Summary
Håndvask anbefales generelt for at forhindre overførsel af smitsomme sygdomme. Der er dog kun få beviser på, hvilke håndvaskningsmetoder der er mest effektive til fjernelse af infektionssygdomspatogener. Vi udviklede en metode til vurdering af effektiviteten af håndvaskningsmetoder ved fjernelse af mikroorganismer.
Abstract
Håndvask anbefales generelt for at forhindre overførsel af smitsomme sygdomme. Imidlertid findes der kun lidt sammenlignelige beviser for effektiviteten af håndvaskningsmetoder generelt. Derudover findes der lidt beviser, der sammenligner håndvaskningsmetoder for at bestemme, hvilke der er mest effektive til fjernelse af infektiøse patogener. Forskning er nødvendig for at fremlægge bevis for de forskellige tilgange til håndvask, der kan anvendes i forbindelse med smitsomme sygdomsudbrud. Her beskrives en laboratoriemetode til vurdering af effektiviteten af håndvaskefremgangsmåder til fjernelse af mikroorganismer fra hænder og deres persistens i skyllevand. Frivilliges hænder spidses først med testorganismen og vaskes derefter med hver håndvaskefremgangsmåde af interesse. Generelt anvendes surrogatmikroorganismer til at beskytte mennesker mod sygdom. Antallet af organismer, der forbliver på frivilliges hænder efter vask, testes ved hjælp af en ændret "handske juice" metode: Hænderne placeres i handsker med en eluOg skrubber for at suspendere mikroorganismerne og gøre dem tilgængelige til analyse ved membranfiltrering (bakterier) eller plaqueanalyse (vira / bakteriofager). Skyllevand fra håndvasken indsamles direkte til analyse. Håndvask effektivitet kvantificeres ved at sammenligne logreduktionsværdien mellem prøver taget efter håndvask til prøver uden håndvask. Skyllevandstannelsen kvantificeres ved at sammenligne skyllevandsprøver fra forskellige håndvaskemetoder til prøver opsamlet efter håndvask med bare vand. Selv om denne metode er begrænset af behovet for at anvende surrogatorganismer for at bevare sikkerheden hos mennesker, frivillige, tager det fat på aspekter af håndvask, der er vanskelige at replikere i et in vitro- studie og fylder forskningsmæssige huller i håndvaskningsevnen og persistensen af infektiøse organismer i skylning vand.
Introduction
Håndvask anbefales generelt for at forhindre spredning af sygdomme, især dem, der overføres af fækal-oral eller luftbåren rute, herunder diarré- og respiratoriske sygdomme 1 . Overraskende er der lidt sammenlignelige beviser for effekten af håndvaskningsmetoder, såsom håndvask med sæbe og vand (HWWS) og med alkoholbaseret håndrensningsmiddel (ABHS), om fjernelse af organismer fra hænderne. Indledende forskning har fundet ud af, at den mekaniske virkning af håndvask, i modsætning til håndvaskefremgangsmåden, kan tegne sig for størstedelen af organismernes fjernelse 2 , 3 . Derudover er der lidt sammenlignende beviser på, hvilken håndvaskningsmetode der er mest effektive. I en uformel litteraturvurdering blev 14 undersøgelser, der sammenlignede effektiviteten af sæbe og håndrensningsmiddel til fjernelse af organismer, identificeret. Af disse undersøgelser fandt fem ABHS at være mere effektive 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 7 fandt HWWS at være mere effektive 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 og to fandt ingen signifikant forskel mellem fremgangsmåderne 16 , 17 . Disse resultater er inkonsekvente og tager ikke højde for den igangværende risiko for sygdom fra vedvarende organismer i skyllevandet efter håndvask. Samlet set er beviser for den komparative effektivitet af håndvaskefremgangsmåder til fjernelse af infektionssygdomsfremkaldende patogener begrænset.
Dette begrænsede bevis har ført til usikkerhed om, hvilke metoder der er mest hensigtsmæssige i udbrudningsindstillinger. For eksempel, I løbet af udbruddet af Ebola Virus Disease (EVD) i Vestafrika fra 2013 til 2016 fremlagde flere store internationale respondenter modstridende anbefalinger for HWWS, ABHS eller 0,05% chloropløsninger. Médecins Sans Frontières (MSF) anbefaler brug af 0,05% chloropløsning til håndvask, mens Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anbefaler HWWS eller ABHS (hvis hænderne ikke er synligt snavset). WHO går så langt at sige, at klor ikke bør anvendes, medmindre der ikke findes andre muligheder, fordi det er mindre effektivt end andre metoder på grund af klorens efterspørgsel udført af huden 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Derudover fremstilles chloropløsningerne sædvanligvis af fire forskellige chlorforbindelser, herunder højtesthypochlorit (HTH), lokalt genereret og stabiliseret natriumhypochlorit (NaOCl) og sodIum dichloroisocyanurat (NaDCC). En systematisk gennemgang af WHO som reaktion på EVD-udbruddet i Vestafrika fandt for nylig kun fire undersøgelser, der undersøgte den komparative effekt af håndvask med klor 23 . Disse undersøgelser frembragte også modstridende resultater, og ingen af disse undersøgelser anvendte den anbefalede klorkoncentration på 0,05% til håndvask eller undersøgte mikroorganismer svarende til Ebola-viruset 10 , 24 , 25 , 26 , 27 . Anbefalingerne blev således ikke fundet bevisbaserede, og det var uklart hvilke anbefalinger der var mest effektive.
Yderligere forskning er nødvendig for at sammenligne håndvaskefremgangsmåder for at forhindre spredning af infektiøse patogener, da håndvaskeinterventioner er et vigtigt redskab til at forebygge epidemisk sygdomsoverførsel. Disse hAndwashing anbefalinger skal være baseret på bevis. Således blev en metode til testning af håndvaskeffektivitet og skyllevandsperistens udført med surrogater eller ikke-infektiøse patogener udviklet 2 , 28 , 29 . Prøveresultater, der anvender Phi6 som en surrogat for Ebola-viruset og ved anvendelse af Escherichia coli som en fælles indikatororganisme, er præsenteret her. I denne protokol præsenteres håndvaskning af effektivitet og skylning af vandpersistensforsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Studien beskrevet her (på Phi6 og E. coli som surrogater for Ebola) blev godkendt af Institutional Review Board ved Tufts Medical Center og Tufts University Health Sciences Campus (# 12018); Harvard University ceded anmeldelse til Tufts Institutional Review Board.
BEMÆRK: Før du starter denne protokol, skal to trin udfyldes. For det første skal en Biosafety Level 1 (BSL-1) surrogat eller ikke-infektiøs version af det patogen, der skal studeres, der er sikkert at anvende på mennesker, identificeres og vælges 30 . En BSL-1-surrogat eller et ikke-infektiøst patogen er nødvendigt for denne protokol, da organismen vil blive anvendt til at inokulere de frie hænder af mennesker frivillige. For det andet skal godkendelse fra det lokale Institutional Review Board for at gennemføre forskning med menneskelige emner opnås inden rekruttering af frivillige eller påbegyndelse af eksperimentet. Mange aspekter af denne protokol kan tilpasses for at møde thE specifikke behov for de spørgsmål, der er af interesse.
1. Rekruttere kvalificerede menneskelige emner
- Rekruttere frivillige ved at sende papir flyers på offentlige opslagstavler og sende e-mails til grupper med medlemmer, der kan være interesseret i at deltage. Disse meddelelser skal indeholde studieformål, kontaktoplysninger og kvalifikationskriterier.
- Mød med frivillige for at vurdere berettigelsen. Bekræft, at frivillige er sunde mellem 18 og 65 år og ikke i øjeblikket gravid eller tager antibiotika, og at de ikke har hudskader / -forstyrrelser, kendte allergier for håndvaskemidler eller historie om psykiske problemer i forbindelse med hygiejne.
- Få anerkendte frivillige læse samtykkeformularer. Besvar eventuelle spørgsmål, de stiller, og få frivillig og underskriver til at underskrive to kopier af formularen. Behold en formular og giv en til frivillige.
- Administrer en basisundersøgelse, herunder spørgsmål om demografiske oplysninger, personAl historie om hudforhold, og information om nylig håndvaskende opførsel. Undersøg hænder for tegn på dermatitis, hudskader eller abnormiteter i grundlinjen 31 .
- Planlæg frivillige til to test sessioner for hver interesseorganisme (en til test med jordbelastning og en til test uden). Oplys frivillige for at undgå antimikrobielle produkter i en syv-dages udvaskningstid før testning for at undgå forstyrrelser fra brug af personlige produkter.
- Giv frivillige med antimikrobielle produkter (shampoo, balsam og sæbe) til brug i stedet for deres sædvanlige produkter. Tilbyde tungthandlede vinylhandsker og instruere emnerne at bære dem, når de bruger produkter som husrensningsprodukter.
2. Forbered håndvaskeopløsninger, der almindeligvis anvendes i nødsituation (sæbe, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC og NaOCl-løsninger)
BEMÆRK: Kloropløsninger kan præpareres Arer op til 12 timer forud for forsøget, men vil nedbrydes hvis det opbevares> 12 timer.
- Vælg og køb en sæbe, der er relevant for den sammenhæng, som testen udføres for.
BEMÆRK: I de fleste tilfælde vil der i tilfælde af infektionssygdomme i udviklingslandene være en såpække. - Vælg og køb en ABHS-løsning, der er relevant for den sammenhæng, som testen udføres.
BEMÆRK: Det valgte ABHS skal have en ethylalkoholkontekst, der er større end eller lig med 70% for at sikre effektivitet. - Forbered en 0,05% calciumhypochlorit (Ca (ClO) 2 ) opløsning ved at tilsætte granulært Ca (ClO) 2 pulver til ultrapure vand. Bestem den nødvendige mængde opløsning baseret på antallet af forsøgspersoner.
- Ved hjælp af følgende ligning bestemmes mængden af pulver, der er nødvendigt for at fremstille den ønskede mængde opløsning i et givet volumen vand ved anvendelse af en given procentdel af tilgængelig chlor:
/files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
BEMÆRK: Ca (ClO) 2 pulver har typisk 60-80% tilgængeligt klor.
- Ved hjælp af følgende ligning bestemmes mængden af pulver, der er nødvendigt for at fremstille den ønskede mængde opløsning i et givet volumen vand ved anvendelse af en given procentdel af tilgængelig chlor:
- Forbered en 0,05% natriumdichloroisocyanurat (NaDCC) opløsning ved at tilsætte et granulært NaDCC pulver til ultrapure vand.
- Ved hjælp af følgende ligning bestemmes mængden af pulver, der er nødvendigt for at fremstille den ønskede mængde opløsning i et givet volumen vand ved anvendelse af en given procentdel af tilgængelig chlor:
BEMÆRK: NaDCC pulver har typisk ca. 50% ledig klor.
- Ved hjælp af følgende ligning bestemmes mængden af pulver, der er nødvendigt for at fremstille den ønskede mængde opløsning i et givet volumen vand ved anvendelse af en given procentdel af tilgængelig chlor:
- Forbered stabiliseret 0,05% NaOCl opløsning ved at tilsætte natriumhypochlorit-opløsning til ultrapure vand.
- Bekræft koncentrationen af NaOCl stamopløsningen (sandsynligvis 5-8%) ved brug af en titreringsprøvningsmetode i henhold til producentens anvisninger ( f.eks. Iodometrisk titrering, se Materialelisten for suGgested kit).
- Ved hjælp af resultaterne af testmetoden beregnes mængden af opløsning, der skal tilsættes til vand ved anvendelse af følgende ligning:
- Forbered stabiliseret 0,05% NaOCl opløsning ved at tilsætte natriumhypochloritopløsning fremstillet ved hjælp af en elektrochlorinator, ultralugt vand og natriumklorid af natriumklorid (NaCl) til ultrapure vand.
- Klargør en 1% chloropløsning med ultralugt vand og NaCl ved anvendelse af en elektrochlorinator ifølge producentens anvisninger.
- Brug en titreringstest metode ( f.eks. Iodometrisk titrering) for at bekræfte koncentrationen af NaOCl stamopløsningen 32 .
- Ved hjælp af testens resultater beregnes mængden af opløsning, der skal tilsættes til vand, ved hjælp af følgende ligning:
- Bekræft cKoncentration af hver af klorhåndvaskopløsningerne ved anvendelse af en titreringsmetode ( f.eks. Iodometrisk titrering) og justering af opløsningerne ved tilsætning af vand eller chlorkildepulver / opløsning, indtil de ligger inden for en 10% fejl af målkoncentrationen (0,045-0,055%).
3. Forbered organismer og jordbelastning og kombiner for at producere inokulatet
BEMÆRK: I de følgende underafsnit anvendes E. coli og Phi6 som prøvebakterielle og virale organismer til metodebeskrivelsen.
- Forbered organismen til at blive testet ved en koncentration på over 10 x 10 8 CFU / ml for bakterier og større end 10 x 107 PFU / ml for virus.
- For at fremstille E. coli strimmer en nonpatogen stamme af E. coli på Luria-Bertani (LB) agarplader og inkuberer ved 37 ° C i 24 timer for at opnå enkle kolonier. Opbevares ved 4 ° C.
BEMÆRK: Dette kan gøres adskiltAl dage før eksperimentering.- En dag før forsøgets start vælges en enkelt koloni fra pladen og inokulerer 10 ml LB bouillon med en steril sløjfe. Inkubér natten over ved 37 ° C med omrystning.
- På morgenen af forsøget startes en frisk kultur ved at tilsætte 1 ml af natten over kulturen til 20 ml frisk LB bouillon. Inkubér i ca. 2,5 timer for at opnå en celletæthed større end 10 8 CFU / ml.
- Brug et spektrofotometer til at estimere koncentrationen af kulturen.
BEMÆRK: Brug en tidligere etableret konverteringsfaktor fra en standardkurve for den anvendte E. coli- stamme, hvilket sikrer en koncentration på over 10 8 CFU / mL 33 . Hvis celletætheden ikke er høj nok, returnerer kulturen til inkubatoren og testes igen, indtil den er klar.
- Bekræft koncentrationen under anvendelse af membranfiltrering 34 .
BEMÆRK: Udfør serielle fortyndinger oF kulturen i phosphatpufret saltvand (PBS), således at opløsningen filtreret vil frembringe et talbart antal kolonier på pladen (det nøjagtige tal vil afhænge af det anvendte medium).- Opsæt en flamme og en filtreringsmanifold med sterile filtreringstræner og en vakuumforbindelse. Steriliser tænger ved at flamme dem med ethanol. Brug dem til at placere et 0,45 μm filter på filtreringsgrenrøret, med gitteret vendt opad. Våd filteret med en lille mængde steril PBS.
- Placer tragten på bunden og tilsæt prøven opløsningen, der skal behandles ved pipettering eller hældning direkte på filteret. Indgreb vakuumet, indtil hele prøven har passeret gennem membranen. Skyl trappens sider med sterilt PBS og indgreb vakuumet igen.
BEMÆRK: Prøverne skal være mindst 100 μl og op til 100 ml. Hvis en prøve er mindre end 10 ml, tilsættes ca. 20 ml PBS til filtreringstragten inden filtrering for at sikre ensartet filtrering af sampetle. - Fjern tragten, flamme-sterilisere tang og løft filteret fra bunden. Placer filteret forsigtigt på LB-agaret i en petriskål, med gitteret vendt opad og sørg for, at filteret ligger i spidsen mod overfladen. Inverter pladerne og inkuber i 24 timer ved 37 ° C.
- Efter 24 timer skal du fjerne pladerne fra inkubatoren og tælle E. coli kolonierne. Brug disse data og den kendte fortyndingsfaktor og volumen af opløsningen til at beregne koncentrationen af den filtrerede opløsning i CFU / mL.
- Propagate Phi6 i Pseudomonas syringae vært ved anvendelse af dobbelt agar overlejringsmetoden 35 .
- Tilsæt 100 μl Phi6-stamcelsuspension og 100 μl P. syringae overnightkultur direkte til 6 ml blød agar (0,3%) næringsmedicinsk bouillon (NBY). Hæld det på plader med NBY hard agar (1,5%) og inkuber natten over ved 26 ° C. Forbered nok plader til at producere nok inokulum til ekspertenEstimering af et udbytte på ca. 4 ml virussuspension pr. Plade.
- Næste dag tilsættes 5 ml PBS oven på det bløde agarlag. Lad det stå ved stuetemperatur i 4 timer, hent det med en pipette og filtrer det med et 0,45 μm filter. Opbevares ved 4 ° C.
BEMÆRK: Denne løsning tjener som viral podning.
- Brug et plaque assay for at bekræfte, at koncentrationen er større end 10 7 PFU / ml 35 . Udfør serielle fortyndinger af virussuspensionen i PBS, således at 100 μl producerer et talbart antal plaques på pladen.
- Pipetter 100 μl af en passende fortyndet prøve og 100 μL overnight værts kultur direkte i et rør indeholdende 6 ml NBY blød agar. Hæld blød agar over NBY hard agar og inkuber ved 26 ° C i 24 timer.
- Næste dag skal du fjerne pladerne fra inkubatorerne og tælle antallet af plaques pr. Plade. Brug disse data og den kendte fortyndingsfaktorCtor og volumen af opløsningen til beregning af koncentrationen af den filtrerede opløsning i PFU / ml.
- For at fremstille E. coli strimmer en nonpatogen stamme af E. coli på Luria-Bertani (LB) agarplader og inkuberer ved 37 ° C i 24 timer for at opnå enkle kolonier. Opbevares ved 4 ° C.
- Forbered den tredobbelte jordbelastning, der er beregnet til at efterligne humant serum.
- Kombiner 7,80 mg / ml bovint serumalbumin, 10,92 mg / ml trypton og 2,52 mg / ml bovint mucin for at producere det krævede volumen jordbelastning. Efter at have blandet jordbelastningen, filtrer den gennem et 0,22 μm filter for at sterilisere. Opbevares ved 4 ° C indtil brug. Steriliser ikke, da proteinerne vil denaturere.
- Forbered en 0,9% NaCl-opløsning til blanding af inokulatet til forhold uden jordbelastning.
- Umiddelbart før testning, tilbered et inokulum sammensat af 68% bakteriel eller viral suspension og 32% jordbelastning. Brug for eksempel 1,02 ml bakteriel eller viral suspension fra trin 3.1.1.2 eller 3.1.3.2 og 0,48 ml af enten jordbelastning (trin 3.2.1) eller 0,9% NaCl-opløsning (trin 3.3). Hvirv eller hvirvel forsigtigt at blande.
BEMÆRK: 1,5 ml af detteInokulum vil blive brugt til hver frivillig under hver tilstand, så sørg for, at det samlede volumen af det dannede inokulum er tilstrækkeligt til det påtænkte antal forsøg.
4. Forberede frivillige til eksperimentet
BEMÆRK: Bestem organismen og jordbelastningsbetingelsen, der skal testes på den dag. De samme frivillige kan bruges til at teste flere forhold, men hver frivillige bør kun udsættes for en runde af test inden for en 48 h periode.
- Før du begynder at teste, bekræft, at frivillige forbliver kvalificerede ved verbalt at kontrollere, at de overholdt den 7-dages antimikrobielle udvaskningsperiode og ved visuelt at bekræfte, at de ikke har udviklet nogen brud eller abnormiteter på deres hud.
- Ved hjælp af en tilfældig talgenerator tildeles hver frivillig enten deres højre eller venstre hånd til prøveudtagning på denne testdag. Tildel en ordre, hvor håndvaskeforholdene vil blive udført.
BEMÆRK: ForEksempel, ABHS kan tildeles # 3 og vil blive udført tredje. - Udfør en "rensende vask" en gang i starten af testen for at fjerne huden af snavs og olier, så hver efterfølgende test udføres under tilsvarende betingelser.
- For at gøre en rengøringsvaske skal du løbe gennem hvert trin i forsøget (afsnit 5 nedenfor) ved hjælp af et tomt inokulat (kun LB-bouillon eller PBS) og tage en prøve uden håndvask.
5. Eksperimentel procedure
- For at teste pH-værdien for hver frivilliges hud (for at styre for variation) skal du placere en fladtippet hud-pH-sonde på palmar overfladeskinnet og mellemrummet mellem pegeren og mellemfingrene. Sørg for, at elektroden er flad mod huden. Optag pH-aflæsningen.
- Spike hænderne.
- Har frivillige cup begge hænder sammen. Spike hænderne med 1,5 ml af inokulatet ved omhyggeligt at pipettere 750 μl langsomt ind i hver håndflade.
- Lad frivillige forsigtigt gnide hænderne sammen, indtil alle overflader af hånden er belagt med inokuleringen, mens hænderne udsættes for så lidt friktion som muligt.
- Få frivillige til at holde deres hænder stille og væk fra deres krop i yderligere 30 s for at lade inokulatet tørre. Inokulatet må ikke tørre helt.
- Vask hænderne.
- Ved alle de følgende vaskeforløb skal du skylle rensevandet fra hænderne i en stor prøveopsamlingspose. Tilsæt 4,5 ml af en 12% natriumthiosulfatopløsning til posen for at neutralisere chlor ved kontakt og proces indenfor 2 timer.
BEMÆRK: Natriumthiosulfat bør tilsættes til alle prøver (selv dem uden klor) for at kontrollere for enhver påvirkning, det kan have på organismen. - Efter podning (afsnit 5.2) vaskes hænderne med den næste metode i den udpegede rækkefølge.
- For kontrol A skal du ikke udføre et håndvaske trin og gå direkte til trin5.5.
- Ved kontrol B vaskes hænderne kun med ultralugt vand ved stuetemperatur (ca. 21 ° C) gennem en tragt med en kendt strømningshastighed.
BEMÆRK: Her blev en strømningshastighed på 1,5 L / m og 500 ml vand anvendt. - Ved håndvask med sæbe, våd hænderne med 10 ml ultralugt vand. Lad de frivillige skumme deres hænder med sæbe og derefter gnide deres hænder sammen i yderligere 20 s. Skyl deres hænder ved at hælde 500 ml ultrapure vand ved stuetemperatur gennem en tragt med en strømningshastighed på 1,5 l / m.
- For alle chloropløsninger ( f.eks. ABHS, HTH, NaDCC og NaOCl), hæld 200 ml chloropløsning gennem en tragt med en strømningshastighed på 1,5 l / m, og få frivilligt til at gnide deres hænder grundigt.
- Ved alle de følgende vaskeforløb skal du skylle rensevandet fra hænderne i en stor prøveopsamlingspose. Tilsæt 4,5 ml af en 12% natriumthiosulfatopløsning til posen for at neutralisere chlor ved kontakt og proces indenfor 2 timer.
- Håndskyl med en modificeret handske juice procedure.
- Efter håndvask skal du straks placere hver frivilliges hånd ( dvs. hånden (højre eller venstre) valgt til testiNg i trin 4.2) i en prøvepose indeholdende 75 ml eluent ( f.eks. PBS) op til håndleddet. Hold toppen af posen tæt rundt om håndleddet.
BEMÆRK: Brug en eluent til prøveudtagning, der indeholder tilstrækkelig natriumthiosulfat til at neutralisere ethvert klor anvendt til håndvask. PBS er en almindeligt anvendt eluent, der passer til mange organismer. - Lad frivillige forsigtigt gnide hånden i opløsningen i 30 s, og sørg for at nå mellem fingrene og under neglene. Masser hånden ud af posen forsigtigt i 30 s for at sikre, at hele hånden skylles grundigt i eluenten helt op til håndleddet.
- Sæt posen og behandle den i overensstemmelse med det relevante assay, beskrevet i afsnit 6, inden for 2 timer.
- Efter håndvask skal du straks placere hver frivilliges hånd ( dvs. hånden (højre eller venstre) valgt til testiNg i trin 4.2) i en prøvepose indeholdende 75 ml eluent ( f.eks. PBS) op til håndleddet. Hold toppen af posen tæt rundt om håndleddet.
- Dekontaminering.
- Inden du gentager processen med hver håndvask metode, skal de frivillige vaske deres hænder grundigt i en vask med sæbe og varmt vand. Spray frivilligeRs 'hænder med 70% ethanol, indtil de er belagt på begge sider. Lad dem tørre.
- Gentag alle trin i afsnit 5 for hver håndvask, brug kun hånden tilfældigt valgt i trin 4.2 ( Figur 1 ).
6. Kvantificering
- Udfør analyser, der er passende for den valgte organisme ( fx membranfiltrering for bakterier eller plaque-assay for vira, beskrevet ovenfor i henholdsvis afsnit 3.1.2 og 3.1.4).
- Efter optælling af pladerne registreres den estimerede CFU / mL eller PFU / mL for hver test til analyserne (afsnit 3.1.2 og 3.1.4).
7. Analyse
- Ved hjælp af resultaterne fra trin 6.2 beregnes loggreduktionsværdien af organismer på hænderne, for hver organisme og jordbelastningsstatus og for hvert emne og håndvaske.
- Til håndvask effektivitet, sammenlign koncentrationen af bakterier / virus i hver Håndvask prøve til kontrol A (ingen håndvask). For skyllevandstannelse skal du sammenligne hver skyllevandprøve til kontrol B (kun vask med vand). Brug følgende standard formel:
Log Reduktion (håndvask ) =
Log Reduktion (skyllevand ) =
BEMÆRK: Logreducering kan også udtrykkes som log 10 (uden håndvask) - log 10 (med håndvask)
- Til håndvask effektivitet, sammenlign koncentrationen af bakterier / virus i hver Håndvask prøve til kontrol A (ingen håndvask). For skyllevandstannelse skal du sammenligne hver skyllevandprøve til kontrol B (kun vask med vand). Brug følgende standard formel:
- Brug en envejs gentagen måleanalyser af varians (ANOVA) til at vurdere de signifikante forskelle i de beregnede logreduktionsværdier mellem håndvaskningsmetoder og en post-hoc Tukey's HSD-test for signifikante modeller til parvis at vurdere væsentlige forskelle (p <0,05)Ef "> 36.
- Før du kører ANOVA, vurder hvert datasæt til sfæriskhed ( f.eks. Ved brug af Bartlett's test). Anvend en korrektion ( f.eks. Greenhouse-Geisser-korrektionen), når testen indikerer, at sfæricitet blev overtrådt 37 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her blev protokollen ( figur 1 ) afsluttet med 18 frivillige, som hver blev testet under anvendelse af både E. coli og Phi6. Der blev fundet signifikante forskelle mellem håndvaskresultater med E. coli både med og uden jordbelastning og Phi6 med jordbelastning ( Figur 2 og Figur 3 ). For E. coli uden jordbelastning resulterede håndvask med HTH, NaDCC og stabiliseret NaOCl alle signifikant større logreduktioner end håndvask med vand kun (F (6.102) = 2,72, p = 0,034). Med jordbelastning resulterede HTH i en signifikant større logreduktion af E. coli end kun vand, HWWS og ABHS (F (6.102) = 3,94, p <0,001). Der var ingen signifikant forskel mellem metoderne for Phi6 uden jordbelastning (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). For Phi6 med jordbelastning (F (6,102) = 7,01, p <0,001) resulterede vand alene imidlertid i en grebAter log reduktion end ABHS eller stabiliseret NaOCl og HWWS i en større log reduktion end ABHS, stabiliseret NaOCl og genereret NaOCl. HTH havde også en større logreduktion end ABHS og stabiliseret NaOCl, og NaDCC resulterede i en større logreduktion end stabiliseret NaOCl og ABHS. Mens HTH udførte mest konsekvent godt på tværs af forholdene, ville vi være forsigtige med overfortolkning af betydelige resultater, da mange konfidensintervaller var store, der varierede fra mindre end 0,5 log til mere end 1,5 logreduktion i mange tilfælde.
I skyllevand resulterede klor i en signifikant større logreducering af E. coli, der vedbliver i skyllevandet end HWWS (uden jordbelastning, F (4,68) = 331,7, p <0,001, med jordbelastning F (4,68) ) = 162,44, p <0,001) ( figur 4 ). Dette samme mønster blev fundet i Phi6 uden jordbelastning ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), med alle chloropløsninger resulterende somAntændelig større reduktion af Phi6 i skyllevand end HWWS. Der var ingen signifikante forskelle i vedholdenhed i skyllevand med Phi6 og jordbelastning ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) ( Figur 5 ).
Figur 1: Eksperimentoversigt. De fem trin, der udføres for hver håndrundsrunde, omfatter: 1) pH-test, 2) Inokulering af hænderne, 3) Håndvask, 4) Skylling af hænderne og 5) Dekontaminering af hænderne for hver af de otte testede betingelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: E. coli håndvask res ÜLTS. Sammenlignet med ingen håndvask resulterede de afprøvede håndvaskningsmetoder i en gennemsnitlig logreduktion i E. coli på 1,94-3,01 uden jordbelastning og 2,18-3,34 med jordbelastning. Håndvask med vand demonstrerede den mindste reduktion i E. coli under begge betingelser (1,94 og 2,18 log). Håndvask med NaDCC resulterede i den største reduktion uden jordbelastning (3,01), og HTH resulterede i den største reduktion med jordbelastning (3,34). I diagrammerne repræsenterer linjen procentvis reduktion i organismer, og fejlstængerne repræsenterer standardfejlen ved logreduktion. Ctrl B, kontrol B; HWWS, håndvask med sæbe; ABHS, alkoholbaseret håndrensning; HTH, højprøvehypochlorit; NaDCC, natriumdichloroisocyanurat; St NaOCl, stabiliseret natriumhypochlorit; Gen NaOCl, dannet natriumhypochlorit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Phi6 håndvaskresultater. Sammenlignet med ingen håndvask resulterede de afprøvede håndvaskningsmetoder i en gennemsnitlig logreduktion i Phi6 på 2,44-3,06 uden jordbelastning og 2,71-3,69 med jordbelastning. Håndvask med sæbe viste den mindste reduktion i Phi6 uden jordbelastning (2,44), og håndvask med stabiliseret NaOCl resulterede i den mindste reduktion med jordbelastning (2,71). Håndvask med genereret NaOCl resulterede i den største reduktion uden jordbelastning (3,06), og håndvask med sæbe resulterede i den største reduktion med jordbelastning (3,69). I diagrammerne repræsenterer linjen procentvis reduktion i organismer, og fejlstængerne repræsenterer standardfejlen ved logreduktion. Ctrl B, kontrol B; HWWS, håndvask med sæbe; ABHS, alkoholbaseret håndrensning; HTH, højprøvehypochlorit; NaDCC, natriumdichloroisocyanurat;St NaOCl, stabiliseret natriumhypochlorit; Gen NaOCl, dannet natriumhypochlorit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: E. coli håndskyllingsresultater. Sammenlignet med håndvask kun med vand var den gennemsnitlige logreduktion af E. coli, der var tilbage i skyllevandet 0,28-4,77 uden jordbelastning og 0,21-4,49 med jordbelastning. Både med og uden jordbelastning blev den mindste reduktion fundet i håndvask med sæbe (0,28 og 0,21). De største reduktioner blev observeret med stabiliseret og genereret NaOCl uden jordbelastning (både 4,77) og med HTH og dannet NaOCl med jordbelastning. I diagrammerne repræsenterer linjen den procentvise reduktion af organismer, og fejlstavene repræsenterer sTandard fejl af log reduktion. HWWS, håndvask med sæbe; ABHS, alkoholbaseret håndrensning; HTH, højprøvehypochlorit; NaDCC, natriumdichloroisocyanurat; St NaOCl, stabiliseret natriumhypochlorit; Gen NaOCl, dannet natriumhypochlorit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Phi6 håndskyllingsresultater. Sammenlignet med håndvask kun med vand var den gennemsnitlige logreduktion af Phi6, der var tilbage i skyllevandet, 1,26-2,02 uden jordbelastning og 1,30-2,20 med jordbelastning. Med jordbelastning blev den mindste reduktion fundet i håndvask med sæbe (1,26). Uden jordbelastning resulterede HTH i den mindste reduktion (2,02). De største reduktioner blev observeret både med og uden jordbelastning med NaDCC(2,02 og 2,20). I diagrammerne repræsenterer linjen procentvis reduktion i organismer, og fejlstængerne repræsenterer standardfejlen ved logreduktion. HWWS, håndvask med sæbe; ABHS, alkoholbaseret håndrensning; HTH, højprøvehypochlorit; NaDCC, natriumdichloroisocyanurat; St NaOCl, stabiliseret natriumhypochlorit; Gen NaOCl, dannet natriumhypochlorit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af De Forenede Nationers Agentur for International Udvikling, Office of Foreign Disaster Assistance (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe blev støttet af National Science Foundation (grant 0966093).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soap bar | Dove | White Beauty Bar soap | |
| Alcohol-based hand sanitizer | Purell | Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol | |
| HTH Powder | Acros Organics | 300340010 | |
| NaDCC Powder | Medentech | Klorsept granules | |
| NaOCl Solution | Acros Organics | 419550010 | |
| Electrochlorinator | AquaChlor | ||
| Iodometric titrator | Hach | 1690001 | |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | NC0117242 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-100 | |
| Bovine Mucin | EMD Milipore | 49-964-3500MG | |
| 0.22 µm Filter | EMD Milipore | GVWP04700 | |
| NaCl | Fisher | BP358-1 | |
| Skin pH probe | Hanna Instruments | H199181 | |
| Large Whirlpak Sample Bag | Nasco | B01447WA | |
| Small Whirlpak Sample Bag | Nasco | B01323WA | |
| Funnel bottle | Thermo Scientific | 3120850001 | You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate |
| Ethanol | ThermoScientific | 615090010 | Mix with water to produce 70% ethanol |
| Spray bottle | Qorpak | PLC06934 | |
| E. coli | ATCC | 25922 | |
| LB Broth | Fisher BioReagents | BP1426-2 | |
| LB Agar | Fisher BioReagents | BP1425-500 | |
| Sterile loop | Globe Scientific | 22-170-204 | |
| Phi6 | HER | 102 | |
| Nutrient broth | BD Difco | BD 247110 | |
| GeneQuant 100 Spectrophotometer | General Electric | 28-9182-04 | |
| Sodium thiosulfate | Fisher Chemical | S445-3 | |
| Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) | EMD Millipore | HAWP04700 | |
| m-ColiBlue24 broth media | EMD Millipore | M00PMCB24 | |
| Petri dish with pad (47 mm) | Fisherbrand | 09-720-500 | |
| Vacuum Manifold | Thermo Scientific/Nalgene | 09-752-5 | |
| Filter funnels | Thermo Scientific/Nalgene | 09-747 | |
| Pseudomonas syringae | HER | 1102 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific | 10010031 | Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe |
References
- Kampf, G., Kramer, A. Epidemiologic Background of Hand Hygiene and Evaluation of the Most Important Agents for Scrubs and Rubs. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 863-893 (2004).
- Miller, T., Patrick, D., Ormrod, D. Hand decontamination: influence of common variables on hand-washing efficiency. Healthc Infect. 16 (1), 18 (2013).
- Jensen, D. A., Danyluk, M. D., Harris, L. J., Schaffner, D. W. Quantifying the effect of hand wash duration, soap use, ground beef debris, and drying methods on the removal of Enterobacter aerogenes on hands. J Food Prot. 78 (4), 685-690 (2015).
- Girou, E., Loyeau, S., Legrand, P., Oppein, F., Brun-Buisson, C. Efficacy of handrubbing with alcohol based solution versus standard handwashing with antiseptic soap: randomised clinical trial. BMJ. 325 (7360), 362 (2002).
- Kac, G., Podglajen, I., Gueneret, M., Vaupré, S., Bissery, A., Meyer, G. Microbiological evaluation of two hand hygiene procedures achieved by healthcare workers during routine patient care: a randomized study. J Hosp Infect. 60 (1), 32-39 (2005).
- Lages, S. L. S., Ramakrishnan, M. A., Goyal, S. M. In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect. 68 (2), 159-163 (2008).
- Holton, R. H., Huber, M. A., Terezhalmy, G. T. Antimicrobial efficacy of soap and water hand washing versus an alcohol-based hand cleanser. Tex Dent J. 126 (12), Retrieved from: http://www.tda.org/Publications/Texas-Dental-Journal 1175-1180 (2009).
- Salmon, S., Truong, A. T., Nguyen, V. H., Pittet, D., McLaws, M. -L. Health care workers' hand contamination levels and antibacterial efficacy of different hand hygiene methods used in a Vietnamese hospital. Am J Infect Control. 42 (2), 178-181 (2014).
- Steinmann, J., Nehrkorn, R., Meyer, A., Becker, K. Two in-vivo protocols for testing virucidal efficacy of handwashing and hand disinfection. Int J Hyg Environ Health. 196 (5), Retrieved from: https://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hygiene-and-environmental-health 425-436 (1995).
- Weber, D. J., Sickbert-Bennett, E., Gergen, M. F., Rutala, W. A. Efficacy of selected hand hygiene agents used to remove Bacillus atrophaeus (a surrogate of Bacillus anthracis) from contaminated hands. JAMA. 289 (10), 1274-1277 (2003).
- Grayson, M. L., Melvani, S., et al. Efficacy of Soap and Water and Alcohol-Based Hand-Rub Preparations against Live H1N1 Influenza Virus on the Hands of Human Volunteers. Clin Infect Dis. 48 (3), 285-291 (2009).
- Oughton, M. T., Loo, V. G., Dendukuri, N., Fenn, S., Libman, M. D. Hand hygiene with soap and water is superior to alcohol rub and antiseptic wipes for removal of Clostridium difficile. Infect Control Hosp Epidemiol. 30 (10), 939-944 (2009).
- Liu, P., Yuen, Y., Hsiao, H. -M., Jaykus, L. -A., Moe, C. Effectiveness of liquid soap and hand sanitizer against Norwalk virus on contaminated hands. Appl Environ Micro. 76 (2), 394-399 (2010).
- Savolainen-Kopra, C., Korpela, T., et al. Single treatment with ethanol hand rub is ineffective against human rhinovirus--hand washing with soap and water removes the virus efficiently. J Med Virol. 84 (3), 543-547 (2012).
- Tuladhar, E., Hazeleger, W. C., Koopmans, M., Zwietering, M. H., Duizer, E., Beumer, R. R. Reducing viral contamination from finger pads: handwashing is more effective than alcohol-based hand disinfectants. J Hosp Infect. 90 (3), 226-234 (2015).
- Steinmann, J., Paulmann, D., Becker, B., Bischoff, B., Steinmann, E., Steinmann, J. Comparison of virucidal activity of alcohol-based hand sanitizers versus antimicrobial hand soaps in vitro and in vivo. J Hosp Infect. 82 (4), 277-280 (2012).
- de Aceituno, A. F., Bartz, F. E., et al. Ability of Hand Hygiene Interventions Using Alcohol-Based Hand Sanitizers and Soap To Reduce Microbial Load on Farmworker Hands Soiled during Harvest. J Food Protect. 78 (11), 2024-2032 (2015).
- Sterk, E. Médecins Sans Frontières - Filovirus Haemorrhagic Fever Guideline. , Available from: http://jid.oxfordjournals.org/content/204/suppl_3/S791.full (2008).
- World Health Organization. WHO Report. Ebola Virus Disease ( EVD ) Key questions and answers concerning water, sanitation and hygiene. , Available from: http://www.who.int/water_sanitation_health/WASH_and_Ebola.pdf 1-5 (2014).
- World Health Organization. Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. First Global Patient Safety Challenge, Clean Care is Safer Care. , Available from: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241597906_eng.pdf (2009).
- Boyce, J. M., Pittet, D. Guideline for Hand Hygiene in Health-Care Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee and the HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. Infect Control Hosp Epidemiol. 23 (12 Suppl), Society for Healthcare Epidemiology of America. S3-S40 (2002).
- Emmanuel, J., Ndoye, B. UNDP Medical Waste Experts Assessment and Recommendations Regarding Management of Ebola-Contaminated Waste. , United Nations Development Programme. Available from: https://noharm-global.org/sites/default/files/documents-files/3127/Report%20to%20WHO%20WASH%20and%20Geneva%20on%20Ebola%20final.pdf (2015).
- Hopman, J., Kubilay, Z., Allen, T., Edrees, H., Pittet, D., Allegranzi, B. Efficacy of chlorine solutions used for hand hygiene and gloves disinfection in Ebola settings: a systematic review. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 1 (2015).
- Lowbury, E. J. L., Lilly, H. A., Bull, J. P. Disinfection of hands: removal of transient organisms. BMJ. 2 (5403), 230-233 (1964).
- Edmonds, S. L., Zapka, C., et al. Effectiveness of Hand Hygiene for Removal of Clostridium difficile Spores from Hands. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (3), 302-305 (2013).
- Rotter, M. L. 150 years of hand disinfection-Semmelweis' heritage. Hyg Med. (22), 332-339 (1997).
- Hitomi, S., Baba, S., Yano, H., Morisawa, Y., Kimura, S. Antimicrobial effects of electrolytic products of sodium chloride--comparative evaluation with sodium hypochlorite solution and efficacy in handwashing. Kansenshōgaku Zasshi. 72 (11), 1176-1181 (1998).
- ASTM International. Standard E1174-13. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Health Care Personnel Handwash Formulations. , Available from: https://www.astm.org/ (2013).
- Casanova, L. M., Weaver, S. R. Evaluation of eluents for the recovery of an enveloped virus from hands by whole-hand sampling. J Appl Microbiol. 118 (5), 1210-1216 (2015).
- Sinclair, R. G., Rose, J. B., Hashsham, S. A., Gerba, C. P., Haas, C. N. Criteria for Selection of Surrogates Used To Study the Fate and Control of Pathogens in the Environment. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1969-1977 (2012).
- Held, E., Skoet, R., Johansen, J. D., Agner, T. The hand eczema severity index (HECSI): A scoring system for clinical assessment of hand eczema. A study of inter- and intraobserver reliability. Br J Dermatol. 152 (2), 302-307 (2005).
- Chlorine Total, Iodometric Method Using Sodium Thiosulfate, Method 8209 Digital Titrator. , Available from: http://www.hach.com/asset-get.download-en.jsa?id=7639983937 (2016).
- GeneQuant 100 User Manual. , Available from: http://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/support-genequant-100/Genequant-100-UM.pdf (2016).
- United States Environmental Protection Agency. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium). , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/method_1604_2002.pdf (2002).
- Adams, M. H., Anderson, E. S. Bacteriophages. , Interscience Publishers. New York. (1959).
- Kao, L. S., Green, C. E. Analysis of Variance: Is There a Difference in Means and What Does It Mean? The Journal of surgical research. 144 (1), 158-170 (2008).
- Schutz, R. W., Gessaroli, M. E. The Analysis of Repeated Measures Designs Involving Multiple Dependent Variables. Research Quarterly for Exercise and Sport. 58 (2), 132-149 (1987).
- Woolwine, J. D., Gerberding, J. L. Effect of testing method on apparent activities of antiviral disinfectants and antiseptics. Antimicrob Agents Chemother. 39 (4), 921-923 (1995).
