uma réplica dos clones individuais por transferência de cerca de 5 mL da suspensão de célula única de um de 96 cavidades plat cultura vaziae. Adicionar 200? L de meio de cultura a cada cavidade e manter as células até os clones positivos são identificados por PCR utilizando electroforese em gel-capilar fluorescente (ver abaixo). Serialmente expandir as células para placas de 10 cm ou qualquer outra escala de escolha (ver secção 7).
- Adicionam-se 5 mL da suspensão de células individuais a partir do passo 2,3-10 mL de tampão-lise directa caseiro (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 2,5 mM, NaCl 0,2 M, 0,15% de SDS, e 0,3% de Tween-20) 12 numa placa de 96 poços de PCR e misturar completamente por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. Centrifugar brevemente (para levar o líquido para baixo para o fundo dos poços).
- Adicionar 200? L de meio de cultura para os restantes ~ 15 ul de suspensão de células a partir do passo 2.3 e incubar a 37 ° C e 5% CO 2, juntamente com a repetição do passo 2.4.
- Sujeitar os lisados do passo 2.5 com o seguinte programa de ciclo térmico para garantir uma lise completa das células e libertação de ADN genómico: 65 ° C durante três0 s, 8 ° C durante 30 s, 65 ° C durante 1,5 min, 97 ° C durante 3 min, 8 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 3 min, 97 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 1 min, e 80 ° C durante 10 min. Centrifugar os lisados brevemente.
- Dilui-se os lisados por adição de 40 mL de água isenta de nuclease e homogeneizar utilizando um misturador de vórtice. centrifugar brevemente. Os lisados diluídas podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a -20 ° C durante vários meses sem perda significativa de qualidade.
3. Executando fluorescente PCR para amplificar / Regiões cas9 alvo CRISPR
- Dois iniciadores de design para a frente marcado com fluoróforo (tanto marcada na extremidade 5' ) de cada uma das regiões alvo CRISPR / cas9; locais que estão mais do que 300 pb um do outro, deve ser considerada como duas regiões alvo separadas (por exemplo, iniciador marcado com fluoróforo verde para controlo da estirpe selvagem não segmentado e azul iniciador marcado com fluororo para clones CRISPR / cas9 segmentados corte; ver a Tabela de Matéria ls).
- Adquirir estes iniciadores marcados para a frente e um iniciador reverso não marcado em conformidade. Note-se que iniciadores podem ser concebidos utilizando qualquer ferramenta de escolha e que os amplicons deve ser 200-500 bp long.
- Executar PCR como descrito previamente 12 para amplificar regiões alvo utilizando os iniciadores marcados.
- Use 3 uL dos lisados diluído do passo 2.8 em uma reacção de 20 ul (ver Tabela 1) e o seguinte programa de ciclo térmico: 94 ° C durante 10 min (1 ciclo); 94 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 1 min (4 ciclos); 94 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 1 min (4 ciclos); 94 ° C durante 10 s, 58 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 1 min (4 ciclos); 94 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 30 s, e 68 ° C durante 1 min (35 ciclos).
- Resolve 5 ul dos produtos de amplificação de PCR num gel de agarose a 1% para verificar o tamanho e quantidade relativa de amplicsss = "xref"> 12.
NOTA: Executar esta etapa para todas as amostras é encorajada mas não é necessário; a resolução de um número seleccionado de amostras é suficiente para estimar a quantidade de amplics presentes nas amostras em geral.
4. As amostras preparando para Capilar Gel Eletroforese
- Dilui-se produtos de amplificação de tipo selvagem (células parentais não segmentados) e CRISPR / ADN cas9-alvo em água isenta de nuclease para aproximadamente 2,5 ng / mL. Certifique-se para diluir a amostra de ADN de tipo selvagem suficiente para ser adicionado a cada amostra de ADN alvo (um mínimo de 0,5 uL de amostra diluída do tipo selvagem por amostra alvo é necessária).
- Mistura-se o tipo selvagem diluído e as amostras de DNA-alvo em igual proporção (por exemplo, mistura 1 mL de amostra de tipo selvagem com 1 mL de amostra-alvo).
- Adicionar 1 mL de amplicões mistos para 8,7 ul de formamida desionizada e 0,3 mL de padrão de tamanho marcado com corante em uma placa com 96 poços de PCR que é compatível com o um genéticaalyzer.
NOTA: O uso de uma mistura principal da formamida e o tamanho padrão (isto é, uma preparação de uma pré-mistura da formamida e o padrão de tamanho num 29: proporção 1 antes da adição dos produtos de amplificação para assegurar valores normalizados) é recomendado. - Firmemente selar a placa e aquecer as amostras a 95 ° C durante 3 min utilizando um termociclador de PCR.
- Colocar a placa em gelo imediatamente após o passo de aquecimento e incuba-se durante pelo menos 3 min.
5. Realizar Capilar eletroforese em gel em um analisador genético
- Configurar os parâmetros de ensaio, do protocolo, e instrumento protocolo de chamada de tamanho sobre o software de electroforese em gel capilar ligado a um analisador genético.
NOTA: Este passo só é necessário para a primeira corrida de electroforese; o programa pode ser guardado para uso futuro. Para execuções subseqüentes, vá direto para o passo 5.2.- Clique no ícone "Criar novo Plate" no painel de instrumentos software.
- Dê o run um nome fictício e selecione as seguintes opções: Número de poços, 96; Tipo de placa, fragmento; Comprimento do capilar, 50 cm; Polímero e, POP7. Clique no botão "Atribuir Placa de conteúdo".
- Em "Ensaios", clique em "Criar Novo Ensaio"; um novo painel aparecerá.
- Nome do ensaio "FPCR-CGE Ensaio" e verifique se "Tipo de Aplicação" está definido corretamente como "Fragmento".
- Configurar o protocolo de instrumento clicando no botão "Criar novo" em "Protocolo de Instrumento".
- Definir ou escolher as seguintes opções e parâmetros nas áreas apropriadas: Aplicação Tipo, Fragmento; Comprimento do capilar, 50 cm; Polímero, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Nome protocolo, FPCR-CGE protocolo do aparelho; Temperatura do forno, 60 ° C; Execute Tensão, 19,5 kV; Pré-corrida Voltagem, 15 kV; Injecção de tensão, 1,6 kV; Run Time, 1.330 s; Tempo pré-run, 180 s; Tempo de injecção, 15 s; e atraso de dados, 1 s.
- Click no botão "Aplicar a Ensaio" e depois no botão "Save to Library" para salvar o programa. Feche o painel para continuar.
- Configurar um protocolo de chamar o tamanho clicando no botão "Criar novo" em "Sizecalling protocolo."
- Definir ou escolher as seguintes opções e parâmetros nas áreas apropriadas: Nome protocolo, FPCR-CGE Sizecalling Protocolo; Tamanho padrão, GS500 (-250) LIZ; Tamanho-chamador, SizeCaller v1.1.0; Configurações de análise, -; Análise Range, completa; Dimensionamento Range, completa; Tamanho método de chamada, Southern Local; Peak Primer, Presente; Azul, Verde, Canais laranja, (check); Altura do pico mínimo, 175 para todos os canais; Use Smoothing, None; Use Baseline (Linha de base Window (Pts)), (check) 51; Mínimo Peak meia largura, 2; Peak tamanho da janela, 15; Polinomial Grau, 3; Slope Limiar de início do pico, 0,0; Slope Threshold Peak End, 0,0; Configurações QC, -; Qualidade tamanho, -; Falha Se o valor for <0,25; Passe Se o valor for <0,75; Suponha Linearidade de 0 a 80 pb0 pb; e Pull-Up bandeira Actua se Rácio de pull-up ≤ 0,1 e pull-up de digitalização ≤ 1.
- Clique no botão "Aplicar a Ensaio" e depois no botão "Save to Library" para salvar o programa. Feche o painel para continuar.
- Certifique-se que o ensaio é salvo clicando no botão "Save to Library" mais uma vez e sair do painel clicando no botão "Fechar".
- De volta à página "Atribuir Placa Conteúdo", clique no link "Criar novo arquivo Convenção Name" em "Convenções de nome do arquivo."
- Nome do programa "FPCR-CGE File Name".
- Em "Atributos disponíveis", selecione os atributos desejados que irão aparecer no nome do arquivo (como "Data de Run", "Time of Run", "Bem Position" e "Nome Sample"). Escolha o local do arquivo desejado, onde os resultados da execução será armazenado.
- Clique no botão "Aplicar a Ensaio" e, em seguida,o botão "Save to Library" para salvar o programa. Feche o painel para continuar.
- De volta à página "Atribuir Índice Placa", clique no link "Create New Resultados Grupo" em "Resultados Grupos".
- Nome do programa "FPCR-CGE Resultados Grupos".
- Em "Atributos disponíveis", selecione os atributos desejados que irão aparecer no nome do arquivo (como "Nome de Ensaio"). Escolha o local do arquivo desejado, onde os resultados da execução será armazenado.
- Clique no botão "Aplicar a Ensaio" e depois no botão "Save to Library" para salvar o programa. Feche o painel para continuar.
- Configure o programa para uma eletroforese executar, seguindo os passos abaixo.
- Vá para o painel e clique no ícone "Criar novo Plate".
- Nome do prazo como desejado (para facilitar a referência, incluir a data, a linha de células, e o nome do gene). Selecione as seguintes opções: Número de poços, 96; Tipo de placa, fragmento; Comprimento do capilar, 50 cm; Polímero e, POP7. Clique no botão "Atribuir Placa de conteúdo".
- Rotular cada poço da amostra, tal como pretendido (por exemplo, uma amostra pode ser chamado "NC" para indicar que o bem é um controlo negativo).
- Sob as Convenções "Ensaios", "nome do arquivo," e "Resultados Grupos" caixas, clique no link "Adicionar da Biblioteca" e selecione os programas criados na etapa 5.1.3 para 5.1.17.
- Destaque todos os poços a serem analisados e selecionar os programas relevantes em "Ensaios", "Convenções de nome de arquivo" e "Resultados Grupos" marcando as caixas ao lado deles.
- Antes de colocar a placa na bandeja do analisador genético, aplicar o selo de borracha na placa de 96 poços e colocar a placa selada na caixa de plástico que vem com o analisador genético.
- Pressione o botão "bandeja" na parte da frente do analisador genético, e quando a bandeja redói a parte frontal do equipamento, abrir a porta e carregar a placa encaixada sobre o tabuleiro. Certifique-se de que a placa está no seu lugar e feche a porta.
- Clique no botão "Fazer a ligação Placa para Run" botão.
- Na página "Placas de carga para Run", fazer uma verificação final para garantir que todos os reagentes e condições estão corretos e em ordem.
- Clique no botão "Start Run". Cada ensaio de 24 amostras (os primeiros poços 3X8 da placa de 96 poços), leva menos de 55 min para completar.
6. Análise do electroferograma para determinar as diferenças de pares de bases
- Quando o capilar de electroforese em gel de execução está completa, abre o software de análise para analisar os resultados.
- Clique em "Adicionar amostras para Project" ícone e procure a pasta que contém os arquivos de execução. Lembre-se do passo 5.1.12 do local atribuído dos arquivos de resultados.
- Selecione todos os arquivos de resultados de cada injeção na corrida concluída e click no botão "Adicionar à lista"; os nomes desses arquivos começam com "Inj" e contêm os detalhes da corrida.
- Clique no botão "Adicionar e Analisar" para prosseguir com a análise.
- Selecione todas as amostras no prazo clicando na primeira amostra e arrastando o cursor até a última amostra e, em seguida, clique no ícone "Lotes de vídeo".
- Para verificar a qualidade do padrão de tamanho, abrir o canal de laranja dos resultados, verificando o ícone laranja e desmarcando o resto dos ícones coloridos; isso é importante para garantir que o tamanho-chamada é precisa e confiável.
- Para visualizar os picos correspondentes aos fragmentos derivados do controlo não-alvo e os clones visados, verificar os ícones azuis e verdes para abrir leituras a partir destes canais.
- Coloque o cursor sobre o eixo horizontal do primeiro lote de resultados e clique com o botão direito para selecionar "Full View." Role para baixo para ver todos os resultados de relance para determinarse houver qualquer problema grave com o prazo. Para aumentar o zoom em um intervalo específico de valores, clique com o botão direito do mouse no eixo relevante da trama, escolha "Zoom para ...", e digite o intervalo de valores de interesse.
NOTA: Um potencial grande problema é que todas as amostras dar picos de baixa intensidade. Isto é geralmente devido ao armazenamento prolongado de produtos de amplificação marcado com fluoróforo antes da electroforese capilar de execução ou o excesso de diluição de amplicões, que pode ser facilmente corrigidas através da repetição do passo de PCR ou diluindo os amplicões utilizando um factor de diluio inferior, respectivamente. - Para salvar os resultados, siga os passos descritos abaixo.
- Certifique-se de que os canais azul e verde são selecionados e clique no ícone "Sizing Table".
- Salve a tabela de valores em formato delimitado por tabulação de texto (.txt) através da abertura de "Arquivo" e escolha "Exportar tabela". Nomeie o arquivo em conformidade e selecionar o local de escolha de arquivo.
- Para salvar a tramas da corrida em formato PDF, vá em "Arquivo" e clique na opção "Imprimir". Escolha o escritor PDF relevante e pressione "Imprimir". Nomeie o arquivo em conformidade e selecionar o local de escolha de arquivo.
- Para calcular a diferença no tamanho dos fragmentos derivados de controlo da estirpe selvagem não segmentado e as CRISPR / clones cas9 segmentados, seguir as etapas descritas a seguir.
- Abra o arquivo de guia de texto delimitado (.txt) do passo 6.9.2 com um programa de planilha. A tabela deve incluir esses quatro colunas importantes: "Dye Peak / Sample" (indicando um canal azul ou verde), "Sample File Name" (os primeiros caracteres indicam o bem ou o nome da amostra), "Size" (indicando o tamanho do fragmento chamado), e "altura" (indicando a intensidade de fluorescência do pico).
- Para destacar picos relevantes, excluir aqueles que não estão na faixa de tamanho esperado.
NOTA: Normalmente, as mutações InDel raramente resultam em maisdo que uma diferença de 100 pb em tamanho; Deste modo, estão excluídos os picos cujo tamanho difere por mais de 100 pb, proveniente do pico de controlo de tipo selvagem (pico dominante no canal verde). Isso pode ser facilmente feito usando o "Between" opção sob a função "Formatação Condicional" na planilha. - Para remover picos não-específicas, que são indistinguíveis a partir do nível do fundo, use "Less Than" opção sob a função "Formatação Condicional" no programa de planilha para excluir picos cujas alturas são menores do que 2.000 unidades. Este valor de corte foi determinado empiricamente e pode, portanto, ser ajustada quando se considere oportuno.
- Calcular a diferença no tamanho do fragmento entre cada um dos picos resultantes do canal azul (CRISPR / clones cas9 segmentados) e o único pico no canal verde (controlo da estirpe selvagem não segmentados) subtraindo a última a partir do ex.
NOTA: É importante a utilização de valores atribuídos a cada eletr capilaramostra esis, como pode haver diferenças inter-amostra na o tamanho do fragmento do controlo da estirpe selvagem. - Arredondar os valores para o número inteiro mais próximo para determinar o número de pares de bases que foram inseridos ou eliminados a partir de, se for o caso, a sequência genómica em questão. Ao bater a um gene de interesse é, seleccionar os clones cujas mutações indel não são de múltiplos de 3 pb para assegurar que não há desvio de enquadramento na sequência de codificação.
7. Verificação do Estado Knockout de Clones
- Expandir clones knockout individual da placa de 96 poços (dos passos 2.4 e 2.6) para uma placa de 24 poços por trypsinizing as células utilizando 25 mL de 0,25% de tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C durante 5 min.
- Adicionar 125? L de meio (DMEM suplementado com FBS a 10%) para as células tratadas com tripsina e ressuspender cuidadosamente.
- Transferir a suspens celular para um tubo de 15 ml e centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o máximo do meio quanto possível, utilizando vácuo de sucção ou uma pipeta, ressuspender o sedimento celular em 500? L de meio, e transferir a suspensão de células para um poço de uma placa de 24 poços. Incubar a 37 ° C e 5% de CO2 até as células atingirem confluência de 80-90%.
- Expandir os clones individuais em série a partir da placa de 24 poços para uma placa de 6 poços e a partir da placa de 6 poços a uma placa de 10 cm quando atingem 80-90% de confluência, repetindo os passos 7.1 a 7.4, utilizando os seguintes volumes: 50 mL de 0,25% de tripsina-EDTA e 150 ul de meio (por expansão a partir da placa de 24 cavidades para a placa de 6 poços) e 200 mL de 0,25% de tripsina-EDTA e 1 ml de meio (por expansão a partir do 6- bem placa para a placa de 10 cm).
- Colheita dos clones quando atingem 80-90% de confluência por trypsinizing as células com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C durante 5 min.
- Adicionar 5 ml de meio (DMEM suplementado com FBS a 10%) para as células tratadas com tripsina e resuspend completamente.
- Transferir a suspens celular igualmente em dois tubos de 15 mL, centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover a forma, tanto quanto possível. Uma porção das células é por extracção de ADN genómico e a outra é para extracção de proteína total.
- Por verificação através de sequenciação de Sanger, seguir as etapas descritas a seguir.
- Extrair ADN genómico a partir dos clones como descrito anteriormente 12.
- Realizar a amplificação por PCR da região que abrange o local alvo CRISPR / cas9, como descrito na secção 3.2, mas utilizar iniciadores n marcados. Não utilizar iniciadores marcados para este passo, como a fluorescência a partir da etiqueta irá interferir com o subsequente passo de sequenciação de Sanger.
- Purifica-se os produtos de amplificação utilizando um kit de limpeza de PCR, conforme descrito anteriormente 12.
- Sequenciar os produtos de amplificação purificado utilizando os iniciadores de PCR utilizados no passo 7.9.2 para determinar o genótipo de um dos clones, como descrito previously 12.
- Por verificação através de análise de Western blot, extrair a proteína total a partir das células de tipo selvagem e clones orientados, como descrito anteriormente 12.
- Realizar análise de Western blot utilizando anticorpos apropriados contra a proteína do gene alvo, tal como descrito anteriormente 12; um clone nocaute verdade é desprovido da expressão da proteína.
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Representative Results
A técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente aqui descrito está previsto para ser aplicável a qualquer região do genoma segmentado em em virtualmente qualquer linha celular que é passível de entrega de ADN estranho. Foi anteriormente demonstrada a sua aplicação por segmentação três genes numa linha celular de cancro colorrectal 12. Aqui, mostramos a sua eficácia na genotipagem de uma linha celular de carcinoma hepatocelular, HEPG2, orientada com um CRISPR / cas9 construir contra a proteína de montagem Nucleosome 1 como um gene (NAP1L1). Na verdade, nós utilizamos com sucesso a técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente para genotipar várias outras células, incluindo linhas de mamíferos não-humanos celulares, dirigidas a numerosos outros genes 12, 13.
Experiência-sábio, o fluorescente techniq electroforese em gel de PCR-capilarue é fácil e rápido de executar. Após a introdução de expressão cas9 e sgRNA constrói para dentro das células e a selecção de clones positivos, os clones individuais são lisadas directamente a partir da placa de cultura de 96 poços, usando o nosso tampão de lise caseiro, directa Lyse-tampão de 12. Na nossa experiência, os lisados resultantes podem ser armazenadas a -20 ° C ou menos durante vários meses, sem perda significativa da qualidade do ADN genómico. O passo de lise é seguido pelo passo de amplificação de PCR, que envolve a produção de produtos de amplificação marcado com fluoróforo que abrangem a região alvo CRISPR. O protocolo de PCR fluorescente fornecida foi optimizado para este propósito e produziu consistentemente amplas produtos de PCR, independentemente da região a ser amplificada. A Figura 1 mostra um resultado representativo da resolução dos produtos de amplificação derivados do passo de PCR fluorescente, com cada pista correspondente a um clone CRISPR indivíduo / cas9-alvo e as várias bandas corresponding para as regiões amplificadas de alelos individuais nos clones. Em nossa experiência, a utilização de outras polimerases e seus protocolos concomitantes resultou em um rendimento amplicon inferior. Embora isto pode ser facilmente rectificado pelo ajuste do factor de diluição durante a preparação da amostra por electroforese em gel capilar, o fundo ou nível de ruído pode, consequentemente, ser mais elevada quando são utilizados produtos de amplificação de menor rendimento. Após o passo de PCR, os produtos de amplificação são diluídas, e aquelas da amostra de tipo selvagem e os clones visados são misturados em igual proporção antes de serem adicionados ao tampão de formamida desionizada e um tamanho padrão, desnaturada e resolvida num gel capilar.
Depois de se completar a electroforese capilar em gel, os resultados de genotipagem estão prontas para serem analisadas. Dois importantes conjuntos de resultados são necessários a partir da electroforese de execução: os electroferogramas contendo os picos correspondendo aos sinais de fluoresccia individuais e thresultado da mesa e que contém todos os valores necessários para os cálculos. A Figura 2 mostra os resultados para a genotipagem de dois clones visados pela sgRNA contra o gene NAP1L1 em células HEPG2. Os picos verdes correspondem aos produtos de amplificação do alelo de tipo selvagem não segmentado em células HEPG2 parentais, enquanto que os picos azuis correspondem a produtos de amplificação dos InDel alelos contendo a mutação do clones CRISPR / cas9 segmentados. Como se mostra claramente, os dois clones são mutantes homozigicos mutantes (com alelos mutados de forma idêntica), com a eliminação de um e dez nucleótidos de ambos os alelos. É importante notar que os electroferogramas são usados apenas para fins de visualização, enquanto que os valores de pico são importantes para determinar o número de diferenças de pares de bases entre o amplic de clones visados e que as células de tipo selvagem.
Para validar a autenticidade do status de knockout, recomendamos a realização deSanger de sequenciação e análise de Western blot para confirmar a eliminação da expressão do gene nas células. Os dois clones identificados acima, deu resultados de sequenciação de Sanger consistentes com os resultados de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente (Figura 3A). Eles também exibida ablação completa da expressão da proteína NAP1L1 (Figura 3B), como seria de esperar de clones knockout.
Figura 1: Os amplicons de PCR de clones HEPG2 alvo de CRISPR / cas9 contra o gene NAP1L1. Produtos de amplificação do passo de PCR fluorescente foram resolvidos em géis de agarose duas separadas (superior e inferior), e cada pista corresponde a um clone de alvo individual. G: escada de ADN (os tamanhos de bandas individuais são dadas ao lado do diagrama). Por favor, clique delae para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A parcela de sinais de fluorescência de duas amostras resolvidos através de electroforese capilar em gel. O eixo horizontal representa o tamanho do fragmento e o eixo vertical representa a intensidade do sinal de fluorescência. Os picos azuis correspondem a fragmentos derivados de clones visados CRISPR / cas9-mediadas, enquanto os picos verdes correspondem a fragmentos derivados a partir de células de tipo selvagem. Magenta linhas correspondem às posições automáticas de chamar de pico determinadas pelo software de análise, que marca as posições que mostram consistentemente picos através amostras. Os valores fornecidos ao lado de picos individuais correspondem aos tamanhos dos fragmentos (em pares de bases) e são obtidos a partir do software de análise. Os valores entre parênteses representam a diferença calculada em tamanho entre fra indivíduogments a partir de um clone de alvo e o fragmento de tipo selvagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os resultados de ensaios para confirmar o nocaute do gene alvo em dois clones. Os resultados (A) Sanger de sequenciação e (B) Análise de transferência de Western utilizando anticorpos contra a proteína indicado. Nucleótidos de azul representam a sequência alvo sgRNA, aqueles em vermelho representam o motivo adjacente protospacer (PAM), aqueles em castanho representam nucleótidos substituídos com bases, e os traços representam as posições em que as sequências de nucleótidos são eliminados no alelo. Os valores entre parênteses ao lado dos nomes de clones individuais representam o genótipo dos alelos do clone; "-1" e "-10" significa que os alelos contêm uma deleção de um e dez nucleótidos, respectivamente, de tamanho aproximado de proteínas detectadas no Western blot:. ~ 54 kDa para NAP1L1 e ~ 84 kDa para p84 (controlo de carga). Por favor clique aqui para visualizar um versão maior desta figura.
| Reagente | Para um volume de reacção de (l) |
| solução específica Kit | 4 |
| Tampão de PCR 10x | 2 |
| 10? M de iniciador directo (marcado) | 1 |
| 10? M de iniciador reverso (não marcado) | 1 |
| de mistura de dNTP 25 mM | 0,4 |
| Taq DNA polimerase | 0,2 |
| agua | 8.4 |
| lisado diluo | 3 |
| Total | 20 |
Tabela 1: Reagentes para a reacção de PCR fluorescente.
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Discussion
O batendo para fora de um gene específico de uma linha de células de modelo de escolha se tornou rotina para elucidar o papel do gene que desempenha nesse contexto celular particular. Na verdade, várias telas genome-wide estão actualmente disponíveis que utilizam o sistema CRISPR / cas9 para alvejar genes humanos virtualmente todos conhecidos no genoma 14, 15, 16. Com estas telas de grande escala (ou mesmo em pequena escala direccionamento de genes individuais de interesse), que é importante conceber e utilizar sgRNAs segmentação diferentes locais do mesmo gene. resultados consistentes nos diferentes sgRNAs utilizados seria inequivocamente capitular o verdadeiro efeito da depleção do gene. Como tal, o direccionamento de um único gene exigiria um passo de genotipagem de alto volume para a genotipagem com exactidão uma multiplicidade de clones a partir de cada um dos sgRNA indivíduo utilizado. A técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente descrito elere pode executar precisamente esta tarefa.
Embora a maioria dos métodos de genotipagem existentes são propícios para fins de alto rendimento, cada um deles sofre de certas limitações inerentes que os tornam menos do que ideal. O agrimensor, ou T7E1, ensaio, que detecta erros de emparelhamento em DNA duplexes 10, não é capaz de diferenciar entre células de tipo selvagem e mutantes homozigicos (clones com dois alelos identicamente mutados), devido ao facto de que estes dois clones de produzir dlices desprovidas de desemparelhamentos 11. O ensaio de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), que relata o desaparecimento de sios de restrio devido a mutações InDel na região do alvo CRISPR 17, está limitada pela disponibilidade de sítios de restrição adequados na região alvo 18. A técnica de análise de DNA de fusão, o qual compreende os diferentes genótipos com base nas suas curvas de fusão 19, 20, sofre de uma falta de consistência. Além disso, todos os três destes métodos não são particularmente informativo em que eles não relatar a ocorrência de um desvio de enquadramento na sequência genética. Em contraste, seqüenciamento Sanger - que é atualmente a técnica de genotipagem mais popular - é extremamente informativo, uma vez que fornece a seqüência exata da região genômica sendo alvejado. No entanto, esta técnica é dispendiosa, em especial em experiências em grande escala. Assim, a caracterização da técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente aqui descrito é vital, porque pode contornar todas as limitações que se deparam as outras técnicas acima descritas.
A técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente permite aos utilizadores de distinguir entre todos os genótipos possíveis que um clone podem existir em-tipo selvagem, mutante heterozigótica (caracterizada por um alelo de tipo selvagem e um alelo mutante), mutante homozigótica (caracteriza-se por dois identalelos mutantes icos), e mutante heterozigótica composto (caracteriza-se por dois alelos mutantes não idênticos). Estes genótipos são facilmente diferenciável pelos padrões de pico no electroferograma. Além disso, esta técnica de genotipagem reporta a diferença entre o tamanho do fragmento do produto de amplificação de tipo selvagem e que um dos clones específicos e é preciso para um único par de bases. Este reporta eficazmente a presença ou ausência de um desvio de enquadramento na sequência genética, permitindo que os utilizadores para reduzir a sua validação para apenas um punhado de clones, economizando tempo e custo. No topo de que, esta técnica também permite a multiplexagem de alvejamento de genes (isto é, pode simultaneamente genotipar mais do que um alvo), e que permite a detecção de uma população celular heterogénea a partir da presença de padrões de picos aberrantes (por exemplo, a presença de três ou mais picos no electroferograma de células diplóides). Para além das linhas de células utilizadas aqui e anteriormente 12 </ sup>, 13, que também têm genotipados com êxito várias outras linhas de células humanas e não humanas, incluindo as células estaminais e as células neuronais (dados não publicados), usando a técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente, e prevemos que esta técnica é aplicável a quaisquer células que são passíveis de CRISPR / cas9 segmentação. Além disso, uma vez que esta técnica relata o genótipo de alelos individuais da célula, é extremamente útil para a genotipagem de células multi-alélicas, tais como células de cancro que têm ou aneuploidia amplificações genéticas.
O protocolo aqui descrito (incluindo todo o material utilizado) foi optimizado para a genotipagem versátil e reprodutível de clones CRISPR / cas9 segmentados. No entanto, há algumas partes que merecem modificação. Eles incluem, mas não estão limitados a: 1) o uso de um vector de expressão sgRNA diferente (ou uma estratégia de clonagem), o que poderá exigir a utilização de uma estratégia de selecção diferente(Por exemplo, a selecção de clones de antibiótico em vez de FACS); 2) a utilização de uma polimerase diferente para o passo de PCR fluorescente; e 3) o uso de diferentes marcas fluorescentes. Além disso, é importante notar que um par de passos essenciais no protocolo pode revelar-se problemática. Por um lado, os produtos de amplificação de PCR fluorescentes podem produzir bandas não específicas no electroferograma em gel de agarose, ou o padrão de pico no electroferograma gel capilar pode ser "ruidoso". Isto é provavelmente devido à qualidade sub-óptima de iniciadores de PCR e, por conseguinte, pode ser rectificado por re-concepção destes iniciadores. Nós recomendamos testar a qualidade dos iniciadores usando os oligonucleótidos não marcados antes da aquisição os marcados com fluoróforo para assegurar a consistência, reprodutibilidade e especificidade da etapa de amplificao. O outro factor importante a notar é a eficiência do RNA guia CRISPR, o qual pode determinar a taxa de obtenção de clones de verdadeiros positivos knockout. Uma vez que nenhum da pesquisa prog sgRNAram que estão actualmente disponíveis são à prova de falhas, a eficácia de cada indivíduo sgRNA só pode ser determinada empiricamente. Assim, é importante conceber e utilizar mais do que um sgRNA (de preferência três ou mais) para cada gene alvo para reduzir a possibilidade de não se obter um clone bem sucedido nocaute.
Embora a técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente é informativo, sensível, e fácil de usar, se trata com algumas reservas. Em primeiro lugar, esta técnica requer a utilização de um analisador genético, que pode não ser facilmente disponível. No entanto, uma vez que o analisador genético utilizado para esta finalidade é o mesmo que o utilizado para a sequenciação de Sanger experiências, o protocolo de electroforese em gel capilar pode ser entregue a prestadores de serviços de sequenciação Sanger existentes. Na verdade, já anteriormente providenciado com o provedor de serviços de sequenciação para executar o protocolo de electroforese em gel capilar a um custo comparável aos quando feito em casa. Em segundo lugar, a precisão do technique podem sofrer mutações quando InDel mais do que 30 pb estão envolvidos. Na nossa experiência, a técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente tende a subestimar o tamanho das indels quando são observadas grandes indels (> 30 pb). No entanto, em nossa experiência, a grande maioria dos mutantes apresentaram comprimentos de mutação muito curto InDel (a maioria são menos de 5 pb). No entanto, isso é altamente dependente do local alvo CRISPR e linha celular utilizada. Em terceiro lugar, a técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente não é capaz de detectar substituições de base sobre a reparação de NHEJ no local do corte CRISPR / cas9. No entanto, tem sido relatado que a substituição de base, como um resultado da reparação de quebras de NHEJ de cadeia dupla é um evento raro 21, e eles não prejudicialmente alterar o quadro de leitura do gene. Em quarto lugar, esta técnica só detecta as alterações na região do alvo amplificados no passo de PCR fluorescente e, portanto, não relata quaisquer aberrações fora do alvo (alterações genéticas UOtside a região amplificada). Se for necessária uma pesquisa tão abrangente dos efeitos off-alvo de sgRNA CRISPR indivíduo, recomendamos sequenciamento do genoma inteiro para detectar com precisão as alterações no genoma dos clones alvo. No entanto, nesta experiência, em vez dispendioso não é necessário, se mais do que um sgRNA é usado por gene alvo, tal como discutido acima. Por último, a técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente aqui descrito tem um limite de tamanho de fragmento de 600 pb. Isto pode representar um problema, se a região-alvo consiste de sequências repetidas ou tem excepcionalmente elevado teor de guanina-citosina (GC), o que pode afectar a eficiência de amplificação por PCR e especificidade. Este problema facilmente evitável salienta a importância de um projeto cuidadoso alvo sgRNA, que deve incluir a devida atenção para a amplificação apropriada da região de destino. Assim, considerando as forças e advertências da técnica de electroforese em gel de PCR-capilar fluorescente, este método fácil de genotipagempode aliviar o fardo de genotipagem de alto volume de clones knockout, que continua a ser um ponto de estrangulamento para esse dia.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Ms. Tan Shi Min, Ms. Helen Ong, e Dr. Zhao Yi para ajudar com os experimentos de eletroforese em gel capilar. Este trabalho foi apoiado por NMRC / IRG conceder NMRC / 1314/2011 e MOE ACRF Tier 2 subvenção do Fundo MOE2011-T2-1-051.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
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