Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.
Abstract
Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) war die Technik der Wahl, um die Struktur und die Funktion von elektrogenen Membranproteinen zu untersuchen, bei denen Echtzeitmessungen von Fluoreszenz und Strömen gleichzeitig über lokale Umlagerungen und globale Funktion berichten. Während hochauflösende Strukturtechniken wie Kryo-Elektronenmikroskopie oder Röntgenkristallographie statische Bilder der interessierenden Proteine liefern, liefert VCF dynamische Strukturdaten, die es uns ermöglichen, die strukturellen Umlagerungen (Fluoreszenz) mit dynamischen Funktionsdaten (Elektrophysiologie) zu verknüpfen. Bis vor kurzem beschränkte die Thiol-reaktive Chemie, die für die ortsgerichtete fluoreszierende Markierung der Proteine verwendet wurde, den Anwendungsbereich des Ansatzes, da alle zugänglichen Cysteine, einschließlich endogener, markiert werden. Es war also erforderlich, Proteine aus endogenen Cysteinen zu konstruieren. Die Etikettierung war auch auf Websites beschränkt, die von der extrazellulären zugänglich warenSeite. Dies änderte sich mit der Verwendung von fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren (fUAA), um spezifisch eine kleine fluoreszierende Sonde als Reaktion auf die Stop-Codon-Suppression unter Verwendung eines orthogonalen tRNA- und tRNA-Synthetasepaar 2 zu integrieren. Die VCF-Verbesserung erfordert nur ein zweistufiges Injektionsverfahren der DNA-Injektion (tRNA / Synthetase-Paar), gefolgt von einer RNA / fUAA-Co-Injektion. Nun ist die Etikettierung sowohl intrazellulärer als auch begrabener Standorte möglich, und die Verwendung von VCF hat sich erheblich erweitert. Die VCF-Technik wird dadurch attraktiv für das Studium einer breiten Palette von Proteinen und - noch wichtiger - ermöglicht die Untersuchung zahlreicher zytosolischer Regulationsmechanismen.
Introduction
Über 200 unnatürliche Aminosäuren verschiedener chemischer und physikalischer Eigenschaften wurden in Proteine in E. coli , Hefe und Säugetierzellen genetisch eingearbeitet 3 . Die unnatürliche Aminosäure wird als Reaktion auf ein spezifisches Stopcodon über ein orthogonal konstruiertes tRNA / Synthetasepaar eingebaut. Der genetische Ansatz zur Veränderung von Proteinen hat wertvolle Einblicke in die Proteinstruktur und -funktion gegeben. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Spannungs-Klammer-Fluorometrie (VCF) in Kombination mit einer fluoreszierenden UAA vor.
In VCF ermöglicht die gleichzeitige Beobachtung von Funktionsdaten und strukturellen Umordnungen, die um die Fluoreszenzsonde (~ 5 Å) lokalisiert sind, eine dynamische Information mit Millisekundenauflösung 1 zu erhalten. Die fluoreszierenden Sonden verändern ihren Abschreckzustand bei lokalisierter Bewegung des Proteins. Eine Bewegung von nur 1-2 Å reicht aus, um zu signifikanten Veränderungen in der Fluoreszenz zu führenIntensität 4 Nach der Identifizierung der interessanten Stelle im Zielprotein wird die Stelle durch Punktmutation mutiert. Klassisch war der Rest zu einem Cystein mutiert worden, während jetzt ein Bernstein-Stop-Codon (TAG) für den genetischen fUAA-Einbau eingeführt wird. Das Protein wird dann in vitro transkribiert.
Während andere Expressionssysteme ( z. B. Säugetierzellen) 5 , 6 , 7 verwendet werden können, sind Xenopus- Oozyten aufgrund ihrer größeren Größe für Strukturfunktionsstudien vorzuziehen, was zu einer leichteren Manipulation und einer höheren Fluoreszenzintensität (mehr Fluorophoren) führt, Zu-Rausch-Verhältnis Darüber hinaus haben Xenopus- Oozyten einen geringen Hintergrund aus endogenen Proteinen 2 , 8 , und die dunkle Pigmentierung auf dem Tierpol schützt vor der Hintergrundfluoreszenz von tEr zytosol Die Xenopus- Oozyten werden chirurgisch entfernt und DNA, die für das für die fUAA spezifische orthogonale tRNA / tRNA-Synthetase-Paar kodiert, wird in den Kern der Oozyten injiziert. Nach einer 6-24 h Inkubationszeit wird die Protein-RNA mit dem fUAA in das Cytosol der Oozyten co-injiziert, gefolgt von einer 2-3-tägigen Inkubationszeit. Um eine Beschädigung der fUAA (Photobleichung) zu verhindern, müssen die Verfahren einschließlich Anap unter rotem Licht durchgeführt werden, um eine Fluorophor-Erregung zu vermeiden.
Oozyten werden auf einem aufgeschnittenen Oozytenspannungsklemmenaufbau untersucht, der auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop montiert ist und elektrische Strom- und Fluoreszenzänderungen gleichzeitig aufgezeichnet werden 9 , 10 . Alternativ können zwei Elektrodenspannungsklemmen 1 oder Patch-Clamp-Konfigurationen 11 verwendet werden. Die Fluoreszenz wird durch entsprechende Wellenlängen mit niedrigem RMS-Rauschen angeregt Emission, die unter Verwendung einer Photodiode aufgezeichnet wurde, die mit einem Verstärker mit hoher Verstärkung verbunden ist.
Es gibt mehrere Vorteile der Verwendung von fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren (fUAAs) in der Spannungskammer-Fluorometrie. Einer ist Zugang zur cytosolischen Seite der Membranproteine; Hier befinden sich viele regulatorische Prozesse ( zB Ca 2+ - oder Nukleotidbindungsstellen, schnelle und geschlossene Inaktivierung von spannungsgesteuerten Ionenkanälen, Porenöffnung, Modulkopplung). Alle diese Prozesse sind nun für die fluoreszierende Markierung zugänglich.
Ein weiterer Vorteil ist die geringe Größe der Sonde, die zu einer geringeren Störung des Proteins führt. Bisher wurden zwei orthogonale tRNA / tRNA-Synthetasepaare für fUAAs 12 , 13 entwickelt, wobei 3- (6-Acetylnaphthalin-2-ylamino) -2-aminopropansäure (Anap) die einzige FUAA ist, die in Xenopus- Oozyten verwendet wurde 2 ,"Xref"> 8 Anap ist ein umweltfreundlicher Fluorophor mit einem Molekulargewicht von 272,3 g / mol und ist nur etwas größer als Tryptophan 12 ( Fig. 1A, 1B ). Aufgrund ihrer geringen Größe werden wahrscheinlich weniger sterische Effekte durch das Fluorophor eingeführt, verglichen mit herkömmlichen Fluorophoren, die über einen Linker (typischerweise mehr als 500 g / mol) befestigt sind. Darüber hinaus befindet sich im Falle von Anap das Fluorophor näher an dem Proteinrückgrat als die an Cysteine gebundenen, und folglich untersucht Anap mehr lokalisierte Umlagerungen. Schließlich ist die Entfernung von endogenen Cysteinen in konventionellem VCF, um eine ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, in UAA-VCF nicht mehr erforderlich und verlässt daher (i) die Proteine in (fast) ihrem nativen Zustand und (ii) erlaubt es, VCF anzuwenden Um eine breitere Palette von Proteinen zu untersuchen, in denen die Funktion durch Cysteinsubstitution verändert werden kann.
Abbildung 1 : Anap- und Fluoreszenz-Spektren. ( A ) Chemische Struktur von Anap. ( B ) Normalisiertes Absorptionsspektrum und Emissionsspektren für 1 nM Anap, was die Empfindlichkeit der Anap-Fluoreszenz gegenüber der Lösungsmittel-Hydrophobie zeigt. Emissionsspektren wurden durch Anregung bei 350 nm erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ein Nachteil bei der Verwendung von fluoreszierenden UAAs besteht darin, dass eine heterogene Population von Proteinen aus der Stop-Codon-Durchlesung, der Translationsneubinierung, den C-terminalen trunkierten Proteinen oder dem Übersprechen mit endogener Aminoacylierung resultieren kann, wenn die Menge an aminoacylierten tRNAs knapp ist. Solche Leck-Expression sollte immer in Abwesenheit von fUAA und dem tRNA / tRNA-Synthetase-Paar überprüft werden. Wir haben uns mit der Frage befasstLationaler Reinitiation und deren Umgehung für N-terminale Einführungsstellen zuvor 14 . Wenn jedoch die fUAA-, tRNA- und tRNA-Synthetase in gesättigten Mengen vorliegen, bleibt nur eine geringe Wahrscheinlichkeit der Leck-Expression bestehen.
Der wesentliche prozedurale Unterschied zwischen fUAA-VCF und konventionellem VCF ist die Injektion und Handhabung der Oozyten; Die Injektion von DNA, die für die tRNA und die tRNA-Synthetase (pAnap) kodiert, folgt der Einführung von Anap, die entweder mit der Protein-mRNA co-injiziert wird oder alternativ der Inkubationslösung als Acetoxymethyl (AM) -ester zugesetzt wird.
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Protocol
Froschmanipulationen wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Richtlinien durchgeführt und wurden vom Ethikkomitee (CDEA, Protokoll Nr. 15-042) der Universität von Montréal genehmigt.
1. mRNA Vorbereitung für fUAA Incorporation
- Wählen Sie eine interessante Stelle im Protein, bei der Konformationsänderungen auftreten werden. Wählen Sie eine Aminosäure in dieser Region, um die fUAA zu substituieren.
HINWEIS: Die Wahl der Position basiert auf den strukturellen Umbuchungen, die erwartet werden. Wenn eine hochauflösende Struktur existiert und eine Hypothese der erwarteten Bewegungen, sollte die Anap so platziert werden, dass sich die chemische Umgebung ändern wird; Dies könnte entweder eine Änderung der Dielektrizitätskonstante (hydrophobe versus hydrophile Umgebung) oder eher eine Abschreckung durch eine andere Aminosäure sein. Die besten Quencher sind Tryptophane. Anap sollte in Kontakt mit dem Quencher in einem Zustand (Überlappung der van-der-Waals Radien) und frei davon indas andere. Wenn keine hochauflösenden Strukturen oder Modelle existieren, müsste man die interessierende Region scannen. In jedem Fall ist es ratsam, mehrere nahe gelegene Orte auszuwählen, um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens von Expressions- und Fluoreszenzsignal zu erhöhen. Um sterische Effekte während der Proteinreifung und / oder -funktion zu minimieren, kann man große und aromatische Aminosäuren (Phe, Trp, Tyr) ersetzen. Die Autoren haben jedoch erfahren, dass das Scannen eines interessierenden Bereichs für die fUAA-Insertion unabhängig von der substituierten Aminosäure produktiver ist. - Legen Sie ein Amber Stop Codon (TAG) an der ausgewählten Stelle mit site-directed Mutagenese 15 . Stellen Sie sicher, dass das Protein von Interesse nicht auf einem Bernstein-Stop-Codon (TAG) endet. Wenn ja, mutieren Sie zu einem anderen (Ocker oder Opal Stop Codon). Amplifizieren, isolieren und sequenzieren die DNA. Erhalten Sie Protein-mRNA mit in vitro Transkription 16 und speichern Sie die mRNA bei 20 ° C oder 80 ° C. </ Ol>
- Chirurgisch erhalten Stage V oder VI Oozyten aus Xenopus laevis Frösche und defolliculieren mit Kollagenase wie zuvor beschrieben 17 .
- Anästhesieren von Fröschen mit einem geeigneten Anästhetikum nach dem zugelassenen Tierprotokoll (hier: 3-Aminobenzoesäureethylester). Wenn sie nicht auf eine sanfte Prise auf eine Zehenspitze reagieren (Verlust des Rückzugsreflexes), dann werden sie für eine Operation in geeigneter Weise betäubt.
- Sofort die Frösche aus der Narkosemittel entfernen und die Haut mit frischem Wasser gründlich ausspülen. Diese Spülung wird verhindern, dass das Tier in tieferen Niveaus der Anästhesie fällt, indem es unabsorbierte Chemikalien von der Hautoberfläche entfernt.
- Eierstockknoten von einer Seite chirurgisch entfernen und die Knoten sorgfältig mit zwei Zangen öffnen. Inkubieren und rühren die Oozyten in "Standard-Oozyten-Lösung" (SOS), die 1% (w / v) Collagenase für 20-30 min enthältZu defollulieren Waschen Sie dreimal mit SOS-Lösung.
- Wählen Sie große und gesunde Oozyten einzeln und inkubieren sie in Barths Lösung, ergänzt mit Antibiotika (100 U / ml Penicilin, 100 μg / ml Streptomycin, 10 mg / 100 ml Kanamycin) und 5% Pferdeserum bei 18 ° C für mindestens 4 h vor der Injektion .
ANMERKUNG: Nach 2 - 4 Operationen mit einer Verzögerung von 4 Monaten dazwischen wird Xenopus laevis durch verlängerte (> 1 h) Inkubation mit 3-Aminobenzoesäureethylester euthanasiert.
- Für die nukleare Injektion von DNA, bereiten Sie eine lange und dünne Injektion Spitze, um in der Lage, den Kern zu erreichen und um eine Beschädigung der Oozyte zu vermeiden. Füllen Sie die Injektionsspitze mit Öl und montieren Sie sie auf dem Nanoinjektor Gerät.
- Installieren Sie den Nano-Injektor unter einem Stereomikroskop und verwenden Sie Pinzette, um das Ende der Spitze zu brechen. Öl auswerfen, bis keine Luftblasen im Ende der Spitze eingefangen sind.
- 1 μl 0,1 μg /# 181; L pAnap in nukleasefreiem Wasser, enthaltend NaOH (1% 1 N NaOH) auf einem Stück Parafilm unter einem Stereoskop und füllen die Injektionsspitze mit der DNA.
- Übertragen Sie 40 Oozyten auf eine mesh-beschichtete Injektionsschale mit Barth-Lösung, ergänzt mit Antibiotika.
HINWEIS: Um die mesh-beschichtete Injektionsschale herzustellen, schneiden Sie ein entsprechendes Stück von 800 μm Nylon-Mesh aus, um eine Polystyrol-Petrischale zu füllen. Fügen Sie Chloroform in die Mitte und legen Sie dann das Netz auf die Oberseite. Halten Sie das Netz flach, bis der Plastik sitzt. - Wenn sich der Oozytenkern im tierischen (dunklen) Pol befindet, zielen Sie die Injektionsspitze in die Mitte des Tierpols und schlagen so, dass die Spitze in der Nähe des Zentrums der Tierhalbkugel (oder 2-3x der Tiefe im Vergleich zur RNA-Injektion) liegt ). Spritzen Sie 9,2 nL pAnap in den Kern jeder Oozyte ein. Die dünne Spitze und das kleine Einspritzvolumen können zu einer unregelmäßigen Injektion oder einer blockierten Spitze führen. Gelegentlich prüfen, ob die Injektion durch Einspritzen in die Luft arbeitet.
HINWEIS: Ob die DNA richtig in den Kern injiziert wird, ist unsicher. Erwarten Sie daher 10 - 40% der Oozyten, um das tRNA / Synthetase-Paar nicht zu exprimieren. Siehe Diskussion zur weiteren Ausarbeitung. - Inkubieren Sie die Oozyten in 2 ml Barth-Lösung, ergänzt mit Antibiotika und 5% Pferdeserum (HS) bei 18 ° C für 6-24 h, um eine robuste Expression von anap-spezifischen tRNAs und tRNA-Synthetasen zu ermöglichen.
HINWEIS: Die DNA-Inkubationszeit kann einige Tage vor der RNA-Injektion dauern, aber sie erhöht die Expression nicht. - Bereiten Sie den Nano-Injektor für die RNA-Injektion vor (wie in Schritt 2.2, aber die Injektionsspitze muss nicht so dünn sein wie bei der DNA-Injektion). Arbeit nur unter rotem Licht von diesem Punkt zu verhindern, dass Photobleaching der Anap.
- Mischen Sie 1 μl 1 mM Anap mit 1 μl 1-2 μg / μL mRNA direkt auf ein Stück Parafilm und füllen Sie die Injektionsspitze mit der gemischten Lösung. Unkraut knapp unterhalb der Membran im pflanzlichen(Hellen) Pol und injizieren 46 nL in jeder pAnap-injizierten Oozyte.
HINWEIS: Die erforderliche mRNA-Konzentration hängt von dem Protein von Interesse ab. - Inkubieren Sie die Oozyten, die vor Licht geschützt sind, in einer Schachtel oder in Aluminiumfolie gewickelt, in Barths Lösung ergänzte Antibiotika und 5% Pferdeserum bei 18 ° C für 2-3 Tage. Tauschen Sie täglich mit frischer Barth-Lösung aus und entfernen Sie tote Oozyten, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Installieren Sie die aufgeschnittene Oozytenspannungsklemme wie oben beschrieben 18 .
- Montieren Sie das elektrophysiologische Aufnahmesystem auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop, indem Sie die Aufzeichnungskammer auf einen Schieber einbauen, der es ermöglicht, es zwischen dem Standard-Stereoskop zu bewegen, um die Oozyte und das Mikroskop zu platzieren, um die Fluoreszenzmessungen durchzuführen (Abbildung 2c ).
HINWEIS: Die Geometrie der Kammer für aufgeschnittene Oozyten ist nicht geeignet, den normalen Tra zu verwendenLicht für die Beleuchtung während der Manipulation. Daher wird eine "Schwanenhals" Halogenlampe mit rotem Filter verwendet, um seitlich von oben zu beleuchten. Der Kondensator des Mikroskops kann entfernt werden, um Platz für die Elektrophysiologiekammer zu senken. - Verbinden Sie ein Photodioden-Erkennungssystem mit dem C-Mount-Ausgang des Fluoreszenzmikroskops (Abbildung 2a ). Verbinden Sie die Photostromauslesung mit einem zweiten Eingangskanal im digitalen Signalprozessor (DSP, Analog / Digital - Digital / Analog - Wandler).
- Verwenden Sie eine 100 W, 12 V Halogenlampe als Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung.
HINWEIS: Alternativ können Hg-Brenner verwendet werden, müssen aber in der Intensität reduziert werden, um ein zu schnelles Photobleichen während der Aufnahmen zu verhindern. LED-Beleuchtung wird nur empfohlen, wenn die jeweiligen LEDs im Erregungsbereich ( zB ~ 350 nm für Anap) eine signifikante Intensität aufweisen. Die meisten weißen LEDs erreichen nicht weit in das UV-Spektrum. - InsErt einen elektrisch gesteuerten Verschluss zwischen Anregungslichtquelle und Mikroskop und verbinden seine Steuerung (typischerweise TTL-Puls) mit einem digitalen Ausgang des DSP. Zeit der TTL-Puls in der Aufnahmesoftware (siehe Herstellerdokumentation), so dass der Verschluss vor Beginn der Aufnahme ~ 100 ms öffnet. Auf diese Weise stört jede Vibration während des Öffnungsvorgangs die Aufnahme nicht. Die Zeit hängt von der Geschwindigkeit und der Vibration des Verschlusses ab. Beenden Sie den Puls 5ms vor dem Ende der Aufnahme, wie in Abbildung 4 gezeigt . Auf diese Weise wird auch der Wert für die Gesamtfluoreszenz aufgezeichnet.
- Setzen Sie einen geeigneten Filterwürfel (Erregungsfilter, dichroitischer Spiegel und Emissionsfilter) in den Filterwürfelrevolver ein. Für Anap verwenden Sie Ex: 377/50 nm Bandpass, dichroitische 409 nm Langpass und Em: 470/40 nm Bandpass.
- Befolgen Sie die Vorbereitungsschritte für die aufgeschnittene Oozytenspannungsklemme, wie zuvor beschrieben und visualisiert 18 (Agarbrückenpräparation, Montage der Oozyte, Saponinpermeabilisierung). Allerdings arbeiten unter rotem Licht zu jeder Zeit zu vermeiden, Bleichen der Fluorophor vor Aufnahmen. Beim Aufstellen der Oozyte ist darauf zu achten, dass der Tierpol nach oben zeigt. Die Pigmentierung unter der Tierpolmembran schützt vor der aus dem Cytosol stammenden Selbstfluoreszenz und reduziert daher die Hintergrundfluoreszenz.
- Schieben Sie die Kammer auf das Mikroskop und fokussieren Sie mit einem 4X-Objektiv.
- Die Oozyte mit der spannungsempfindlichen V1-Elektrode (3 M KCl) auflösen, auf das 40X-Wasser-Immersion (NA 0.8 - 0.9) -Objekt umschalten. Konzentriere dich auf den nach oben weisenden Tierpfosten.
- Schalte das rote Licht aus. Wählen Sie den richtigen Filterwürfel aus, indem Sie den Filterwürfelrevolver drehen und der optische Ausgangsport mit der Photodiode verbunden ist. Schalte den Heiligenschein einEn-Lampe mit höchster Intensität und schalten Sie kurz den Auslöser für 2-5 s offen, um die Hintergrund-Fluoreszenzintensität zu lesen, die von der Eizelle stammt. Bei der beschriebenen Einstellung sollte der Wert etwa 50-200 pA für Anap sein.
- Schalten Sie die Klemme ein, drehen Sie den Bad- / Schutzschalter auf aktiv und stellen Sie das Membranpotential (V1 - V2) auf das Befehlspotential ein, indem Sie den Drehknopf auf der Kopfstufe drehen.
- Wählen Sie Haltepotential, Schrittprotokoll, Anzahl und Länge der Impulse etc. in der Aufnahmesoftware. Aufzeichnung von spannungsabhängigen Strömen und Anap-Fluoreszenz-Intensitäten.
- Um zwei Standorte im selben Protein gleichzeitig zu überwachen, mutieren Sie eine extrazelluläre und zugängliche Aminosäure in Cystein und entfernen Sie andere Cysteine, um eine spezifische Markierung mit Thiol-Chemie zu gewährleisten.
- Führen Sie Schritt 2.1-2.5 aus.
- Vor VCF-Aufnahmen inkubieren Oozyten in 5 μM TMR-Maleimid in Markierungslösung für 15 min (oder andere Farbstoffe)Mit nicht überlappenden Spektren im Vergleich zu Anap).
- Die Oozyten mit Etikettierlösung dreimal waschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
- Führen Sie Schritt 4.1-4.6 aus.
- Setzen Sie einen geeigneten Filterwürfel für TMR (Erregungsfilter, dichroitischer Spiegel und Emissionsfilter) in den Filterwürfelrevolver ein. Wechseln Sie in den TMR-Filterwürfel, indem Sie den Filterrevolver drehen.
- Lesen Sie die Hintergrundfluoreszenz für TMR wie für Anap in Schritt 4.4 beschrieben.
HINWEIS: Die Etikettierung mit Thiol-Chemie führt zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz durch unspezifische Markierung in der Membran. Daher kann die TMR-Hintergrundfluoreszenz den Verstärker (> 2.000 pA) sättigen. In diesem Fall nicht die Lichtintensität verringern, sondern einfach die Hintergrundfluoreszenz subtrahieren, indem der Photodiode ein Offsetstrom hinzugefügt wird. In handelsüblichen Systemen wird das "Sample-and-Hold" -Funktion auf dem Detektorsystem verwendet. Beachten Sie den Hintergrund-Fluoreszenzwert (mit einem 10X Neutral-Dichte-Filter) in einem Labor jAllnal, da dieser Wert nicht aufgezeichnet wird (Sättigung). - Aufzeichnung von spannungsabhängigen Strömen und TMR-Fluoreszenzintensitäten gleichzeitig wie in Schritt 4.6.
2. Oozytenvorbereitung und Injektion
Abbildung 2 : Darstellung der DNA- und RNA-Injektion in Xenopus -Oozyten zur Anap-Inkorporation.
Zuerst wird pAnap in den Kern der Xenopus- Oozyte injiziert ( 1 ). Nach 6-24 h werden Anap und Kanal-RNA in den Pflanzenpol ( 2 ) coinjiziert. Anap wird mit der tRNA, die ein Amber-Stop-Anti-Codon trägt, orthogonal aminoacyliert, durch die Aminosäure-tRNA-Synthetase, die durch pAnap codiert wird. Auf diese Weise werden die aminoacylierten Anap-tRNAs vom Ribosom am eingesetzten Bernstein-Stop-Codon in der Channe erkanntL RNA, was zur Unterdrückung des Stopcodons und der Insertion von Anap führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. VCF-Setup
Abbildung 3 < / Strong> : VCF-Setup. ( A ) Seitenansicht des VCF-Setups zeigt den Lichtweg im Mikroskop. Der Filterwürfel enthält einen Erregungsfilter, einen dichroitischen Spiegel und einen Emissionsfilter. ( B ) Ausgewählte Oozytenkammerabmessungen sind 3,4 cm für den oberen Kammerradius (1), 5,5 cm für die untere Kammerlänge (2), 1,4 cm für die untere Kammerbreite (3) und 1,7 cm für die mittlere Kammerbreite (4). ( C ) Vorderansicht des VCF-Setups. Das erste Okular auf der linken Seite ist für die Montage der Oozyte in der abgeschnittenen Spannungskammer und für die Permeabilisierung. Dann wird die Kammer unter dem Mikroskop im zweiten Okular nach rechts geschoben. Hier wird die V1-Elektrode unter Verwendung des 4X-Objektivs in die Oozyte eingeführt und die Fluoreszenz wird mit dem Wasser-Immersions-40X-Objektiv aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Zweifarbige VCF
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Representative Results
Fig. 4 zeigt ein Beispiel von VCF-Aufzeichnungen, die aus einer Oozyten-Expression von Shaker-Kanälen mit schneller Inaktivierung entfernt wurden (IR), L382stop-W434F in Gegenwart von pAnap und Anap. Die W434F-Mutation blockiert die ionischen Kaliumströme, was es ermöglicht, die transienten Gatterladungsverschiebungen (Torströme) zu messen. Die gleichzeitige Aufzeichnung von Torströmungen (obere Spur) und Anap-Fluoreszenzintensitätsänderungen (untere Spur) bei Depolarisation zeigen die erfolgreiche Einbindung von Anap in die Position L382. Hier befindet sich Anap auf der Unterseite jeder der vier S4-Transmembran-Helices, die sich während der Aktivierung bewegen (L382) und berichten daher über intrazelluläre lokale Umlagerungen. Eine Fluoreszenzänderung kann durch Lösungsmittelrelaxation (Umgebungspolaritätsänderungen) und / oder Abschrecken durch andere Aminosäuren verursacht werden 4 . Beide Mechanismen sind ein Ergebnis von relativen Proteinumlagerungen. Fig. 5 zeigt Anap- und TMR-Fluoreszenzsignale unter Verwendung von Schrittprotokollen, die aus derselben Oozyte erhalten wurden. Durch die Zugabe der A359C-Mutation in den L382stop-W434F-Hintergrund und die Markierung mit TMR-Maleimid ist es mit der beschriebenen Technik möglich, Echtzeit-Bewegungen in verschiedenen Regionen im selben Protein zu untersuchen. In diesem Fall prüft TMR die Bewegung der oberen S4-Helix (A359C), während Anap die Bewegung des Bodens von S4 (L382) untersucht. Aus dem zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzänderung kann man durch die Analyse der Kinetik dynamische Informationen des durch die Fluoreszenz überwachten Übergangs abrufen ( Abb. 5A, 5B ). Darüber hinaus wird die Fluoreszenzspannungsbeziehung (FV) erhalten, indem die stationäre Fluoreszenzintensität gegen die Spannung aufgetragen wird ( 5C ). Die FV spiegelt das Gleichgewicht zwischen den Belegungen der überwachten Zustände wider, die im Falle von Ionenkanälen v folgen könntenOltage Sensorbewegung oder Öffnung der zentralen Pore. Durch die Verwendung von fUAAs ist es nun möglich, die FV aus dem Inneren des Kanals zu erhalten. Abbildung 5C zeigt, dass der obere Teil von S4 (TMR) die gleiche Spannungsabhängigkeit wie der untere Teil von S4 (Anap) hat.
Das Signal-Rausch-Verhältnis hängt hauptsächlich von der relativen Fluoreszenzänderung (dF / F) und der Gesamtfluoreszenz ab. Die dF / F definiert die Signalgröße, während das Rauschen durch die Gesamtfluoreszenz aufgrund der Quantenfarbe des Lichts (Poisson-Rauschen) bestimmt wird. Die dF / F hängt vom Zustand der Abschreckung in den verschiedenen Zuständen des Proteins und der Belegung der Zustände ab ( zB der offenen Wahrscheinlichkeit). Die Gesamtfluoreszenz umfasst die Fluoreszenz aus der spezifischen Markierung und aus unspezifischer Hintergrundkennzeichnung. Die Gesamtspezifische Fluoreszenz wird durch die Anzahl der exprimierten Proteine und die Quantenausbeute des Fluorophors bestimmt. Die große Fläche der XeNopus-Oozyten ist vorteilhaft, weil sie die Anzahl der beitragenden Proteine erhöht.
Anaps Quantenausbeute, dh die Anzahl der pro Anregungszyklus emittierten Photonen oder die "Helligkeit" des Fluorophors, ist geringer, was zu einer niedrigeren Gesamtfluoreszenzintensität und damit zu einem niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnis führt. Gleichzeitig führt die Anap-Markierung zu einer geringen Hintergrundfluoreszenz, so dass das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis (dF / F) für Anap höher ist ( 5A, 5B ).
Ein wichtiges Kontrollversuch besteht darin, die Expression in Abwesenheit von Anap zu überprüfen, um die Wirkung der Leck-Expression zu beurteilen. Es wurde bisher gezeigt, dass isolierte Spannungssensor-Domänen (iVSDs, 1-382), denen der S4-S5-Linker und die Pore fehlen, funktionell ausgedrückt werden. Daher, in Abwesenheit von Anap, L382stop-W434F Kanäle als iVS auszudrückenDs wie in Abbildung 6 gezeigt . Der Ausdruck von Volllängenkanälen mit Anap hat wenig oder keine iVSD-Ströme, während abgeschnittene Kanäle in Abwesenheit von Anap starke iVSD-Ströme aufweisen. Die Anwesenheit solcher C-terminalen verkürzten Proteine hängt von der Position des eingesetzten Stopcodons ab und sollte bei der Arbeit mit unnatürlichen Aminosäuren immer berücksichtigt werden. Kontrollversuche ohne Anap erlauben die Überprüfung, ob eine heterologe Population in Experimenten mit Anap vorhanden ist.
Abbildung 4 : Gleichzeitige Gating-Strömungen und Fluoreszenz-Änderungen von einer Cytosol-Protein-Oberfläche, die mit VCF erhalten wurde. Gating-Ströme, die mit einem P / 4-Subtraktionsprotokoll erhalten wurden, und gleichzeitiges Aufzeichnen von Fluoreszenz bei Depolarisation. Anap wird in Shaker an Position L382 aufgenommen, was zu vo führtSpannungsabhängige Fluoreszenzintensitäten vom intrazellulären Ende der S4-Helix. Die maximale Fluoreszenzintensität wird mit "F" bezeichnet und die Fluoreszenzänderung wird mit "dF" bezeichnet. Der Stern am Ende der Fluoreszenzänderung markiert das Schließen des elektrischen Verschlusses (die Öffnung des Verschlusses, bevor der Puls nicht gezeigt wird). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5 : Zweifarbige VCF mit Anap und TMR. ( A ) Anap und ( B ) TMR-Fluoreszenzänderungen, die aus einer Shaker A359C-L382Anap-W434F exprimierten Oozyten, die mit TMR-Maleimid markiert sind, erhalten wurden. ( C ) Fluoreszenzänderungen von A und B sind gegen das Membranpotential (FV) aufgetragen. Daten zeigen Mittelwert7, SD mit n = 5 Oozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6 : C-terminale abgeschnittene Shaker-Kanäle werden in Abwesenheit von Anap ausgedrückt. Isolierte Spannungssensor-Domänen (iVSD, 1-382) werden mit zH4IR-L382stop-W434F in Abwesenheit von Anap ausgedrückt, was zu iVSD-Strömen bei hyperpolarisierten Potentialen führt. In Gegenwart von Anap konkurriert jedoch die Volllängen-Shaker-Expression mit der iVSD-Expression, und als Ergebnis ist die Menge an iVSD geringer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die in vivo- Aminoacylierung von tRNAs, die kontinuierlich zusammen mit der tRNA-Synthetase transkribiert werden, ermöglicht es, hohe Expressionsniveaus für Fluoreszenzmessungen zu erhalten. Für eine effiziente fUAA-Inkorporation ist es entscheidend, dass pAnap korrekt in den Zellkern injiziert wird. Aufgrund der Ungewissheit der genauen Lage des Kerns wird erwartet, dass 10-40% der DNA-Injektionen versagen, was zu nicht-exprimierenden (oder leckexprimierenden) Oozyten führt. Daher ist es wichtig, den Ausdruck in Abwesenheit von Anap und pAnap zu überprüfen, um aktuelle Phänotypen und Größen im Falle von Leckkanälen zu identifizieren. Auf diese Weise ist es möglich, Oozyten mit geeigneten DNA-Injektionen (hoher Expression, Anap dF, Volllängenstrom-Phänotyp) von denen mit fehlgeschlagenen DNA-Injektionen zu unterscheiden (keine oder niedrige Expression, kein Anap dF, abgeschnittener aktueller Phänotyp falls vorhanden). Im Falle eines plötzlichen Mangels an Ausdruck mit Anap, bereiten Sie eine neue Anap Aliquot als Anap ist nicht stabil für längere periOds in wässriger Lösung (bis zu 1 Jahr).
Die Verwendung von FUAAs mit VCF ist durch die Wahl der Fluorophore begrenzt, da jede neue fUAA ein orthogonales tRNA / tRNA-Synthetase-Paar erfordert, das entwickelt werden soll. Bisher existiert nur Anap als funktionelle fUAA, um über die Proteindynamik in Oozyten zu berichten. Hohe Expressionsniveaus sind erforderlich, um Anap-Fluoreszenz-Veränderungen nachzuweisen, und wir schätzen eine minimale Proteindichte von 2 - 4000 μm - 2 in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit der Stelle. Zum Beispiel können Anap-Fluoreszenz-Änderungen bei nur 0,2 mS Ionenströmen für V234Anap (2,4 x 10 9 Kanäle pro eingespannter Fläche in abgeschnittener Spannungsklemme) gesehen werden, während 5 nC von Gating-Strömen (1 x 10 6 Kanäle Kanäle pro geklemmt Bereich in abgeschnittener Spannungsklemme) sind für A391Anap-W434F erforderlich. Da Shaker ein Tetramer ist, hat es vier Anap-Moleküle pro Kanal. Folglich benötigen Dimere oder monomere Proteine wahrscheinlich höhere Expressionsniveaus. FurtheDie Bleichkinetik von Anap, die sowohl von der chemischen Umgebung als auch von der Lichtintensität abhängt, sollte überprüft werden, um sicherzustellen, dass genügend Intensität für das gesamte Protokoll bleibt. Wir fanden, dass die Kinetik im 1-Sekunden-Zeitbereich noch mit einem typischen Spannungsschrittprotokoll aufgezeichnet werden kann. Das Bleichen kann durch Verringerung der Lichtintensität minimiert werden (langsame Prozesse können mehr gefiltert werden) oder Hinzufügen von Triplet-Zustands-Quenchern wie Trolox (bekannt aus Einzelmolekül-Fluoreszenz-Studien). Wenn LED-Anregung verwendet wird, kann man auch ein Protokoll aufstellen, um die Fluoreszenzintensität alle 100 ms für 5-10 ms zu "proben", wodurch die Erregungszeit 10-20X effektiv reduziert wird.
Die Spannungsklemmen-Fluorometrie war eine leistungsstarke Methode, um die Strukturfunktion der Membranproteine zu untersuchen, und sie wurde mit einer Vielzahl von Fluoreszenztechniken kombiniert, einschließlich markierter Liganden 11 , Lanthanid-basierter und Förster Resonance EnergY Transfer (LRET / FRET) 20 , 21 und Übergangsmetall FRET 22 . Allerdings behinderten die Beschränkungen der Etikettierungstechniken die weit verbreitete Anwendung. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine, die in vielen anderen Anwendungen von unschätzbarem Wert sind, sind zu groß, um eine allgemeine Alternative zu bieten. Sie wurden erfolgreich im C-Terminus 23 und der Ligandenbindungsdomäne von BK Ca- Kanälen 24 eingesetzt, können aber nicht in "Hotspots" des Proteins eingeführt werden. Die Einführung von fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren in das Feld öffnete die Technik auf zwei Arten 2 : (i) viele weitere Proteine können untersucht werden, da nicht mehr endogene Cysteine entfernt werden müssen; (Ii) zytosolische und begrabene Stellen können markiert werden, so dass ein breiteres Spektrum an regulatorischen Mechanismen untersucht werden kann.
Zukünftige Technik der orthogonalen tRNA / synthetAse Paare für neue fUAAs würde die Anwendbarkeit von VCF noch weiter erhöhen. Außerdem könnten mehrere Inkorporationen verschiedener FUAAs unter Verwendung einer Vier-Basis- oder Fünf-Basen-Codon-Strategie 25 , 26 ermöglicht werden. Aufgrund der hohen Effizienz, mit der Xenopus- Oozyten in der Lage sind, UAAs und die weit verbreitete Anwendung von VCF zu integrieren, erwarten wir, dass fUAA-VCF eine Schlüsseltechnologie im Bereich der Proteinstruktur und -funktion wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
PAnap war ein freundliches Geschenk von Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschungsstipendien MOP-102689 und MOP-136894 (an RB) und der kanadischen Stiftung für Innovation Grant 950-225005 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90 mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3 mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82 mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41 mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100 U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100 µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10 mg/100mL |
| Horse Serum (HS) | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5 mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 |
References
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