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Developmental Biology

मॉडलिंग के लिए सटीक सेलुलर पृथक्करण दृष्टिकोण Zebrafish के विकास में तीव्र किडनी चोट

Published: June 3, 2017 doi: 10.3791/55606
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, NYITCOM, 2Department of Basic Sciences, NYITCOM-A-State

Summary

यह काम गुर्दा जीएफपी ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग कर कमानी किडनी की चोट के विवो मॉडल में एक नया प्रस्तुत करता है। मॉडल नेफ्रोन की चोट और मरम्मत के सेलुलर तंत्र दिखाने के लिए गुर्दा उपकला कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण पृथक करने के लिए अनुमति देता है।

Abstract

तीव्र किडनी चोट (एसीआई) उच्च मृत्यु दर के साथ एक सामान्य चिकित्सा स्थिति है। गुर्दे की मरम्मत क्षमता के साथ, सहायक उपचार के बाद पर्याप्त गुर्दे की क्रिया को बहाल करना संभव है। हालांकि, सेलुलर स्तर पर नेफ्रॉन सेल की मौत और मरम्मत की प्रक्रिया को बेहतर ढंग से समझने के लिए सेल मृत्यु कम करने और पुनर्योजी प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए आवश्यक है। Zebrafish pronephros इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए एक अच्छा मॉडल प्रणाली है क्योंकि इसमें शारीरिक संरचना शामिल हैं जो स्तनधारी नेफ्रोन के समान हैं। इससे पहले, मछली में किडनी की चोट का अध्ययन करने वाला सबसे सामान्य मॉडल औषधीय सौम्यमिसिन मॉडल था। हालांकि, यह मॉडल चोट के सटीक स्टेटियोटेम्पोरल नियंत्रण की अनुमति नहीं देता है, और इसलिए किडनी की मरम्मत में शामिल सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना मुश्किल है। इस सीमा को पार करने के लिए, यह काम एक विधि प्रस्तुत करता है, जिसके माध्यम से, जेनेमिसिन दृष्टिकोण के विपरीत, एक विशिष्ट ग्रीन फ्यूरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -एक्सदबाने वाले नेफ़्रॉन सेगमेंट को वायलेट लेजर लाइट (405 एनएम) का उपयोग कर फोटोशोलेट किया जा सकता है। ए.के.आई. का यह उपन्यास मॉडल कई फायदे प्रदान करता है कि उपकला चोट के अन्य तरीकों की कमी है। इसका मुख्य लाभ चोट स्तर के "डायल" और विवो पशु मॉडल में मजबूत में सटीक spatiotemporal नियंत्रण की क्षमता है। इस नई विधि में गुर्दे की चोट और मरम्मत तंत्र की समझ के स्तर को महत्वपूर्ण रूप से आगे बढ़ाने की क्षमता है।

Introduction

तीव्र किडनी चोट (AKI) 1 , 2 , जिसे तीव्र गुर्दे की विफलता के रूप में भी जाना जा सकता है, को मोटे तौर पर गुर्दे की क्रिया 3 में अचानक हानि के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि इस शर्त की समझ के स्तर को वर्षों से उल्लेखनीय रूप से बढ़ाया गया है, रोग और मृत्यु दर उच्च 1 , 2 बनी हुई हैं। इस स्थिति के लिए वर्तमान उपचार ज्यादातर सहायक है, क्योंकि ड्रग थेरेपी के कई नैदानिक ​​परीक्षणों के परिणाम नकारात्मक 4 , 5 हैं । गुर्दा अद्वितीय है क्योंकि इसमें स्वयं की मरम्मत करने की क्षमता है। अतः, एसीआई के शुरुआती निदान के बाद सहायक चिकित्सा रुग्णता 6 को सीमित करने का सबसे अच्छा तरीका है। हालांकि, एकेआई को जल्दी से पहचानना मुश्किल है, और मृत्यु दर उन लोगों के लिए एक चौंका देने वाला 50-80% है, जिनके लिए डायलिसिस 5 की आवश्यकता होती है। इस स्थिति के लिए गुर्दे की अपनी क्षमता और इलाज के विकल्प की कमी की क्षमता के साथ, इस नेफ्रोन पुनर्जनन प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए तरीकों का विकास करना महत्वपूर्ण है।

AKI अनुसंधान के लिए कई अलग-अलग मॉडलों का इस्तेमाल किया गया है जिसमें चोट और जानवरों के मॉडल के विभिन्न एजेंट शामिल हैं। किडनी के नुकसान के एजेंट के संदर्भ में, एमिनोग्लिक्साइड एंटीबायोटिक gentamicin का उपयोग नेफ्रोटॉक्सिक एजेंट के रूप में किया गया है जो AKI 7 , 8 की ओर जाता है। हालांकि, कई समूहों ने पाया है कि गर्भनिरोधक उपचार zebrafish भ्रूण 9 के लिए घातक है। यह नलिकात्मक क्षति का कारण बनता है जो भ्रूण की वसूली के लिए बहुत गंभीर है, बिना किसी प्रकार के हस्तक्षेप के उत्थान के अध्ययन को मुश्किल बनाते हैं। स्तनधारी मॉडल, जैसे माउस और चूहा, को मूल्यवान माना जाता है, लेकिन उन्हें AKI के अध्ययन के दौरान कई सीमाएं मिलती हैं। शायद कृंतक मॉडल का मुख्य नुकसान विज़ुआ में कठिनाई हैकृंतक किडनी को ले जाने और इस प्रकार सटीक स्टेतिओटेमोरल प्रक्रियाओं का निर्धारण करना जो उपकला मृत्यु और मरम्मत की ओर अग्रसर होता है

जॉनसन एट अल भ्रूण और लार्वा zebrafish 9 में तीव्र गुर्दा की चोट के लिए प्रेरित करने के लिए एक लेजर पृथक-आधारित तकनीक की सूचना दी है। डेक्सट्रान संयुग्म के साथ इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद वे गुर्दे को नुकसान पहुंचाने के लिए स्पंदित लेजर पृथक्करण का इस्तेमाल करते थे। डेक्सट्रान संयुग्म से प्रतिदीप्ति, ट्यूबुल एपिथेलियम 9 में क्षति और उत्थान के दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह मॉडल ऊपर उल्लिखित दो सीमाओं पर काबू पाता है, लेकिन यह चोट के वर्गीकृत स्तरों की अनुमति नहीं देता है और बड़े, मनमाना सेल समूहों पर काम करना मुश्किल है।

यहां वर्णित ए.के.आई. के नए लेजर पृथक-आधारित ज़ेब्राफी मॉडल ने सभी उपरोक्त सीमाओं को संबोधित किया। लैर्वल ज़ेब्राफिश में प्रमेफ्रिक किडनी एक परिपक्व, कार्य अंग है जिसमें स्तनधारी के समान खंड शामिल हैंएक ग्लोमेरुलस, प्रॉक्सिमल और डिस्टल नलिकाएं, और एक कलेक्शन डक्ट 10 सहित फ़ोरन ज़ेबराफिष लार्वा भी ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, जिससे कि प्रतिदीप्ति तकनीक के माध्यम से गुर्दे का पालन करना संभव है। इस प्रकार, zebrafish AKI के vivo मॉडल में एक मूल्यवान हैं , और गुर्दा की चोट और मरम्मत में शामिल सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लार्वा प्रमेफ्रिक किडनी (5-12 दिन-बाद के निषेचन (डीपीएफ) का उपयोग किया जा सकता है

यह पत्र एक ऐसी विधि को प्रस्तुत करता है जिसके द्वारा विशिष्ट ग्रीन फ्लूरोसेन्ट प्रोटीन (जीएफपी) -छोटे जा रहे नेफ़्रोन सेगमेंट को कम-ऊर्जा (स्पंदित-लेजर सिस्टम की तुलना में) वायलेट लेजर लाइट (405 एनएम) का उपयोग कर फोटोशोलेट किया जा सकता है। GFP प्रतिदीप्ति जीएफपी फोटोबलीचिंग के अवलोकन के माध्यम से दिखाई देने वाले बदलावों को बनाने के लिए, कोशिकाओं के समूह के लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है। इसके अलावा, जीएफपी (वायलेट प्रकाश को अवशोषित करके) जीएफपी-व्यक्त गुर्दा कोशिकाओं में चोट को मजबूत करने के लिए एक ऊर्जा सिंक के रूप में कार्य करता है। समय चूक माइक्रोफिर कॉपी की मरम्मत प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अध्ययनों में सेल प्रसार, सेल प्रवासन, और सेल मेटाप्लासिलिया 11 , 12 , 13 को सभी संभावित प्रक्रियाएं मिल सकती हैं जो कि गुर्दा की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं। हालांकि, इन प्रक्रियाओं के सापेक्ष महत्व और उनके परस्पर क्रिया का विवरण ए.के.आई. के मौजूदा मॉडलों की सीमाओं के कारण उजागर करना मुश्किल हो गया है। इस उपन्यास के दृष्टिकोण का प्रयोग करना, यह दिखाना संभव था कि तीव्र क्षति के बाद सेल माइग्रेशन गुर्दे की मरम्मत में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।

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Protocol

यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के प्रयोगशाला के देखभाल और उपयोग के गाइड में सिफारिशों के अनुसार किया गया था। प्रोटोकॉल एनआईआईटी कॉलेज ऑफ ओस्टियोपैथिक चिकित्सा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (NYITCOM IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी सर्जरी और विवो प्रयोग में ट्रिकेइनेन संज्ञाहरण के तहत किया गया था, और सभी प्रयासों को पीड़ा को कम करने के लिए किया गया था।

1. भ्रूण प्राप्त करना और उनका अनुरक्षण करना

  1. गुर्दा जीएफपी फ्लोरोसेंट zebrafish पार करके भ्रूण प्राप्त करें
    नोट: फ्लोरोसेंटली लेबल वाले zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों के उदाहरण तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं
  2. 24 घंटे के बाद निषेचन के दौरान ई 3 समाधान में भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. 24 घंटे के बाद, एक ई 3 समाधान के माध्यम से मध्यम को बदलें जिसमें 0.003% 1-फेनिल -2-थियोरेरिया (पीटीयू) शामिल हैं।
    नोट: पीटीयू का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह मेलानोजेनेसिस में टाइरोसिनेस-आश्रित कदम ब्लॉक करता हैऔर इसलिए pigmentation रोकता है। यहां, यह समाधान ई 3-पीटीयू के रूप में संदर्भित है
  4. निषेचित भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं जब तक कि> 6 डीपीएफ न हो, उस बिंदु पर किडनी परिपक्व हो जाए।
    नोट: 7-9 डीपीएफ विंडो में लार्वा का उपयोग करना सबसे अच्छा है।
  5. 40 एक्स बढ़ाई और हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर पर एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, उज्ज्वल किडनी जीएफपी प्रतिदीप्ति के साथ लार्वा का चयन करें।

2. लाइव-इमेजिंग के लिए ज़ेबराफिश बढ़ते हुए

  1. अगर 3 डीपीएफ से पहले भ्रूण को फोटो देना है, तो इमेजिंग के लिए zebrafish बढ़ने से पहले किसी भी असभ्य zebrafish से chorion को हटा दें।
    1. संदंश (पसंदीदा) के साथ मैन्युअली डिचोरेट करें या प्रोटीस मिश्रण के साथ एक रासायनिक उपचार का उपयोग करें।
      नोट: Dechorination सर्वश्रेष्ठ इमेजिंग परिणाम के लिए अनुमति देता है।
  2. पेट्री डिश में ई 3-पीटीयू समाधान का उपयोग करके सीओरियन मलबे को कुल्ला और ई 3-पीटीयू के साथ डिश भरें।
  3. prepaगुर्दा फोटोबॉलेशन और लाइव इमेजिंग के लिए zebrafish को माउंट करने के लिए 0.2 मिलीग्राम / एमएल ट्रिक्सिन समाधान के साथ 1-2% कम-पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose करें।
    1. अगर एलएमपी एगरोज़ पहले ही तैयार हो चुका था, तो इसे पिघलकर माइक्रोवेव में फिर से गरम कर लें।
  4. LMP agarose तैयार करने के बाद, एक विदारक माइक्रोस्कोप पर 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश रखें। एनेस्थेटेड लार्वा को ठीक से उन्मुख करने के लिए एक खींचा गिलास जांच रखें।
    नोट: इस चरण को एक समय पर फैशन में करना और सभी जगहों पर करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एगारोज़ से पहले 1-3 मिनट में भ्रूण को ढंकता है।
  5. भ्रूण को agarose में स्थानांतरित करने से पहले, सुनिश्चित करें कि agarose शांत ( यानी शरीर के तापमान के बारे में)। भ्रूण को ठंडा-डाउन पिघला हुआ एगरोज़-ट्रिक्सिन समाधान में रखने के लिए प्लास्टिक या ग्लास ट्रांसफर विंदुक का प्रयोग करें।
    नोट: ऐसा इसलिए किया जाता है क्योंकि एगारोज़ जो बहुत गर्म है वह भ्रूण के लिए हानिकारक हो सकता है, जिससे हृदय की गिरफ्तारी हो सकती हैया मौत
  6. ट्रांसफर पिपेट का प्रयोग करना, भ्रूण को agarose समाधान में फिर से तैयार करना और एक 35 मिमी डिश के मध्य में भ्रूण / लार्वा की स्थिति।
  7. 35 मिमी डिश के तल को समान रूप से कवर करने के लिए भ्रूण / लार्वा युक्त एगारोज फैलता है; उपयोग करने के लिए सबसे अच्छी मात्रा में एगरोज़ ~ 1-1.1 एमएल है।
  8. फोटोबलेशन और इमेजिंग के लिए सर्वोत्तम संभव स्थिति में भ्रूण को उन्मुख करने के लिए कांच जांच का उपयोग करें।
    नोट: मूवी 1 एकतरफा फोटोशोलेशन के लिए भ्रूण / लार्वा का सबसे अच्छा तरीका दिखाती है। यह चरण सबसे अधिक समय-संवेदनशील होता है और agarose जेल से शुरू होने से पहले जल्दी से किया जाना चाहिए, क्योंकि गलना शुरू होने के बाद मछली को पुनरोद्ध करने का कोई प्रयास हानिकारक है।
    1. ओरिएंट लार्वा जिससे कि किडनी सेगमेंट की किरण बीम पथ के लिए लंबवत है, जबकि विकृत खंड लेजर बीम से दूर है ( मूवी 1 देखें)।
      नोट: यह लार्वा को मूवी 1 में दिखाए गए अनुसार बदल कर प्राप्त किया जा सकता है।
    2. Agarose के लिए लगभग 15 मिनट की अनुमति दें। वाष्पीकरण को कम करने के लिए पेट्री डिश को कवर करें एक बार agarose मजबूत हो गया है, भ्रूण या लार्वा photoablation के लिए तैयार है।

    3. लेजर पृथक्करण

    1. Confocal इमेजिंग सिस्टम संचालित
      नोट: संदर्भित इमेजिंग प्लेटफॉर्म (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते समय, अनुशंसित सेटिंग्स में 40 एक्स बढ़ाई, एक 0.8 एनए पानी डिपिंग लेंस, और नमूने के 488 और 405 एनएम रोशनी दोनों की अनुमति देने के लिए सेट किए गए पहले डिक्रॉइक मिरर शामिल हैं। ग्रीन चैनल पर पता लगाना चाहिए
    2. एक कन्फोकल मंच पर स्थिरता वाले zebrafish युक्त पकवान की स्थिति।
      नोट: इस प्रक्रिया को 40-60 एक्स पानी की डिपिंग लेंस का उपयोग करके ईमानदार कॉन्फ़िगरेशन के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। हालांकि, उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए प्रक्रिया को संशोधित करना संभव है।
    3. ईमानदार कॉन्फ़िगरेशन में, एक माइक्रोस्कोर के शीर्ष पर भ्रूण युक्त पेट्री डिश करेंमॉडलिंग की मिट्टी ( उदाहरण के लिए, प्लास्टिसिन) का उपयोग करके इसे स्लाइड करें। Confocal सूक्ष्मदर्शी के स्तर पर पेट्री डिश के साथ कांच की स्लाइड स्थिति।
    4. इमेजिंग समाधान E3-PTU के 3 एमएल जोड़ें (चरण 1.3 देखें) 0.2 मिलीग्राम / एमएल ट्रिक्सिन के साथ।
      नोट: मंच पर स्लाइड रखने से पहले इमेजिंग समाधान को तुरंत जोड़ा जा सकता है। इमेजिंग समाधान के अलावा बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए ताकि एगारोज़ को डिश के नीचे से तरंग से रोका जा सके।
    5. पानी की सूई लेंस (40 या 60 एक्स) पर स्विच करें धीरे-धीरे चरण बढ़ाएं, जिससे सुनिश्चित करें कि लेंस को बीम पथ में फंसे होने से हवा को रोकने के लिए थोड़ा गुना है। एक बार जब लेंस एक कोण पर समाधान को छू लेता है, तो उसे केंद्र में भरें ताकि भ्रूण के दृश्य के क्षेत्र में हो।
    6. प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत का उपयोग करके ब्याज का सेगमेंट खोजें हल्की बिखरने को कम करने के लिए चोट के लिए लक्षित शाखा की स्थिति को देखें ( मूवी 1 देखें)।
      नोट: बाद मेंटी कदम संदर्भित सॉफ़्टवेयर (सामग्री की सारणी देखें) का उपयोग करते हैं, लेकिन प्रक्रिया आसानी से अन्य प्लेटफार्मों के लिए अनुकूलित हो सकती है
    7. सॉफ्टवेयर खोलें "देखें" पर नेविगेट करें | "अधिग्रहण नियंत्रण" | "सी 2 प्लस कॉम्पैक्ट जीयूआई" और "पिक्सेल वेलकम टाइम" को "1.9 μs", "फ्रेम आकार" से "512 x 512 पिक्सल" और "पिनहोल साइज" को "90 माइक्रोन" पर सेट करें। "405 एनएम (या कुछ सिस्टम में 408 एनएम) लेजर की तीव्रता" शून्य और "488 लेजर तीव्रता" को "कम" (अधिमानतः <1%) तक सेट करें। एक अच्छा गतिशील श्रेणी प्राप्त करने के लिए "लाभ" को समायोजित करें, लेकिन संकेत को संतृप्त न करें।
      नोट: ये मान महत्वपूर्ण नहीं हैं और स्थिरता के लिए उपयोग किए जाते हैं। जब 405 एनएम लेजर का उपयोग किया जाता है, तो इसका परिणाम जीएफपी प्रतिदीप्ति में बढ़ जाएगा। Photobleaching (चरण 3.11) के दौरान सिग्नल की संतृप्ति से बचने के लिए, ग्रीन चैनल पर संकेत लाभ मूल्य को छोटा किया जाना चाहिए। ब्लू चैनल लाभ शून्य पर छोड़ा जा सकता है, क्योंकि यह सा में इस्तेमाल नहीं किया जाता हैmpling।
    8. 488 एनएम लेजर के उपयोग से गुर्दे को स्कैन करने के लिए सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में "स्कैन" पर क्लिक करें। बीम पथ के लिए लंबवत ब्याज का वह भाग ढूंढें और जो अच्छा जीएफपी प्रतिदीप्ति के साथ अच्छी तरह से विज़ुअलाइज्ड हो। एक बार उस क्षेत्र की पहचान हो जाने के बाद, एक अण्डाकार क्षेत्र-रुचि (आरओआई) का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र को आकर्षित करें।
      1. "आरओआई" पर जाएं "अंडाकार ROI बनाएं।"
        नोट: लेजर उपचार की एक सटीक खुराक के प्रशासन की अनुमति देने के दौरान photobleaching होने पर इसका औसत GFP तीव्रता को लगातार मापने के लिए उपयोग किया जाएगा।
    9. "देखें" पर नेविगेट करें | "अधिग्रहण नियंत्रण" | "C2plus स्कैन एरिया" और "बैंड स्कैन एरिया" चुनें। आयताकार मुखौटा उस इंटरफ़ेस के भीतर दिखाई देगा। लेजर पृथक्करण के लिए लक्षित क्षेत्र को कवर करने के लिए कर्सर का उपयोग करके एक आयताकार स्कैन विंडो को मैन्युअल रूप से परिभाषित करें ( यानी ड्रैग, आकार बदलना और मुखौटा बदलना) के भीतर राइट-क्लिक करेंचयन स्वीकार करने के लिए मुखौटा क्षेत्र
      नोट: केवल चयनित क्षेत्र को स्कैन किया जाएगा।
    10. जीएफपी को सक्रिय करने के लिए सिर्फ 488 एनएम लेजर का उपयोग करके ग्रीन चैनल की निगरानी करते समय समय माप शुरू करें। सुनिश्चित करें कि 488 लेजर की तीव्रता अपेक्षाकृत कम है (~ 1%)। "उपाय" चुनकर रुचि के क्षेत्र में जीएफपी की औसत तीव्रता का आकलन करें | "टाइम मापन।" ROI के भीतर औसत तीव्रता मानों की निगरानी के लिए "ग्राफ़" या "डेटा" टैब का उपयोग करें
      नोट: अधिग्रहण की दर पिक्सेल रहने के समय और चरण 3.9 में आयताकार खिड़की सेट के आकार से परिभाषित की गई है, लेकिन सामान्य तौर पर, यह संकेत (~ 2-10 फ्रेम / एस) की त्वरित निगरानी की अनुमति देता है।
    11. वायलेट लेजर (405 एनएम) के साथ गुर्दे की कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाते हुए तीव्रता को "लेजर पावर" नियंत्रण को दायीं ओर सभी तरह से स्लाइड करके 100% तक बढ़ा दें। यदि तीव्रता कम है तो 488-एनएम लेजर सक्रिय रह सकते हैं।
      1. एक पंक्ति जी देखें"डेटा" टैब का उपयोग करते हुए "ग्राफ" टैब या जीएफपी तीव्रता के संख्यात्मक मूल्यों का उपयोग करके रैप, और जब तक यह वांछित स्तर तक नहीं जाता, तब तक प्रतीक्षा करें, उदाहरण के लिए बेसलाइन का 50% ( चित्रा 1 में दिखाया गया है)।
        नोट: संदर्भित लेजर इकाई के हिस्से के रूप में एक 20 मेगावाट लेजर का उपयोग किया गया है (सामग्री की तालिका देखें); सिस्टम के बीच अधिकतम तीव्रता भिन्न हो सकती है लोअर तीव्रता को अधिक जोखिम के लिए मुआवजा दिया जा सकता है ( यानी कुल जीपीपी विरंजन का उपयोग करके कुल एक्सपोजर का एक उपाय)।
    12. अण्डाकार आरओआई (चरण 3.8) के भीतर जीएफपी की तीव्रता एक वांछित स्तर तक गिरा दी गई है, तुरंत "लेजर पावर" स्लाइडर को बायीं ओर ले जाने के लिए "0" के लिए वायलेट (405 एनएम) लेजर की तीव्रता में कमी आती है सॉफ्टवेयर नियंत्रण कक्ष
      1. GFP प्रतिदीप्ति की एक नई आधार रेखा प्राप्त करें X / Y का अनुपात प्राप्त करके पृथक की पुष्टि करें
        नोट: चित्र देखें1 बी; पृथक होने से पहले ई = औसत तीव्रता और एक्स = पृथक होने के बाद औसत तीव्रता, आरओआई के भीतर लगातार चार नमूनों का औसत उपयोग करते हुए। सटीक लक्ष्य अनुपात (50%, 60%, आदि ) किसी दिए गए प्रयोग के लिए वांछित चोट की मात्रा पर निर्भर करता है।

    प्रेजिडियम आइडियाड स्टीनिंग के साथ समय चूक माइक्रोस्कोपी

    1. फोटोबॉलेशन के बाद किडनी सेल की चोट के सहसंबंध के रूप में प्रोपिडियम आयोडाइड स्टेंसिंग की कल्पना करने के लिए सामान्य समय चूक विचार (पिछले 15 अध्ययन में उल्लिखित) लागू करें।
    2. क्रमशः चरण 2 और 3.7 में वर्णित, एम्बेडिंग और फोटोबॉलेशन के पहले 3 घंटे के लिए 30 माइक्रोग्राम प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान (1% डीएमएसओ ई 3-पीटीयू) में लार्वा को पूर्व सेवन करें।
      नोट: agarose या इमेजिंग समाधान में कोई अतिरिक्त प्रोपियोडियम आयोडाइड की आवश्यकता नहीं है।
    3. चरण 3.1-3.12 में वर्णित के रूप में, कंबल की किडनी की चोट को प्रेरित करें।
    4. समय चूक छवि ढेर, descri के रूप में प्राप्त करेंएक पिछले अध्ययन 14 में बिस्तर, 488 एनएम लेजर (जीएफपी) और एक 461-एनएम लेजर (प्रोविडियम आयोडाइड, पीआई) का उपयोग करते हुए।
      नोट: जीएफपी के लापता होने और प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला होने की स्थिति के संबंध में दो रंगों को कन्फोकल स्टैक में आरोपित किया गया है।
    5. समय चूक छवि ढेर प्राप्त करने के लिए पैरामीटर सेट करें: आभासी टुकड़ा मोटाई = 4 माइक्रोन, z- स्टैक अंतराल = 2 माइक्रोन, पिक्सेल रहने का समय = 1.9 μs, छवि आयाम = 512 x 512, और औसतन = 2
      नोट: इन मापदंडों को निरंतर, 4 से 4 लार्वा तक की 10 से 15 मिनट की अंतराल रिकॉर्डिंग की अनुमति मिलती है और यह सुनिश्चित करना है कि नमूने का न्यूनतम फोटोबलीचिंग है।
    6. डेटा को कल्पना और विश्लेषण करने के लिए रिकॉर्डिंग फ़ाइल स्वरूप के साथ संगत इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

कृपया ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक कई गुर्दा जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ ईटी (केआरटी 8: ईजीएफपी) sqet11-9, ईटी (केआरटीई: ईजीएफपी) sqet33-d10, और टीजी (एटीपी 1 ए 4 ए 4: जीएफपी) सहित इस्तेमाल किया गया था। यहां दिखाए गए उदाहरण के परिणाम ईटी (krt8: EGFP) sqet11-9 लाइन से प्राप्त किए गए थे।

चित्रा 1 उदाहरण photoablation प्रोटोकॉल दिखाता है। औसत जीएफपी तीव्रता की रुचि के क्षेत्र ( चित्रा 1 ए और मूवी 1 ) के अंदर नजर रखी जाती है। एक उदाहरण औसत तीव्रता का निशान चित्रा 1 बी में दिखाया गया है

जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, 405 एनएम लेसर प्रकाश के संपर्क के बाद, जीएफपी प्रतिदीप्ति एक समय में एक कोशिका को गायब करने तक जारी है, जब तक कि 220 मिनट में, पूरे पृथक सेगमेंट अपनी जीएफपी सकारात्मकता का 100% खो देता है। जीएफपी एफ का यह नुकसानप्रतिदीप्ति वास्तव में कोशिका मृत्यु के कारण होती है और नहीं, उदाहरण के लिए, जीएफपी अभिव्यक्ति की डाउन्र्र्यूगेशन। यह जीएफपी सकारात्मकता खोने वाले कोशिकाओं में लाल फ्लोरोसेंट प्रोपिडियम आयोडाइड पॉजिटिव नाभिक की उपस्थिति से इसका सबूत है।

सेल की मृत्यु की सीमा पृथक सेगमेंट में औसत जीएफपी प्रतिदीप्ति को मापकर और इसका मतलब गहन जीएफपी तीव्रता के साथ तुलना में पृथक सेगमेंट के तत्काल पूर्वकाल और बाद के मुकाबले का आकलन किया जा सकता है। चित्रा 3 चित्रा 3 उजागर खंड में लेजर एक्सपोजर की सीमा (photobleaching की प्रारंभिक राशि से मापा जाता है) और कोशिका मृत्यु की सीमा के बीच संबंध को दर्शाता है। इससे पता चलता है कि, शुरुआती एक्सपोजर को अलग करके, चोट और डायल करने के लिए "डायल" करना संभव है। प्रारंभिक जीएफपी फोटोबलीचिंग के 10-20% के साथ, जीएफपी सकारात्मकता की लगभग कोई कमी 5 घंटे बाद की चोट पर नहीं देखी जाती है। 50 और 60% फोटोबलीचिंग पूरी तरह गायब हो जाती है5 हफ्ते में जीएफपी का आदान-प्रदान, जबकि 30 और 40% विरंजन इंटरमीडिएट परिणाम की ओर जाता है, 50% अनुमानित मृत्यु के साथ लगभग 35% फोटोबलीचिंग में देखा गया। ये परिणाम पीआई धुंधला ( चित्रा 3 बी ) द्वारा समर्थित हैं। लगभग 100 मिनट के बाद पृथक्करण पर लगभग कोई पीआई धुंधला हो जाने में 20% फोटोबलीिंग परिणाम। 50% फोटोबलीिंग 60 मिनट के बाद पृथक एपिथेलियम में निरंतर पीआई पॉजिटिविटी की ओर जाता है, जबकि 30 और 40% फोटोबलीचिंग इंटरमीडिएट पीआई इनकॉर्पोरेशन की ओर जाता है। जैसा कि इस आंकड़े से देखा जा सकता है, इस पद्धति से ग्रसित मात्रा में उपकला चोट की प्रेरण और घातक और उप घातक उपकला क्षति के उपकलात्मक प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए अनुमति मिलती है।

आकृति 1
चित्रा 1: फोटोबलेशन प्रक्रिया ( ए ) योजनाबद्ध भ्रूण / लार्वा ओरिएंटेशन, लेजर एक्सपोज़र, और क्षेत्र के हित (अंडाकार) मापजीएफपी फोटोबलीचिंग की मात्रा की निगरानी के लिए औसत प्रतिदीप्ति की चिकित्सा; मूवी 1. देखें आयताकार बॉक्स स्कैन विंडो को इंगित करता है। ( बी ) 405 एनएम लेजर एक्सपोजर से पहले, के दौरान, और उसके बाद के वास्तविक जीएफ़पी तीव्रता के निशान का वास्तविक क्षेत्र का एक उदाहरण। चार लगातार मापन (हरे बक्से के अंदर दिखाए गए) पर औसत जीएफपी तीव्रताएं (वाई) और तस्वीर (एक्स) के बाद दिखायी जाती हैं। अनुपात एक्स / वाई कुल प्रकाश जोखिम के एक उपाय के रूप में उपयोग किया जाता है और चित्रा 3 में एक्स अक्ष पर प्लॉट किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
2 चित्रा: 405 एनएम लेजर एक्सपोजर के बाद उपकला सेल मौत। जीएफपी के गायब होने के एक उदाहरण अनुक्रमिक फ्रेमफोटोबॉलेशन (40% प्रारंभिक फोटोबलीचिंग) के बाद प्रेजिडियम आयोडाइड स्टेंसिंग की उपस्थिति। वायलेट-लाइट (405 एनएम) एक्सपोजर के बाद फ्रेम 0, 130, 170 और 220 मिनट पर है। जीएफपी के लापता होने पर लाल फ्लोरोसेंट पीआई परमाणु ऊर्जा की उपस्थिति के साथ मेल खाता है। कृपया ध्यान दें कि लाल चैनल का उपयोग करके प्रिआई प्रतिदीप्ति का पता लगाया गया है। गुर्दे के बाहर लाल प्रत्यारोपण क्रोमोफोरस और पेट की लुमेन में पीआई की उपस्थिति के कारण होता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: फोटोबॉलेशन की मात्रा में उपकला चोट के प्रति उत्तर। ( ए ) फोटोबॉलेशन एक्सपीस में जीएफपी प्रतिदीप्ति में प्रारंभिक कमी के प्रतिशत से मापा जाता हैएड खंड यह घायल क्षेत्र में औसत जीएफपी प्रतिदीप्ति में गिरावट के साथ तुलना में 5 घंटे के बाद चोट लगने की तुलना में है। यह माप सामान्यतः प्रतिदीप्ति अपस्ट्रीम की औसत राशि और घायल वर्ग के डाउनस्ट्रीम के लिए सामान्यीकृत है। प्रारंभिक फोटोबलीचिंग के लक्ष्य खुराक 10, 20, 30, 40, 50 और 60% थे। वास्तविक मात्रा 14.8, 24.4, 33.8, 45.4, 56.5 और 62.1% फोटोबलीचिंग की राशि है, जो 85.2, 75.6, 66.2, 54.6, 43.5 और 37.9% शेष प्रतिदीप्ति परिणामस्वरूप, n = 2 - 6 / लक्ष्य समूह। त्रुटि सलाखों एक्स के साथ मानक विचलन (photoablation के तुरंत बाद शेष प्रतिदीप्ति का प्रतिशत) और वाई (photoablation के बाद 5 घंटे शेष प्रतिदीप्ति के बाद) अक्षों का प्रतिनिधित्व करते हैं। ( बीई ) पीआई धुंध GFP सकारात्मकता के समग्र गायब होने की समानताएं। लगभग 100% पोस्ट-लेजर एक्सपोजर ( बी , दाएं पैनल) पर लगभग 20% (80% शेष प्रतिदीप्ति) फोटोबलीचिंग पर कोई पीआई धुंधला नहीं देखा जाता है। ( सी और ई ) दिखाते हैं, लगभग 100% पीआई पॉजिटिविटी 60 मिनट पोस्ट में देखी जाती है -ज्यान (सही पैनल) ( बीई ) में बायां पैनल, फोटोबलीचिंग की प्रारंभिक राशि दिखाते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति पैटर्न संदर्भ
टीजी (wt1b: GFP) ग्लोमेरुलस, कुछ पीटी [1 1]
टीजी (atp1a1a.4: GFP) ग्लोमेरुलस के लिए डिस्टाल [12]
टीजी (cdh17: GFP) ग्लोमेरुलस के लिए डिस्टाल [9,10]
टीजी (ret1: GFP) देर डीटी, पीडी [13]
टीजी (enpep: GFP) ग्लोमेरुलस के लिए डिस्टाल [14]
टीजी (cd41: GFP) बहु-स्तरीय कोशिकाएं [15]
ईटी (krt8: EGFP) sqet11-9 सीधे पीटी, प्रारंभिक डीटी [16,17]
ईटी (krt8: EGFP) sqet33-D10 पीआईटी का बदला हुआ [16,17]
पीटी = समीपस्थ ट्यूबुल
डीटी = दूरस्थ ट्यूबुले
पीडी - प्रोनफ्रिक वाहिनी
तालिका 1: किडनी जीएफपी ज़ेब्राफिश लाइन के उदाहरण। कुछ प्रतिनिधि ज़ेबराफिश लाइनें यहां सूचीबद्ध हैं, जो इंगित करता है कि प्रक्षेफ़्रिक किडनी के किस खंड को एक विशेष ट्रांसजेनिक लाइन में लेबल किया गया है।

मूवी 1
मूवी 1: फोटोशॉलेशन प्रक्रिया का एनीमेशन सारांश। फिल्म के पहले भाग में, उचित भ्रूण / लार्वा अभिविन्यास प्रदर्शित किया जाता है। दोनों गुर्दा की शाखाओं को हरे रंग में दिखाया गया है। एक ग्लास जांच का उपयोग एगरोस में मछली को ओरिएंट करने के लिए किया जाता है। ऐसा किया जाता है यदि नियंत्रण, गैर-घायल शाखा का वांछित होता है मछली को जोड़कर प्राइफाट्रिक किडनी की केवल एक शाखा पर लेजर एक्सपोजर की अनुमति देता है। फिल्म के दूसरे भाग में, लेजर पृथक प्रक्रिया को रेखांकित किया गया है। अंडाकार प्रारंभिक फोटोबलेक की मात्रा पर नजर रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले पृथक होने वाले खंड के भीतर रुचि के क्षेत्र को इंगित करता हैहिंग। आयताकार विंडो क्षैतिज खंड के आकार और स्थिति के सटीक समायोजन के लिए अनुमति देता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

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Discussion

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सिस्टम के बीच कुल लेजर शक्ति भिन्न होती है हालांकि, प्रतिशत जीएफपी फोटोबलीचिंग का उपयोग लेसर शक्ति में भिन्नता से स्वतंत्र फ्लोरोसेंट किडनी को दिया जाने वाली कुल ऊर्जा के एक पढ़ने के लिए और एक्सपोजर की लंबाई से मुआवजा देने की अनुमति देता है। ध्यान रखें, हालांकि, फोटोशैली के इस पद्धति में विभिन्न ऊतकों की प्रतिक्रिया अलग-अलग होती है। गुर्दे की परिपक्वता अवधि के दौरान, परिपक्व लार्वा की तुलना में युवा भ्रूणों में जीएफपी प्रतिदीप्ति में 50% की कमी प्राप्त करना काफी महत्वपूर्ण है। फोटोबलेशन के ऊतक प्रति संवेदनशीलता में ये मतभेद अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित और अनुकूल करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस प्रकार, जीएफपी प्रतिदीप्ति में प्रतिशत में कमी को मॉनिटर करना महत्वपूर्ण है ताकि चोट की मात्रा और घायल किडनी एपिथेलियम की भविष्यवाणी की गई प्रतिक्रिया को ठीक से मापा जा सके।

इस पद्धति का मुख्य लाभ में जब किडनी की चोट के अन्य तरीकों की तुलना में किया गया थाZebrafish चोट की spatiotemporal स्थान के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है साथ ही, यह शोधकर्ताओं को चोट के स्तर को ऊपर और नीचे डायल करने की अनुमति देता है। चोट की मात्रा को नियंत्रित करने की यह क्षमता उपकला कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं के परीक्षण के लिए अनुमति देनी चाहिए और एपोपोसिस बनाम नेक्रोसिस बनाम वसूली के मामले में निर्णय लेने में सहायता करनी चाहिए। उदाहरण के लिए, यह दिखाने के लिए संभव है कि सेल माइग्रेशन, जीवित एपिथेलियम का खंडीय पृथक्करण के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रिया है और यह कि सेल प्रसार एक द्वितीयक प्रक्रिया है, संभवतः सेल माइग्रेशन 14 द्वारा उत्पन्न यांत्रिक बलों द्वारा संचालित होता है।

सेलुलर स्तर पर मरम्मत प्रक्रिया का अध्ययन करने की क्षमता के अलावा, इस पद्धति में अन्य फायदे हैं सबसे पहले, पिछली फोटोबॉलेशन तकनीकों में फोटोडैमेज 9 की मात्रा पर सीमित नियंत्रण था हालांकि, यह मॉडल चोट की मात्रा पर एक वर्गीकृत नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, जिससे यह आसान हो जाता हैभविष्य के अध्ययन का संचालन करें इसके अलावा, इस दृष्टिकोण में, जीएफपी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के मनमानी समूहों को लक्षित करना संभव है, इस प्रकार पूरे खंडों के आसान पृथक्करण की अनुमति है। हालांकि यह स्पंदित लेजर तकनीक के साथ हासिल किया जा सकता है, लेकिन यह प्रायोगिक डिजाइन की क्षमता को सीमित करने के लिए अधिक श्रमसाध्य है। उपकला संबंधी चोट को लक्षित करने और लक्षित करने के लिए जीएफपी का उपयोग एक और लाभ है, क्योंकि बहुत सारे जीएफपी ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफी उपलब्ध हैं ( तालिका 1 केवल एक आंशिक सूची है)। ट्रांसजेनिक प्रजातियों द्वारा व्यक्त अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन का भी अध्ययन किया गया है, जैसे कि किलर रेड प्रोटीन, लेकिन ये मछली ट्रांसजेनिक्स व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं 16 । जीएफपी का उपयोग करने का एक अतिरिक्त फायदा यह है कि, अलग-अलग लेजर तरंग दैर्ध्य के साथ, जीएफपी अभिव्यक्ति को फोटोबलेशन (405 एनएम) या इमेजिंग (488 एनएम) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जॉनसन एट अल द्वारा प्रकाशित विधि 9 को गैर फ्लोरोसेंट पर लागू किया जा सकता हैZebrafish और इस प्रकार इस दृष्टिकोण से अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस लेजर पृथक्करण मॉडल की एक और सीमा यह है कि यह उन सभी अलग-अलग कारकों को ध्यान में नहीं रख सकता है जो मानव AKI को जन्म दे सकती हैं। ऐसी घटनाओं की एक श्रृंखला हो सकती है जो मानव शरीर में सेल नेक्रोसिस को जन्म देती है, साथ ही सेल एपोपोसिस जो कि गुर्दा की चोट के दौरान प्रेरित होती है। यह स्पष्ट नहीं है कि लेजर पृथक्करण के दौरान पैदा हुए विभिन्न वातावरण मनुष्यों में ए.के.आई. के रोग विज्ञान के सभी पहलुओं की नकल कर सकते हैं 10 बहरहाल, इस लेजर पृथक्करण मॉडल के वैकल्पिक मॉडल के कई फायदे हैं। वास्तविक समय में एक उच्च संकल्प में गुर्दा कोशिका की मौत और मरम्मत के अध्ययन के लिए अनुमति देकर, इस विधि से गुर्दा की मरम्मत तंत्र की बेहतर समझ होनी चाहिए और एसीआई उपचार के नए तरीकों की नींव रखनी चाहिए।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

हम गुर्दा जीएफपी ट्रांसजेनिक लाइनों को साझा करने के लिए डॉ। इयान ड्रमोंड और डा। व्लादिमीर कोर्ज को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम यह काम करने के लिए आवश्यक संसाधन उपलब्ध कराने के लिए भी NYITCOM को धन्यवाद देना चाहेंगे। यह अध्ययन अनुदान द्वारा समर्थित था: K08DK082782, R03DK097443 (एनआईएच), और एचएससीआई पायलट अनुदान (ए वी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm Genesee Scientific 32-103 Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm Midwest Scientific 910 Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar Fischer Scientific 50-241-57 Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet Globe Scientific 135030 Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine Sigma Aldrich A5040-25G Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose Fischer Scientific BP165-25 Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) Fischer Scientific 21-1640-2C Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope Nikon SMZ1270 Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine Lumencor SOLA SM-5-LCR-SB Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System Nikon Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU Sigma P7629-10G Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software Nikon C2+ Procedural Usage: Step 3
Laser Unit Agilent MLC 400 Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI) Sigma Aldrich P4170-100MG Procedural Step Usage: 4.2

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 124 किडनी ज़ेब्राफिश जीएफपी उपकला कोशिका लेजर फोटोबलेशन कन्फोकल
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Datta, R., Wong, A., Camarata, T.,… More

Datta, R., Wong, A., Camarata, T., Tamanna, F., Ilahi, I., Vasilyev, A. Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (124), e55606, doi:10.3791/55606 (2017).

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