Summary
Detta arbete presenterar en ny in vivo- modell av segmentell njurskada med användning av NGF-transgena zebrafisk. Modellen möjliggör induktion av den riktade ablationen av njureepitelceller för att visa de cellulära mekanismerna för nephronskada och reparation.
Abstract
Akut njurskada (AKI) är ett vanligt sjukdomstillstånd med hög dödlighet. Med njurens reparationsförmåga är det möjligt att återställa tillräcklig njurefunktion efter stödjande behandling. En bättre förståelse för hur nephroncellsdöd och reparation sker på cellulär nivå krävs för att minimera celldöd och för att förbättra den regenerativa processen. Zebrafish pronephros är ett bra modellsystem för att uppnå detta mål eftersom det innehåller anatomiska segment som liknar däggdjursnephronen. Tidigare var den vanligaste modellen som användes för att studera njursskador i fisken den farmakologiska gentamicinmodellen. Emellertid tillåter denna modell inte exakt spatiotemporal kontroll av skada, och det är därför svårt att studera cellulära och molekylära processer som är involverade i njurreparation. För att övervinna denna begränsning presenterar detta arbete en metod, genom vilken, i motsats till gentamicin-tillvägagångssättet, ett specifikt Green Fuorescent Protein (GFP) -exempelPressande nefron-segment kan fotograferas med en violett laserljus (405 nm). Denna nya modell av AKI ger många fördelar som andra metoder för epitelskada saknar. Dess främsta fördelar är möjligheten att "ringa" nivån på skada och den exakta spatiotemporala kontrollen i den robusta in vivo djurmodellen. Denna nya metod har potential att avsevärt öka förståelsen för njurskador och reparationsmekanismer.
Introduction
Akut njurskada (AKI) 1 , 2 , som även kan benämnas akut njursvikt, definieras i stor utsträckning som en plötslig nedsättning vid njursjukdom 3 . Även om förståelsen för detta tillstånd har förbättrats anmärkningsvärt under åren har sjukligheten och dödligheten varit höga 1 , 2 . Den nuvarande behandlingen för detta tillstånd är främst stödjande, eftersom resultaten från flera kliniska prövningar av läkemedelsbehandling har varit negativa 4 , 5 . Njurarna är unika genom att den har möjlighet att reparera sig själv. Därför är stödjande terapi efter en tidig diagnos av AKI det bästa sättet att begränsa morbiditet 6 . Det är dock svårt att upptäcka AKI tidigt och dödligheten är en svindlande 50-80% för dem som behöver dialys 5. Med njurernas förmåga att reparera sig själva och bristen på behandlingsalternativ för detta tillstånd är det viktigt att utveckla metoder för att förbättra denna nephronregenereringsprocess.
Det har funnits många olika modeller som används för AKI-forskning som innehåller olika agenter av skada och djurmodeller. När det gäller medel för njurskador har aminoglykosidantibiotikum gentamicin använts som ett nefrotoxiskt medel som leder till AKI 7 , 8 . Flera grupper har emellertid funnit att gentamicinbehandling är dödlig för zebrafiskembryon 9 . Det orsakar tubulär skada som är för allvarlig för återvinning av embryon, vilket gör studien av förnyelse svår utan någon typ av ingrepp. Mammaliska modeller, som mus och råtta, anses också värdefulla, men de står inför många begränsningar under studien av AKI. Kanske är den största nackdelen med gnagare modeller svårigheten i visuaLizing njurarna av gnagare och därigenom bestämma de exakta spatiotemporala processerna som leder till epiteldöd och reparation.
Johnson et al. Har rapporterat en laserablationsbaserad teknik för att inducera akut njurskada i embryonala och larvalzebrafisk 9 . De använde pulserad laserablation för att skada njurarna efter en intramuskulär injektion med dextrankonjugat. Fluorescensen från dextran-konjugat möjliggör visualisering av skada och regenerering i tubuleepiteln 9 . Denna modell övervinner de två begränsningarna som nämnts ovan, men det tillåter inte graderade skador och är svår att utföra på stora, godtyckliga cellgrupper.
Den nya laserablationsbaserade zebrafiskmodellen av AKI som beskrivs här behandlar alla ovanstående begränsningar. Den pronephric njuren i larvalzebrafisken är ett moget, fungerande organ som innehåller segment som liknar däggdjuret nePhron, inklusive en glomerulus, proximala och distala tubuler och en uppsamlingskanal 10 . Zebrafish larver är också optiskt transparenta, vilket gör det möjligt att observera njurarna genom fluorescenstekniker. Sebrafisk är således en värdefull in vivo- modell av AKI, och den larval pronephriska njuren (5-12 dagar efter fertilisering (dpf)) kan användas för att studera cell- och molekylära processer som är involverade i njurskada och reparation.
Detta papper presenterar en metod genom vilken specifika gröna fluorescerande proteiner (GFP) -expressande nephron-segment kan fotograferas med hjälp av ett 40-nm-ljudeffektivt (jämfört med ett pulserande lasersystem) violett laserljus. GFP-fluorescensen möjliggör inriktningen av en grupp av celler, vilket gör de förändringar som uppträder synliga genom observation av GFP-fotobildning. Dessutom fungerar GFP (genom absorption av violett ljus) som en energisänkning för att förstärka skadorna i GFP-uttryckande njurceller. Time-lapse-mikroKopia kan sedan användas för att studera reparationsprocessen. Studier har funnit cellproliferation, cellmigration och cellmetaplasi 11 , 12 , 13 för alla är potentiella processer som kan spela en viktig roll vid njurreparation. Emellertid har den relativa betydelsen av dessa processer och detaljerna i deras samspel varit svåra att upptäcka på grund av begränsningarna av existerande modeller av AKI. Med hjälp av detta nya tillvägagångssätt kunde man visa att cellmigration spelar en central roll vid njurreparation efter akut skada 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes i enlighet med rekommendationerna i handledningen för vård och användning av laboratoriedjur hos de nationella instituten för hälsa. Protokollet godkändes av NYIT College of Osteopathic Medicine Institutionell djurvård och användningskommitté (NYITCOM IACUC). All operation och in vivo- experiment utfördes under tricinbedövning, och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidande.
1. Erhålla och upprätthålla embryon
- Skaffa embryon genom att korsa njuren GFP fluorescerande zebrafisk.
OBS: Exempel på fluorescensmärkta zebrafisktransgena linjer anges i tabell 1 . - Förvara embryonerna vid 28,5 ° C i E3-lösningen under 24 timmar efter befruktning.
- Efter 24 h byt ut mediet med en E3-lösning som innehåller 0,003% 1-fenyl-2-tiourea (PTU).
OBS: PTU används eftersom det blockerar de tyrosinasberoende stegen vid melanogenesOch förhindrar följaktligen pigmentering. Här kallas denna lösning som E3-PTU. - Höj de befruktade embryonerna vid 28,5 ° C tills de är> 6 dpf, vid vilken tid njurarna har mognat.
OBS! Det är bäst att använda larver i 7-9 dpf-fönstret. - Med hjälp av ett fluorescerande dissekeringsmikroskop vid 40X förstoring och grön fluorescensutsläppsfiltret, välj larverna med ljus nyre-GFP-fluorescens.
2. Montering av Zebrafish för Live-imaging
- Om photoablating embryon före 3 dpf, ta bort chorion från oöppnad zebrafisk innan du monterar zebrafisken för avbildning.
- Manuellt dekarinera med tångar (föredragna) eller använd en kemisk behandling med en proteasblandning.
OBS: Dechorering möjliggör de bästa bildresultatet.
- Manuellt dekarinera med tångar (föredragna) eller använd en kemisk behandling med en proteasblandning.
- Skölj chorionsskräpet i petriskålen med E3-PTU-lösning och fyll på skålen med E3-PTU.
- PrepaRe 1-2% LMP-agaros med 0,2 mg / ml tricinlösning för att montera zebrafisken för njurefotoablation och levande bildbehandling.
- Om LMP-agaros redan var förberedd på förhand, värm upp den i mikrovågsugnen för att smälta den.
- När LMP-agarosen är beredd, sätt en 35 mm plast petriskål på ett dissekeringsmikroskop. Placera en lutad sond i närheten för att korrekt orientera de bedövade larverna.
OBS! Det är viktigt att göra detta steg i rätt tid och att ha allt på plats, eftersom embryon måste orienteras innan agarosen stelnar på ca 1-3 min. - Innan du överför embryot till agarosen, se till att agarosen är kall ( dvs vid ungefär kroppstemperatur). Använd en plast- eller glasöverföringspipett för att placera embryot i den nedkylda smälta agaros-tricainlösningen.
OBS! Detta görs eftersom agaros som är för varmt kan vara skadligt för embryot, vilket leder till hjärtstilleståndEller döden - Om du använder en överföringspipett, repetera embryot i agaroslösningen och placera embryot / larven mitt i en 35 mm skål.
- Snabb sprid agarosen som innehåller embryot / larven för att jämnt täcka botten av 35 mm skålen; Den bästa volymen av agaros att använda är ~ 1-1,1 ml.
- Använd glasproben för att rikta embryot på bästa möjliga sätt för fotoablation och bildbehandling.
OBS! Film 1 visar embryo / larvens bästa orientering för ensidig fotoablation. Detta steg är den mest tidskänsliga och bör utföras snabbt innan agarosen börjar gelas, eftersom varje försök att omorientera fisken efter att gelningen börjar är skadlig.- Orientera larven så att njursegmentet av intresse är vinkelrätt mot strålbanan medan kontralaterala segmentet är borta från laserstrålen (se Film 1 ).
OBS! Detta kan uppnås genom att vrida larven som visas i Film 1 . - Låt ca 15 minuter för agaros att stelna. Täck petriskålen för att minimera avdunstning. När agarosen har stelnat är embryot eller larven redo för fotoablation.
3. Laserablation
- Använd det konfokala bildsystemet.
OBS! När du använder den refererade bildplattformen (se materialtabellen), innehåller de rekommenderade inställningarna 40X förstoring, en 0,8 NA vattendämpningslins och den första dikroiska spegelsatsen som tillåter både 488 och 405 nm belysning av provet. Detektionen bör utföras på den gröna kanalen. - Placera skålen med den immobiliserade zebrafisken på ett konfokalt stadium.
OBS! Den här proceduren är optimerad för upprätt konfiguration med en 40-60X vattendämpande lins. Det bör dock vara möjligt att ändra proceduren för ett inverterat mikroskop. - I upprättstående konfiguration placerar du petriskålen som innehåller embryot ovanpå en mikroskopGlasögon och håll den på plats med hjälp av modelleringslera ( t ex plastin). Placera glasskivan med petriskålen på scenen av konfokalmikroskopet.
- Tillsätt 3 ml av bildningslösningen E3-PTU (se steg 1.3) med 0,2 mg / ml tricain.
OBS! Bildbehandling lösningen kan också läggas omedelbart innan du lägger bilden på scenen. Tillsatsen av bildlösning bör göras mycket noggrant för att förhindra att agarosen flyter från botten av skålen. - Byt till vattendämpningslinsen (40 eller 60X). Långsamt höja scenen, se till att linsen är något vinklad för att förhindra att luft sitter fast i strålbanan. När linsen rör lösningen i en vinkel, centrera den så att den befinner sig i embryonens synvinkel.
- Hitta segmentet av intresse med hjälp av fluorescensljuskällan. Placera grenen på ett ytligt sätt inriktat på skada för att minimera ljusspridning (se Film 1 ).
OBS: The subsequenT steg använder sig av refererad programvara (se materialet), men proceduren kan enkelt anpassas till andra plattformar. - Öppna programvaran. Navigera till "Visa" | "Förvärvskontroll" | "C2plus Compact GUI" och sätt "pixel dwell time" till "1.9 μs," "frame size" till "512 x 512 pixels" och "pinhole size" till "90 μm." Ställ in "405 nm (eller 408 nm i vissa system) laserintensitet" till noll och "488 laserintensitet" till "låg" (helst <1%). Justera "gain" för att få ett bra dynamiskt område men att inte mätta signalen.
OBS: Dessa värden är inte kritiska och används för konsistens. När en 405 nm laser används kommer det att resultera i ökningar i GFP-fluorescens. För att undvika mättnad av signalen under fotobildning (steg 3.11) ska signalvärdet minskas på den gröna kanalen. Den blå kanalförstärkningen kan lämnas vid noll, eftersom den inte används för sampling. - Klicka på "Scan" i mjukvarubränssnittet för att skanna njuren med en 488 nm laser. Hitta det intressanta segmentet som är vinkelrätt mot strålbanan och det är väl visualiserat, med bra GFP-fluorescens. När den regionen har identifierats, rita en region av intresse med hjälp av en elliptisk region-of-interest (ROI).
- Navigera till "ROI" | "Rita elliptisk avkastning."
OBS: Detta kommer att användas för att kontinuerligt mäta genomsnittlig GFP-intensitet medan fotobildningen sker, vilket möjliggör administration av en exakt dos av laserbehandling.
- Navigera till "ROI" | "Rita elliptisk avkastning."
- Navigera till "Visa" | "Förvärvskontroller" | "C2plus Scan Area" och välj "Band Scan Area." Den rektangulära masken kommer att visas inom det gränssnittet. Manuellt definiera ett rektangulärt skanningsfönster med markören ( dvs dra, ändra storlek och vrid masken) för att täcka segmentet som är inriktat på laserablation. Högerklicka iMaskområde för att acceptera valet.
OBS! Endast den valda regionen ska skannas. - Börja tidsmätningen medan du övervakar den gröna kanalen med bara 488 nm-lasern för att aktivera GFP. Kontrollera att intensiteten hos 488-lasern är relativt låg (~ 1%). Mät GFP: s genomsnittliga intensitet i intresseområdet genom att välja "Mätning" | "Tidsmätning". Använd fliken "Grafik" eller "Data" för att övervaka medelintensitetsvärdena inom avkastningen.
ANMÄRKNING: Anskaffningsgraden definieras av pixeluppehållstid och storleken på det rektangulära fönstret som ställts i steg 3.9, men i allmänhet tillåter den snabb övervakning av signalen (~ 2-10 bilder / s). - Inducera skador på njurcellerna med violettlasern (405 nm) genom att öka intensiteten till 100% genom att skjuta "laser power" -kontrollen hela vägen till höger. 488 nm lasern kan förbli aktiv om intensiteten är låg.
- Observera en linje gRaph med fliken "Graph" eller de numeriska värdena för GFP intensitet med fliken "Data" och vänta tills den sjunker till önskad nivå, till exempel 50% av baslinjen (som visas i Figur 1 ).
OBS! En 20 mW laser har använts som en del av den refererade laserenheten (se materialet ). Maximal intensitet kan variera mellan system. Lägre intensitet kan kompenseras genom längre exponering ( dvs användning av procent GFP-blekning som ett mått på total exponering).
- Observera en linje gRaph med fliken "Graph" eller de numeriska värdena för GFP intensitet med fliken "Data" och vänta tills den sjunker till önskad nivå, till exempel 50% av baslinjen (som visas i Figur 1 ).
- När GFP-intensiteten inom det elliptiska ROI-värdet (steg 3.8) har sjunkit till önskad nivå, minskar du omedelbart intensiteten hos den violett (405 nm) lasern till "0" genom att flytta skjutreglaget "laserkraft" helt åt vänster in Mjukvaran kontrollpanelen.
- Skaffa en ny baslinje av GFP-fluorescens. Bekräfta ablationen genom att erhålla ett förhållande av X / Y.
OBS: Se Figur1B; Y = medelintensitet före ablationen och X = medelintensitet efter ablationen med användning av i genomsnitt 4 konsekutiva prover inom ROI. Det exakta målförhållandet (50%, 60%, etc. ) beror på den mängd skada som önskas för ett givet experiment.
- Skaffa en ny baslinje av GFP-fluorescens. Bekräfta ablationen genom att erhålla ett förhållande av X / Y.
4. Time-lapse-mikroskopi med propidiumjodidfärgning
- Applicera generella tidsförloppsöverväganden (beskrivs i en tidigare studie 15 ) för att visualisera propidiumjodidfärgning som ett samband mellan njurcellskada efter fotoablation.
- Förinkubera larverna i 30 μM propidiumjodidlösning (1% DMSO i E3-PTU) under 3 timmar före inbäddning och fotoablation, såsom beskrivs i steg 2 respektive 3,7.
OBS! Ingen ytterligare propidiumjodid krävs i agaros eller bildlösning. - Inducera segmentär njurskada, som beskrivs i steg 3.1-3.12.
- Hämta tidsfördröjda bildstaplar, som beskrivsSäng i en tidigare studie 14 , med användning av en 488 nm laser (GFP) och en 461 nm laser (Propidium Iodide, PI).
OBS! De två färgerna är överlagrade i konfokala staplar för att korrelera GFP-försvinnandet och utseendet av propidiumjodidfärgning. - Ställ in parametrarna för att få tidsfördröjningsbildstaplarna enligt följande: virtuell skivtjocklek = 4 μm, z-stackintervall = 2 μm, pixel-uppehållstid = 1,9 μs, bilddimensioner = 512 x 512 och medelvärde = 2.
OBS: Dessa parametrar möjliggör kontinuerlig inspelning av 10 till 15 minuter mellan upp till 4 larver och säkerställer att det finns minimal fotobildning av provet. - Använd bildhanteringsprogram som är kompatibel med inspelningsfilformatet för att visualisera och analysera data.
- Orientera larven så att njursegmentet av intresse är vinkelrätt mot strålbanan medan kontralaterala segmentet är borta från laserstrålen (se Film 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Observera att detta protokoll har använts framgångsrikt med ett antal transplantatlinjer av njur GFP, inklusive ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 och Tg (atp1a1a.4: GFP). Exempelresultaten som visas här erhölls med användning av ET (krt8: EGFP) sqet11-9-linjen.
Figur 1 visar exemplet photoablation protokollet. Den genomsnittliga GFP-intensiteten övervakas inom området av intresse ( Figur 1A och Film 1 ). Ett exempel på medelintensitetsspår visas i figur IB .
Såsom visas i Figur 2 , fortsätter GFP-fluorescensen efter exponering för 405 nm laserljus att försvinna en cell åt gången tills, vid 220 minuter, förlorar hela det ablerade segmentet 100% av sin GFP-positivitet. Denna förlust av GFP fLuorescens beror faktiskt på celldöd och inte, till exempel, nedreglering av GFP-uttryck. Detta framgår av utseendet av röda fluorescerande propidiumjodid-positiva kärnor i cellerna som förlorar GFP-positivitet.
Omfattningen av celldöd kan bedömas genom att mäta genomsnittlig GFP-fluorescens i det ablerade segmentet och jämföra det med den genomsnittliga GFP-intensiteten omedelbart framåt och bakom det ablerade segmentet. Figur 3 visar förhållandet mellan omfattningen av laserexponering (mätt med den initiala mängden fotobildning) och omfattningen av celldöd i det exponerade segmentet. Det visar att man, genom att ändra den ursprungliga exponeringen, kan "ringa" skadan och svaret på det skadade epitelet. Med 10-20% av den initiala GFP-fotobildningen observeras nästan ingen minskning av GFP-positivitet vid 5 h efter skada. 50 och 60% fotoladdning leder till en fullständig försvinnandeArans av GFP vid 5 h, medan 30 och 40% blekning leder till mellanliggande resultat, med 50% uppskattad död observerad vid ca 35% fotobildning. Dessa resultat stöds av PI-färgning ( Figur 3B ). 20% fotoblandning resulterar i praktiskt taget ingen PI-färgning vid 100 min efter ablation. 50% fotobildning leder till kontinuerlig PI-positivitet i det ablerade epitelet efter 60 min, medan 30 och 40% fotoblandning leder till mellanliggande PI-inkorporering. Som framgår av dessa data möjliggör denna metod att inducera graderade mängder epitelskada och för studier av epithelial responsen på dödlig och sublodal epitelskada.
Figur 1: Photoablation Procedure. ( A ) Schematisk visar embryo / larvorientering, laserexponering och region-of-interest (ellipse) mätningUrement av den genomsnittliga fluorescensen för att övervaka mängden GFP-fotobildning; Se film 1. Den rektangulära rutan anger skanningsfönstret. ( B ) Ett exempel på en verklig region av intresse genomsnittlig GFP-intensitetsspår före, under och efter 405 nm laserexponering. Genomsnittliga GFP-intensiteter på fyra på varandra följande mätningar (visas i gröna lådor) visas före (Y) och efter (X) fotoablationen. Förhållandet X / Y används som ett mått på den totala ljusexponeringen och ritas på X-axeln i figur 3 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Epitelcellsdöd efter 405 nm laser exponering. Exempel sekventiella ramar som visar försvinnandet av GFP anD utseendet av propidiumjodidfärgning efter fotoablation (40% initial fotobildning). Ramarna är 0, 130, 170 och 220 min efter violett ljus (405 nm) exponering. Försvinnandet av GFP sammanfaller med utseendet av röd fluorescerande PI-kärnpositivitet. Observera att PrI-fluorescens detekteras med den röda kanalen. Den röda fluorescensen ses utanför njuren beror på kromoforer och närvaron av PI i tarmen. Skalstång = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Dosreaktion av epitelskador till mängden Photoablation. ( A ) Photoablation mäts med procent av initial reduktion i GFP fluorescens i exposEd segment. Detta jämförs med nedgången i genomsnittlig GFP-fluorescens i det skadade segmentet vid 5 h efter skada. Denna mätning normaliseras till medelmängden fluorescens uppströms och nedströms det skadade segmentet. Måldoser var 10, 20, 30, 40, 50 och 60% av den ursprungliga fotobildningen. De faktiska beloppen är något större, vilket motsvarar 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 och 62,1% fotobildning, vilket resulterar i 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 och 37,9% återstående fluorescens, n = 2 - 6 / mål grupp. Felstängerna representerar standardavvikelsen längs X (procent av återstående fluorescens omedelbart efter fotoablation) och Y (procent av återstående fluorescens 5 h efter fotoablation) axlar. ( BE ) PI-färgning parallellerar den övergripande försvinnandet av GFP-positivitet. Praktiskt taget ingen PI-färgning observeras vid 20% (80% återstående fluorescens) fotobildning vid 100 min efter laser exponering ( B , höger panel). ( C och
| Transgena | Uttrycksmönster | referenser |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomerulus, vissa PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | Distal till glomerulus | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Distal till glomerulus | [9,10] |
| Tg (ret1: GFP) | Sen DT, PD | [13] |
| Tg (enpep: GFP) | Distal till glomerulus | [14] |
| Tg (CD41: GFP) | Multicilierade celler | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | Rak PT, tidig DT | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-D10 | Konvoluterad PT | [16,17] |
| PT = Proximal Tubule | ||
| DT = Distal Tubule | ||
| PD - Pronephric Duct |
Film 1: Animationsöversikt av Photoablation Procedure. I den första delen av filmen visas korrekt embryo / larvorientering. De två njurgrenarna visas i grönt. En glasprob används för att orientera fisken i agaros. Detta görs om en kontroll, icke skadad gren är önskvärd. Fiske fisken tillåter laser exponering på bara en gren av pronephric njure. I den andra delen av filmen beskrivs laserablationen. Ellipsen indikerar regionen av intresse inom segmentet som genomgår ablation som används för att övervaka mängden initial photobleaching. Det rektangulära fönstret möjliggör exakt justering av storleken och positionen hos det ablerade segmentet. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det bör noteras att den totala laserkraften varierar mellan system. Med hjälp av procentuell GFP-fotobildning tillåter man emellertid en utläsning av den totala energin som levereras till fluorescerande njuren, oberoende av variationen i laserkraft och kompenseras för längden av exponeringen. Tänk på att svaret från olika vävnader till denna metod för fotoablation varierar. Även vid njurmognad är det betydligt svårare att få en 50% minskning av GFP-fluorescens hos yngre embryon än hos mogna larver. Dessa skillnader i vävnadsreaktion mot fotoablation bör beaktas vid modifiering och anpassning av detta protokoll till olika tillämpningar. Således är det kritiskt att övervaka procentuell reduktion i GFP-fluorescens för att korrekt mäta mängden skada och det förutsagda svaret hos det skadade njureepitelet.
De viktigaste fördelarna med denna metod när man jämförde andra metoder för njurskada iZebrafisk är det som tillåter den exakta kontrollen av skadans spatiotemporala läge. Det gör det också möjligt för forskare att ringa upp skadorna upp och ner. Denna förmåga att kontrollera mängden skada borde möjliggöra undersökning av svaren på epitelceller och bör hjälpa till med beslutsfattande när det gäller återhämtning kontra apoptos mot nekros. Det är till exempel möjligt att visa att cellmigration är ett initialt svar på överlevande epitel till segmentablation och att cellproliferation är en sekundär process, sannolikt driven av mekaniska krafter som genereras av cellmigration 14 .
Förutom möjligheten att studera reparationsprocessen på cellulär nivå finns det andra fördelar med denna metodik. För det första hade tidigare fotoablationstekniker begränsad kontroll över mängden fotodamage 9 . Men den här modellen möjliggör en graderad kontroll över mängden skada, vilket gör det lättare attGenomföra framtida studier. Dessutom är det i detta tillvägagångssätt möjligt att rikta godtyckliga grupper av GFP-fluorescerande celler, vilket möjliggör enkel ablation av hela segmenten. Även om detta skulle kunna uppnås med den pulserande lasertekniken är den mer arbetskrävande, vilket begränsar potentialen för experimentell design. Användningen av GFP för att rikta och förstärka epitelskada är en ytterligare fördel, eftersom det finns så många GFP-transgena zebrafiskar tillgängliga ( Tabell 1 är endast en partiell lista). Andra fluorescerande proteiner uttryckta av transgena arter har också studerats, såsom Killer-rött protein, men dessa transgener är inte allmänt tillgängliga 16 . En ytterligare fördel med att använda GFP är att med olika laservåglängder kan GFP-uttryck användas antingen för fotoablation (405 nm) eller avbildning (488 nm). Det bör dock noteras att metoden som publicerats av Johnson et al. 9 kan appliceras på icke-fluorescerandeZebrafisk och kan därmed användas i större utsträckning än detta tillvägagångssätt.
En annan begränsning av denna laserablationsmodell är att den inte får ta hänsyn till alla olika faktorer som kan leda till mänsklig AKI. Det kan finnas en kedja av händelser som leder till cellnekros i människokroppen, såväl som cellapoptos som induceras under njurskada. Det är oklart om den olika miljön som produceras under laserablation kan imitera alla aspekter av AKIs patofysiologi hos människor 10 . Ändå har denna laserablationsmodell många fördelar gentemot alternativmodellerna. Genom att tillåta studier av njurcellsdöd och reparation med hög upplösning i realtid borde denna metod leda till en bättre förståelse av njurreparationsmekanismer och lägga grunden för nya tillvägagångssätt för AKI-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka doktor Iain Drummond och Dr. Vladimir Korzh för att dela transplantat med njure GFP. Vi vill också tacka NYITCOM för att tillhandahålla nödvändiga resurser för att utföra detta arbete. Denna studie stöddes delvis av bidrag: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) och HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
