Summary
Многопараметрическую флуоресцентную иммуногистохимию можно использовать для оценки количества, относительного распределения и локализации популяций иммунных клеток в микроокружении опухоли. В этой рукописи описывается использование этой методики для анализа субпопуляций Т-клеток при раке ротоглотки.
Abstract
Метод четырехцветной иммуногистохимии (IHC) представляет собой метод количественного определения популяций клеток с учетом их относительного распределения и их локализации в ткани. Этот метод широко применялся для изучения иммунного инфильтрата в различных типах опухолей. Микроокружение опухоли инфильтрируется иммунными клетками, которые притягиваются к месту опухоли. Было обнаружено, что различные популяции иммунных клеток играют разные роли в микроокружении опухоли и оказывают различное влияние на исход заболевания. В этой рукописи описывается использование многопараметрического флуоресцентного IHC на орофарингеальной плоскоклеточной карциноме (OPSCC) в качестве примера. Этот метод можно распространить на другие образцы тканей и интересующие их типы клеток. В представленном исследовании мы проанализировали внутриэпителиальный и стромальный отсек большой когорты OPSCC (n = 162). Мы сосредоточились на тотальных Т-лимфоцитах (CD3 + ), иммуносупрессивном регулате(Tregs, т. Е. FoxP3 + ), и Т-хелперных 17 (Th17) клеток ( т.е. IL-17 + CD3 + ), используя ядерную контрастность для выделения опухолевого эпителия из стромы. Было обнаружено, что большое количество Т-клеток коррелирует с улучшенной безрецидивной выживаемостью у пациентов с низким количеством внутриутробных IL-17 + не-Т-клеток. Это говорит о том, что IL-17 + не-Т-клетки могут коррелировать с плохим иммунным ответом в OPSCC, что согласуется с корреляцией, описанной между IL-17 и плохой выживаемостью у онкологических больных. В настоящее время разрабатываются новые многопараметрические методы флуоресценции IHC с использованием до 7 различных флюорохромов и позволят более точную характеристику и локализацию иммунных клеток в микроокружении опухоли.
Introduction
Орофарингеальная плоскоклеточная карцинома (OPSCC) представляет собой гетерогенную группу злокачественных клеток, возникающих в ротоглотке. Факторы риска для OPSCC включают инфекцию папилломы человека (ВПЧ) и употребление алкоголя и табака 1 , 2 . Роль иммунного ответа и того, как его использовать в клинических условиях, только начинает изучаться. Микроокружение опухоли инфильтрируется иммунными клетками, которые привлекаются к месту рака. Хотя высокая частота цитотоксических Т-клеток CD8 + коррелировала с улучшенной выживаемостью у пациентов с OPSCC 3 , роль других подтипов T-клеток, включая Tregs и клетки Th17, все еще не ясна 4 . В то время как клетки Th1 и Th17, как предполагается, помогают в иммунном ответе, нацеленном на опухолевые клетки, Tregs хорошо известны своими способностями подавлять активность других Т-клеток 5 . Однако наличие TБыло обнаружено, что regs коррелирует как с благоприятными, так и с неблагоприятными ответами в разных типах опухолей 6 . Поскольку не все иммунные клетки, присутствующие в крови, проникают в опухоль в одинаковой степени, изучение локального микроокружения опухоли обеспечивает наиболее надежную меру иммунного ответа, направленного против опухоли. Целью этого исследования является определение корреляции между числами и типами иммунных клеток и клиническим исходом. Мы использовали четырехцветную флюоресцентную визуализацию IHC для анализа количества и локализации различных субпопуляций Т-клеток в OPSCC человека.
Мы сосредоточились на тотальных Т-лимфоцитах (CD3 + ), клетках Th17 и иммуносупрессивных FoxP3 + Tregs, чей путь дифференцировки тесно связан с клетками Th17. Ячейки Th17 характеризуются комбинацией CD3 и IL-17. Цитокин IL-17 также может быть продуцирован не-Т-клетками 7 . Мы определили распределение внутриэпитныхГелиальные и стромальные Т-клетки, Tregs, Th17 и IL-17 + не-Т-клетки в большой серии случаев OPSCC и проанализировали корреляции с выживанием пациентов. Многоцветную флуоресценцию IHC использовали для идентификации экспрессии CD3, Foxp3 и IL-17 в комбинации с контрастирующим DAPI. Этот анализ позволил легко и четко идентифицировать как опухолевые клетки (с использованием ядерного окрашивания DAPI), так и популяции инфильтрирующих Т-клеток (с использованием комбинации разных маркеров). После подготовки образца и окрашивания использовали флуоресцентный микроскоп и программное обеспечение для визуализации для разделения различных используемых флуоресцентных цветов и определения количества и типа клеток, присутствующих как в опухолевом эпителии, так и в связанной с опухолью строме.
Альтернативным анализом количественных оценок и фенотипических популяций иммунных клеток является анализ проточной цитометрии или цитометрия по времени (CyTOF) анализ опухолевых или периферических образцов ( например, крови или асцита). Используя этоТехника, вся информация о локализации и относительном распределении различных типов клеток теряется. Использование и анализ периферических образцов также не дает информации о том, какие клетки способны проникать в микроокружение опухоли. Показано, что анализ клеток крови и асцитной иммунной клетки не отражает фенотип и частоту инфильтрации иммунной клетки опухолевой ткани 8 , 9 .
Другой альтернативой является использование микроскопии с ярким полем. Преимуществом этого метода в отношении флуоресцентной визуализации является отсутствие тканевой аутофлуоресценции. Хотя некоторые образцы содержат больше аутофлуоресценции, особенно эритроцитов, но также и других типов клеток, включая нейтрофильные гранулоциты, - эти области легко удаляются при анализе почти всех образцов. Иммунофлуоресценция дает преимущество анализа нескольких маркеров в одном образце с использованием панели целевого флуоресцированияNt длины волн. Это в настоящее время невозможно в той же степени для микроскопии с ярким полем из-за отсутствия достаточного количества меток и коммерчески доступных изотипов антител для конкретного антигена.
Многослойная флуоресцентная методика IHC, описанная здесь, была использована во многих различных типах рака и комбинациях антител для изучения различных популяций иммунных клеток, а также экспрессируемых опухолевыми клетками молекул, таких как человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) и PD-L1 10 , 11 , 12 . Протокол был установлен и проверен с использованием различных типов образцов и антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы пациентов обрабатывались в соответствии с медицинскими этическими принципами, описанными в Кодексе поведения для надлежащего вторичного использования человеческой ткани Нидерландской федерации биомедицинских научных обществ (www.federa.org).
1. Подготовьте слайды
- Получите резецированный тканевый материал (любой вид ткани) из отдела патологии после получения разрешения медицинской этической комиссии на использование резецированного материала.
ПРИМЕЧАНИЕ. В текущем эксперименте образцы опухоли предварительной обработки были получены из первичных опухолей орофарингеального рака, диагностированных в Медицинском центре Лейденского университета, Лейден, Нидерланды в период с 1970 по 2011 год, выбранных, как описано выше (n = 162) 13 . Размер ткани ограничивался только требованием для достаточного количества опухолевой ткани для надежного приема 4 микроскопических изображений внутри опухоли. - Закрепите ткань в 4% забуференном формалине в течение как минимум 12 часов. Дегидратируйте ткань в агИзлучением ряда этанола. Промойте его в ксилоле и вставьте его в парафиновый воск с помощью автоматизированного тканевого процессора.
- Вырезать 4-микронные формалин-фиксированные, парафиновые (FFPE) участки ткани на стеклянных слайдах с использованием микротома. Поместите тканевой блок в держатель микротонной ткани, используя стандартные процедуры.
- Отрежьте ленты ткани и положите их на поверхность водяной бани, содержащей деионизированную воду при температуре 45ºC. Используйте слайд, подходящий для иммуногистохимического окрашивания, чтобы выловить участок, поместив слайд в воду непосредственно под секцию. Аккуратно перемещайте скользящий угол под углом, вынимая участок из воды и вставляя его на ползун.
- Дайте сушат в течение ночи при 37 ° C.
- Депарафинируйте слайды FFPE, полностью погрузив их в свежий 100% ксилол, три раза по 5 мин каждый. Пересушите слайды, дважды погрузив их в свежий 100% этанол, 70% этанол и 50% этанол в течение 5 мин каждый,
2. Выполнение поиска Antigen
- Промойте слайды в деионизированной воде в течение 5 мин.
- Разогреть буфер Tris-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) (10 мМ Трис плюс 1 мМ ЭДТА, pH 9,0) до температуры кипения с использованием микроволны. Выполните поиск антигена путем погружения слайдов в предварительно нагретый буфер EDTA и выдерживания буфера при этой температуре в течение 10 минут в микроволновой печи.
ПРИМЕЧАНИЕ. Можно использовать любую микроволновую печь мощностью 900 Вт. - Пусть слайды остывают в буфере в течение 2 часов.
3. Пятновыводители
- Вымойте слайды дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) в течение 5 минут каждый.
- Нарисуйте круг вокруг ткани с помощью гидрофобного пера, чтобы предотвратить разбрызгивание разведенных антител со слайда. Вымойте еще раз с PBS; Это необязательно.
- Инкубируйте ткань с первичными антителами (анти-CD3 1:50, анти-FoxP3 1: 200 и анти-IL-17 1:50), разведенными в 1% мас. / Об.(БСА) в PBS при комнатной температуре в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ. Объем каждого слайда зависит от размера ткани, но обычно он составляет 50-150 мкл. Замените первичные антитела антителами одного и того же класса изотипа с неизвестной специфичностью для негативных контрольных слайдов при том же разведении, что и антитела CD3, CD8 и FoxP3 ( т. Е. Антитело для контроля изотипа кролика Ig, антитело для контроля изотипа мышиного IgG1 и коза IgG-изотипное контрольное антитело). - Промывайте слайды три раза PBS в течение 5 минут каждый.
- Инкубируйте ткань с помощью комбинации флуоресцентно меченых вторичных антител, нацеленных на первичные виды антител и / или изотипы ( то есть 1: 200 осел-анти-козьих IgG Alexa 488, ослик-анти-кроличьи IgG A546 и осел-анти-мышь A647), разведенные в 1% BSA в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Объем на слайд зависит от размера ткани, но обычно составляет 50-150 мкл.- ПослеДобавляя вторичное антитело, держите слайды защищенными от света как можно больше, сохраняя их в темном ящике или обернув короб в алюминиевую фольгу.
4. Крепление и противодействие тканевым слайдам
- Промывайте слайды три раза в PBS в течение 5 минут каждый.
- Смонтируйте слайды с помощью водной анти-увядающей монтажной среды, содержащей ядерное противостояние ( например, DAPI). Проанализируйте слайды с помощью флуоресцентного микроскопа как можно скорее (в течение двух недель). Храните слайды в темноте при 4 ° C до анализа.
5. Проанализируйте окрашенные пятна
- Получите четыре изображения каждого слайда с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом 20-25X. Возьмите изображения в случайных местах по всей области опухоли, включенной в слайд, чтобы захватить репрезентативную фракцию опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ. Следует использовать стандартное увеличение 250X. Любые флуоресцентные oГ лазерного сканирующего микроскопа, при условии наличия фильтров и лазеров, необходимых для визуализации используемых флуорохромов.- Для визуализации Alexa 488 используйте максимум возбуждения 490 и максимум излучения 525; Для визуализации Alexa 546, используйте максимум возбуждения 556 и максимум излучения 573; Для визуализации Alexa 647, используйте максимум возбуждения 650 и максимум излучения 665; И для визуализации DAPI использовать максимум возбуждения 358 и максимум излучения 461.
- Сохраните изображения в виде файлов изображений ( например, jpeg и tiff) в программном обеспечении, доступном пользователю.
- Дискриминация между опухолевым эпителием и областями стромы опухоли на основе ядерной и клеточной формы опухолевых эпителиальных и стромальных клеток после консультации с патологоанатом.
- Чтобы определить общую площадь стромальной поверхности, нарисуйте линию вокруг всей площади (областей), занятой стромальными клетками (а не опухолевыми клетками), и повторитеD площадь поверхности с использованием программного обеспечения для анализа изображений, предоставленного производителем микроскопа.
- Нажмите на вкладку «Оверлей» под изображением; Выберите форму «Закрытая полилиния» и нажмите на нее. Демаркируйте границу между опухолевым эпителием и стромальными полями, щелкнув по области до тех пор, пока не достигнете первой точки; Это обеспечивает меры для этой области.
ПРИМЕЧАНИЕ. После закрытия формы рядом с формой, окружающей площадь поверхности выбранного изображения (A = x μm 2 ), появится число.
- Нажмите на вкладку «Оверлей» под изображением; Выберите форму «Закрытая полилиния» и нажмите на нее. Демаркируйте границу между опухолевым эпителием и стромальными полями, щелкнув по области до тех пор, пока не достигнете первой точки; Это обеспечивает меры для этой области.
- Вычтите эту площадь поверхности из общей площади поверхности изображения (предоставленной в свойствах изображения), чтобы вычислить площадь поверхности эпителия. Исключить сосудистые, некротические и аутофлуоресцентные области, вычерчивая линию вокруг них, регистрируя размер предоставленной области и вычитая это из области эпителиальной поверхности.
- Сохраните все значения площади поверхности в файле электронной таблицы, чтобы рассчитать средние площади поверхности иНомера ячеек на слайд.
- Используя программное обеспечение для анализа изображений, определите, являются ли ячейки одно-, двух- или трехкратно положительными, проверяя флуоресценцию всех четырех каналов.
- Подсчитайте одно-, двух- и трехпозиционные ячейки на каждом изображении с помощью ImageJ.
- Загрузить изображениеJ. Откройте изображение, нажав «Файл» и «Открыть» и выбрав изображение для анализа. Щелкните правой кнопкой мыши на «Point Tool» (красный квадрат в середине четырех строк) и выберите «Multi-Point Tool». Дважды щелкните «Многоточечный инструмент» и подсчитайте количество различных типов ячеек в изображении, выбрав другой номер счетчика для каждого типа ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Подсчитайте все ячейки каждого типа ячейки, как определено наличием одного, двух или всех трех флуоресцентных цветов. Исключить DAPI, так как это ядерное противостояние присутствует во всех клетках и используется для выделения опухолевых клеток из иммунных клеток. Каждый тип ячейки подсчитываетсяИспользуя другой номер счетчика. Подсчитайте номера клеток каждого типа клеток отдельно в опухолевых эпителиальных и стромальных областях, каждый раз выбирая другой номер счетчика. Не учитывайте клетки в кровеносных сосудах и в основном аутофлуоресцентные области. - Запишите количество ячеек, проанализированных в каждом контейнере для каждого изображения в файле электронной таблицы.
- Разделите общее количество клеток для каждого типа клеток по общей площади поверхности эпителия опухоли и проанализирована строма опухоли.
- Загрузить изображениеJ. Откройте изображение, нажав «Файл» и «Открыть» и выбрав изображение для анализа. Щелкните правой кнопкой мыши на «Point Tool» (красный квадрат в середине четырех строк) и выберите «Multi-Point Tool». Дважды щелкните «Многоточечный инструмент» и подсчитайте количество различных типов ячеек в изображении, выбрав другой номер счетчика для каждого типа ячейки.
- Подсчитайте одно-, двух- и трехпозиционные ячейки на каждом изображении с помощью ImageJ.
- Чтобы определить общую площадь стромальной поверхности, нарисуйте линию вокруг всей площади (областей), занятой стромальными клетками (а не опухолевыми клетками), и повторитеD площадь поверхности с использованием программного обеспечения для анализа изображений, предоставленного производителем микроскопа.
6. Статистический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ. Все статистические анализы должны обсуждаться со статистиком для обеспечения качества данных. Для общей статистики используйте руководство по медицинской статистике 14 .
- Проверьте корреляции между частотами ячеек с использованием критерия ранговой корреляции Спирмена.
- Проверьте статистические различия в числах положительных celLs между группами пациентов с использованием теста Wilcoxon Mann-Whitney.
- Протестируйте корреляции между номерами клеток и безрецидивной выживаемостью ( т. Е. Время от постановки диагноза до локального или отдаленного повторения смерти или болезни), разделив пациентов в группах на основании отсечения числа клеток с использованием генерации кривой Каплана-Мейера и log Анализ ранга 15 .
- Проводите многофакторный анализ с использованием анализа регрессии пропорционального риска Кокса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Образцы опухолей предварительной обработки FFPE, полученные из первичных опухолевых опухолей, диагностированных в Медицинском центре Лейденского университета, Лейден, Нидерланды в период с 1970 по 2011 год, отобранных, как описано выше (n = 162), окрашивали с использованием протокола, описанного 13 . Было проанализировано от одного до четырех случайных изображений каждого слайда ( рис. 1 ). Показаны некоторые аутофлуоресцентные клетки, которые можно четко различить по их полному желтому виду. Клетки действительно двойные или тройные положительные только пятна положительные для конкретного антитела при ожидаемой локализации, которая находится на клеточной мембране или ядре, в этом случае. Негативные контрольные слайды не показали какого-либо конкретного окрашивания над автофлуоресценцией фоновой ткани ( рис. 2 и рис. 4 ), подтверждая, что весь сигнал специфичен для целей, распознаваемых первичнымантитела. Было обнаружено, что все образцы опухолей инфильтрированы CD3 + Т-клетками в различной степени. FoxP3 + Tregs всегда выражали CD3 и были одной из основных инфильтрационных популяций Т-клеток. CD3-клетки, экспрессирующие IL-17 (клетки Th17), были незначительной популяцией инфильтрирующих Т-клеток. IL-17 выражается CD3 - клетка была другой обильной инфильтрация популяции клеток. Клетки IL-17 + FoxP3 + содержали не более 0,01% всех клеток FoxP3 + .
Все статистические тесты были двухсторонними, а значения p ниже 0,05 считались значимыми 14 . Представлены корреляции между внутриэпителиальным или общим числом клеток и выживаемостью, поскольку корреляции между стромальным или общим числом клеток и выживаемостью пациентов были схожими. Большое количество инфильтрационных тотальных CD3 + Т-клеток показало тенденцию к корреляции с улучшенной выживаемостью без заболевания (0,086, рис. 5А ) по сравнению с низким количеством Т-клеток ( т. Е. Низшего квартиля). При специфическом изучении пациентов с низким числом клеток IL-17 + большое количество инфильтрационных Т-клеток коррелировало с улучшенной выживаемостью без лечения (p = 0,012, фиг. 5B ). Прогностический эффект инфильтрационных опухолей Т-клеток был потерян в группе пациентов с большим количеством инфильтрационных опухолей клеток ИЛ-17 + (данные не показаны). Таким образом, влияние проникающих в опухоль Т-клеток в OPSCC может быть связано с низким количеством присутствующих клеток IL-17 + .
Рисунок 1: FFPE Oropharyngeal Cancer Tissue, окрашенная четырехцветной флуоресценцией IHC. Представительное изображение иммунофлуоресцентного пятна для CD3 ( A , красный), IL-17 ( B Ong>, зеленый) и FoxP3 ( C , синий), а также объединенное изображение в сочетании с DAPI (серый) ( D ). Две автофлуоресцентные ячейки обозначены стрелками. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Отрицательный контроль для CD3. Репрезентативное изображение опухолевой ткани FFPE орофарингеальной ткани, окрашиваемой, как описано в протоколе, заменяя анти-CD3-антитело антителом контрольного изотипа кролика Ig с неизвестной специфичностью. Не показано окрашивание IgG кролика ( A , красный) в сочетании с окрашиванием для IL-17 ( B , зеленый), FoxP3 ( C , синий) и DAPI ( D , серый).2large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Отрицательный контроль для ИЛ-17. Репрезентативный образ раковой ткани опухоли FFPE, окрашиваемой, как описано в протоколе, заменяя антитело против IL-17 антителом контрольного изотипа козы Ig с неизвестной специфичностью. Не показано окрашивание козы Ig ( B , зеленый) в сочетании с окрашиванием для CD3 ( A , красный), FoxP3 ( C , синий) и DAPI ( D , серый). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
F4: Отрицательное управление для FoxP3. Репрезентативное изображение опухолевой ткани FFPE орофарингеальной ткани, окрашиваемой, как описано в протоколе, заменяя антитело против FoxP3 мышиным IgG1-изотипом контрольного антитела с неизвестной специфичностью. Не показано окрашивание мышиного IgG1 ( C , синий) в сочетании с окрашиванием для CD3 ( A , красный), IL-17 ( B , зеленый) и DAPI ( D , серый). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Кривые выживания Каплана-Мейера. Для пациентов с меньшим числом медианов IL-17 + клеток / мм 2 показаны кривые выживаемости безрецидивной выживаемости для очень низкого ( т. Е. Самого низкого квартиля) по сравнению с большим количеством тотаЛ Т-клеток ( А ) и низкой ( то есть ниже медианы) по сравнению с большим количеством общих Т-клеток ( В ) в общей площади опухоли. Воспроизводится с разрешения журнала Cancer Immunology Immunotherapy 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для описанного протокола одним из наиболее важных шагов является определение правильного разбавления используемых первичных антител. Разведение меченых вторичных антител составляло 1: 200, как рекомендовано изготовителем этих специфичных к Alexa антител. Затем разбавление первичных антител следует определять путем серийного разведения, предпочтительно используя два разных образца предполагаемого типа ткани (в данном случае OPSCC). Оптимальным рабочим разбавлением является разбавление, при котором получается четкий сигнал без фонового шума и отсутствие сигнала для отрицательного контроля при той же концентрации. Модификации могут быть сделаны в отношении типа вторичных антител и используемой монтажной среды в зависимости от типа доступного микроскопа и предпочтения исследователя. Если ожидаемые результаты не достигнуты, мы рекомендуем изучить тип используемых стеклянных слайдов, поскольку некоторые из них, как известно, вызывают проблемы с фоновыми сигналами Для отдельных видов окрашивающих растворов ( например, Perma Blue). Во-вторых, некоторые антигены могут быть нарушены путем использования вызванного тепловым излучением эпитопа. В этом случае исследователь может заменить стадию нагревания буфера другими методами, такими как получение индуцированного ферментом эпитопа. В-третьих, при использовании гидрофобного пера маркировка не должна делаться слишком близко к ткани, так как это предотвратит правильную работу окрашивающего раствора. Что касается количества разделов на выборку и необходимого количества изображений в каждом разделе, то исследователь и конкретный исследовательский вопрос должны определить количество, необходимое для ответа на вопрос исследования с достаточной статистической мощностью. Для нашего анализа мы использовали один раздел для каждого образца и четыре изображения для каждого раздела. Наконец, при использовании иммунофлуоресцентного окрашивания следует проявлять осторожность при использовании лака для ногтей, чтобы запечатать крышки, поскольку алкоголь, присутствующий в растворе для ногтей, может влиять на флуоресцентный сигнал.
Ve_content "> Протокол, описанный здесь, не требует анализа с высокой пропускной способностью. Мы попытались автоматизировать этот шаг, но субъективная интерпретация размера и морфологии ячеек осложняет автоматизацию анализа имеющимися в то время пакетами программного обеспечения. И окрашивание может быть автоматизировано в значительной степени, подсчет ячеек выполнялся вручную.Мы смогли изучить корреляции между изучаемыми и клиническими исходами инфильтрационных Т-клеток, используя описанный протокол. Было обнаружено, что большое количество Т-клеток коррелирует с улучшенной безрецидивной выживаемостью у пациентов с низким количеством внутриутробных IL-17 + не-Т-клеток. Это указывает на то, что IL-17 + не-Т-клетки могут быть связаны с плохим иммунным ответом в OPSCC, что согласуется с корреляцией, описанной между IL-17 и плохим выживанием у онкологических пациентов. 16 .
ImprВ настоящее время коммерчески доступны программные решения для автоматизации этого этапа и в настоящее время заменяют наблюдение и подсчет ручных ячеек, что приведет к более надежным, объективным, воспроизводимым и быстрым результатам.
Кроме того, в настоящее время растет количество коммерческих наборов, позволяющих мультиплексировать флуоресцентные иммуногистохимические маркеры 17 . Это позволит мультиплексировать до 7 различных иммунных маркеров / биомаркеров в сочетании с ядерным контрастом. Тем не менее, мы считаем, что протокол, о котором сообщается здесь, будет по-прежнему более эффективно и легко применяться в лабораториях, где нет сложной и дорогостоящей инфраструктуры, микроскопов и программных пакетов для многоспектрального анализа окраски.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют никакого коммерческого или финансового конфликта интересов.
Acknowledgments
Симоне Пунт поддерживалась грантом UL2010-4801 от Нидерландского онкологического общества. Мы хотели бы поблагодарить всех соавторов оригинальной статьи, что этот протокол JoVE основан на: Эмили А. Дронкерсе, Марии Дж. П. Уэлтерсе, Ренске Годемане, Сенаде Коленовиче, Елизавете Блумене, Питере Дж. Ф. Снейдерсе, Арко Гортере и Сьёрд ван Дер Бург.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
