Summary
Denne artikkelen beskriver en forbedring av konvensjonell spenningsklemme-fluorometri (VCF) der fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) brukes i stedet for maleimidfarger, for å undersøke strukturelle omarrangementer i ionkanaler. Prosedyren inkluderer Xenopus oocyt DNA-injeksjon, RNA / fUAA myntutjaging, og samtidige strøm- og fluorescensmålinger.
Abstract
Spenningsklemme Fluorometri (VCF) har vært den valgte teknikken for å undersøke strukturen og funksjonen til elektrogenmembranproteiner der sanntidsmålinger av fluorescens og strømmer samtidig rapporterer om lokale omarrangementer og global funksjon, henholdsvis 1 . Mens høyoppløselige strukturteknikker som kryo-elektronmikroskopi eller røntgenkrystallografi gir statiske bilder av proteiner av interesse, gir VCF dynamiske strukturelle data som gjør at vi kan knytte strukturelle omarrangementer (fluorescens) til dynamiske funksjonsdata (elektrofysiologi). Inntil nylig ble den tiol-reaktive kjemi som ble brukt til stedstyrt fluorescerende merking av proteiner, begrenset omfanget av tilnærmingen fordi alle tilgjengelige cysteiner, inkludert endogene, vil bli merket. Det ble således pålagt å konstruere proteiner fri for endogene cysteiner. Merking ble også begrenset til steder som er tilgjengelige fra det ekstracellulæreside. Dette endret seg ved bruk av fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) for spesifikt å inkorporere en liten fluorescerende probe som svar på stoppkodonundertrykkelse ved bruk av et ortogonalt tRNA og tRNA syntetasepar 2 . VCF-forbedringen krever bare en to-trinns injeksjonsprosedyre av DNA-injeksjon (tRNA / syntetasepar) etterfulgt av RNA / fUAA co-injeksjon. Nå er det mulig å merke både intracellulære og begravede steder, og bruken av VCF har utvidet seg betydelig. VCF-teknikken blir dermed attraktiv for å studere et bredt spekter av proteiner og - enda viktigere - tillater det å undersøke mange cytosoliske regulatoriske mekanismer.
Introduction
Over 200 unaturlige aminosyrer av forskjellige kjemiske og fysiske egenskaper er blitt genetisk inkorporert i proteiner i E. coli , gjær og pattedyrceller 3 . Den unaturlige aminosyren er inkorporert som respons på et spesifikt stoppkodon via et ortogonalt konstruert tRNA / syntetasepar. Den genetiske tilnærmingen til å modifisere proteiner har gitt verdifull innsikt i proteinstruktur og funksjon. Her presenterer vi en protokoll for bruk av Spenning-Clamp Fluorometry (VCF) i kombinasjon med et fluorescerende UAA.
I VCF gir samtidig observasjon av funksjonelle data og strukturelle omarrangementer lokalisert rundt den fluorescerende sonden (~ 5 Å) oss mulighet til å oppnå dynamisk informasjon med millisekundoppløsning 1 . De fluorescerende prober endrer deres slokkingstilstand ved lokalisert bevegelse av proteinet. En bevegelse på kun 1-2 Å er tilstrekkelig til å føre til signifikante endringer i fluorescensenIntensitet 4 . Etter identifisering av stedet av interesse i målproteinet, blir stedet mutert ved punktmutasjon. Klassisk hadde resten blitt mutert til et cystein, mens nå er det innført en ravstoppkodon (TAG) for genetisk fUAA-inkorporering. Proteinet blir deretter in vitro transkribert.
Mens andre ekspresjonssystemer ( f.eks. Pattedyrceller) kan brukes 5 , 6 , 7 , foretrekkes Xenopus- oocytter for strukturfunksjonsstudier på grunn av deres større størrelse, hvilket fører til enklere manipulasjon og høyere fluorescensintensitet (mer fluoroforer) Støyforhold. Videre har Xenopus- oocytter lav bakgrunn fra endogene proteiner 2 , 8 og den mørke pigmenteringen på dyrepolskjermene mot bakgrunnsfluorescens fra tHan cytosol. Xenopus- oocytene fjernes kirurgisk, og DNA som koder for det ortogonale tRNA / tRNA-syntetaseparet som er spesifikt for fUAA, injiseres i kjernen til oocytene. Etter en 6-24 h inkubasjonstid, injiseres protein RNA med fUAA i cytosol av oocytene, etterfulgt av en inkubasjonsperiode på 2-3 dager. For å forhindre skade på fUAA (fotoblekking), må prosedyrene inkludert Anap utføres under rødt lys for å unngå fluoroforspenning.
Oocytter studeres på et åpent oocyt spenningsklemmeoppsett, som er montert på et oppreist fluorescensmikroskop, og elektriske strøm- og fluorescensendringer registreres samtidig 9 , 10 . Alternativt kan toelektrodspenningsklemme 1 eller patch-clamp konfigurasjoner 11 brukes. Fluorescens er begeistret av passende bølgelengder med lav RMS-støy og Utslipp innspilt ved bruk av en fotodiode koblet til en forsterker med høy amplifikasjon.
Det er flere fordeler med å bruke fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAAer) i spenningsklemmefluorometri. Den ene er tilgang til den cytosoliske siden av membranproteinene; Mange regulatoriske prosesser er plassert her ( f.eks. Ca 2+ - eller nukleotidbindingssteder, hurtig og lukket tilstandsinaktivering av spenningsgatede ionkanaler, poreåpning, modulkobling). Alle disse prosessene er nå tilgjengelige for fluorescensmerking.
En annen fordel er den lille størrelsen på sonden som fører til mindre forstyrrelse av proteinet. Så langt har to ortogonale tRNA / tRNA syntetasepar for fUAAer blitt konstruert 12 , 13 , hvor 3- (6-acetylnaftalen-2-ylamino) -2-aminopropansyre (Anap) er den eneste fUAA som har blitt brukt i Xenopus oocytter 2 ,"Xref"> 8. Anap er en miljøfølsom fluorofor med en molekylvekt på 272,3 g / mol og er bare litt større enn tryptofan 12 ( figur 1A, 1B ). På grunn av sin lille størrelse er det mindre sannsynlig at færre steriske effekter vil bli introdusert av fluoroforen sammenlignet med konvensjonelle fluorforer festet via en linker (typisk over 500 g / mol). Videre, når det gjelder Anap, ligger fluoroforen nærmere proteinprotein enn de som er koblet til cystein, og følgelig søker Anap flere lokaliserte omlegginger. Til slutt, fjerning av endogene cysteiner i konvensjonell VCF for å sikre områdespesifikke merking er ikke lenger et krav i UAA-VCF og derfor (i) etterlater proteiene i (nesten) deres opprinnelige tilstand og (ii) tillater VCF å bli anvendt Å studere et bredere spekter av proteiner hvor funksjonen kan endres ved cysteinsubstitusjon.
Figur 1 : Anap og fluorescensspektra. ( A ) Kjemisk struktur av Anap. ( B ) Normalisert absorpsjonsspektrum og utslippspektra for 1 nM Anap, som demonstrerer følsomheten av Anap fluorescens til løsningsmiddelhydrofobiciteten. Utslippsspektra ble oppnådd ved spennende ved 350 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En ulempe ved bruk av fluorescerende UAAer er at en heterogen populasjon av proteiner kan skyldes stoppkodon-gjennombrudd, translasjonsinitiering, C-terminale avkortede proteiner eller crosstalk med endogen aminoacylering dersom mengden av aminoacylerte tRNAer er knappe. Et slikt lekkasjeuttrykk bør alltid kontrolleres i fravær av fUAA og tRNA / tRNA syntetaseparet. Vi tok opp spørsmålet om transLational reinitiation og hvordan å omgå den for N-terminale innføringssteder tidligere 14 . Men når fUAA, tRNA og tRNA syntetase er tilstede i mettede mengder, forblir det bare en liten sannsynlighet for lekkasjeekspresjon.
Den sentrale prosessuelle forskjellen mellom fUAA-VCF og konvensjonell VCF er injeksjon og håndtering av oocytene; Injeksjonen av DNA som koder for tRNA og tRNA-syntetase (pAnap) følges av introduksjonen av Anap, som enten er co-injisert med protein-mRNA eller alternativt tilsatt til inkubasjonsoppløsningen som en acetoksymetyl (AM) ester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Froskmanipulasjoner ble utført i samsvar med de kanadiske retningslinjene og er godkjent av etikkutvalget (CDEA, protokoll # 15-042) ved Universitetet i Montréal.
1. mRNA-fremstilling for fUAA-inkorporering
- Velg et område av interesse for proteinet der konformasjonsendringer forventes å forekomme. Velg en aminosyre i denne regionen som skal erstattes av fUAA.
MERK: Valg av posisjon er basert på de strukturelle omleggingene som forventes. Hvis en høyoppløsningsstruktur eksisterer og en hypotese av de forventede bevegelsene, bør anapet plasseres slik at det kjemiske miljøet vil endre seg; Dette kan enten være en endring i den dielektriske konstanten (hydrofob versus hydrofilt miljø) eller, mer sannsynlig, slukking av en annen aminosyre. De beste quenchers er tryptofaner. Anap bør være i kontakt med quencheren i en tilstand (overlapping av van-der-Waals radii) og fri for det iden andre. Hvis ingen strukturer eller modeller med høy oppløsning eksisterer, må man skanne region av interesse. I begge tilfeller er det tilrådelig å velge flere nærliggende steder for å øke sannsynligheten for å oppnå uttrykk og fluorescenssignal. For å minimere steriske effekter under proteinmetning og / eller funksjon, kan man velge å erstatte store og aromatiske aminosyrer (Phe, Trp, Tyr). Forfatterne har imidlertid opplevd at skanning av en region av interesse for fUAA-innsetting uansett den substituerte aminosyren, er mer produktiv. - Sett et amberstoppkodon (TAG) på det valgte stedet ved hjelp av stedrettet mutagenese 15 . Sørg for at proteinet av interesse ikke slutter på et gult stoppkodon (TAG). Hvis det er tilfelle, mutere til en annen (oker eller opal stop codon). Forsterk, isolere og sekvensere DNA. Hent protein mRNA med in vitro transkripsjon 16 og lagre mRNA ved 20 ° C eller 80 ° C. </ Ol>
- Kirurgisk oppnår stadium V eller VI-oocytter fra Xenopus laevis frosker og defollikulerer med kollagenase som tidligere beskrevet 17 .
- Anesteser frosker med en passende bedøvelse i henhold til godkjent dyreprotokoll (her: 3-aminobenzoesyreetylester). Når de ikke klarer å reagere på en mild klemme på tåspissen (tap av tilbaketrekningsrefleks), blir de passende bedøvet for kirurgi.
- Fjern umiddelbart froskene fra bedøvelsesløsningen og skyll huden grundig med ferskvann. Dette skyllet hindrer at dyret faller inn i dypere nivåer av anestesi ved å fjerne uabsorbert kjemikalie fra hudoverflaten.
- Fjern eggstokk noder fra den ene siden kirurgisk og åpner nøye forsiktig med to tang. Inkubere og agitere oocytene i "standard oocytløsning" (SOS) som inneholder 1% (w / v) kollagenase i 20-30 minÅ defolliculate. Vask tre ganger med SOS-løsning.
- Velg store og sunne oocytter individuelt og inkuber dem i Barths løsning tilsatt antibiotika (100 U / ml penicilin, 100 μg / ml streptomycin, 10 mg / 100 ml kanamycin) og 5% hesteserum ved 18 ° C i minst 4 timer før injeksjon .
MERK: Etter 2 - 4 operasjoner med en 4 måneders forsinkelse i mellom, blir Xenopus laevis euthanisert ved langvarig (> 1 time) inkubasjon med 3-aminobenzoesyre-etylester.
- For kjernefysisk injeksjon av DNA, lag en lang og tynn injeksjonstips for å kunne nå kjernen og unngå å skade oocytten. Fyll injeksjonsspissen med olje og fest den på nanoinjektorenheten.
- Installer nano-injeksjonen under et stereomikroskop og bruk tang for å bryte enden av spissen. Skru ut olje til det ikke er noen luftbobler fanget inne i toppen av spissen.
- Plasser 1 μl 0,1 μg /# 181; L pAnap i nukleasefritt vann inneholdende NaOH (1% 1N NaOH) på et parparilm under et stereoskop og fyll injeksjonsspissen med DNA.
- Overfør 40 oocytter til en maskebelagt injeksjonsfat som inneholder Barths løsning tilsatt antibiotika.
MERK: For å lage den maskerte injeksjonsretten, skjær ut en passende størrelse 800 μm nylon nett for å fylle en polystyren petriskål. Legg kloroform i midten og legg deretter masken på toppen. Hold nettverket flatt til plast settes. - Når oocytkjernen er lokalisert i dyrets (mørke) pol, må du injisere spissen midt på dyrepolen og forfølge slik at spissen når nær midten av dyrehalveren (eller 2-3 ganger dybden i forhold til RNA-injeksjonen ). Injiser 9,2 nL pAnap inn i kjernen til hver oocyt. Tynn spiss og lite injeksjonsvolum kan føre til uregelmessig injeksjon eller blokkert spiss. Kontroller av og til om injeksjonen virker ved å injisere i luften.
MERK: Om DNA blir riktig injisert i kjernen, er usikkert. Forventer derfor at 10-40% av oocytene ikke uttrykker tRNA / syntetaseparet. Se Diskusjon for videreutvikling. - Inkuber oocytene i 2 ml Barths løsning tilsatt antibiotika og 5% hesteserum (HS) ved 18 ° C i 6-24 timer for å tillate robust ekspression av Anap-spesifikke tRNA og tRNA-syntetaser.
MERK: DNA-inkubasjonstid kan vare flere dager før RNA-injeksjon, men det øker ikke uttrykket. - Forbered nanoinjektoren for RNA-injeksjon (samme som trinn 2.2, men injeksjonstipset trenger ikke å være så tynt som for DNA-injeksjon). Arbeid kun under rødt lys fra dette punktet for å forhindre fotobryting av Anap.
- Bland 1 μL 1 mM Anap med 1 μL 1-2 μg / μL mRNA direkte på en del parafilm og fyll injeksjonsspissen med den blandede løsningen. Impale like under membranen i vegetalen(Lyse) polen og injiser 46 nL i hver pAnap-injisert oocyt.
MERK: Den nødvendige mRNA-konsentrasjonen avhenger av protein av interesse. - Inkubér oocytene beskyttet mot lys i en eske eller innpakket i aluminiumsfolie, i Barths løsningstilføyde antibiotika og 5% hesteserum ved 18 ° C i 2-3 dager. Bytt med fersk Barths løsning hver dag og fjern døde oocytter for å unngå forurensning.
- Installer sperreutstyret for åpent oocyt spenningsklemme som tidligere beskrevet 18 .
- Monter elektrofysiologi-opptakssystemet på et oppreist fluorescensmikroskop ved å installere opptakskammeret på en glidebryter som gjør det mulig å flytte det mellom standard stereoskopet for å plassere oocytten og mikroskopet for å utføre fluorescensmålingene ( figur 2c ).
MERK: Kammerets geometri for kuttede oocytter er ikke egnet til å bruke normal traNsmitted lys for belysning under manipulering. Derfor brukes en "gooseneck" halogenlampe med rødt filter til å belyse sidelengs fra toppen. Kondensatoren til mikroskopet kan fjernes, gjør plass til å senke scenen for elektrofysiologi kammeret. - Koble et fotodiode-detekteringssystem til C-mount utgangsporten i fluorescensmikroskopet ( Figur 2a ). Koble fotoutgangen til en annen inngangskanal i den digitale signalprosessoren (DSP, analog / digital - digital / analog omformer).
- Bruk en 100 W, 12 V halogen lampe som lyskilde for fluorescens excitasjon.
MERK: Alternativt kan Hg-brennere brukes, men må reduseres i intensitet for å forhindre for rask fotoblekking under opptak. LED-belysning anbefales kun hvis de respektive LEDene viser signifikant intensitet i eksitasjonsområdet ( f.eks. ~ 350 nm for Anap). De fleste hvite lysdioder når ikke langt inn i UV-spektret. - insEr en elektrisk kontrollert lukker mellom eksitasjonskilden og mikroskop og koble kontrollen (typisk TTL-puls) til en digital utgang fra DSP. TTL-puls i opptaksprogramvaren (se produsentens dokumentasjon), slik at lukkeren åpner ~ 100 ms før starten av opptaket. På denne måten påvirker ikke vibrasjon i åpningsprosessen innspillingen. Tiden avhenger av hastigheten og vibrasjonen til lukkeren. Slutt pulsen 5ms før slutten av opptaket som vist i figur 4 . På denne måten blir verdien for total fluorescens også registrert.
- Sett inn en passende filterkube (eksitasjonsfilter, dikroisk speil og utslippsfilter) i filterkubetårnet. For Anap, bruk Ex: 377/50 nm bandpass, dikroisk 409 nm longpass og Em: 470/40 nm bandpass.
- Følg forberedelse trinn for cut-open oocyte spenning-klemme som tidligere beskrevet og visualisert 18 (agar bridge forberedelse, montering av oocyte, saponin permeabilization). Men arbeid under rødt lys til enhver tid for å unngå bleking av fluoroforen før opptak. Når du plasserer oocyten, må du sørge for at dyrestangen vender oppover. Pigmenteringen under dyrepolemembranen skjuler mot autofluorescens stammer fra cytosolen og reduserer derfor bakgrunnsfluorescens.
- Skyv kammeret over til mikroskopet og fokus med en 4X-objektiv.
- Impalere oocyten med spenningsavnemmende V1-elektroden (3 M KCl), bytt til 40X vanndypning (NA 0.8 - 0.9). Fokus på dyrestangen som vender oppover.
- Slå av det røde lyset. Velg riktig filterkube ved å dreie filterkubetårnet og den optiske utgangsporten koblet til fotodioden. Slå på halogenEn lampe med høyeste intensitet og kortvarig skyve lukkeren åpen i 2-5 s for å lese bakgrunnsfluorescensintensiteten som kommer fra oocytten. Med det beskrevne oppsettet skal verdien være rundt 50-200 pA for Anap.
- Slå på klemmen, vri på badet / vaktbryteren til aktiv og juster membranpotensialet (V1 - V2) til kommandopotensialet ved å dreie bryteren på I-hovedet.
- Velg holdpotensial, trinnprotokoll, nummer og lengde på pulser etc. i opptaksprogramvaren. Ta opp spenningsavhengige strømmer og Anap fluorescensintensiteter.
- For å overvåke to steder i samme protein samtidig, mutere en ekstracellulær og tilgjengelig aminosyre i cystein, og fjern andre cysteiner for å sikre spesifikk merking med tiol-kjemi.
- Utfør trinn 2.1-2.5.
- Før VCF-opptak, inkuber oocytter i 5 μM TMR-maleimid i merkeløsning i 15 minutter (eller annet fargestoffMed ikke-overlappende spektra sammenlignet med Anap).
- Vask oocytene med merkeløsning tre ganger for å fjerne overflødig fargestoff.
- Utfør trinn 4.1-4.6.
- Sett inn en passende filterkube for TMR (eksitasjonsfilter, dikroisk speil og utslippsfilter) i filterkubetårnet. Bytt til TMR-filterkuben ved å dreie filtertårnet.
- Les bakgrunnsfluorescensen for TMR som beskrevet for Anap i trinn 4.4.
MERK: Mærkning med tiol-kjemi resulterer i høy bakgrunnsfluorescens på grunn av uspesifikk merking i membranen. Derfor kan TMR-bakgrunnsfluorescensen mette forsterkeren (> 2000 pA). I så fall må du ikke redusere lysintensiteten, men bare trekke bakgrunnsfluorescensen ved å legge til en forskyvningsstrøm til fotodioden. I kommersielt tilgjengelige systemer bruker "sample-and-hold" -funksjonen på detektorsystemet. Merk bakgrunnsfluorescensverdien (ved bruk av et 10X nøytralt tetthetsfilter) i et laboratorium jVår, da denne verdien ikke blir registrert (metning). - Registrer spenningsavhengige strømmer og TMR-fluorescensintensiteter samtidig som i trinn 4.6.
2. Oocytpreparat og injeksjon
Figur 2 : Illustrasjon av DNA- og RNA-injeksjon i Xenopus- oocytter for Anap-inkorporering.
Først injiseres pAnap i kjernen til Xenopus- oocytten ( 1 ). Etter 6-24 timer, blir anap og kanal RNA coinjected inn i vegetabilsk polen ( 2 ). Anap vil være ortogonalt aminoacylert med tRNA som bærer et gult stopp-antikodon, ved aminoacyl-tRNA-syntetasen som er kodet av pAnap. På denne måten blir de aminoacylerte anap-tRNAene gjenkjent av ribosomet ved det innsatte amberstoppkodonet i channeL RNA, noe som resulterer i undertrykkelse av stoppkodonet og innføring av Anap. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. VCF Setup
Figur 3 < / Strong> : VCF-oppsett. ( A ) Sett fra siden av VCF-oppsettet som viser lysbanen inne i mikroskopet. Filterkuben inneholder et eksitasjonsfilter, dikroisk speil og et utslippsfilter. ( B ) Utvalgte oocytkammerdimensjoner er 3,4 cm for øvre kammerradius (1), 5,5 cm for bunnkammerlengde (2), 1,4 cm for bunnkammerbredde (3) og 1,7 cm for midtkammerbredde (4). ( C ) Forhåndsvisning av VCF-oppsettet. Den første okulære til venstre er for montering av oocyten i sperrekammerkammeret og for permeabilisering. Deretter skyves kammeret under mikroskopet ved den andre okulære til høyre. Her blir V1-elektroden satt inn i oocyten ved hjelp av 4X-objektivet, og fluorescens registreres ved hjelp av 40X-objektivet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. To-farges VCF
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 viser et eksempel på VCF-opptak hentet fra en oocyt-uttrykkende Shaker-kanal med hurtig inaktivering fjernet (IR), L382stop-W434F i nærvær av pAnap og Anap. W434F-mutasjonen blokkerer ioniske kaliumstrømmer, noe som gjør det mulig å måle transientgassladningsforskyvningene (gatingstrømmene). Samtidige opptak av gatingstrømmer (øvre spor) og Anap fluorescensintensitetsendringer (lavere spor) ved depolarisering demonstrerer vellykket innlemmelse av Anap i posisjon L382. Her ligger Anap på bunnen av hver av de fire S4 transmembrane helices som beveger seg under aktivering (L382) og rapporterer dermed om intracellulære lokale omlegginger. En fluorescensendring kan forårsakes av løsningsmiddelavslapping (miljøpolaritetsendringer) og / eller quenching av andre aminosyrer 4 . Begge mekanismene er et resultat av relative proteinomlegginger. Figur 5 viser Anap og TMR fluorescenssignaler ved hjelp av trinnprotokoller oppnådd fra samme oocyt. Ved å legge til A359C-mutasjonen i L382stop-W434F-bakgrunnen og merking med TMR-maleimid, er det mulig med den beskrevne teknikken å sonde sanntidsbevegelser i forskjellige regioner i samme protein. I dette tilfellet tester TMR bevegelsen av den øvre S4-helixen (A359C) mens Anap probes bevegelsen av bunnen av S4 (L382). Fra tidspunktet for fluorescensendringen kan man hente dynamisk informasjon om overgangen overvåket av fluorescensen ved å analysere kinetikken ( figur 5A, 5B ). Videre oppnås fluorescensspenningsforholdet (FV) ved å plotte den steady-state fluorescensintensiteten mot spenning ( figur 5C ). FV reflekterer likevekten mellom bevegelser av overvåkede tilstander som i tilfelle av ionkanaler kunne følge vOltensensorbevegelse, eller åpning av den sentrale porene. Ved å bruke fUAAs er det nå mulig å skaffe FV fra innsiden av kanalen. Figur 5C viser at den øvre delen av S4 (TMR) har samme spenningsavhengighet som den nedre delen av S4 (Anap).
Signal-støyforholdet er hovedsakelig avhengig av den relative fluorescensendringen (dF / F) og den totale fluorescens. DF / F definerer signalstørrelsen mens støyen bestemmes av total fluorescens på grunn av lysets kvante karakter (Poisson-støy). DF / F vil avhenge av tilstanden av quenching i de forskjellige tilstandene av proteinet, og okkuperingen av tilstandene ( f.eks. Den åpne sannsynligheten). Total fluorescens omfatter fluorescensen fra spesifikk merking og fra uspesifikk bakgrunnsmerking. Den totale spesifikke fluorescens er definert av antall uttrykte proteiner og kvantumutbyttet av fluoroforet. Den store overflaten av XeNopus oocytter er fordelaktig fordi det øker antall bidragende proteiner.
Anapets kvantumutbytte, dvs. antall fotoner som sendes ut per eksitasjonssyklus eller "lysstyrken" av fluoroforen, er lavere, noe som fører til lavere total fluorescensintensitet og derved lavere signal / støyforhold. På samme tid fører Anap-merking til lav bakgrunnsfluorescens slik at signal-til-bakgrunnsforholdet (dF / F) er høyere for Anap ( Figur 5A, 5B ).
Et viktig kontrolleksperiment er å kontrollere uttrykk i fravær av Anap, for å vurdere effekten av lekkasjeuttrykk. Det har tidligere blitt vist at isolerte spenningssensor domener (iVSDs, 1-382) som mangler S4-S5 linkeren og porene er funksjonelt uttrykt 19 . Derfor, i fravær av Anap, uttrykker L382stop-W434F-kanaler som iVSDs som vist i figur 6 . Ekspresjon av fulllengdekanaler med Anap har liten eller ingen iVSD-strøm, mens avkortede kanaler har sterke iVSD-strømmer i fravær av Anap. Tilstedeværelsen av slike C-terminale avkortede proteiner avhenger av posisjonen til det innsatte stoppkodonet og bør alltid tas i betraktning når man arbeider med unaturlige aminosyrer. Kontrolleksperimenter uten Anap tillater verifisering om en heterolog populasjon er tilstede i eksperimenter med Anap.
Figur 4 : Samtidig gatingstrømmer og fluorescensendringer fra et cytosolisk proteinoverflate oppnådd med VCF. Gatingstrømmer oppnådd med en P / 4-subtraksjonsprotokoll og samtidig opptak av fluorescens ved depolarisering. Anap er innlemmet i Shaker på posisjon L382, noe som gir opphav til voSpenningsavhengige fluorescensintensiteter fra den intracellulære enden av S4-helixen. Den maksimale fluorescensintensiteten er betegnet "F" og fluorescensendringen er betegnet "dF". Stjerne på slutten av fluorescensendringen markerer lukking av elektrisk lukker (åpning av lukkeren før pulsen ikke vises). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 : To-farges VCF med Anap og TMR. ( A ) Anap og ( B ) TMR fluorescensendringer oppnådd fra en Shaker A359C-L382Anap-W434F-uttrykkende oocyt merket med TMR-maleimid. ( C ) Fluorescensendringer fra A og B er plottet mot membranpotensialet (FV). Data viser gjennomsnitt7; SD med n = 5 oocytter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 : C-terminale avkortede shakerkanaler uttrykkes i mangel av anap. Isolerte spenningssensor-domener (iVSD, 1-382) uttrykkes med zH4IR-L382stop-W434F i fravær av Anap, noe som resulterer i iVSD-strømmer ved hyperpolariserte potensialer 19 . I nærvær av Anap konkurrerer Shaker-uttrykket i full lengde med iVSD-uttrykk, og som et resultat er mengden av iVSD mindre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo aminoacyleringen av tRNA som kontinuerlig blir transkribert sammen med tRNA-syntetasen, gjør det mulig å oppnå høye ekspresjonsnivåer for fluorescensmålinger. For effektiv fUAA-inkorporering er det kritisk at pAnap er riktig injisert i kjernen. På grunn av usikkerheten om den nøyaktige plasseringen av kjernen, forventes 10-40% av DNA-injeksjonene å mislykkes, noe som resulterer i ikke-uttrykkende (eller lekkasje-uttrykkende) oocytter. Derfor er det viktig å kontrollere uttrykk i fravær av Anap og pAnap for å identifisere aktuelle fenotyper og størrelser i tilfelle lekkasjer. På den måten er det mulig å skille mellom oocytter med riktige DNA-injeksjoner (høyt uttrykk, Anap dF, full lengde gjeldende fenotype) fra de med mislykkede DNA-injeksjoner (nei eller lavt uttrykk, ingen Anap dF, avkortet nåværende fenotype hvis noen). I tilfelle plutselig mangel på uttrykk med Anap, utarbeide en ny Anap-alikvote, da Anap ikke er stabil for lengre periOds i vandig oppløsning (opptil 1 år).
Bruken av fUAAer med VCF er begrenset av valget av fluorforer siden hver ny fUAA krever et ortogonalt tRNA / tRNA syntetasepar som skal konstrueres. Hittil eksisterer bare Anap som en funksjonell fUAA for å rapportere om proteindynamikk i oocytter. Høye ekspresjonsnivåer kreves for å oppdage Anap fluorescensendringer, og vi anslår en minimal proteindensitet på 2 - 4000 μm - 2 avhengig av følsomheten til stedet. For eksempel kan anap fluorescens endringer ses på bare 0,2 mS ioniske strømmer for V234Anap (2,4 x 10 9 kanaler per klemmet område i sperre spenningsklemme), mens 5 nC gating strømmer (1 x 10 6 kanaler kanaler per klemmet Område i sperreklemme) er nødvendig for A391Anap-W434F. Som Shaker er en tetramer har den fire Anap molekyler per kanal. Følgelig krever dimerer eller monomere proteiner sannsynligvis høyere uttrykksnivåer. furtheRare, blekekinetikk av Anap, som avhenger av det kjemiske miljøet samt lysintensiteten, bør verifiseres for å sikre at tilstrekkelig intensitet forblir for hele protokollen. Vi fant at kinetikken i 1 sekunds tidsintervall kan fremdeles registreres med en typisk spenningstrinnsprotokoll. Bleking kan minimeres ved å redusere lysintensiteten (sakte prosesser kan filtreres mer) eller tilsetning av triplet-state quenchers som Trolox (kjent fra single-molekyl fluorescensstudier). Hvis LED-excitering brukes, kan man også sette opp en protokoll for å "prøve" fluorescensintensiteten hver 100 ms i 5-10 ms, og effektivt redusere eksitasjonstiden 10-20X.
Spenningsklemmefluorometri har vært en kraftig teknikk for å studere funksjonsforholdet til membranproteiner, og det har blitt kombinert med en rekke fluorescensteknikker, inkludert merkede ligander 11 , lantantidbaserte og Förster Resonance EnergY Overføring (LRET / FRET) 20 , 21 og overgangsmetall FRET 22 . Begrensninger på merkingsteknikkene hindret imidlertid den utbredte applikasjonen. Genetisk kodede fluorescerende proteiner, mens uvurderlige i mange andre applikasjoner, er for store til å tilby et generelt alternativ. De har blitt vellykket ansatt i C-terminalen 23 og ligandbindende domenet til BK Ca- kanalene 24 , men kan ikke innføres i "hotspots" av proteinet. Innføringen av fluorescerende unaturlige aminosyrer i feltet åpnet teknikken på to måter 2 : (i) mange flere proteiner kan studeres siden ikke lenger endogene cysteiner må fjernes; (Ii) cytosoliske og begravede steder kan merkes slik at et bredere spekter av regulatoriske mekanismer kan undersøkes.
Fremtidig prosjektering av ortogonale tRNA / syntetAse par for nye fUAAs ville øke anvendligheten av VCF enda lenger. Også flere inkorporeringer av forskjellige fUAAer kunne gjøres mulig ved å anvende en firebasert eller fembasert kodonstrategi 25 , 26 . På grunn av den høye effektiviteten som Xenopus oocytes er i stand til å inkorporere UAA og den utbredt anvendelse av VCF, forventer vi fUAA-VCF å bli en nøkkelteknikk innen proteinstruktur og funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
PAnap var en god gave fra Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Dette arbeidet ble finansiert av de kanadiske instituttene for helseforskningsstipend MOP-102689 og MOP-136894 (til RB) og Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90 mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3 mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82 mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41 mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100 U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100 µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10 mg/100mL |
| Horse Serum (HS) | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5 mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 |
References
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , CRC Press. 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
