Summary
Multiparameterfluorescensimmunohistokjemi kan brukes til å vurdere antall, relativ fordeling og lokalisering av immuncellepopulasjoner i tumormikromiljøet. Dette manuskriptet beskriver bruken av denne teknikken for å analysere T-celle subpopulasjoner i orofaryngealkreft.
Abstract
Firefargesfluorescensimmunohistokjemi (IHC) -teknikken er en metode for å kvantifisere cellepopulasjoner av interesse mens man tar hensyn til deres relative fordeling og lokalisering i vevet. Denne teknikken har blitt brukt i stor grad for å studere immuninfiltrasjonen i ulike svulst typer. Vaskemiljøet er infiltrert av immunceller som er tiltrukket av svulstoffet. Forskjellige immuncellepopulasjoner har blitt funnet å spille forskjellige roller i svulmemiljøet og å ha en annen innvirkning på sykdomsutfallet. Dette manuskriptet beskriver bruken av multiparameter fluorescens IHC på oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC) som et eksempel. Denne teknikken kan utvides til andre vevsprøver og celletyper av interesse. I den presenterte studien analyserte vi det intraepiteliale og stromale rommet av en stor OPSCC kohorte (n = 162). Vi fokuserte på totalt T-lymfocytter (CD3 + ), immunosuppressive regulatOry-T-celler (Tregs, dvs. FoxP3 + ) og T helper 17 (Th17) celler ( dvs. IL-17 + CD3 + ) ved hjelp av et nukleært motstander for å skille tumorepitel fra stroma. Et høyt antall T-celler viste seg å være korrelert med forbedret sykdomsfri overlevelse hos pasienter med lavt antall intratumorale IL-17 + ikke-T-celler. Dette antyder at IL-17 + ikke-T-celler kan være korrelert med en dårlig immunrespons i OPSCC, som er i samsvar med korrelasjonen beskrevet mellom IL-17 og dårlig overlevelse hos kreftpatienter. For tiden utvikles nye multifarameterfluorescens-IHC-teknikker ved bruk av opptil 7 forskjellige fluorokromer og vil muliggjøre en mer nøyaktig karakterisering og lokalisering av immunceller i svulmemiljøet.
Introduction
Oropharyngeal squamous cell carcinomas (OPSCCs) er en heterogen gruppe av squamouscellecancer som stammer fra oropharynx. Risikofaktorer for OPSCC inkluderer humant papillomavirus (HPV) infeksjon og bruk av alkohol og tobakk 1 , 2 . Rollen av immunresponsen og hvordan du bruker dette i en klinisk setting, begynner bare å bli utforsket. Vaskemiljøet er infiltrert av immunceller som er tiltrukket av kreftområdet. Selv om en høy CD8 + cytotoksisk T-cellefrekvens har vært korrelert med forbedret overlevelse hos OPSCC-pasienter 3 , er rollen til andre T-celle-undergrupper, inkludert Tregs og Th17-celler, fortsatt uklar 4 . Mens Th1- og Th17-celler skal bistå i immunresponsmålrørende tumorceller, er Tregs velkjent for deres evne til å undertrykke aktiviteten til andre T-celler 5 . Imidlertid er tilstedeværelsen av TRegs har blitt funnet å korrelere med både gunstige og ugunstige svar i forskjellige svulst typer 6 . Siden ikke alle immunceller som er tilstede i blodet, infiltrerer svulsten i samme grad, gir studiet av det lokale tumormikromiljøet det mest pålitelige målet på immunresponsen rettet mot svulsten. Målet med denne studien er å bestemme korrelasjonen mellom tallene og typene immunceller og det kliniske utfallet. Vi brukte firefarget fluorescens IHC-bildebehandling for å analysere antall og lokalisering av ulike T-celle subpopulasjoner i human OPSCC.
Vi fokuserte på totalt T-lymfocytter (CD3 + ), Th17-celler og immunosuppressive FoxP3 + Tregs, hvis differensieringsvei er nært relatert til Th17-celler. Th17-celler kjennetegnes av kombinasjonen av CD3 og IL-17. Cytokinet IL-17 kan også fremstilles av ikke-T-celler 7 . Vi bestemte fordelingen av intraepitHelial og stromal T-celler, Tregs, Th17 og IL-17 + ikke-T-celler i en stor serie OPSCC-tilfeller og analyserte korrelasjonene med pasientoverlevelse. Multikolor fluorescens IHC ble brukt til å identifisere ekspresjonen av CD3, Foxp3 og IL-17, i kombinasjon med en DAPI-motstrekning. Denne analysen tillot for enkel og klar identifikasjon av begge tumorceller (ved bruk av DAPI-nukleær farging) og infiltrerende T-cellepopulasjoner (ved hjelp av en kombinasjon av forskjellige markører). Etter prøvepreparering og -farging ble et fluorescerende mikroskop og bildebehandlingsprogram brukt for å separere de forskjellige fluorescerende fargene som ble brukt og for å bestemme antall og type celler som er tilstede i både tumorepitelet og den tumorassosierte stroma.
Et alternativt assay for å kvantifisere og fenotype immuncellpopulasjoner er strømningscytometrianalyse eller cytometri ved tidstroende (CyTOF) analyse av tumor eller perifere prøver ( dvs. blod eller ascites). Bruk detteTeknikk, går all informasjon om lokalisering og relativ fordeling av de forskjellige celletyper tapt. Bruken og analysen av perifere prøver gir også ikke informasjon om hvilke celler som er i stand til å infiltrere tumormikromiljøet. Blod- og asciteimmun-celleanalyser har vist seg å ikke reflektere fenotypen og hyppigheten av immuncelleinfiltrering av tumorvevet 8 , 9 .
Et annet alternativ er bruken av lysfeltmikroskopi. En fordel ved denne teknikken over fluorescensbilder er fraværet av vevs autofluorescens. Selv om enkelte prøver inneholder mer autofluorescens-spesielt erytrocytter, men også andre celletyper, inkludert nøytrofile granulocytter, kan disse områdene enkelt fjernes ved analyse av nesten alle prøver. Immunofluorescens gir fordelen av å analysere flere markører i en prøve ved å bruke et panel med målrettet fluoresceNt bølgelengder. Dette er for øyeblikket umulig i samme grad for lysfeltmikroskopi på grunn av mangelen på et tilstrekkelig antall etiketter og kommersielt tilgjengelige antistoffisotyper for et bestemt antigen.
Den flerfarvede fluorescens-IHC-teknikken som er beskrevet her, har blitt brukt i mange forskjellige krefttyper og antistoffkombinasjoner for å studere forskjellige immuncellepopulasjoner, så vel som tumorcelle-uttrykte molekyler, slik som humane leukocytantigener (HLA) og PD-L1 10 , 11 , 12 . Protokollen er etablert og validert ved bruk av mange forskjellige typer prøver og antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasientprøver ble håndtert i henhold til de medisinske etiske retningslinjene som er beskrevet i adferdskodeksen for korrekt sekundær bruk av humant væv av den nederlandske sammenslutningen av biomedisinske vitenskapelige samfunn (www.federa.org).
1. Klargjør lysbilder
- Få resektert vevsmateriale (enhver form for vev) fra en patologiavdeling etter å ha fått medisinsk etisk komité tillatelse til å bruke resektert materiale.
MERK: For det nåværende eksperimentet ble forbehandlingstumprøver oppnådd fra primære orofaryngeale svulster diagnostisert i Leiden Universitetsmedisinske senter, Leiden, Nederland mellom 1970 og 2011, valgt som beskrevet tidligere (n = 162) 13 . Størrelsen på vevet var bare begrenset av kravet om tilstrekkelig mengde svulstvev for å pålidelig ta 4 mikroskopiske bilder inne i svulsten. - Fest vevet i 4% buffert formalin i minst 12 timer. Dehydrere vevet i agRaded serie etanol. Vask det i xylen og legg det i parafinvoks ved hjelp av en automatisert vevprosessor.
- Klipp 4 μm tykk formalin-fast, paraffin-innebygd (FFPE) vevseksjoner på glideskinner ved hjelp av et mikrotom. Plasser vevblokken i mikroton vevholderen ved å bruke standard prosedyrer.
- Klipp bånd av vev og legg dem på overflaten av et vannbad som inneholder avionisert vann ved 45 ºC. Bruk et lysbilde egnet for immunohistokjemisk farging for å fiske ut en del ved å plassere lysbildet i vannet rett under seksjonen. Forsiktig skyv lysbildet opp i en vinkel, ta seksjonen ut av vannet og klistre den på lysbildet.
- La lysbildene tørke over natten ved 37 ° C.
- Deparaffinize FFPE lysbildene ved å nedsenke dem helt i fersk 100% xylen, tre ganger i 5 minutter hver. Rehydrer lysbildene ved å nedsenke dem to ganger i frisk 100% etanol, 70% etanol og 50% etanol i 5 minutter hver.
2. Utfør antigen gjenfinning
- Vask glidene i deionisert vann i 5 minutter.
- Forvarm tris-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) buffer (10 mM Tris pluss 1 mM EDTA, pH 9,0) til koketemperatur ved bruk av en mikrobølgeovn. Utfør antigeninnhenting ved å nedsenke lysbildene i den forvarmede EDTA-bufferen og holde bufferen ved denne temperaturen i 10 minutter i mikrobølgeovnen.
MERK: Enhver mikrobølgeovn med en effekt på 900 W kan brukes. - La lysbildene kjøle seg ned i bufferen i 2 timer.
3. Stain Tissue Slides
- Vask glidene to ganger med fosfatbuffert saltvann (PBS) i 5 minutter hver.
- Tegn en sirkel rundt vevet med en hydrofob penne for å forhindre at de fortynnede antistoffene spres av lysbildet. Vask enda en gang med PBS; Dette er valgfritt.
- Inkuber vevet med primære antistoffer (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 og anti-IL-17 1:50) fortynnet i 1% v / v bovint serum aLbumin (BSA) i PBS ved romtemperatur over natten.
MERK: Volumet per lysbilde avhenger av størrelsen på vevet, men det er typisk 50 - 150 μL. Erstatt de primære antistoffene med antistoffer av samme isotype-klasse med ukjent spesifisitet for de negative kontrollglassene ved samme fortynning som CD3-, CD8- og FoxP3-antistoffene ( dvs. kanin Ig-isotype-kontrollantistoff, mus IgG1-isotype-kontrollantistoff og geit IgG isotype kontrollantistoff). - Vask lysbildene tre ganger med PBS i 5 minutter hver.
- Inkuber vevet med en kombinasjon av fluorescensmerkede sekundære antistoffer rettet mot de primære antistoffartene og / eller isotypene ( dvs. 1: 200 esel anti-geit IgG Alexa 488, esel anti-kanin IgG A546 og esel-anti-mus A647) fortynnet i 1% BSA i PBS ved romtemperatur i 1 time.
MERK: Volumet per lysbilde avhenger av vevets størrelse, men er vanligvis 50 - 150 μl.- EtterLegge til sekundær antistoff, hold lysbildene beskyttet mot lys så mye som mulig ved å lagre dem i en mørk boks eller ved å pakke boksen i aluminiumsfolie.
4. Monter og motstøt Tissue Slides
- Vask lysbildene tre ganger i PBS i 5 minutter hver.
- Monter lysbildene ved hjelp av et vandig, antifarget monteringsmedium som inneholder et nukleært motstander ( f.eks. DAPI). Analyser lysbildene med et fluorescerende mikroskop så snart som mulig (innen to uker). Oppbevar lysbildene i mørket ved 4 ° C til analyse.
5. Analyser fargede vævsglass
- Få fire bilder av hvert lysbilde ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med et 20 - 25X objektiv. Ta bilder på tilfeldige steder i hele det totale svulstområdet som er inkludert i lysbildet for å fange en representativ brøkdel av svulsten.
MERK: En standard forstørrelse på 250X skal brukes. Enhver fluorescerende oR laserskanningsmikroskop kan brukes, forutsatt at det har filtre og lasere som trengs for å visualisere de anvendte fluorokromene.- For visualisering av Alexa 488, bruk et eksitasjons maksimum på 490 og et utslipp maksimalt 525; For visualisering av Alexa 546, bruk en eksitasjons maksimal på 556 og et utslipp maksimalt 573; For visualisering av Alexa 647, bruk et eksitasjons maksimum på 650 og et utslipp maksimalt 665; Og for visualisering av DAPI, bruk et eksitasjons maksimum på 358 og et utslipps maksimum på 461.
- Lagre bildene som bildefiler ( dvs. jpeg og tiff) i programvaren som er tilgjengelig for brukeren.
- Diskriminere mellom tumorepitel og tumorstrom-områder basert på nukleare og cellulære former for tumorepitelial mot stromalceller etter å ha konsultert en patolog.
- For å bestemme det totale stromalarealet, tegne en linje rundt alle områder som er okkupert av stromalceller (i stedet for tumorceller) og recorD overflaten ved hjelp av bildeanalyseprogrammet levert av mikroskopprodusenten.
- Klikk på "Overlegg" -fanen under bildet; Velg "Closed Poly-line" -formen og klikk på den. Avgrens grensen mellom tumorepitel- og stromalfelt ved å klikke rundt området til du kommer til det første punktet igjen .; Dette gir et mål for dette området.
MERK: Når formen er lukket, vises et nummer ved siden av formen som omkranser overflaten på det valgte bildet (A = x μm 2 ).
- Klikk på "Overlegg" -fanen under bildet; Velg "Closed Poly-line" -formen og klikk på den. Avgrens grensen mellom tumorepitel- og stromalfelt ved å klikke rundt området til du kommer til det første punktet igjen .; Dette gir et mål for dette området.
- Trekk dette overflatearealet fra det totale bildet overflateareal (angitt i bildeegenskaper) for å beregne epithelial overflateareal. Ekskluderer vaskulære, nekrotiske og autofluorescerende områder ved å tegne en linje rundt dem, registrere størrelsen på det angitte området og trekke det fra epithelial overflaten.
- Lagre alle overflateantal i en regnearkfil for å beregne de gjennomsnittlige overflatene ogCelle tall per lysbilde.
- Ved hjelp av bildeanalyseprogrammet, avgjøre om cellene er single-, double- eller triple-positive ved å kontrollere fluorescensen av alle fire kanalene.
- Telle single-, double- og triple-positive celler i hvert bilde ved hjelp av ImageJ.
- Last ned ImageJ. Åpne et bilde ved å klikke på "File" og "Open" og velg bildet som skal analyseres. Høyreklikk på "Point Tool" (et rødt firkant i midten av fire linjer) og velg "Multi Point Tool". Dobbeltklikk på "Multi-Point Tool" og telle antall forskjellige celletyper i bildet ved å velge et annet tellernummer for hver celletype.
MERK: Telle alle cellene til hver annen celletype, som identifisert av tilstedeværelsen av en, to eller alle tre fluorescerende farger. Utelukk DAPI, da dette nukleare motstoffet er tilstede i alle celler og brukes til å diskriminere tumorceller fra immunceller. Hver celletype tellerBruker et annet tellernummer. Telle celle tallene for hver celletype separat i tumorepitel- og stromalområdene ved å velge et annet tellernummer hver gang. Teller ikke celler i blodkar og i stor grad autofluorescerende områder. - Ta opp antall celler som er analysert i hver diskboks for hvert bilde i en regnearkfil.
- Del det totale antall celler for hver celletype over det totale overflatearealet av tumorepitel og tumorstroma analysert.
- Last ned ImageJ. Åpne et bilde ved å klikke på "File" og "Open" og velg bildet som skal analyseres. Høyreklikk på "Point Tool" (et rødt firkant i midten av fire linjer) og velg "Multi Point Tool". Dobbeltklikk på "Multi-Point Tool" og telle antall forskjellige celletyper i bildet ved å velge et annet tellernummer for hver celletype.
- Telle single-, double- og triple-positive celler i hvert bilde ved hjelp av ImageJ.
- For å bestemme det totale stromalarealet, tegne en linje rundt alle områder som er okkupert av stromalceller (i stedet for tumorceller) og recorD overflaten ved hjelp av bildeanalyseprogrammet levert av mikroskopprodusenten.
6. Statistisk analyse
MERK: Alle statistiske analyser skal diskuteres med en statistiker for å sikre datakvaliteten. For generell statistikk, bruk en medisinsk statistikkguide 14 .
- Test sammenhenger mellom cellefrekvenser ved hjelp av en Spearmans rangkorrelasjons-rho-test.
- Test de statistiske forskjellene i antall positive celLs mellom pasientgrupper ved bruk av Wilcoxon Mann-Whitney testen.
- Test sammenhengene mellom celle tall og sykdomsfri overlevelse ( dvs. tidspunktet fra diagnosen til lokal eller fjern tilbaketrekking av død eller sykdom) ved å dele pasientene i grupper basert på et antall celler ved bruk av Kaplan-Meier-kurvegenerering og logg Ranganalyse 15 .
- Utfør multivariate analyser ved hjelp av Cox proporsjonal fareregresjonsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En serie FFPE-forbehandlingstumprøver oppnådd fra primære orofaryngeale svulster diagnostisert i Leiden Universitetsmedisinske senter, Leiden, Nederland mellom 1970 og 2011, valgt som beskrevet tidligere (n = 162) ble farget ved hjelp av protokollen beskrevet 13 . En til fire tilfeldige bilder av hvert lysbilde ble analysert ( figur 1 ). Noen autofluorescerende celler er indikert, noe som tydelig kan skelnes av deres fullgult utseende. Celler virkelig dobbelt- eller trippel-positive bare flekk positive for et bestemt antistoff ved den forventede lokalisering, som er ved cellemembranen eller kjernen, i dette tilfellet. Negative kontrolldyser viste ingen spesifikke flekker over bakgrunnsvevsautofluorescens ( Figur 2 og Figur 4 ), som bekrefter at alt signal er spesifikt for målene som er anerkjent av primærsystemetantistoffer. Alle svulstprøver ble funnet å infiltreres av CD3 + T-celler i varierende omfang. FoxP3 + Tregs uttrykte alltid CD3 og var en av de store infiltrerende T-cellepopulasjonene. CD3-celler som uttrykker IL-17 (Th17-celler) var en mindre populasjon av de infiltrerende T-celler. IL-17 uttrykt av CD3 - celler var en annen rikelig infiltrerende cellepopulasjon. IL-17 + FoxP3 + -celler omfattet ikke mer enn 0,01% av alle FoxP3 + -celler.
Alle statistiske tester var tosidige, og p-verdier under 0,05 ble vurdert som signifikante 14 . Korrelasjonene mellom intraepitel- eller totalcelletall og overlevelse presenteres, siden korrelasjonene mellom stromal- eller totalcelletall og pasientoverlevelse var lignende. Et stort antall infiltrerende totale CD3 + T-celler viste en trend mot en korrelasjon med forbedret sykdomsfri overlevelse (0,086, Figur 5A ) sammenlignet med et lite antall T-celler ( dvs. laveste kvartil). Når det ble studert pasienter med lavt antall IL-17 + -celler, var et høyt antall totale infiltrerende T-celler korrelert med forbedret sykdomsfri overlevelse (p = 0,012, figur 5B ). Den prognostiske effekten av tumor-infiltrerende T-celler gikk tapt i gruppen av pasienter med et høyt antall tumor-infiltrerende IL-17 + -celler (data ikke vist). Dermed kan effekten av tumor-infiltrerende T-celler i OPSCC være relatert til det lave antallet av IL-17 + -celler som er til stede.
Figur 1: FFPE Oropharyngeal Cancer Tissue Stained av Four-Color Fluorescence IHC. Representativt bilde av en immunfluorescerende flekk for CD3 ( A , rød), IL-17 ( B Ong>, green) og FoxP3 ( C , blue), samt det fusjonerte bildet kombinert med DAPI (grå) ( D ). To autofluorescerende celler er indikert med pilene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Negativ kontroll for CD3. Representativt bilde av FFPE orofaryngeal kreftvev, farget som beskrevet i protokollen, erstatter anti-CD3-antistoffet med et kanin-Ig-isotype-kontrollantistoff med ukjent spesifisitet. Ingen farging for kanin Ig ( A , rød) kombinert med farging for IL-17 ( B , grønn), FoxP3 ( C , blå) og DAPI ( D , grå) er vist.2large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Negativ kontroll for IL-17. Representativt bilde av FFPE oropharyngeal cancer vev, farget som beskrevet i protokollen, erstatter anti-IL-17 antistoffet med et geit Ig isotype kontrollantistoff med ukjent spesifisitet. Ingen flekker for geit Ig ( B , grønn) kombinert med flekker for CD3 ( A , rød), FoxP3 ( C , blå) og DAPI ( D , grå) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
FIgure 4: Negativ kontroll for FoxP3. Representativt bilde av FFPE oropharyngeal cancer vev, farget som beskrevet i protokollen, ved å erstatte anti-FoxP3 antistoffet med et mus IgG1 isotype kontrollantistoff med ukjent spesifisitet. Ingen farging for mus IgG1 ( C , blå) kombinert med flekker for CD3 ( A , rød), IL-17 ( B , grønn) og DAPI ( D , grå) er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kaplan-Meier Survival Curves. For pasienter med under-median antall IL-17 + celler / mm 2 , vises sykdomsfrie overlevelseskurver for en svært lav ( dvs. laveste kvartil) versus høyt antall totaL T-celler ( A ) og en lav ( dvs. undermedian) versus høyt antall totale T-celler ( B ) i total tumorområdet. Gjengitt med tillatelse fra Cancer Immunology Immunotherapy journal 13 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For protokollen som er beskrevet, er et av de mest kritiske trinnene å bestemme riktig fortynning av de primære antistoffene som brukes. Fortynningen av de merkede sekundære antistoffene var 1: 200, som anbefalt av produsenten av disse spesifikke Alexa-merkede antistoffene. Fortynningen av de primære antistoffene skal da bestemmes ved en seriell fortynning, fortrinnsvis ved bruk av to forskjellige prøver av den tilsiktede vevstype (i dette tilfellet OPSCC). Den optimale arbeidsfortynningen er fortynningen der et klart signal oppnås, uten bakgrunnsstøy og i fravær av signal for negativ kontroll ved samme konsentrasjon. Modifikasjoner kan gjøres med hensyn til type sekundære antistoffer og monteringsmedium som brukes, avhengig av hvilken type mikroskop som er tilgjengelig og forskerens preferanse. Hvis de tilsiktede resultatene ikke oppnås, anbefaler vi at du ser på hvilke typer glasskinner som brukes, som noen er kjent for å forårsake problemer med bakgrunnssignaler For spesielle typer fargeløsninger ( f.eks. Perma Blue). For det andre kan noen antigener bli forstyrret ved bruk av varmeinducerte epitopinnhenting. I så fall kan forskeren erstatte buffertens oppvarmingstrinn med andre teknikker, slik som enzyminducert epitop-gjenvinning. For det tredje, hvis du bruker den hydrofobe pennen, bør merkingen ikke gjøres for nær vevet, da dette forhindrer at fargeløsningen fungerer som den skal. Når det gjelder antall seksjoner per prøve og det nødvendige antall bilder per seksjon, er det opp til forskeren og det spesifikke spørsmålet om å bestemme antallet som kreves for å svare på forskningsspørsmålet med tilstrekkelig statistisk effekt. For vår analyse brukte vi en seksjon per prøve og fire bilder per seksjon. Til slutt, når du bruker immunofluorescerende flekker, bør du ta vare når du bruker neglelakk til å forsegle dekselet, da alkohol som finnes i neglelakkløsningen kan påvirke det fluorescerende signalet.
Ve_content "> Protokollen beskrevet her innebærer ikke høy gjennomstrømningsanalyse. Vi har forsøkt å automatisere dette trinnet, men den subjektive tolkningen av cellestørrelse og morfologi kompliserer automatiseringen av analysen med programvarepakker som er tilgjengelige på den tiden. Og flekker kan i stor grad automatiseres, ble telling av cellene utført manuelt.Vi var i stand til å studere korrelasjonene mellom de infiltrerende T-celle undersettene som ble studert og klinisk utfall ved hjelp av den beskrevne protokollen. Et høyt antall T-celler viste seg å være korrelert med forbedret sykdomsfri overlevelse hos pasienter med lavt antall intratumorale IL-17 + ikke-T-celler. Dette antyder at IL-17 + ikke-T-celler kan være relatert til en dårlig immunrespons i OPSCC, som er i samsvar med korrelasjonen beskrevet mellom IL-17 og dårlig overlevelse hos kreftpasienter 16 .
VisnOved programvare har nå blitt kommersielt tilgjengelig for å automatisere dette trinnet og erstatter nå manuell celleobservasjon og telling, noe som vil føre til mer pålitelige, objektive, reproduserbare og raske resultater.
I tillegg er tilgjengeligheten av kommersielle sett som tillater multipleksering av fluorescerende immunohistokjemiske markører for tiden økende 17 . Dette vil muliggjøre multipleksering av opptil 7 forskjellige immunmarkører / biomarkører i kombinasjon med et nukleært motstoff. Imidlertid mener vi at protokollen som rapporteres her, fortsatt vil bli mer effektivt og enkelt brukt i laboratorier som mangler komplekse og dyre infrastrukturer, mikroskoper og programvarepakker for multispectral flekkeranalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen kommersiell eller økonomisk interessekonflikt.
Acknowledgments
Simone Punt ble støttet av UL2010-4801 fra det nederlandske kreftforeningen. Vi vil gjerne takke alle medforfatterne av det originale papiret at denne JoVE-protokollen er basert på: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter og Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
