Summary
Multiparameter fluorescence immunohistochemistry는 종양의 미세 환경에서 면역 세포 집단의 수, 상대 분포 및 위치를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 구강 인두 암에서 T 세포 subpopulation을 분석하는이 기술의 사용을 설명합니다.
Abstract
4 색 형광 immunohistochemistry (IHC) 기술은 조직의 상대 분포와 위치를 고려하면서 관심있는 세포 집단을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 종양 유형에서 면역 침윤을 연구하기 위해 광범위하게 적용되었습니다. 종양 미세 환경은 종양 부위에 끌리는 면역 세포에 의해 침투된다. 다른 면역 세포 집단은 종양의 미세 환경에서 다른 역할을하고 질병의 결과에 다른 영향을주는 것으로 밝혀졌습니다. 이 원고는 oropharyngeal 편평 세포 암 (OPSCC)에 대한 다중 매개 변수 형광 IHC의 사용을 예로 설명합니다. 이 기술은 관심있는 다른 조직 샘플 및 세포 유형으로 확장 될 수 있습니다. 제시된 연구에서, 우리는 큰 OPSCC 코호트 (n = 162)의 상피 및 간질 구획을 분석했다. 우리는 총 T 림프구 (CD3 + ), 면역 억제 조절간질에서 종양 상피를 구별하기 위해 핵 역지사를 사용하여 T 세포 (Tregs, 즉 FoxP3 + ) 및 T 헬퍼 17 (Th17) 세포 ( 즉, IL-17 + CD3 + 종양 내 IL-17 + 비 T 세포의 수가 적은 환자에서 높은 수의 T 세포가 무병 생존율의 개선과 상관 관계가있는 것으로 나타났다. 이는 IL-17 + non-T 세포가 OPSCC의 면역 반응이 좋지 않음을 암시하며 이는 IL-17과 암 환자의 생존율이 낮은 경우의 상관 관계와 일치한다. 현재, 새로운 다중 매개 변수 형광 IHC 기술은 최대 7 개의 형광 색소를 사용하여 개발되고 있으며, 종양 미세 환경에서 면역 세포의보다 정확한 특성 분석 및 국소화를 가능하게 할 것입니다.
Introduction
Oropharyngeal 편평 세포 암 (OPSCCs)은 구강 인두에서 기인 한 편평 세포 암의 이질적인 그룹입니다. OPSCC의 위험 요소에는 HPV (human papillomavirus) 감염과 알코올 및 담배 사용이 포함됩니다 1 , 2 . 면역 반응의 역할과이를 임상 환경에서 사용하는 방법이 이제 막 연구되기 시작했습니다. 종양 미세 환경은 암세포에 끌리는 면역 세포에 의해 침투됩니다. 높은 CD8 + 세포 독성 T 세포 주파수 OPSCC 환자 3 향상된 생존율과 상관 하였지만, Tregs와 Th17 세포를 포함하는 다른 T 세포 서브 세트의 역할은 아직 불분명 4. 받은 Th1과 Th17 세포가 면역 반응 대상으로 종양 세포에 도움을 해야하는 반면, Tregs는 다른 T 세포 (5)의 활동을 억제하는 자신의 능력에 대한 알려져있다. 그러나, T의 존재regs는 서로 다른 종양 유형에서 호의적 인 반응과 바람직하지 않은 반응과 상관 관계가있는 것으로 밝혀졌습니다 6 . 혈액에 존재하는 모든 면역 세포가 종양에 같은 정도로 침투하는 것은 아니기 때문에 국소 종양 미세 환경을 연구하면 종양에 대한 면역 반응을 가장 확실하게 측정 할 수 있습니다. 이 연구의 목적은 면역 세포의 수와 유형 및 임상 결과 간의 상관 관계를 결정하는 것이다. 우리는 인간 OPSCC에서 다양한 T 세포 subpopulation의 수와 위치를 분석하기 위해 4 색 형광 IHC 이미징을 사용했습니다.
우리는 총 T 림프구 (CD3 + ), Th17 세포 및 면역 억제 성 FoxP3 + Tregs에 중점을 두었습니다.이 분화 경로는 Th17 세포와 밀접한 관련이 있습니다. Th17 세포는 CD3과 IL-17의 조합으로 특징 지어집니다. 사이토 카인 IL-17은 또한 비 - T 세포 (7)에 의해 제조 할 수있다. 우리는 intra-epitidine의 분포를 결정했다헬리 얼 및 간질 T 세포, Tregs, Th17 및 IL-17 + 비 T 세포를 대상으로 OPSCC 발현을 조사하고 환자 생존과의 상관 관계를 분석 하였다. 다색 형광 IHC는 CD3, Foxp3 및 IL-17의 발현을 DAPI 대조 염색제와 함께 확인하는데 사용되었다. 이 분석은 종양 세포 (DAPI 핵 염색법 사용)와 침윤 T 세포 집단 (다른 마커의 조합 사용) 모두를 쉽고 명확하게 식별 할 수있게 해줍니다. 샘플 준비 및 염색법에 따라 형광 현미경과 이미징 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 형광 색상을 구분하고 종양 상피와 종양 관련 간질 모두에 존재하는 세포의 수와 유형을 결정했습니다.
면역 세포 집단을 정량화하고 표현하기위한 또 다른 분석법은 유동 세포 계측법 분석 또는 종양 또는 주변 샘플 ( 즉, 혈액 또는 복수)의 비행 시간 (CyTOF) 분석에 의한 세포 계측법입니다. 이것을 사용하여기술을 사용하면 다른 세포 유형의 지방화 및 상대적 분포에 대한 모든 정보가 손실됩니다. 말초 샘플의 사용 및 분석은 어떤 세포가 종양 미세 환경에 침투 할 수 있는지에 대한 정보도 제공하지 않습니다. 혈액과 복수 면역 세포 분석은 종양 조직의 면역 세포 침윤의 표현형과 빈도를 반영하지 않는 것으로 나타났습니다 8 , 9 .
또 다른 대안은 명 시야 현미경을 사용하는 것입니다. 형광 이미징에 비해이 기법의 장점은 조직 autofluorescence의 부재입니다. 일부 샘플에는자가 형광, 특히 적혈구뿐만 아니라 호중구 과립구를 포함한 다른 세포 유형이 포함되어 있어도 거의 모든 샘플의 분석에서 쉽게 제거 할 수 있습니다. Immunofluorescence는 형광 표적을 사용하여 하나의 샘플에서 여러 마커를 분석 할 수있는 이점을 제공합니다nt 파장. 이것은 특정 항원에 대한 충분한 수의 표지 및 상업적으로 이용 가능한 항체 이소 타입이 없기 때문에 명 시야 현미경 검사에서 현재 동일한 정도로 불가능합니다.
여기에 설명 된 다색 형광 IHC 기술은 다양한 면역 세포 집단, 인간 백혈구 항원 (HLA) 및 PD-L1 10 , 11 과 같은 종양 세포 발현 분자를 연구하기 위해 다양한 암 유형 및 항체 조합에서 사용되었습니다 . 12 . 이 프로토콜은 많은 다른 유형의 시료와 항체를 사용하여 입증되고 검증되었습니다.
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Protocol
환자 샘플은 네덜란드 생명 과학 사회 연합 (www.federa.org)의 인체 조직의 적절한 부차적 사용을위한 행동 강령에 설명 된 의료 윤리 지침에 따라 처리되었습니다.
1. 슬라이드 준비
- 절제 된 물질을 사용할 수있는 의료 윤리위원회의 허가를 얻은 후 병리과에서 절제 된 조직 물질 (모든 종류의 조직)을 얻습니다.
참고 : 현재 실험을 위해, 전처리 종양 샘플 (N = 162) (13) 전 기술로 선정, 라이덴 대학 의료 센터, 라이덴, 1970 년과 2011 년 사이에 네덜란드에서 진단 차 인두 종양에서 얻었다. 조직의 크기는 종양 내부에 4 개의 현미경 이미지를 안정적으로 취할 수있는 충분한 양의 종양 조직에 대한 요구 사항에 의해서만 제한되었습니다. - 최소 12 시간 동안 4 % 완충 포르말린에 조직을 고정. ag에서 조직 탈수에탄올의 습격 시리즈. 자일 렌으로 씻고 자동 티슈 프로세서를 사용하여 파라핀 왁스에 묻습니다.
- 마이크로톰을 사용하여 유리 슬라이드에 4 μm 두께의 포르말린 고정, 파라핀 내장 (FFPE) 조직 절편을 자릅니다. 표준 절차를 사용하여 조직 블록을 마이크로 톤 조직 홀더에 놓습니다.
- 조직의 리본을 잘라내어 45ºC의 탈 이온수가 담긴 수조의 표면에 놓습니다. immunohistochemical 염색법에 적합한 슬라이드를 사용하여 섹션 바로 아래에있는 물에 슬라이드를 놓아서 섹션을 낚시질하십시오. 조심스럽게 슬라이드를 비스듬히 위로 움직여 단면에서 물을 꺼내 슬라이드에 붙입니다.
- 슬라이드를 37 ° C에서 밤새 말리십시오.
- FFPE 슬라이드를 신선한 100 % 크실렌에 완전히 담그어 5 분 동안 세 번씩 FFPE 슬라이드를 탈 파라핀시킵니다. 신선한 100 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 50 % 에탄올에서 각각 5 분 동안 두 번 침몰시켜 슬라이드를 보충하십시오..
2. 항원 검색 수행
- 5 분 동안 탈 이온수에서 슬라이드를 씻으십시오.
- 전자 레인지를 사용하여 트리스 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 버퍼 (10 MM 트리스 플러스 1 MM EDTA, pH 9.0)를 끓는 온도로 예열하십시오. 미리 가열 EDTA 버퍼에 슬라이드를 잠수함과 전자 레인지에서 10 분 동안이 온도에서 버퍼를 유지하여 항원 검색을 수행합니다.
참고 : 900W의 전력을 사용하는 모든 전자 레인지를 사용할 수 있습니다. - 슬라이드를 2 시간 동안 버퍼에서 식히십시오.
3. 얼룩 조직 슬라이드
- 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 슬라이드를 각각 5 분씩 씻으십시오.
- 슬라이드 주변에서 희석 된 항체가 흘러 나오지 않도록 소수성 펜으로 조직 주위에 원형을 그립니다. PBS로 한번 더 씻으십시오. 이것은 선택 사항입니다.
- 1 % w / v 소 혈청 a에 희석 된 1 차 항체 (항 -CD3 1:50, 항 -FoxP3 1 : 200 및 항 -IL-17 1:50)로 조직을 인큐베이션한다PBS 중 lbumin (BSA)을 실온에서 밤새 처리 하였다.
참고 : 슬라이드 당 볼륨은 조직의 크기에 따라 다르지만 일반적으로 50 - 150 μL입니다. CD3, CD8 및 FoxP3 항체 ( 예 : 토끼 Ig 이소 형 제어 항체, 마우스 IgG1 이소 형 제어 항체 및 염소)와 동일한 희석에서 부정적인 제어 슬라이드에 대한 알 수없는 특이성과 동일한 아이소 타입 클래스의 항체로 기본 항체를 바꿉니다 IgG 이소 타입 컨트롤 항체). - 슬라이드를 5 분 동안 PBS로 세 번 씻으십시오.
- 1 차 항체 종 및 / 또는 isotypes ( 즉, 1 : 200 당나귀 안티 - 염소 IgG 알렉사 488, 당나귀 안티 - 토끼 IgG A546, 그리고 당나귀 안티 마우스 A647)를 희석 한 형광 標識 이차 항체의 조합으로 조직을 부화 PBS 중 1 % BSA를 실온에서 1 시간 동안 처리 하였다.
참고 : 슬라이드 당 볼륨은 조직의 크기에 따라 다르지만 일반적으로 50 - 150 μL입니다.- 후2 차 항체를 추가하고 어두운 상자에 보관하거나 상자를 알루미늄 호일로 포장하여 가능한 한 많은 빛으로부터 슬라이드를 보호하십시오.
4. 마운트 및 Counterstain 조직 슬라이드
- 슬라이드를 5 분 동안 PBS로 3 번 씻으십시오.
- 핵 counterstain ( 예 : DAPI)을 포함하는 수용액 방지 퇴색 마운트 매체를 사용하여 슬라이드를 마운트합니다. 가능한 한 빨리 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석하십시오 (2 주 이내에). 분석까지 슬라이드를 4 ° C에서 어둠에 보관하십시오.
5. 스테인드 조직 슬라이드 분석
- 20 - 25X 목적을 갖춘 형광 현미경을 사용하여 각 슬라이드의 네 이미지를 얻습니다. 슬라이드에 포함 된 전체 종양 영역의 무작위 위치에서 이미지를 촬영하여 종양의 대표적인 부분을 캡처합니다.
참고 : 표준 배율 250X를 사용해야합니다. 모든 형광등레이저 스캐닝 현미경은 사용 된 형광색을 시각화하는 데 필요한 필터와 레이저가 있으면 사용할 수 있습니다.- Alexa 488의 시각화를 위해 여기 최대 값 490, 최대 방사 값 525를 사용하십시오. Alexa 546의 시각화를 위해 여기 최대 값을 556, 최대 방사 값을 573으로 사용하십시오. Alexa 647의 시각화를 위해 최대 여기 650 및 최대 방사 665를 사용하십시오. DAPI의 시각화를 위해서는 여기 최대치를 358, 최대 방출량을 461로 사용하십시오.
- 이미지를 사용자가 사용할 수있는 소프트웨어의 이미지 파일 ( 예 : jpeg 및 tiff)로 저장하십시오.
- 병리학자를상의 한 후 종양 상피 세포와 간질 세포의 핵 및 세포 형태에 따라 종양 상피와 종양 간질 영역을 구별합니다.
- 총 기질 표면적을 결정하기 위해, 간질 세포 (종양 세포가 아닌)가 차지하는 모든 영역 주위에 선을 그어주고d 현미경 제조업체가 제공 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 표면적.
- 이미지 아래의 "Overlay"탭을 클릭하십시오. "Closed Poly-line"모양을 선택하고 클릭하십시오. 종양 상피 세포와 간질 세포 사이의 경계를 경계 짓기 위해 다시 마우스를 클릭하십시오. 이 영역에 대한 측정 값을 제공합니다.
참고 : 모양을 닫으면 선택한 이미지의 서페이스 영역을 둘러싸는 모양 옆에 숫자가 나타납니다 (A = x μm 2 ).
- 이미지 아래의 "Overlay"탭을 클릭하십시오. "Closed Poly-line"모양을 선택하고 클릭하십시오. 종양 상피 세포와 간질 세포 사이의 경계를 경계 짓기 위해 다시 마우스를 클릭하십시오. 이 영역에 대한 측정 값을 제공합니다.
- 이 표면 영역을 전체 이미지 표면 영역 (이미지 속성에서 제공)에서 뺀 후 상피 표면적을 계산합니다. 제공된 영역의 크기를 기록하고 상피 표면 영역에서 그 부분을 빼내서 혈관, 괴사 및자가 형광 영역을 제거하십시오.
- 모든 표면적 수치를 스프레드 시트 파일에 저장하여 평균 표면적을 계산하고슬라이드 당 셀 번호.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 네 가지 채널 모두의 형광을 확인하여 세포가 단일, 이중 또는 삼중 양성인지 확인합니다.
- ImageJ를 사용하여 각 이미지의 단일, 이중 및 삼중 양성 세포를 센다.
- ImageJ를 다운로드하십시오. "파일"및 "열기"를 클릭하고 분석 할 이미지를 선택하여 이미지를 엽니 다. "Point Tool"(4 줄 중간의 빨간색 사각형)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "Multi-Point Tool"을 선택하십시오. "Multi-Point Tool"을 두 번 클릭하고 각 셀 유형에 다른 카운터 번호를 선택하여 이미지에서 다른 셀 유형의 수를 계산하십시오.
참고 : 하나, 둘 또는 세 가지 형광색의 존재 여부에 따라 식별되는 각기 다른 세포 유형의 모든 세포를 세십시오. 이 핵 역전사는 모든 세포에 존재하며 면역 세포와 종양 세포를 구별하는 데 사용되므로 DAPI는 제외합니다. 각 셀 유형이 계산됩니다.다른 카운터 번호를 사용합니다. 매번 다른 카운터 번호를 선택하여 종양 상피 및 간질 영역에서 각 세포 유형의 세포 수를 개별적으로 계산하십시오. 혈관과 주로자가 형광 영역의 세포를 세지 마십시오. - 스프레드 시트 파일에서 각 이미지의 각 카운터 저장소에서 분석 된 셀 수를 기록하십시오.
- 분석 된 종양 상피와 종양 간질의 총 표면적에 대해 각 세포 유형의 총 세포 수를 나눕니다.
- ImageJ를 다운로드하십시오. "파일"및 "열기"를 클릭하고 분석 할 이미지를 선택하여 이미지를 엽니 다. "Point Tool"(4 줄 중간의 빨간색 사각형)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "Multi-Point Tool"을 선택하십시오. "Multi-Point Tool"을 두 번 클릭하고 각 셀 유형에 다른 카운터 번호를 선택하여 이미지에서 다른 셀 유형의 수를 계산하십시오.
- ImageJ를 사용하여 각 이미지의 단일, 이중 및 삼중 양성 세포를 센다.
- 총 기질 표면적을 결정하기 위해, 간질 세포 (종양 세포가 아닌)가 차지하는 모든 영역 주위에 선을 그어주고d 현미경 제조업체가 제공 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 표면적.
6. 통계 분석
참고 : 모든 통계 분석은 데이터의 품질을 보장하기 위해 통계 전문가와 논의해야합니다. 일반적으로 통계를 들어, 어떤 의료 통계 가이드 (14)를 사용합니다.
- 스피어 만 (Spearman)의 순위 상관 관계 ρ 테스트를 사용하여 세포 주파수 간의 상관 관계를 테스트합니다.
- 양성 세포 수의 통계적 차이 테스트Wilcoxon Mann-Whitney test를 사용하여 환자군간에 비교 하였다.
- Kaplan-Meier 곡선 생성 및 로그를 사용하여 세포 수를 기준으로 그룹별로 환자를 나누어 셀 번호와 무병 생존 기간 ( 즉, 진단에서 사망 또는 질병의 재발까지의 시간) 간의 상관 관계를 테스트합니다 순위 분석 15 .
- Cox 비례 위험 회귀 분석을 사용하여 다 변수 분석을 수행하십시오.
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Representative Results
상기 프로토콜을 사용하여 염색 하였다 (N = 162)을 이전에 기재된 13 바와 같이 라이덴 의료원 라이덴 1970 년과 2011 년 사이 네덜란드 진단 차 인두 종양에서 얻은 FFPE 예비 처리 종양 샘플의 일련의 선택. 각 슬라이드의 1 ~ 4 개의 임의 이미지가 분석되었습니다 ( 그림 1 ). 일부자가 형광 세포가 표시되며 이는 완전한 노란색 외관으로 명확하게 구분할 수 있습니다. 진정으로 이중 또는 삼중 양성 세포는 예상되는 국소화에서 특정 항체에 대해 양성이며 세포막 또는 핵에 존재한다. 음성 대조군 슬라이드는 백그라운드 조직자가 형광보다 높은 특이적인 염색을 보이지 않았으며 ( 그림 2 및 그림 4 ), 모든 신호가 1 차적으로 인식 된 표적에 특이하다는 것을 확인했습니다항체. 모든 종양 샘플은 다양한 범위로 CD3 + T 세포에 의해 침투되는 것으로 밝혀졌다. FoxP3 + Tregs는 항상 CD3을 발현하고 주요 침윤 T 세포 집단 중 하나였습니다. IL-17 (Th17 세포)를 발현하는 CD3 세포는 침윤성 T 세포의 소수 집단이었다. CD3 - 세포에 의해 발현되는 IL-17은 다른 풍부한 침윤 세포 집단이었다. IL-17 + FoxP3 + 세포는 모든 FoxP3 + 세포의 0.01 % 이상을 구성하지 않았다.
모든 통계 학적 시험 양면이었고, 0.05 이하, P 값은 14으로 유의하다고 하였다. 간질 또는 총 세포 수와 환자 생존 간의 상관 관계가 유사하기 때문에 상피내 또는 총 세포 수와 생존율 사이의 상관 관계가 제시된다. 많은 수의 침윤성 CD3 + T 세포가 무병 생존율의 향상과의 상관 관계를 보였다 (0.086, 도 5A )에 비해 낮은 T 세포 수 ( 즉, 가장 낮은 사 분위수)와 비교된다. IL-17 + 세포 수가 적은 환자를 구체적으로 조사한 결과, 전체적으로 침습성 T 세포 수가 증가하여 무병 생존율이 향상되었다 (p = 0.012, 그림 5B ). 종양 침윤성 T 세포의 예후 효과는 많은 양의 종양 침윤성 IL-17 + 세포를 가진 환자 그룹에서 상실되었다 (데이터는 표시되지 않음). 따라서, OPSCC에서 종양 침윤 T 세포의 효과는 존재하는 IL-17 + 세포의 수가 적을 수있다.
그림 1 : 4 색 형광 IHC로 염색 된 FFPE 구강암 조직. CD3 ( A , red), IL-17 ( B )에 대한 면역 형광 염색의 대표 이미지 ong>, 녹색) 및 FoxP3 ( C , 파란색), 병합 된 이미지와 DAPI (회색) ( D )가 결합 된 것입니다. 두 개의자가 형광 세포가 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : CD3에 대한 음성 컨트롤. 프로토콜에서 설명한대로 염색 FFPE 구강 인두 암 조직의 대표 이미지, 알 수없는 특이성과 토끼 Ig 이소 형 제어 항체와 안티 CD3 항체를 대체. IL-17 ( B , 녹색), FoxP3 ( C , 파란색) 및 DAPI ( D , 회색)에 대한 염색과 결합 된 토끼 Ig ( A , red)에 대한 염색은 보이지 않았다.2large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : IL-17에 대한 음성 대조군. 프로토콜에서 설명한대로 염색 된 FFPE 구강 인두 암 조직의 대표적인 이미지로, 특이성이 알려지지 않은 염소 Ig 이소 타입 컨트롤 항체로 항 IL-17 항체를 대체했습니다. CD3 ( A , 적색), FoxP3 ( C , 청색) 및 DAPI ( D , 회색)에 대한 염색과 결합 된 염소 Ig ( B , 녹색)에 대한 염색은 보이지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에프그림 4 : FoxP3에 대한 네거티브 컨트롤. 프로토콜에 기술 된대로 염색 FFPE 구강 인두 암 조직의 대표 이미지, 알 수없는 특이성과 마우스 IgG1 isotype 컨트롤 항체와 안티 FoxP3 항체를 대체. CD3 ( A , 적색), IL-17 ( B , 녹색) 및 DAPI ( D , 회색)에 대한 염색과 결합 된 마우스 IgG1 ( C , 청색)에 대한 염색이 나타나지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : Kaplan-Meier Survival Curves. 이하의 중앙값 환자 IL-17 / mm 2 세포, 무병 생존 곡선자는 tota 높은 비교 수 (즉, 낮은 분위수) 매우 낮은 대해 나타낸다 +(L)의 T 세포 (A) 및 총 종양 영역에서 총 T 세포 (B)의 많은 수의 비교 (중앙값 이하 IE) 저. Cancer Immunology Immunotherapy 저널 13의 허가를 받아 복제했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명 된 프로토콜에 대해 가장 중요한 단계 중 하나는 사용 된 1 차 항체의 정확한 희석을 결정하는 것입니다. 이러한 특정 알레시 - 라벨 항체의 제조 업체가 권장하는 바와 같이, 표지 2 차 항체의 희석은 1 : 200이었다. 일차 항체의 희석은 바람직하게는 의도 된 조직 유형 (이 경우, OPSCC)의 2 개의 상이한 샘플을 사용하여 연속 희석에 의해 결정되어야한다. 최적의 작업 희석은 배경 잡음이없고 동일한 농도의 음성 대조군에 대한 신호가없는 명확한 신호가 얻어지는 희석입니다. 이용 가능한 현미경 유형 및 연구자의 선호도에 따라, 2 차 항체 및 장착 매질의 유형에 관한 수정이 이루어질 수있다. 의도 한 결과가 달성되지 않으면 배경 신호에 문제를 일으키는 것으로 알려진 유리 슬라이드 유형을 조사하는 것이 좋습니다 특별한 종류의 염색 용액 ( 예, Perma Blue). 둘째, 일부 항원은 열 유도 항원 결정 인자 검색을 사용하여 혼란을 일으킬 수 있습니다. 이 경우, 연구원은 버퍼의 가열 단계를 효소 유도 에피토프 회수와 같은 다른 기술로 대체 할 수있다. 세 번째, 소수성 펜을 사용하는 경우, 마킹을 조직에 너무 가깝게해서는 안되며, 이는 염색 용액이 제대로 작동하지 못하게합니다. 샘플 당 섹션 수와 섹션 당 필요한 이미지 수에 관해서는 충분한 통계력으로 연구 질문에 대답하는 데 필요한 수를 결정하는 것은 연구원 및 특정 연구 질문에 달려 있습니다. 분석을 위해 샘플 당 섹션 하나와 섹션 당 네 개의 이미지를 사용했습니다. 마지막으로, immunofluorescent 얼룩을 사용할 때 매니큐어 솔루션에 존재하는 알코올이 형광 신호에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 커버 슬립을 봉인하기 위해 매니큐어를 사용할 때주의를 기울여야합니다.
ve_content "> 여기에 설명 된 프로토콜은 처리량이 많은 분석을 포함하지 않지만이 단계를 자동화하려고 시도했지만 세포 크기 및 형태의 주관적 해석은 당시 사용 가능한 소프트웨어 패키지로 분석 자동화를 복잡하게합니다. 염색은 대단히 자동화 될 수 있으며, 세포 수 계산은 수동으로 수행됩니다.우리는 설명 된 프로토콜을 사용하여 연구 된 침윤 T 세포 하위 집합과 임상 결과 사이의 상관 관계를 연구 할 수있었습니다. 종양 내 IL-17 + 비 T 세포의 수가 적은 환자에서 높은 수의 T 세포가 무병 생존율의 개선과 상관 관계가있는 것으로 나타났다. 이는 IL-17 + 비 T 세포가 암 환자 (16)에 IL-17 및 예후 사이의 상관 기술과 일치한다 OPSCC에서 불량한 면역 반응과 관련 될 수 있음을 시사한다.
노출oved 소프트웨어 프로그램은 현재이 단계를 자동화하기 위해 상업적으로 이용 가능하며 현재 수동 셀 관찰 및 카운팅을 대체하고 있으며 이는보다 신뢰성 있고 객관적이며 재현성 있고 빠른 결과를 가져옵니다.
또한, 형광성 면역 조직 화학 마커의 멀티플렉싱을 가능하게하는 상업용 키트의 이용 가능성은 현재 상승 중입니다 17 . 이를 통해 핵 역전 염색약과 함께 최대 7 개의 다른 면역 마커 / 바이오 마커를 다중화 할 수 있습니다. 그러나 여기에보고 된 프로토콜은 멀티 스펙트럼 염색 분석을위한 복잡하고 값 비싼 인프라, 현미경 및 소프트웨어 패키지가없는 실험실에서보다 효율적이고 쉽게 적용될 수 있다고 믿습니다.
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Disclosures
저자는 상업적 또는 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
Simone Punt는 Dutch Cancer Society의 허가 UL2010-4801에 의해 지원되었습니다. Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter 및 Sjoerd van이 JoVE 프로토콜을 기반으로 한 원저자의 모든 공동 저자들에게 감사드립니다. der Burg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
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