Summary
Este trabajo presenta un nuevo modelo in vivo de lesión renal segmentaria utilizando el pez cebra transgénico GFP de riñón. El modelo permite la inducción de la ablación específica de las células epiteliales del riñón para mostrar los mecanismos celulares de la lesión nefrona y la reparación.
Abstract
La lesión aguda del riñón (LRA) es una condición médica común con una alta tasa de mortalidad. Con las habilidades de reparación del riñón, es posible restaurar la función renal adecuada después del tratamiento de apoyo. Sin embargo, se necesita una mejor comprensión de cómo la muerte y la reparación de las células nefronas ocurren a nivel celular para minimizar la muerte celular y mejorar el proceso regenerativo. El pronefros del pez cebra es un buen sistema modelo para lograr este objetivo porque contiene segmentos anatómicos que son similares al nefrón de mamíferos. Anteriormente, el modelo más común utilizado para estudiar la lesión renal en los peces era el modelo farmacológico de la gentamicina. Sin embargo, este modelo no permite un control espaciotemporal preciso de la lesión, por lo que es difícil estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la reparación renal. Para superar esta limitación, este trabajo presenta un método a través del cual, en contraste con el enfoque de gentamicina, una proteína verde fluorescente específica (GFP) -exEl prensado del segmento nefrón puede ser fotoablado usando una luz láser violeta (405 nm). Este nuevo modelo de AKI proporciona muchas ventajas que otros métodos de lesión epitelial carecen. Sus principales ventajas son la capacidad de "marcar" el nivel de lesión y el control espaciotemporal preciso en el robusto modelo animal in vivo . Este nuevo método tiene el potencial de avanzar significativamente el nivel de comprensión de la lesión renal y los mecanismos de reparación.
Introduction
La lesión aguda del riñón 1 , 2 , que también se puede denominar insuficiencia renal aguda, se define ampliamente como una alteración súbita de la función renal 3 . Mientras que el nivel de comprensión de esta condición se ha mejorado notablemente en los últimos años, las tasas de morbilidad y mortalidad se han mantenido altas 1 , 2 . El tratamiento actual para esta condición es en su mayoría de apoyo, ya que los resultados de múltiples ensayos clínicos de la terapia de drogas han sido negativos 4 , 5 . El riñón es único en que tiene la capacidad de repararse. Por lo tanto, la terapia de apoyo después de un diagnóstico precoz de la IRA es la mejor manera de limitar la morbilidad 6 . Sin embargo, es difícil detectar la LRA tempranamente, y la tasa de mortalidad es sorprendente en un 50-80% para aquellos que requieren diálisis 5. Con la capacidad de los riñones para repararse y la falta de opciones de tratamiento para esta condición, es importante desarrollar métodos para mejorar este proceso de regeneración de nefrón.
Ha habido muchos modelos diferentes utilizados para la investigación de AKI que incluye diferentes agentes de lesiones y modelos animales. En términos de agentes de daño renal, el aminoglucósido antibiótico gentamicina se ha utilizado como un agente nefrotóxico que conduce a AKI 7 , 8 . Sin embargo, varios grupos han encontrado que el tratamiento con gentamicina es letal para el embrión de pez cebra 9 . Provoca daños tubulares que son demasiado graves para la recuperación del embrión, haciendo difícil el estudio de la regeneración sin algún tipo de intervención. Los modelos de mamíferos, como el ratón y la rata, también se consideran valiosos, pero se enfrentan a muchas limitaciones durante el estudio de la LRA. Tal vez la principal desventaja de los modelos de roedores es la dificultad en visuaDeterminando así los procesos espaciotemporales precisos que conducen a la muerte y reparación epiteliales.
Johnson et al. Han informado de una técnica basada en la ablación con láser para inducir una lesión renal aguda en el pez cebra embrionario y larval 9 . Utilizaron la ablación láser pulsada para dañar el riñón después de una inyección intramuscular con conjugados de dextrano. La fluorescencia de los conjugados dextrano permite la visualización del daño y la regeneración en el epitelio de los túbulos [ 9] . Este modelo supera las dos limitaciones mencionadas anteriormente, pero no permite niveles graduados de lesión y es difícil de llevar a cabo en grandes grupos de células arbitrarias.
El nuevo modelo basado en la ablación láser de pez cebra de AKI descrito aquí se ocupa de todas las limitaciones anteriores. El riñón proneférico en el pez cebra larvario es un órgano maduro y funcional que contiene segmentos similares a los mamíferos nePhron, incluyendo un glomérulo, túbulos proximal y distal, y un conducto colector 10 . Las larvas de pez cebra también son ópticamente transparentes, lo que hace factible observar el riñón a través de técnicas de fluorescencia. Por lo tanto, el pez cebra es un valioso modelo in vivo de IRA, y el riñón pronefrico larvario (5-12 días después de la fecundación (dpf)) puede ser usado para estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la lesión renal y la reparación.
Este artículo presenta un método a través del cual los segmentos de nefrona que expresan la Proteína Fluorescente Verde (GFP) específica pueden ser fotoablados usando una luz láser violeta de baja energía (en comparación con un sistema de láser pulsado) (405 nm). La fluorescencia GFP permite la orientación de un grupo de células, haciendo que los cambios que se hacen visibles a través de la observación de GFP photobleaching. Además, la GFP (mediante la absorción de luz violeta) sirve como un sumidero de energía para potenciar la lesión en células renales que expresan GFP. Micros de lapso de tiempoCopia se puede utilizar para estudiar el proceso de reparación. Los estudios han encontrado que la proliferación celular, la migración celular y la metaplasia celular 11 , 12 , 13 son procesos potenciales que pueden desempeñar un papel importante en la reparación renal. Sin embargo, la importancia relativa de estos procesos y los detalles de su interacción han sido difíciles de descubrir debido a las limitaciones de los modelos existentes de AKI. Utilizando este nuevo enfoque, fue posible demostrar que la migración celular desempeña un papel central en la reparación renal después de una lesión aguda [ 14] .
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Protocol
Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Colegio de Medicina de Osteopatía de NYIT Instituto de Cuidado de Animales y Comité de Uso (NYITCOM IACUC). Toda la cirugía y la experimentación in vivo se realizó bajo anestesia con tricaína, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
1. Obtención y mantenimiento de embriones
- Obtener embriones cruzando el riñón GFP fluorescente pez cebra.
NOTA: Los ejemplos de líneas transgénicas de pez cebra marcadas fluorescentemente se enumeran en la Tabla 1 . - Mantener los embriones a 28,5 ° C en solución de E3 durante las 24 h posteriores a la fecundación.
- Después de 24 h, sustituir el medio con una solución de E3 que contiene 0,003% de 1-fenil-2-tiourea (PTU).
NOTA: La PTU se utiliza porque bloquea los pasos dependientes de la tirosinasa en la melanogénesisY por lo tanto previene la pigmentación. Aquí, esta solución se conoce como E3-PTU. - Elevar los embriones fertilizados a 28,5 ° C hasta que son> 6 dpf, momento en el que los riñones han madurado.
NOTA: Lo mejor es utilizar larvas en la ventana 7-9 dpf. - Utilizando un microscopio de disección fluorescente con un aumento de 40X y filtros de emisión de fluorescencia verde, seleccione las larvas con fluorescencia brillante de GFP en el riñón.
2. Montaje del Zebrafish para Live-imaging
- Si fotoablating los embriones antes de 3 dpf, quitar el chorion de cualquier pez cebra sin sombrear antes de montar el pez cebra para la formación de imágenes.
- Manualmente dechorinate con fórceps (preferido) o utilizar un tratamiento químico con una mezcla de proteasa.
NOTA: Dechorination permite obtener los mejores resultados de imagen.
- Manualmente dechorinate con fórceps (preferido) o utilizar un tratamiento químico con una mezcla de proteasa.
- Enjuague los restos de corión en la placa de petri usando la solución E3-PTU y rellene el plato con E3-PTU.
- PrepaL 1-2% de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) con solución de tricaína 0,2 mg / ml para montar el pez cebra para la fotoablación renal y la imagen en vivo.
- Si la agarosa LMP ya estaba preparada de antemano, recaliéntela en el microondas para derretirla.
- Una vez que se prepara la agarosa LMP, coloque una placa de Petri de plástico de 35 mm en un microscopio de disección. Coloque una sonda de vidrio tirado cerca para orientar adecuadamente las larvas anestesiadas.
NOTA: Es importante hacer este paso de manera oportuna y tener todo en su lugar, porque los embriones deben orientarse antes de que la agarosa se solidifique en aproximadamente 1-3 minutos. - Antes de transferir el embrión a la agarosa, asegúrese de que la agarosa esté fría ( es decir , aproximadamente a la temperatura corporal). Utilice una pipeta de transferencia de plástico o vidrio para colocar el embrión en la solución de agarosa-tricaína fundida enfriada.
NOTA: Esto se hace porque la agarosa que es demasiado caliente puede ser perjudicial para el embrión, lo que lleva a un paro cardiacoO muerte - Usando una pipeta de transferencia, vuelva a dibujar el embrión en la solución de agarosa y coloque el embrión / larva en medio de un plato de 35 mm.
- Esparcir rápidamente la agarosa que contiene el embrión / larva para cubrir uniformemente el fondo del plato de 35 mm; El mejor volumen de agarosa para usar es de ~ 1-1,1 mL.
- Utilice la sonda de vidrio para orientar el embrión en la mejor posición posible para la fotoablación y la obtención de imágenes.
NOTA: La película 1 muestra la mejor orientación del embrión / larva para la fotoablación unilateral. Este paso es el más sensible al tiempo y debe realizarse rápidamente antes de que la agarosa comience a gelificarse, ya que cualquier intento de reorientar el pescado después de que comience la gelificación es perjudicial.- Oriente la larva para que el segmento de riñón de interés sea perpendicular a la trayectoria del haz, mientras que el segmento contralateral está alejado del rayo láser (ver Película 1 ).
NOTA: Esto se puede lograr girando la larva como se muestra en la Película 1 . - Deje unos 15 minutos para que la agarosa se solidifique. Cubrir la placa de Petri para minimizar la evaporación. Una vez que la agarosa se ha solidificado, el embrión o larva está listo para la fotoablación.
3. Ablación láser
- Operar el sistema de imágenes confocal.
NOTA: Cuando se utiliza la plataforma de imágenes referenciada (ver tabla de materiales), los ajustes recomendados incluyen una ampliación de 40X, una lente de inmersión de 0,8 NA y el primer conjunto de espejo dicroico para permitir la iluminación de 488 y 405 nm de la muestra. La detección debe realizarse en el canal verde. - Coloque el plato que contiene el pez cebra inmovilizado en una etapa confocal.
NOTA: Este procedimiento se optimiza para la configuración vertical usando una lente de inmersión de agua 40-60X. Sin embargo, debería ser posible modificar el procedimiento para un microscopio invertido. - En la configuración vertical, coloque la placa de Petri que contiene el embrión en la parte superior de un microscOpe la diapositiva y manténgala en su lugar utilizando arcilla de modelado ( por ejemplo, plastilina). Coloque el portaobjetos de vidrio con la placa de Petri sobre el escenario del microscopio confocal.
- Añadir 3 ml de la solución de formación de imágenes E3-PTU (ver paso 1.3) con 0,2 mg / ml de tricaína.
NOTA: La solución de imagen también se puede añadir inmediatamente antes de colocar la diapositiva en el escenario. La adición de la solución de la proyección de imagen se debe hacer muy cuidadosamente para evitar que la agarosa flote de la parte inferior del plato. - Cambie a la lente de inmersión de agua (40 o 60X). Levante lentamente la platina, asegurándose de que la lente esté ligeramente inclinada para evitar que el aire quede atrapado en la trayectoria del haz. Una vez que el objetivo toca la solución en un ángulo, el centro de manera que se encuentra en el campo de visión de los embriones.
- Encuentre el segmento de interés usando la fuente de luz de fluorescencia. Posicione superficialmente la rama dirigida a la lesión para minimizar la dispersión de la luz (vea Película 1 ).
NOTA: El subsequenT pasos hacen uso de software referenciado (ver la Tabla de Materiales), pero el procedimiento puede ser fácilmente adaptado a otras plataformas. - Abra el software. Navegue hasta "Ver" | "Control de Adquisición" | "C2plus Compact GUI" y establecer "tiempo de permanencia de píxeles" a "1,9 μs", "tamaño de marco" a "512 x 512 píxeles" y "tamaño de pinhole" a "90 μm". Ajuste "intensidad láser de 405 nm (o 408 nm en algunos sistemas)" a cero y "intensidad láser 488" a "baja" (preferiblemente <1%). Ajuste la "ganancia" para obtener un buen rango dinámico pero no para saturar la señal.
NOTA: Estos valores no son críticos y se utilizan para la coherencia. Cuando se utiliza un láser de 405 nm, resultará en aumentos en la fluorescencia GFP. Para evitar la saturación de la señal durante el fotoblanqueo (paso 3.11), el valor de ganancia de la señal debe reducirse en el canal verde. La ganancia de canal azul se puede dejar en cero, ya que no se utiliza para saMpling - Haga clic en "Escanear" en la interfaz de software para escanear el riñón usando un láser de 488 nm. Encuentre el segmento de interés que es perpendicular a la trayectoria del haz y que está bien visualizado, con buena fluorescencia GFP. Una vez que esa región ha sido identificada, dibuje una región de interés usando una región de interés (ROI) elíptica.
- Navegar hasta "ROI" | "Dibuja ROI elíptico."
NOTA: Esto se usará para medir continuamente la intensidad promedio de GFP mientras se lleva a cabo el fotoblanqueo, permitiendo la administración de una dosis precisa de tratamiento con láser.
- Navegar hasta "ROI" | "Dibuja ROI elíptico."
- Navegue hasta "Ver" | "Controles de adquisición" | "Área de escaneo C2plus" y seleccione "Área de exploración de banda". La máscara rectangular aparecerá dentro de esa interfaz. Defina manualmente una ventana de exploración rectangular con el cursor ( es decir , arrastrar, cambiar el tamaño y girar la máscara) para cubrir el segmento dirigido para la ablación con láser. Haga clic con el botón derecho en elZona de máscara para aceptar la selección.
NOTA: Sólo se escaneará la región seleccionada. - Comience la medición del tiempo mientras monitoriza el canal verde utilizando sólo el láser de 488 nm para activar GFP. Asegúrese de que la intensidad del láser 488 es relativamente baja (~ 1%). Medir la intensidad media de la GFP en la región de interés seleccionando "Measure" | "Medición del tiempo". Utilice las fichas "Gráfico" o "Datos" para supervisar los valores de intensidad media dentro del ROI.
NOTA: La velocidad de adquisición se define por el tiempo de permanencia de los píxeles y el tamaño de la ventana rectangular establecida en el paso 3.9, pero en general, permite la supervisión rápida de la señal (~ 2-10 cuadros / s). - Inducir daño a las células del riñón con el láser violeta (405 nm) aumentando la intensidad al 100% deslizando el control de la "potencia del láser" completamente a la derecha. El láser de 488 nm puede permanecer activo si la intensidad es baja.
- Observe una línea gUsando la pestaña "Gráfico" o los valores numéricos de la intensidad GFP usando la pestaña "Datos" y esperar hasta que caiga a un nivel deseado, por ejemplo 50% de la línea base (como se muestra en la Figura 1 ).
NOTA: Se ha utilizado un láser de 20 mW como parte de la unidad láser referenciada (ver la Tabla de Materiales ); La intensidad máxima puede variar entre los sistemas. Una intensidad más baja puede ser compensada por una exposición más prolongada ( es decir, usando el porcentaje de blanqueo GFP como una medida de la exposición total).
- Observe una línea gUsando la pestaña "Gráfico" o los valores numéricos de la intensidad GFP usando la pestaña "Datos" y esperar hasta que caiga a un nivel deseado, por ejemplo 50% de la línea base (como se muestra en la Figura 1 ).
- Una vez que la intensidad GFP dentro del ROI elíptico (paso 3.8) ha bajado a un nivel deseado, disminuya inmediatamente la intensidad del láser violeta (405 nm) a "0" moviendo el control deslizante de "potencia láser" completamente a la izquierda en El panel de control del software.
- Obtener una nueva línea base de fluorescencia GFP. Confirme la ablación obteniendo una relación de X / Y.
NOTA: Vea la Figura1B; Y = intensidad media antes de la ablación y X = intensidad media después de la ablación, utilizando un promedio de 4 muestras consecutivas dentro del ROI. La proporción objetivo exacta (50%, 60%, etc. ) depende de la cantidad de lesión que se desea para un experimento dado.
- Obtener una nueva línea base de fluorescencia GFP. Confirme la ablación obteniendo una relación de X / Y.
4. Microscopía de lapso de tiempo con tinción con yoduro de propidio
- Aplique consideraciones generales de lapso de tiempo (resumidas en un estudio previo 15 ) para visualizar la tinción con yoduro de propidio como un correlato de la lesión de células renales después de la fotoablación.
- Pre-incubar las larvas en 30 μ M solución de yoduro de propidio (1% DMSO en E3-PTU) durante 3 h antes de la incorporación y fotoablación, como se describe en los pasos 2 y 3.7, respectivamente.
NOTA: No se requiere más yoduro de propidio en la agarosa o en la solución de formación de imágenes. - Inducir lesión renal segmentaria, como se describe en los pasos 3.1-3.12.
- Obtener pilas de imágenes de lapso de tiempo, según descriEn un estudio previo 14 , utilizando un láser de 488 nm (GFP) y un láser de 461 nm (Propidium Iodide, PI).
NOTA: Los dos colores se superponen en pilas confocales para correlacionar la desaparición de GFP y la aparición de tinción con yoduro de propidio. - Establezca los parámetros para obtener las pilas de imágenes de lapso de tiempo de la siguiente manera: espesor de rebanada virtual = 4 μm, intervalo de pila z = 2 μm, tiempo de permanencia de pixel = 1,9 μs, dimensiones de imagen = 512 x 512 y promediado = 2.
NOTA: Estos parámetros permiten el registro continuo de intervalos de hasta 10 a 15 minutos de hasta 4 larvas y aseguran que haya un fotoblanqueo mínimo de la muestra. - Utilice software de imagen compatible con el formato de archivo de grabación para visualizar y analizar los datos.
- Oriente la larva para que el segmento de riñón de interés sea perpendicular a la trayectoria del haz, mientras que el segmento contralateral está alejado del rayo láser (ver Película 1 ).
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Representative Results
Tenga en cuenta que este protocolo se utilizó con éxito con un número de líneas transgénicas GFP renal, incluyendo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 y Tg (atp1a1a.4: GFP). Los resultados de ejemplo mostrados aquí se obtuvieron usando la línea sqet11-9 de ET (krt8: EGFP).
La Figura 1 muestra el ejemplo del protocolo de fotoabla- ción. La intensidad media de GFP se monitorea dentro de la región de interés ( Figura 1A y Película 1 ). Un ejemplo de traza de intensidad media se muestra en la Figura 1B .
Como se muestra en la Figura 2 , después de la exposición a la luz láser a 405 nm, la fluorescencia GFP sigue desapareciendo una célula a la vez hasta que, a los 220 min, todo el segmento ablado pierde el 100% de su positividad GFP. Esta pérdida de GFP fLa luorescencia es de hecho debido a la muerte celular y no, por ejemplo, la regulación negativa de la expresión de GFP. Esto se evidencia por la aparición de núcleos positivos de yoduro de propidio fluorescente rojo en las células que pierden la positividad de las buenas prácticas agrarias.
El grado de muerte celular puede evaluarse midiendo la fluorescencia media de GFP en el segmento ablacionado y comparándolo con la intensidad GFP media inmediatamente anterior y posterior al segmento ablacionado. La Figura 3 muestra la relación entre el grado de exposición al láser (medido por la cantidad inicial de fotoblanqueo) y el grado de muerte celular en el segmento expuesto. Muestra que, variando la exposición inicial, es posible "marcar" la lesión y la respuesta del epitelio lesionado. Con un 10-20% del fotoblanqueo GFP inicial, prácticamente no se observa reducción de la positividad GFP a las 5 h después de la lesión. 50 y 60% photobleaching conduce a una completa disappeDe la GFP a las 5 h, mientras que el 30 y 40% de blanqueo conduce a resultados intermedios, con un 50% de muerte estimada observada en aproximadamente 35% de fotoblanqueo. Estos resultados son apoyados por tinción PI ( Figura 3B ). El 20% de fotoblanqueo da como resultado prácticamente ninguna tinción PI a los 100 minutos después de la ablación. El fotoblanqueo al 50% conduce a una positividad continua de PI en el epitelio ablacionado después de 60 minutos, mientras que el fotoblanqueo 30 y 40% conduce a la incorporación intermedia de IP. Como puede verse a partir de estos datos, esta metodología permite la inducción de cantidades graduadas de lesión epitelial y para el estudio de la respuesta epitelial al daño epitelial letal y sub letal.
Figura 1: Procedimiento de fotoablación. ( A ) Esquema que muestra la orientación embrión / larva, la exposición al láser y la región de interés (elipse) measUredo de la fluorescencia media para monitorizar la cantidad de fotoblanqueo GFP; Consulte Película 1. El cuadro rectangular indica la ventana de escaneado. ( B ) Un ejemplo de una intensidad GFP real promedio de región de interés antes, durante y después de la exposición al láser a 405 nm. Las intensidades promedio de GFP en cuatro mediciones consecutivas (mostradas dentro de cajas verdes) se muestran antes (Y) y después (X) la fotoablación. La relación X / Y se utiliza como una medida de la exposición a la luz total y se representa en el eje X en la figura 3 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Muerte de células epiteliales después de la exposición al láser a 405 nm. Ejemplo de marcos secuenciales que muestran la desaparición de GFPD la aparición de tinción de yoduro de propidio después de fotoablación (40% fotoblanqueo inicial). Los marcos están a 0, 130, 170 y 220 minutos después de la exposición a luz violeta (405 nm). La desaparición de GFP coincide con la aparición de fluorescencia roja PI positividad nuclear. Tenga en cuenta que la fluorescencia PrI se detecta utilizando el canal rojo. La fluorescencia roja que se observa fuera del riñón se debe a los cromóforos ya la presencia de PI en el lumen del intestino. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Respuesta de la dosis de lesión epitelial a la cantidad de fotoablación. ( A ) La fotoablación se mide por el porcentaje de reducción inicial en la fluorescencia GFP en las exposicionesEd. Esto se compara con la disminución de la fluorescencia GFP promedio en el segmento lesionado a las 5 h post-lesión. Esta medición se normaliza a la cantidad media de fluorescencia aguas arriba y aguas abajo del segmento lesionado. Las dosis diana fueron 10, 20, 30, 40, 50 y 60% del fotoblanqueo inicial. Las cantidades reales son ligeramente mayores, lo que supone un fotoblanqueo de 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 y 62,1%, lo que da como resultado una fluorescencia restante de 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 y 37,9%, n = 2 - 6 / target grupo. Las barras de error representan la desviación estándar a lo largo de los ejes X (porcentaje de la fluorescencia restante inmediatamente después de la fotoablación) e Y (porcentaje de fluorescencia restante 5 h después de la fotoablación). ( BE ) tinción PI paralelo a la desaparición general de la positividad GFP. Virtualmente no se observa tinción PI al 20% (80% de fluorescencia restante) fotoblanqueo a los 100 minutos después de la exposición al láser ( B , panel derecho). ( C y
| Transgénico | Patrón de expresión | Referencias |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomérulo, algunos PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | Distal al glomérulo | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Distal al glomérulo | [9, 10] |
| Tg (ret1: GFP) | DT tardía, PD | [13] |
| Tg (enpep: GFP) | Distal al glomérulo | [14] |
| Tg (cd41: GFP) | Células multiciliadas | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | PT recto, DT temprano | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 | Convoluted PT | [16,17] |
| PT = Tubo proximal | ||
| DT = Tubo distal | ||
| PD - Conducto pronefrico |
Película 1: Resumen de animación del procedimiento de fotoablación. En la primera parte de la película, se demuestra la adecuada orientación de embriones y larvas. Las dos ramas del riñón se muestran en verde. Se utiliza una sonda de vidrio para orientar el pescado en agarosa. Esto se hace si se desea una rama de control, no dañada. Angling el pez permite la exposición del laser en solamente una rama del riñón pronephric. En la segunda parte de la película, el procedimiento de ablación con láser se describe. La elipse indica la región de interés dentro del segmento sometido a la ablación utilizada para monitorizar la cantidad de photobleac inicialHing. La ventana rectangular permite el ajuste preciso del tamaño y la posición del segmento ablacionado. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)
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Discussion
Cabe señalar que la potencia total del láser varía entre sistemas. Sin embargo, el porcentaje de fotoblanqueo GFP permite una lectura de la energía total entregada al riñón fluorescente, independientemente de la variación en la potencia láser y compensada por la duración de la exposición. Tenga en cuenta, sin embargo, que la respuesta de los diferentes tejidos a este método de fotoablación varía. Incluso durante la maduración del riñón, es significativamente más difícil obtener una reducción del 50% en la fluorescencia GFP en embriones más jóvenes que en larvas maduras. Estas diferencias en la respuesta del tejido a la fotoablación deben tenerse en cuenta al modificar y adaptar este protocolo a diferentes aplicaciones. Por lo tanto, es crítico para controlar el porcentaje de reducción en la fluorescencia GFP para medir adecuadamente la cantidad de lesión y la respuesta prevista del epitelio renal lesionado.
Las principales ventajas de este método al comparar otros métodos de lesión renal enPez cebra es que permite el control preciso de la ubicación espaciotemporal de la lesión. Además, permite a los investigadores marcar el nivel de lesión arriba y abajo. Esta capacidad para controlar la cantidad de lesión debe permitir el examen de las respuestas de las células epiteliales y debe ayudar con la toma de decisiones en términos de recuperación versus apoptosis versus necrosis. Por ejemplo, es posible mostrar que la migración celular es una respuesta inicial del epitelio superviviente a la ablación segmentaria y que la proliferación celular es un proceso secundario, probablemente impulsado por las fuerzas mecánicas generadas por la migración celular [ 14] .
Además de la capacidad de estudiar el proceso de reparación a nivel celular, existen otras ventajas para esta metodología. En primer lugar, anteriores técnicas de fotoablation había limitado el control sobre la cantidad de fotodamado [ 9] . Sin embargo, este modelo permite un control graduado sobre la cantidad de lesión, facilitando laRealizar estudios futuros. Además, en este enfoque, es posible dirigir grupos arbitrarios de células fluorescentes GFP, permitiendo así la fácil ablación de segmentos enteros. Si bien esto podría lograrse con la técnica de láser pulsado, es más laborioso, limitando el potencial para el diseño experimental. El uso de GFP para dirigir y potenciar la lesión epitelial es una ventaja adicional, porque hay tantos GFP transgénicos de pez cebra disponible ( Tabla 1 es sólo una lista parcial). Otras proteínas fluorescentes expresadas por especies transgénicas también se han estudiado, como la proteína Killer rojo, pero estos transgénicos de peces no están ampliamente disponibles [ 16] . Una ventaja adicional del uso de GFP es que, con diferentes longitudes de onda láser, la expresión GFP se puede utilizar para la fotoablación (405 nm) o de imágenes (488 nm). Sin embargo, debe observarse que el método publicado por Johnson et al. 9 se puede aplicar a fluorescentes no fluorescentesPez cebra y por lo tanto puede ser utilizado más ampliamente que este enfoque.
Otra limitación de este modelo de ablación con láser es que puede no tener en cuenta todos los diferentes factores que pueden conducir a la LRA humana. Puede haber una cadena de eventos que conducen a la necrosis celular en el cuerpo humano, así como la apoptosis celular que se induce durante la lesión renal. No está claro si el medio ambiente producido durante la ablación con láser puede imitar todos los aspectos de la fisiopatología de la LRA en los seres humanos 10 . Sin embargo, este modelo de ablación láser tiene muchas ventajas sobre los modelos alternativos. Al permitir el estudio de la muerte de las células renales y la reparación a una alta resolución en tiempo real, este método debe conducir a una mejor comprensión de los mecanismos de reparación de riñón y sentar las bases para nuevos enfoques para el tratamiento de la LRA.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Queremos agradecer al Dr. Iain Drummond y al Dr. Vladimir Korzh por compartir líneas transgénicas GFP de riñón. También queremos agradecer a NYITCOM por proporcionar los recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo. Este estudio fue en parte apoyado por subvenciones: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), y la subvención piloto HSCI (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
