Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Summary

Questo manoscritto specifica la realizzazione di reti neurali rivelate micro-tessuto: costruzioni tridimensionali di dimensioni microniche costituite da tratti longitudinali allineati allineati che comprendono la popolazione neuronale aggregata racchiuse in un idrogel tubolare. Questi impalcature viventi possono servire come relè funzionali per ricostruire o modulare la circuiteria neurale o come test-letti biofidelici che imitano la neuroanatomia della materia grigio-bianca.

Abstract

Il recupero funzionale si verifica raramente dopo lesioni o degenerazioni causate da malattie all'interno del sistema nervoso centrale (CNS) a causa dell'ambiente inibitorio e della limitata capacità di neurogenesi. Stiamo sviluppando una strategia per affrontare simultaneamente la perdita di percorso neuronale e axon all'interno del CNS danneggiato. Questo manuale presenta il protocollo di fabbricazione per reti neurali (micro-TENN) progettate da micro-tessuti, costruzioni impiantabili costituiti da neuroni e tratti assonali allineati che attraversano il lumen di matrice extracellulare (ECM) di un cilindro idrogelizzato preformato centinaia di micron di diametro che può estendere centimetri in lunghezza. Gli aggregati neuronali sono delimitati agli estremi dell'incasso tridimensionale e sono allineati da proiezioni assonali. Le micro-TENN sono in una posizione unica come strategia per la ricostruzione del CNS, che emulano aspetti della cytoarchitettura del connettore del cervello e potenzialmente forniscono mezzi per la sostituzione della rete. Il neuGli aggregati ronalmente possono sinaptare con il tessuto ospite per formare nuovi relè funzionali per ripristinare e / o modulare i circuiti mancanti o danneggiati. Questi costrutti possono anche agire come "scaffolds viventi" pro-rigenerativi capaci di sfruttare meccanismi di sviluppo per la migrazione cellulare e la percorrenza axonale, fornendo segnali strutturali e solubili sinergici basati sullo stato di rigenerazione. Le micro-TENN sono fabbricate versando idrogel liquido in uno stampo cilindrico contenente un ago centrato longitudinalmente. Una volta che l'idrogelo ha gellato, l'ago viene rimosso, lasciando una micro-colonna vuota. Una soluzione ECM viene aggiunta al lumen per fornire un ambiente adatto per l'adesione neuronale e l'espansione assonica. I neuroni dissociati vengono aggregati meccanicamente per una precisa semina all'interno di una o entrambe le estremità della micro-colonna. Questa metodologia crea in modo affidabile i costrutti miniaturizzati indipendenti con tratti assonali prolungati che possono ricapitolare le caratteristiche della neuroanatomia cerebrale. Synaptic immGli indicatori di calcio non codificati e codificati geneticamente suggeriscono che le micro-TENN posseggano un'ampia distribuzione sinaptica e un'attività elettrica intrinseca. Di conseguenza, le micro-TENN rappresentano una strategia promettente per la ricostruzione neurochirurgica mirata dei percorsi cerebrali e possono anche essere applicati come modelli biofidelici per studiare i fenomeni neurobiologici in vitro .

Introduction

Una caratteristica comune dei disturbi e delle malattie del sistema nervoso centrale (CNS) come la lesione traumatica del cervello (TBI), lesioni del midollo spinale (SCI), ictus, malattia di Alzheimer e la malattia di Parkinson è la disconnessione dei percorsi assonali e delle cellule neuronali Perdita ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Ad esempio, quando un colpo ischemico non viene trattato, si stima che gli assoni siano persi a una velocità di 7 miglia di assoni al minuto ⁵ . Nel caso di TBI, che circa 1,7 milioni di persone sperimentano ogni anno negli Stati Uniti, la degenerazione assonale può continuare a verificarsi anni dopo il trauma, in quanto il pregiudizio iniziale precipita uno stato neurodegenerativo a lungo termine ⁴ . Aggravatando questi effetti deleteri, il CNS ha una capacità fortemente limitataCittà per la rigenerazione ^{1 , 7 , 8 , 9} . Dopo la lesione, si sviluppa un ambiente inibitorio caratterizzato da una mancanza di guida diretta a bersagli distanti, nella presenza di inibitori associati alla mielina che ostacolano la crescita del neurite e la formazione di una cicatrice gliale mediante astrociti reattivi ^{8 , 10 , 11 , 12} . La cicatrice gliale serve come barriera biochimica e fisica alla rigenerazione, con molecole come proteoglicani di condroitina solfato che ostruiscono la crescita dell'assone ^{8 , 11} . Inoltre, anche se le cellule staminali neurali sono state trovate nel CNS adulto, la produzione di nuovi neuroni è limitata, in quanto una prova consistente di neurogenesi è stata trovata solo nel bulbo olfattivo, l'ippocampoZona subgranulare, zona periventricolare e canale centrale del midollo spinale ^{13 , 14} . Questi ostacoli impediscono il recupero funzionale dei neuroni perduti e dell'architettura della materia bianca dopo lesioni o malattie, con conseguente effetto spesso alterato e prolungato di queste condizioni.

Nonostante la mancanza di capacità rigenerativa nel CNS adulte, è stato dimostrato che la rigenerazione assonale è possibile se vengono presentati adeguati suggerimenti ambientali ai neuroni ospiti ^{15 , 16 , 17 , 18} . I ricercatori hanno cercato di trasportare e manipolare fattori di crescita ( ad esempio, fattore di crescita del nervo, fattore di crescita epidermico, fattore di crescita dipendente dagli ialti e fattore neurotrofico 3) e altre molecole di guida per stimolare la plasticità e la rigenerazione dell'assone ^{14 ,}/ Sup> ^{18 , 19} . Anche se questi studi hanno confermato che gli assoni adulti sono in grado di rispondere ai fattori di crescita, queste strategie sono limitate dalla bassa permeabilità della barriera emato-sangue e dalle specifiche sfumature spaziali e temporali necessarie per promuovere la rigenerazione ^{14 , 18 e 19} . Altri approcci hanno affidato l'iperattivazione dei fattori di trascrizione correlati alla rigenerazione nei neuroni del CNS. Ad esempio, la sovraespressione del fattore di trascrizione Stat3 stimola la rigenerazione assonale nel nervo ottico ²⁰ . Tuttavia, sia la consegna della biomolecola che la sovraespressione dei fattori di trascrizione non riescono a sostituire le popolazioni neuronali perse. Le strategie cellulari sono state principalmente incentrate sul trapianto di cellule staminali neurali (NSC) nel CNS, sfruttando la loro capacità di sostituire i neuroni CNS, rilasciare fattori trofici,E sostenere i tentativi di neurogenesi che si verificano dopo lesioni ¹⁷ . Nonostante ciò, ci sono ancora pressanti sfide che ostacolano questo approccio, compresa la capacità ostacolata delle cellule neurali trapiantate per sopravvivere, integrarsi con l'ospite e rimanere spazialmente limitati all'area ferita ^{6 , 14 , 17 , 21} . Inoltre, la sola consegna cellulare non è in grado di reintegrare la citoarchitettura di percorsi axonal danneggiati o persi. Un approccio alternativo che affronta i problemi che si trovano ad affrontare le strategie di consegna di cellule e droga / chimica sta combinando questi approcci con l'uso dei biomateriali ^{14 , 22 , 23} . I biomateriali come gli idrogeli sono in grado di emulare le proprietà biochimiche e fisiche della matrice extracellulare (ECM), aiutando la distribuzione cellulare eD all'interno dell'area ferita e fornendo fattori di crescita e altre molecole bioattive con rilascio controllato ²² . Le caratteristiche interessanti di queste strategie basate su biomateriali hanno portato alla prova della rigenerazione assonica in vivo dopo il trapianto di scaffolds alla zona lesionata ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30} . Tuttavia, le strategie biomateriali acellulari non sostituiscono le popolazioni neuronali perse; Quando vengono utilizzati come veicoli di erogazione per cellule precursori neuronali, gliali o neuronali, i biomateriali non sono in grado di ricostituire reti assonali a lunga distanza. La sfida di sviluppare un approccio che affronta sia la degenerazione del percorso assonale che la perdita neuronale associati a lesioni e malattie del CNS rimangono ancora <Sup class = "xref"> 31.

Il nostro gruppo di ricerca ha riportato in precedenza lo sviluppo di reti neurali (micro-TENN), progettate da micropagnetismi impiantabili, che sono un tipo di "scaffold vivente" costituito da corpi cellulari neuronali limitati a una o entrambe le estremità di una micro-colonna idrogel-ECM agarosio , Con tratti assonali allineati in tutto l'interno di questo incasso tridimensionale (3D) ^{1 , 10 , 31 , 32} . Una delle principali differenze tra questa tecnica e gli approcci precedenti è che la citoarchitettura delle micro-TENNs è stata completamente creata in vitro e viene poi trapiantato dopo ^{33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,}Sup class = "xref"> 39 ^{, 40 , 41} . La fabbricazione in vitro offre un ampio controllo spaziale e temporale del fenotipo cellulare e dell'orientamento, delle proprietà meccaniche / fisiche, dei segnali biochimici e dei fattori esogeni, che beneficiano dell'integrazione di questi scaffolds con l'ospite dopo l'impianto ^{41 , 42} . Le micro-TENN sono ispirate anatomicamente perché emulano la neuroanatomia del cervello, mostrando tracce assonali simili a quelle che ponte le distinte aree funzionali del cervello ( Figura 1A ) ¹ . Pertanto, questa strategia potrebbe essere in grado di sostituire fisicamente i tratti di tessuti bianchi persi e neuroni dopo l'impianto in una regione lesionata. Questa tecnica è ispirata anche da meccanismi di sviluppo in cui "scaffolds viventi naturali" formati da cellule gliali radiali e assoni pionieristici agiscono come guide di percorrenza per celluleMigrazione dalla zona subventricolare e outgrowth axon, rispettivamente ⁴³ . Questi meccanismi sono ricapitolati nei tratti assonali allineati di micro-TENN, che possono presentare percorsi di vita per la migrazione delle cellule neurali e la rigenerazione assonale mediante una crescita assonale mediata dall'assone ( Figura 1C ) ⁴³ . Inoltre, questa strategia sfrutta l'integrazione sinaptica tra i neuroni micro-TENN e il circuito nativo, formando nuovi relè che possono contribuire al recupero funzionale ( Figura 1B ) ⁴³ . La capacità di formazione di sinapsi può anche concedere a questo approccio la capacità di modulare il CNS e di rispondere al tessuto dell'ospite in base ai feedback di rete. Ad esempio, i neuroni ottogeneticamente attivi nei montanti viventi possono essere stimolati per modulare i neuroni dell'ospite attraverso interazioni sinaptiche ( Figura 1D ).

Inoltre, il costruttore tubolare a base biomaterialeLa presenza di micro-TENN offre un ambiente adeguato per l'adesione, la crescita, l'estensione del neurite e la segnalazione delle cellule, mentre le dimensioni in miniatura dei costrutti potenzialmente consentono l'impianto minima invasivo e forniscono un microambiente parzialmente sequestrato per una graduale integrazione nel cervello. Infatti, le pubblicazioni recenti hanno dimostrato il potenziale delle micro-TENN per imitare i percorsi neurali dopo l'impianto nel cervello del topo. A seguito di microinjection stereotassiale, abbiamo precedentemente riportato prove di sopravvivenza neuronale micro-TENN, mantenimento dell'architettura del tratto assonale e estensione del neurite nella corteccia ospite per almeno 1 mese in vivo ^{10 , 31} . Inoltre, l'etichettatura con la sinapsina ha fornito prove istologiche dell'integrazione sinaptica con il tessuto nativo ^{10 , 31} . Nel complesso, le micro-TENN possono essere particolarmente adattate per ricostruire e modulare danniCNS sostituendo i neuroni perduti, integrando sinapticamente con il circuito ospite, ripristinando la citoarchitettura assonale persa e, in alcuni casi, fornendo assoni rigeneranti con gli opportuni segnali di percorrenza.

Figura 1: Principi e ispirazione dietro lo sviluppo di reti neurali innovative (micro-TENN). ( A ) Le micro-TENN simulano la citoarchitettura del connettore del cervello (viola), in cui regioni funzionalmente distinte sono collegate da tratti assonali lunghi e allineati in modo unidirezionale (rosso, verde) o bidirezionale (blu). Come esempio, le micro-TENN potrebbero ricostituire le connessioni perse in percorsi corticotalamici e nigrostriatali o nel percorso perforante dalla corteccia entorilina all'ippocampo (adattato da Struzyna et al. , 2015) ¹ . ( B ) Diagramma di una unidirezioneL e bidimensionale micro-TENN (rosso e blu) sinapticamente integranti con il circuito ospite (viola) per servire come relè funzionale tra le due estremità di una lesione. ( C ) Schema dei tratti assonali di un micro-TENN unidirezionale (verde) che funge da guida per la rigenerazione degli assoni ospitanti (viola) facilitati dall'assone verso un obiettivo con cui il micro-TENN interagisce. ( D ) Schema concettuale dell'utilizzo di micro-TENNS attivo-otticamente attivi come neuromodulatori, sfruttando l'integrazione sinaptica con neuroni eccitatori o inibitori (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'attuale manoscritto illustra la metodologia utilizzata per la realizzazione di micro-TENN utilizzando i neuroni corticali cerebrali embrionati. In particolare, le micro-TENN potrebbero essere fabbricate con altri tipi di cellule neurali. Per esAmpiamente, i primi rapporti di sviluppo micro-TENN di successo hanno caratterizzato i neuroni del ganglio radicale dorsale (DRG) ³² . Le micro-colonne idrogel possono essere generate ( Figura 2A ) aggiungendo agarosio liquido ad una matrice cilindrica a taglio laser su misura oa tubi capillari, entrambi contenenti aghi allineati di agopuntura. L'ago forma il lumen e determina il diametro interno (ID) della micro-colonna, mentre l'ID tubo capillare e il diametro dei cilindri nel dispositivo taglio laser dettano il diametro esterno (OD) dei costrutti. L'OD e l'ID possono essere scelti in base all'applicazione desiderata selezionando diametri differenti per i tubi del dispositivo / capillare e gli aghi di agopuntura rispettivamente. La lunghezza delle micro-colonne può anche essere variata; Ad oggi, abbiamo riportato la costruzione di micro-TENN fino a 20 mm di lunghezza ¹⁰ e perseguono attivamente lunghezze ancora più lunghe. Dopo i gel agarosici e l'agopuntura nLe eedle vengono rimosse, una soluzione ECM generalmente costituita da collagene di tipo I e laminina viene aggiunta al lumen dei costrutti ( figura 2C ). Il nucleo ECM fornisce un ponteggio per supportare l'adesione delle cellule neuronali e l'espansione assonica. Inizialmente i neuroni corticali primari del ratto venivano placcati nelle micro-colonne utilizzando sospensioni cellulari dissociate ^{10 , 31 , 32} . Tuttavia, questo approccio non ha prodotto la citoarchitettura target in tutti i casi, definita come i corpi delle cellule neuronali limitati alle estremità delle micro-colonne, con il lumen centrale costituito da tratti assonali puri allineati. Da allora, l'uso di un metodo di aggregazione neuronale forzata (basato su protocolli adattati da Ungrin e altri ) ha permesso una più affidabile e coerente fabbricazione di micro-TENNs con la struttura ideale ( figura 2B ) ⁴⁴ . Oltre a descrivere la correnteMetodo, questo articolo mostrerà rappresentativi di fase-fase e immagini confocali di micro-TENN che dimostrano la formazione di tratti assonali nel tempo, così come la citoarchitettura finalizzata. Questo manoscritto si espanderà anche sugli aspetti degni di nota del protocollo e sulle sfide e sulle future direzioni della tecnologia micro-TENN.

Figura 2: Diagramma schema del processo di fabbricazione micro-TENN a tre stadi. ( A ) Sviluppo dell'idrogel agarosico: (i) Inizialmente, un piccolo aghi di agopuntura ( ad esempio , diametro di 180-350 μm) viene inserito nei canali cilindrici di uno stampo a taglio laser su misura o di un capillare ( ad es. , Diametro 380-700 μm). Nella fase successiva, l'agarosio liquido in DPBS viene introdotto nei canali cilindrici o nei tubi capillari. (Ii) Dopo i gel di agarosio, l 'ago viene rimosso eLo stampo viene smontato per produrre le micro-colonne cave agarose. (Iii) Questi costrutti vengono poi sterilizzati e memorizzati in DPBS. ( B ) La cultura neuronale primaria e il metodo aggregato: (i) L'aggregazione neuronale viene eseguita in matrici di micro-pozzi piramidali, stampate da stampi stampati in 3D, che si inseriscono nei pozzetti di una piastra di coltura a 12 pozzetti. (Ii) Le micro-TENN includono i neuroni primari di ratto dissociati dai cervelli fetali dei ratti embrionali-giorno-18. Dopo la dissociazione tissutale con trypsina-EDTA e DNasi I, viene preparata una soluzione cellulare di densità 1,0-2,0 x 106 cellule / mL. Iii) 12 μL di questa soluzione vengono trasferiti a ciascun pozzetto nella matrice piramidale a micro-pozzetto. La piastra contenente questi micro-pozzetti viene centrifugata per produrre aggregati cellulari. (Iv) Questi vengono quindi incubati durante la notte prima della placcatura nelle micro-colonne. ( C ) Fabbricazione del nucleo ECM e sementi cellulari: (i) Prima della semina cellulare, una soluzione ECM contenente 1 mg / ml di collagene di tipo I e 1 mg / mlIl laminino viene trasferito all'interno delle micro-TENN e permesso di polimerizzare. (Ii) A seconda che si producano micro-TENN unidirezionali o bidirezionali, un aggregato viene posto rispettivamente in uno o entrambi gli estremi della micro-colonna. (Iii) Dopo un periodo di incubazione per promuovere l'adesione, le micro-TENN vengono coltivate in piatti Petri inondati con un mezzo basale neuronale embrionale integrato. (Iv) Dopo 3-5 giorni di coltura, la struttura finale del micro-TENN dovrebbe dimostrare gli aggregati di cellule agli estremi della micro-colonna, con tracce assonali che coprono la sua lunghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutte le procedure relative agli animali sono state approvate dai comitati istituzionali di cura degli animali presso l'Università di Pennsylvania e dal Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e rispettano le linee guida stabilite dalla NIH Politica del Servizio Sanitario Pubblico sulla Humane Care and Use of Laboratory Animali (2015).

1. Sviluppo dell'idrogelo di agarosio (componente acellulare di micro-TENN)

1. Preparazione della soluzione di agarosio
   1. All'interno di un cabinet per la biosicurezza, preparare i serbatoi per le micro-colonne trasferendo 20 ml di Dulbecco's fosfato-tamponato salina (DPBS) ad ognuno dei due piatti Petri da 10 cm. Sterilizzare pinze fine e microscalpelli con uno sterilizzatore a caldo.
   2. Pesare 3 g di agarosio e trasferirlo in un bicchiere sterile all'interno dell'armadio di biosicurezza. Aggiungere 100 mL di DPBS per una concentrazione finale del 3% in peso / volume (w / v). Includere un bar magnetico pulito e coprire il bicchiere con alumiNum foil.
   3. Con un piatto caldo / agitatore, scaldare il bicchiere a 100 ° C e mescolare a 120-200 giri / min per dissolvere completamente l'agarosio (la soluzione si trasformerà da nuvoloso a chiaro). Tenere il riscaldamento e mescolare in seguito per evitare la gelazione e modificare la temperatura di riscaldamento, se necessario, per evitare di bruciare l'agarosio.
      NOTA: La fabbricazione con il dispositivo di taglio laser e con i capillari è riportata di seguito nelle sezioni 1.2 e 1.3. Procedere alla sezione 1.4 dopo aver completato i passaggi descritti in una delle sezioni. Per entrambi i metodi di fabbricazione di micro-colonna, aggiungete velocemente l'agarosio liquido, poiché l'agarosio si solidifica velocemente in fase di raffreddamento. Quando si sterilizza con un autoclave in uno dei seguenti passaggi, utilizzare le condizioni standard applicate alle vetrerie.
2. Preparazione a micro-colonna utilizzando un dispositivo tagliato a laser
   NOTA: il dispositivo tagliato a laser è tagliato da un acrilico trasparente utilizzando un tagliatore laser commerciale CO ₂ . Il fabriLa cationizzazione di strutture e dispositivi mediante taglio laser è ben documentata per una vasta gamma di applicazioni di ingegneria e ricerca ^{45 , 46 , 47} . Questo stampo ( figura 3 ) è costituito da una serie di cinque canali cilindrici, ognuno con un diametro di 398 μm e una lunghezza di 6,35 mm. Queste matrici cilindriche sono formate lungo la loro lunghezza da due pezzi: una metà inferiore (lunghezza: 25,4 mm, larghezza: 6,35 mm, altezza: 6,0 mm) e una metà superiore (lunghezza 31,5 mm, larghezza: 6,35 mm, altezza: 12,7 mm ), Come mostrato nelle figure 3A e 3B rispettivamente. Le due metà possono essere bloccate insieme dai cappucci anteriori e posteriori osservati in Figura 3C (lunghezza: 31,5 mm, larghezza: 6,35 mm, altezza: 12,7 mm), che presentano quattro fori di allineamento coincidenti con due fori ciascuno in alto e in basso Pezzi e che aiutano a fissare tutte le parti insieme quando avvitate. Questi cappellini anche incCupi cinque fori, concentrici ai canali cilindrici, in cui gli aghi di agopuntura possono essere inseriti per formare il lumen delle micro-colonne.
   1. Sterilizzare il dispositivo mostrato in Figura 3 , rivestendolo con foglio di alluminio e autoclave. Montare il dispositivo come mostrato in Figura 3D allineando i tappi anteriori e posteriori con solo la parte inferiore inferiore e fissando i tre pezzi con due viti e dadi (diametro filo: 3,05 mm) delle viti 4-40 nei fori di allineamento inferiori.
   2. Introdurre completamente un ago agopuntura (diametro 180 μm, lunghezza 30 mm) nei fori dell'ago sul lato anteriore o posteriore del dispositivo ( Figura 3D ). Con una micropipetta, versare abbastanza agarosio liquido (~ 1 mL per i cinque canali) sulla parte inferiore inferiore per riempire completamente le metà dei canali cilindrici.
   3. Immediatamente posizionare la parte superiore superiore del dispositivo sopra la metà inferiore e applicare pressione fino a quando non è saldamente dentroPosto per completare i canali cilindrici (l'attrito tra i tappi e il pezzo superiore manterrà il secondo posto). Aspetta ~ 5 min a temperatura ambiente dopo l'aggiunta di agarosio per consentire la sua gelazione all'interno dei canali del dispositivo.
   4. Estrarre manualmente l'ago da ciascuno dei fori sui tappi del dispositivo. Rimuovere le viti e separare manualmente i due cappellini e la metà superiore dal pezzo inferiore, dove quest'ultima terrà le micro-colonne idrogel.
   5. Utilizzare pinze fine per rimuovere delicatamente le micro-colonne dai canali sul metà inferiore e posizionarli nel piatto Petri preparato in precedenza contenente DPBS (punto 1.1.1). Riutilizzare il dispositivo per un altro ciclo di fabbricazione a micro-colonna. Procedere alla sottosezione 1.4.
3. Fabbricazione a micro-colonna con tubi capillari
   1. Trasferire tubi capillari di vetro (diametro: 398,78 μm, lunghezza: 32 mm) all'interno dell'armadio della biosicurezza. Interrompere manualmente(Diametro 180 μm, lunghezza 30 mm) in ogni frammento ( Figura 2A ).
   2. Trasferire 1 ml di agarosio liquido dal bicchiere alla superficie di un piatto Petri vuoto. Tenendo il tubo capillare e l'ago introdotto, posizionare un'estremità del tubo a contatto con la piscina di agarosio liquido per riempirla mediante azione capillare. Agitare il tubo per promuovere l'aumento capillare.
      NOTA: Riempire i tubi capillari con agarosio liquido quanto l'azione capillare consente; Successivamente, queste micro-colonne possono essere tagliate in costruzioni più piccole a seconda della lunghezza desiderata. La piscina di agarosio da 1 ml viene utilizzata tipicamente per un solo tubo, poiché l'agarosio raffredda e gel rapidamente, impedendo un'ulteriore azione capillare.
   3. Quando il liquido cessa di salire, rimuovere il tubo capillare dalla piscina e posizionarlo orizzontalmente sulla superficie di un piatto di Petri. Attendere 5 min per lasciare il gel agarosio all'interno dei tubi/ Li>
   4. Posizionare il pollice e il dito indice su entrambi i lati del tubo e premere contro di esso. Usate l'altra mano per estrarre rapidamente l'ago usando il pollice e il dito indice per evitare che la micro-colonna scivoli fuori dal tubo. Inserire un ago da 30 gauge nel tubo capillare per spingere lentamente la micro-colonna in un piatto contenente DPBS (punto 1.1.1).
4. Taglio e sterilizzazione a micro-colonna
   1. Trasferire delicatamente una micro-colonna da DPBS a un piatto vuoto utilizzando pinze fine. Aggiungere 10 μL di DBPS alla parte superiore della micro-colonna con una micropipetta per evitare l'essiccazione. Posizionare quest'ultimo piatto sotto uno stereoscopio per una guida visiva.
      NOTA: Durante il protocollo, l'essiccazione a micro-colonna o la disidratazione si riferisce all'acquisizione di una struttura sgualcita che è visivamente distinguibile dall'aspetto tipico e idratato di questi costrutti. Le micro-colonne disidratate fissano saldamente alla superficie dei piatti di Petri e cSi può facilmente spostare, mentre i costrutti idratati tendono a scivolare attraverso la superficie dopo essere stati manipolati con pinze. Un'immagine a contrasto di fase di una micro-colonna completamente seccata è mostrata nella Figura 8A .
   2. Tagliare la micro-colonna con un microscalpello per abbreviarlo alla lunghezza desiderata (qui, 2-5 mm). Trasportare la microcassetta tagliata con pinze fine per l'altro piatto Petri di DPBS preparato al punto 1.1.1.
   3. Ripetere i passaggi 1.4.1 e 1.4.2 per ogni micro-colonna fabbricata.
   4. Sterilizzare le micro-colonne nei piatti Petri contenenti DPBS con luce ultravioletta (UV) per 1 h. Conservare i piatti di Petri a 4 ° C prima dell'aggiunta di ECM e della placcatura delle cellule.

2. La cultura dei neuroni primari e il metodo di aggregazione delle cellule forzate

1. Preparazione della matrice piramidale a micro-pozzetto
   NOTA: Questa sezione utilizza uno stampo stampato in 3D costituito da una base cilindrica (diametro 2,2 cm, altezza 7,0 mm) a9 piramidi quadrati in cima (lunghezza laterale: 4,0 mm, angolo inclinato: 60 °), organizzati in un array 3 x 3, come mostrato nella Figura 3E . Il processo di fabbricazione degli additivi che utilizza stampanti 3D in commercio è ben documentato. Il software di progettazione computerizzato può essere utilizzato per progettare lo stampo. Il file di disegno risultante può quindi essere convertito digitalmente in un percorso utensile per una stampante 3D. Ogni stampante ha specifiche differenti e le istruzioni per l'impostazione e l'utilizzo di una stampante 3D variano di conseguenza.
   1. Utilizzare un foro da 3/32 "per forare 16 fori in un array 4 x 4 (lunghezza laterale: 4 cm, separazione fori: 1 cm), centrato nel coperchio di un piatto di Petri da 10 cm. Il pezzo inferiore del piatto di Petri per pesare 27 g di polidimetilsilossano (PDMS) e 3 g di agente di tintura (per un rapporto di 1:10). Mescolare con una micro spatola per distribuire uniformemente l'agente.
   2. Coprire il PDMS / agente di polimerizzazione con il coperchio forato. Collegare un'estremità di un tubo al vuotoInserire l'altra estremità nello stelo di un imbuto (diametro della bocca: 10 cm, lunghezza del gambo: 3 cm, diametro del gambo: 1,5 cm).
   3. Fate un'apertura con una punta da 3/32 "nella parte superiore di una lampadina a pipetta da 1 ml e inserire e fissare una punta di micropipetta da 1000 μL nell'apertura (con l'estremità appuntita verso l'alto). Mettere la lampadina e la punta nel tubo e tirare Il tubo verso l'alto fino a quando la lampadina non chiude il tubo nello stelo dell'imbuto.
   4. Posizionare l'imbuto sul coperchio piatto forato e fissare il tubo con un supporto robusto disponibile. Aprire la valvola a vuoto per 5 minuti per aspirare e portare le bolle d'aria sulla superficie.
   5. Chiudere la valvola, rimuovere l'imbuto e colpire il piatto di Petri contro la superficie del cappuccio fumo ~ 3 volte per scoppiare le eventuali bolle d'aria rimanenti.
   6. Posizionare uno stampo stampato in 3D a tre piani in ciascuno dei pozzetti in una piastra di coltura a 12 pozzetti, con le piramidi rivolte verso l'alto. Versare il PDMS / agente di polimerizzazione sopra gli stampi fino ad ogni pozzetto di tIl piatto è riempito. Coprire la piastra a 12 pozzetti con il suo coperchio e trasferirla in forno per 1 ora a 60 ° C per asciugare.
   7. Rimuovere con cautela ogni matrice micro-pozzetto PDMS ( Figura 3F ) dalla piastra con una micro-spatola. Coprire le matrici PDMS con foglio di alluminio e sterilizzare mediante autoclave. All'interno di un armadietto di biosicurezza, inserire una matrice di micro-pozzo in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti ( Figura 2B ).
2. Isolamento dei neuroni corticali dai feti del ratto
   1. Aggiungere circa 20 ml di soluzione equilibrata di Hank (HBSS) a ciascuno di quattro o sei piatti di Petri da 10 cm (uno per ogni tessuto sezionato) all'interno di un armadio per la biosicurezza. Trasferire questi piatti in una capsula di dissezione e metterli in ghiaccio. Sterilizzare strumenti di dissezione, come microscalpelli, forbici e pinze, con uno sterilizzatore a caldo.
   2. Medio basale pre-caldo del neurone embrionale + supplemento senza serum al 2% + 0.4 mM L-glutamina (indicato come "mezzo di coltura" qui di seguitoR) e 0,25% di trysina + 1 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) a 37 ° C. Sciogliere la deossiribonucleasi (DNase) I collocandola a temperatura ambiente. Preparare 1,5 ml di una soluzione DNAse I da 0,15 mg / ml in HBSS e mantenere la soluzione su ghiaccio.
   3. Eutanizzare un ratto di embryonic-day-18 in gravidanza mediante inalazione di anidride carbonica e confermare la morte per decapitazione. Trasferire la carcassa ad una cappa di dissezione sterile e posizionarla verso l'alto con l'estremità ventrale. Sciacquare bene l'addome con il 70% di etanolo.
   4. Aprire l'utero e rimuovere i feti (di solito 11) dai sacchi amniotici con forbici e trasferirli con pinze a un piatto di Petri contenente HBSS freddo, come descritto ⁴⁸ . Posizionare un blocco di granito refrigerato (-20 ° C) sotto lo stereoscopio. Posizionare il piatto di Petri sulla superficie di questo blocco freddo per conservare la bassa temperatura dell'HBSS durante la procedura di dissezione.
   5. Sciacquare i cuccioli swishing HBSS intorno e poi trasferirli al piatto successivo pulitoContenente HBSS. Con l'aiuto dello stereoscopio e degli strumenti di dissezione, rimuovono in sequenza le teste, gli emisferi cerebrali e i cortici dei feti e trasferiscono ciascun tessuto con pinze a un nuovo piatto pieno di HBSS dopo ogni dissezione ⁴⁸ .
   6. Aspirare solo i cortici con una pipetta Pasteur e collocare il tessuto in un tubo centrifugo sterile da 15 ml. Scartare gli altri tessuti sezionati. Sciacquare i cortici tre volte aggiungendo e rimuovendo in sequenza ~ 5 ml di HBSS con una pipetta sierologica. Mettere il tubo sul ghiaccio quando non è in uso.
   7. Trasferire i cortici con una pipetta Pasteur a un tubo da 15 mL contenente trypsin-EDTA pre-riscaldato (4-6 cortici per 5 mL di trypina-EDTA). Agitare manualmente il tubo una volta e posizionarlo a 37 ° C. Invertire il tubo ogni 3 minuti per evitare che il tessuto si blocchi.
   8. Fermare l'esposizione a trypsina dopo ~ 10 minuti rimuovendo il tessuto con una pipetta Pasteur e trasferendola a una centrifuga pulita da 15 mltubo. Aggiungere la soluzione da 0,15 mg / ml DNasi I (1,5 mL) al tubo con una pipetta.
   9. Utilizzare una pipetta Pasteur per rompere manualmente i grumi di tessuto e quindi vortice (~ 30 s) finché la soluzione non appare omogenea e non ci sono frammenti di tessuto rimanenti nel liquido. Se non è possibile completamente omogeneizzare la soluzione, estrarre i frammenti insolubili tirandoli nella punta di una pipetta Pasteur.
   10. Centrifugare la soluzione di cellule omogenea ottenuta nel punto 2.2.9 a 200 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare le cellule pelletate. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura con una pipetta sierologica e vortice per risospendere le cellule.
   11. Contare il numero di cellule nella soluzione preparata al punto 2.2.10 utilizzando un emocitometro; La resa prevista è 3,0-5,0 x 10 ⁶ cellule / emisfero corticale. Preparare 1 mL o più di sospensione cellulare in mezzo di coltura, con una densità di 1,0-2,0 x 106 cellule / mL.
3. Formazione di aggregati di cellule neuronali
   1. Con una micropipetta, aggiungere 12 μL della sospensione cellulare da 1,0-2,0 x 10 ⁶ / mL in ciascun micro-pozzetto dell'array PDMS (che è stato inserito nella piastra nel punto 2.1.7).
      NOTA: la concentrazione cellulare può essere regolata in base all'ID ID micro-colonna e alla dimensione dell'aggregato cellulare desiderato, poiché le concentrazioni superiori producono aggregazioni maggiori.
   2. Centrifugare la piastra a 200 xg per 5 minuti per forzare l'aggregazione delle cellule in fondo ai micropiuma ( Figura 2B ). Aggiungere accuratamente 2 ml di terreno di coltura alla cima di ogni matrice PDMS per coprire tutti i micropiumini seminati, facendo attenzione a non disturbare le cellule aggregate.
   3. Se le cellule non saranno trasdurate con un vettore virale, incubare la piastra per 12-24 ore a 37 ° C e 5% CO ₂ e quindi procedere alla sezione 3. Se gli aggregati saranno trasdotti, saltare l'incubazione e procedere alla sezione 2.4 .
4. TranSduction con un vettore virale per osservare la segnalazione del calcio
   Nota: Queste fasi vengono eseguite per trasduzione di neuroni con un vettore virale contenente un indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI). I risultati mostrati in questo articolo sono stati ottenuti utilizzando un virus adeno associato commercialmente (AAV) (serotipo 1) con GCaMP6f, un GECI con rapida cinetica costituita da proteine ​​fluorescenti verdi (GFP), calmodulina (CaM) e peptide M13, Guidato dal promotore di Synapsin I umano. La soluzione vettoriale virale può richiedere la diluizione in DPBS sterile prima della trasduzione, a seconda della concentrazione della soluzione stock. La salute delle cellule / morfologia e la forza del segnale GCaMP6f devono essere osservate nel tempo per un intervallo di concentrazioni di vettori. Questa procedura di ottimizzazione deve essere eseguita da ogni investigatore per determinare il titolo appropriato per le proprie colture cellulari. Il tempo tipico di espressione di GCaMP6f è di 7-8 giorni dalla trasduzione che si verifica durante l'incubazione effettuata in stEp 2.4.2.
   1. Con una micropipetta, aggiungere il volume richiesto di soluzione virale vettoriale (per una concentrazione finale di ~ 3,0 x 10 ⁹ copie genomiche per aggregato) al terreno di coltura, coprendo gli aggregati. Lentamente pipetta su e giù per assicurare che la soluzione vettoriale sia distribuita omogeneamente in tutto il mezzo di coltura.
   2. Incubare la piastra con i micropiumini piramidali seminati per 24 h a 37 ° C e 5% CO ₂ per consentire la trasduzione virale di GCaMP6f.
      

3. Sviluppo del componente cellulare delle micro-TENN

1. Fabbricazione di base ECM
   1. Dopo l'incubazione aggregata, aggiungere il collagene di tipo I e la laminina al terreno di coltura (per una concentrazione di 1 mg / mL ciascuna) in un tubo di microcentrifuga per preparare la soluzione ECM. Eseguire le fasi 3.1.2-3.1.4 a temperatura ambiente ma mantenere il tubo con ECM sul ghiaccio quando non è in uso per prevenire la gelazione precoce.
      
   2. Regolare il pH della soluzione ECM trasferendo 1-2 μL in carta di lucido per verificare il pH iniziale, se necessario, aggiungendo 1 μl di idrossido di sodio 1 N (NaOH) e / o 1 N acido cloridrico (HCl) E ripetendo fino al pH 7,2-7,4. Assicurare l'omogeneizzazione della soluzione ECM pipettando su e giù evitando la formazione di bolle d'aria.
   3. Trasferire le microcollezioni con le pinze sterilizzate dai piatti nel punto 1.4.3 per vuotare i piatti Petri da 35 o 60 mm. Lavorare su 4-5 micro-colonne alla volta per prevenire la disidratazione. Fissare una punta da 10 μl attaccata ad una punta da 1000 μl a una micropipetta. Utilizzando lo stereoscopio per la guida visiva, posizionare la punta ad una estremità delle micro-colonne e aspirazione per estrarre il DPBS residuo e le bolle d'aria dal lumen.
   4. Creare velocemente 4-5 μL di ECM in una micropipetta. Osservando sotto uno steReoscopio, posizionare la punta della micropipetta in una delle estremità delle micro-colonne e scaricare abbastanza ECM per riempire il lumen. Confermare l'assenza di bolle d'aria nel lumen, in quanto potrebbero inibire l'espansione assonica attraverso l'ECM. Se esistono bolle d'aria, rimuovere l'ECM come descritto nel passaggio 3.1.3 e aggiungere nuovamente l'ECM.
   5. Per prevenire la disidratazione, aggiungere circa 2 μL di ECM attorno ad ogni micro-colonna. Incubare le micro-colonne idrogel / ECM nei piatti di Petri a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 25 min. Procedere alla coltura delle cellule immediatamente dopo l'incubazione.
      NOTA: Il periodo di incubazione nel punto 3.1.5 è destinato a consentire tempo per la polimerizzazione del collagene e della laminina all'interno delle micro-colonne.
2. Seminazione delle cellule neuronali nelle micro-colonne
   NOTA: Per cambiare il mezzo di coltura degli aggregati trasduttori, inclinare la piastra, utilizzare una micropipetta per rimuovere il mezzo che si passa alla parete del pozzetto e poi aggiungere lentamente ~ 1 ml contro il(Per evitare disturbi degli aggregati nei micropiumini piramidali). Ripetere questo mezzo cambia una seconda volta.
   1. A seguito del periodo di incubazione nel punto 3.1.5, trasferire circa 10-20 μL di terreno di coltura in due aree libere nei piatti Petri in possesso delle micro-colonne. Utilizzare una micropipetta per trasferire singolarmente gli aggregati sul piatto di Petri contenente i costrutti e spostarli con pinze a una delle piccole piscine di terreno di coltura per preservare la salute delle cellule.
   2. Mentre osserva sotto un stereoscopio, inserire un aggregato ad ogni estremità delle micro-colonne per micro-TENN bidirezionali o, ad una estremità, per un'architettura unidirezionale (a piacimento) usando le pinze. Confermare il posizionamento degli aggregati all'interno delle micro-colonne utilizzando lo stereoscopio. Utilizzare pinze per spostare le micro-colonne seminate nell'altra piccola piscina di terreno di coltura per evitare la disidratazione e per preservare la salute aggregata.
   3. Incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 45 minuti aConsentire agli aggregati di aderire all'ECM. Verificare che gli aggregati rimangano alle estremità delle micro-colonne utilizzando lo stereoscopio; Reintrodurre gli aggregati delle cellule e ripetere la fase di incubazione come necessario.
   4. Inumidire con cura i piatti Petri contenenti le micro-TENN con mezzo di coltura (3 o 6 ml per un piatto di Petri da 35 o 60 mm), utilizzando una pipetta sierologica. Posizionare i piatti in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ per la coltura a lungo termine.
   5. Eseguire le modifiche half-media ogni 2 giorni con il mezzo di coltura. Rimuovere con cautela la metà del vecchio mezzo con una pipetta e utilizzare lo stereoscopio per una guida visiva per evitare di aspirare le micro-TENN. Sostituire aggiungendo lentamente il mezzo fresco e pre-riscaldato con una pipetta.
   6. Per riutilizzare le matrici di micro-pozzetto PDMS, rimuovere il mezzo di coltura, bollire gli array in acqua deionizzata per 30 minuti e sterilizzare in autoclave per un altro ciclo di formazione e coltura dell'aggregato.
      NOTA: nei timepoints desiderati, ilLa citoarchitettura delle micro-TENN può essere verificata utilizzando microscopia a fase di contrasto. Qui sono stati utilizzati dei tempi di esposizione di 5-8 ms e 10X (0,64 μm / pixel) e 20X (0,32 μm / pixel) per catturare le immagini a contrasto di fase. La fluorescenza associata a cambi di concentrazione di calcio nelle micro-TENN viralmente trasdurate è stata catturata utilizzando un microscopio a fluorescenza ad alta velocità con un tempo di esposizione di 50 ms, un obiettivo 10x (0,64 μm / pixel) e una luce a stato solido con filtri a passa- Nm e ~ 510 nm per rispettivamente l'eccitazione ed emissione, per visualizzare il segnale di fluorescenza GCaMP6f.

4. Immunocitochimica per studi in vitro

Nota: Per le immagini qui mostrate, sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: tubulina anti-Tuj-1 / beta-III (1: 500) e anti-sinapsina-1 coniglio (1: 500) per l'etichettatura degli assoni e pre Rispettivamente. Gli anticorpi secondari erano anti dolore- mouse 568 (1: 500) e asino anti-coniglio 488 (1: 500). I volumi necessari delle soluzioni anticorpali primarie e secondarie preparate, così come i volumi della formaldeide, del siero di cavallo e delle soluzioni detergenti, dipendono dal volume richiesto per interamente coprire i costrutti. Questi volumi possono essere minimizzati utilizzando una penna barriera idrofobica per limitare l'area circostante ogni micro-colonna.

ATTENZIONE: Questa sezione utilizza formaldeide e Hoechst. La formaldeide è un composto tossico noto per essere cancerogeno e Hoechst è un mutageno noto. Pertanto, questi composti devono essere smaltiti in un apposito contenitore di rifiuti. Tratti sempre in un cappuccio chimico usando attrezzature adeguate per la protezione personale, come un cappotto da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti.

1. Preparare una soluzione di formaldeide di volume / volume (v / v) del 4,0% in soluzione salina fosfato-tamponata (PBS) all'interno di una cappa chimica chimica.
2. Rimuovere il mezzo di coltura dai contenitori PetriLe micro-TENN con una micropipetta. Aggiungere abbastanza volume della soluzione di formaldeide ai piatti per coprire completamente le micro-TENN. Immergere le micro-TENN nella soluzione di formaldeide per 35 minuti a 18-24 ° C per fissare le cellule all'interno delle micro-colonne.
3. Rimuovere la soluzione di formaldeide al 4.0% dai piatti di Petri con una pipetta e scartare seguendo le appropriate linee guida per lo smaltimento dei materiali pericolosi.
4. Eseguire due risciacqui rapidi aggiungendo abbastanza PBS per interamente coprire le micro-TENN fisse e quindi rimuovere il PBS con una pipetta. Effettuare un terzo lungo risciacquo ammollando i costrutti nel PBS per 10 min.
   ATTENZIONE: scartare il PBS utilizzato per il risciacquo come eventualmente contenente tracce di formaldeide.
5. Preparare una soluzione di 0,3% v / v di detergente non ionico nel siero di cavallo del 4% v / v in PBS. Rimuovere il PBS dai piatti Petri contenenti le micro-TENN fisse e aggiungere un volume sufficiente della soluzione detergente del 0,3% per coprire i costrutti. Immergi per 60 minuti a 18-24 & #176; C permeabilizzare le cellule.
6. Rimuovere la soluzione detergente con una pipetta. Eseguire due risciacqui rapidi aggiungendo e rimuovendo successivamente il PBS. Successivamente, eseguire tre risciacqui più lunghi imbevando i costrutti in PBS per 5 minuti durante ogni risciacquo.
7. Diluire gli anticorpi primari nel 4% di siero di cavallo. Rimuovere il PBS dai piatti Petri contenenti le micro-TENN fisse e permeabilizzate. Aggiungere abbastanza soluzione anticorpale primaria alle micro-colonne per coprirle completamente. Sigillare i piatti Petri con il parafilm per evitare l'evaporazione e incubare durante la notte (12-16 h) a 4 ° C.
8. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria dai piatti e risciacquare come descritto nel passaggio 4.6. Al buio, preparare la soluzione anticorpale secondaria in 4,0% cavallo di cavallo. Aggiungere abbastanza soluzione anticorpale secondaria per coprire completamente i costrutti, coprire i piatti con foglio di alluminio e incubare per 2 ore a 18-24 ° C.
9. Preparare la soluzione Hoechst (1: 10.000) in PBS per macchiare i nuclei.
NOTA: Le immagini per le micro-TENN immunologiche sono state prese con un microscopio confocale laser con una risoluzione di 2.048 (~ 8 s / frame), un obiettivo di 10x (0.64 μm / pixel), eccitazione 487 nm e lunghezze d'onda di emissione di ~ 525 nm La fluorescenza verde, l'eccitazione di 561 nm e lunghezze d'onda di emissione ~ 595 nm per la fluorescenza rossa e ~ 3,22 μm / fetta con ~ 60 fette in media per le z-stack.

Representative Results

Le micro-TENN sono state monitorate usando la microscopia a fase-fase per valutare la loro citoarchitettura e la loro crescita assonale ( Figura 4 ). All'interno di micro-TENN unidirezionali di lunghezza di 2 mm, gli aggregati neuronali sono stati limitati ad una estremità della micro-colonna e hanno proiettato un fascio di assoni attraverso il nucleo interno. Axons ha percorso l'intera lunghezza della colonna di 5 giorni in vitro (DIV) ( Figura 4A ). C'è stato un maggiore tasso iniziale di crescita assonale in micro-TENN bidirezionali di lunghezza di 2 mm, in quanto gli assoni hanno attraversato l'intera micro-colonna con 3 DIV ( Figura 4B ). Con 5 DIV, le micro-TENN bidirezionali presentavano tracce asse dense che collegavano gli aggregati mantenuti agli estremi della micro-colonna. Questa citoarchitettura è stata osservata anche in micro-TENN da 5 mm, con assoni che attraversano la micro-colonna di 5 DIV ( Figura 4C ). Come osservato in tutti i casi, l'ECM nel lumen e le restrizioni geometricheL'agarosio ha fornito la direzione necessaria per formare tracce assonali che strutturalmente imitano le caratteristiche della neuroanatomia nativa.

In questo protocollo sono state applicate tecniche di immunocitochimica e sono state prese immagini confocali per verificare i componenti dell'architettura micro-TENN. I nuclei cellulari macchiati con Hoechst (blu) sono stati localizzati quasi esclusivamente negli aggregati agli estremi di micro-colonne unidirezionali e bidirezionali, con in essenza nessuna colorazione Hoechst all'interno ( Figura 5 ). Questa osservazione ha confermato ciò che è stato dedotto dalle immagini a contrasto di fase: le popolazioni neuronali sono state limitate alle estremità e solo gli assoni (in rosso) hanno attraversato il lumen delle micro-TENN. Tuttavia, dopo che gli assoni hanno attraversato gli aggregati, la migrazione cellulare è stata osservata lungo i tratti assonali nel lumen interno, come osservato dalla presenza di nuclei (azzurri) nell'interno a 28 DIV per un bidire di 2 mm di lunghezzaMicro-TENN ctional ( Figura 6 ). Inoltre, la sinosina I immunolabeling (verde) è stata trovata in tutti i corpi cellulari e tratti assonali ( Figura 6 ). Synapsin I è una proteina terminale pre-sinaptica implicata nella regolazione del rilascio del neurotrasmettitore e indica la presenza di terminali pre-sinaptici quando si trova in una distribuzione di punctate; È stato correlato in precedenza con la formazione di sinapsi attivi mediante registrazioni delle patch di cellule intere ⁴⁹ . La colorazione della sinapsina nella zona centrale ricca dell'assone della micro-TENN è probabilmente una combinazione di puncta e la sinapsina viene trasportata verso il basso degli assoni verso terminali pre-sinaptici. Tuttavia, la presenza di synapsin puncta all'interno degli aggregati micro-TENN suggerisce che questi costrutti hanno la capacità di comunicare attraverso le sinapsi, anche se la colocalizzazione della sinapsina con una proteina post-sinaptica sarebbe necessaria per ulteriori prove strutturali delle sinapsi funzionali./ P>

Le micro-TENN sono state anche fabbricate con neuroni aggregati che sono stati trasdotti con un AAV contenente l'indicatore di calcio GCaMP6f per sondare preliminarmente le proprietà elettrofisiologiche di questi costrutti. Questi costrutti hanno espresso l'indicatore di calcio per tutta la loro lunghezza, come dimostrato dalla fluorescenza sia negli aggregati neuronali che nei tratti assonali ( Figura 7A ). Si noti che a causa delle impostazioni del microscopio finalizzate a massimizzare l'intensità degli aggregati, la fluorescenza nei tratti assonali è risultata più fredda. Queste micro-TENN transdurate sono state analizzate nel tempo con la microscopia a fluorescenza ad alta velocità (senza stimolazione elettrica esterna) e sono state selezionate in modo casuale alcune regioni di interesse (ROI) di dimensioni cellulari in un micro-TENN rappresentativo per caratterizzare la capacità di segnalazione di questi costruisce. Le esplosioni di concentrazione di calcio sono state osservate in quasi tutti i ROI, come riflesso con l'assocLe intensità fluorescenti fluttuanti durante il tempo ( Figura 7B ). In particolare, diversi ROI sembrano mostrare una periodicità quasi costante di aumenti di concentrazione di calcio ( Figura 7B ). Questi cambiamenti di concentrazione di calcio sono dedotti a essere il risultato di potenziali di azione spontanee, intrinseche, di segnalazione cellulare all'interno di singoli aggregati e / o di segnalazione attraverso assoni da aggregati distinti. Ulteriori analisi sono necessarie per caratterizzare in modo completo le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni e dei tratti assonali all'interno di micro-TENN. Tuttavia, questi risultati iniziali dimostrano che le micro-TENN presentano una robusta attività elettrica endogena / basale.

Figura 3: Cianografie del dispositivo di fabbricazione micro-colonna laser-cut e stampo piramidale a micro-pozzo stampato 3D per l'aggregazione cellulare. ( A) - ( B ) Cianografia e immagine delle parti inferiori e superiori della matrice di canali cilindriche, rispettivamente, utilizzati per fabbricare le micro-colonne idrogel. ( C ) Cianografia e immagine dei tappi utilizzati per tenere insieme il dispositivo. Entrambe le parti anteriori e posteriori condividono le stesse dimensioni. ( D ) Immagine del dispositivo assemblato richiesto per fabbricare le micro-colonne. Solo i due coperchi e la parte inferiore sono bloccati insieme alle viti nei due fori di allineamento inferiori (a sinistra). Le linee tratteggiate mostrano il posizionamento degli aghi di agopuntura attraverso i cinque fori su ciascun tappo. L'agarosio liquido viene aggiunto alla metà inferiore dei cilindri e, successivamente, la metà superiore (destra) viene posta sul dispositivo per formare l'agarosio liquido in forma. ( E ) Blueprint dei stampi stampati 3D utilizzati per realizzare matrici di micro-pozzetto PDMS. ( F ) Immagini dello stampo stampato 3D (a sinistra) e dei PDMS micro-pozzi (a destra). Tutte le dimensioni sono in milli Metri (mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Osservazione della crescita axonica in micro-TENNA mediante l'imaging a contrasto di fase dei costrutti unidirezionali e bidirezionali in funzione dei giorni in vitro . ( A ) Le micro-TENN unidirezionali di lunghezza di 2 mm mostrano i tratti assonali che estendono quasi l'intera lunghezza della micro-colonna di 5 DIV. ( B ) Rispetto alle micro-TENN unidirezionali, le micro-TENN bidirezionali da 2 mm mostrano una velocità di crescita axonale più veloce. ( C ) Per micro-TENN bidirezionali da 5 mm, i tratti assonali popolano la lunghezza della micro-colonna a 5 DIV. Questa architettura viene mantenuta almeno fino a 10 DIV. Barre di scala = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Cytoarchitettura micro-TENN osservata con immagini confocalizzate di micro-TENN unidirezionali e bidirezionali immunologicamente identificate. Le cellule sono state macchiate per nuclei cellulari (Hoechst; blu) e assoni (Tuj1; rosso). ( A ) Immagine a contrasto di fase di una micro-TENN bidirezionale (28 DIV) da 5 mm. Le ricostruzioni confocali ( D ) - ( F ) e ( I ) - ( K ) di un micro-TENN bidirezionale (28 DIV) e unidirezionale (25 DIV) a 5 mm mostrano i nuclei cellulari etichettati ( D ), ( I ) E gli assoni ( E ), ( J ), così come l'overlay ( F ), ( K ). Barre di scala: 500 μm. Insetti in ( A F ) e ( K ) si riferiscono agli ingressi neuronali e ai tratti assonali di fase-contrasto ( B ) - ( C ) e confocale ( G ) - ( H ), ( L ) . Le immagini mostrano gli aggregati limitati alle estremità del micro-TENN, mentre il lumen è allineato da tratti assonali allineati. Barre scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Espressione della sinapsina I della proteina terminale pre-sinaptica in un micro-TENN bidirezionale rappresentativo. Il costrutto è stato macchiato per nuclei cellulari (Hoechst; blu), assoni (Tuj1; rosso) e bouton pre-sinaptici (sinapsina I, verde). ( A ) Fase-contrImmagine di una micro-TENN bidirezionale a 2 mm a 28 DIV. ( D ) - ( G ) Ricostruzioni confocali che mostrano i nuclei cellulari ( D ), gli assoni ( E ), i bouton pre-sinaptici ( F ) e l'overlay ( G ) dei tre canali. Le scatole mostrano zoom-ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) delle immagini a contrasto di fase e sovrapposte per gli aggregati neuronali, rispettivamente. Barre scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Attività di segnalazione spontanea in una micro-TENN bidirezionale osservata attraverso l'espressione di un indicatore di calcio geneticamente codificato. ( A ) FluorescenzaLa microscopia ha confermato l'espressione del reporter GCaMP, come osservato dalla fluorescenza in tutti gli aggregati e gli assoni. Barra di scala = 100 μm. ( B ) Le variazioni di fluorescenza associate alle variazioni di concentrazione di calcio sono state misurate senza stimoli esterni in diverse aree di interesse (ROI) in funzione del tempo. I cerchi colorati numerati in ( A ) indicano questi ROI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagini di contrasto a fasi di modi comuni di fallimento nella metodologia micro-TENN. ( A ) Una micro-colonna agarosica completamente disidratata / secca a seguito della rimozione e / o dell'evaporazione di DPBS nelle fasi iniziali di fabbricazione. Barra di scala = 5081; m. ( B ) Microcollo di idrogel con il lumen che allinea la parete esterna del costrutto a causa della mancanza di allineamento concentrico dell'ago agopunturale con il tubo capillare. Barra di scala = 100 μm. ( C ) Micro-TENN seminato con entrambi gli aggregati presenti a 1 DIV. ( D ) Uno degli aggregati è sceso dalla stessa micro-colonna ( C ) a 3 DIV. ( E ) micro-TENN unidirezionale a 4 DIV. ( F ) I tracciati aggregati e assonali esce dalla micro-colonna in ( E ) e rimangono galleggianti nel mezzo di coltura a 5 DIV. Barra di scala per ( C ) - ( E ) = 300 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La lesione e la malattia del CNS causano in genere la perdita o la disfunzione dei percorsi assonali a lunga distanza che comprendono il connettore del cervello, con o senza la degenerazione neuronale concomitante. Questo è aggravato dalla limitata capacità del CNS per promuovere la neurogenesi e la rigenerazione. Nonostante il perseguimento di strategie di riparazione come fattori di crescita, cellule e consegna biomateriali come approcci individuali o combinatoriali, queste tecniche non riescono contemporaneamente a rappresentare sia la degenerazione delle cellule neuronali che la perdita delle connessioni assonali ^{14 , 22} . Queste lacune nella tecnologia limitano la capacità di riparare, alterare e sondare reti neurali in modo controllato e sostenibile. Di conseguenza, la tecnologia micro-TENN è stata sviluppata per affrontare la necessità di una strategia di riparazione neurale che, in contrasto con i metodi esistenti, facilita sia la sostituzione neuronale che la ricostruzione di connessioni longitudinali. MicRo-TENNs sono impalcati impalcature di vita con una cytoarchitettura preformata che si avvicina ai blocchi di elementi di livello del sistema del cervello che sono specificamente progettati per la ricostruzione mirata, la sostituzione e la modifica dei circuiti neurali ospitanti. Queste impalcature sono costituite da popolazione discreta di neuroni collegati da tratti longitudinali assonali all'interno del lume contenente ECM di idrogeli cilindrici a agarosio in miniatura. Questi costrutti possono essere in grado di funzionare come relè sinaptici per sostituire i percorsi persi e modulare dinamicamente i circuiti nativi. Inoltre, nei casi di degenerazione assonale isolata (con i neuroni di origine rimasti intatti), le micro-TENN possono servire come guide per la rigenerazione assonale basata sul meccanismo della rigenerazione dell'assone facilitato dall'assone. Questo manoscritto ha presentato il protocollo di fabbricazione per creare in modo affidabile micro-TENN, con geometria controllata, fenotipo e caratteristiche funzionali. Microscopia a contrasto di fase, immunocitochimiciStry e microscopia confocale hanno dimostrato che le micro-TENN prodotte con il protocollo mostrano la citoarchitettura richiesta e esprimono la sinapsina proteica terminale pre-sinaptica. Inoltre, è stato dimostrato che le micro-TENN possiedono attività di segnalazione intrinseca, forse dovuta a potenziali d'azione, in assenza di simulazione esterna. Ciò è stato accertato dalla presenza di fluttuazioni quasi-sincrone nella fluorescenza associata a un reporter di calcio geneticamente codificato.

Lo sviluppo di Micro-TENN può essere riassunto in tre fasi: (1) la fabbricazione del tubo idrogelico cavo, (2) l'aggiunta della soluzione ECM al lumen del tubo, e (3) la semina degli aggregati di neuroni isolati nel Estremità del tubo. Le micro-colonne possono essere fabbricate con tubi capillari di vetro o con un dispositivo micro-fabbricato contenente canali cilindrici. Questo dispositivo può essere creato con qualsiasi metodo di micro-fabrication ad alta precisione disponibile per l'investigatore. LiquidoL'agarosio viene versato nei canali del dispositivo o nei tubi capillari contenenti un ago agopuntura centrato per creare le micro-colonne idrogel. Dopo la gelazione di agarosio, l'ago di agopuntura viene rimosso per produrre il lumeno vuoto. Nella figura 8 sono evidenziate diverse insidie ​​comuni durante la fabbricazione o la crescita. Si noti che alcune delle immagini visualizzate nella figura 4 e un caso estremo della figura 8B mostrano la parte luminale precariamente vicina alla parete del cilindro. Per produrre uno spessore uniforme della parete quando si utilizza il metodo del tubo capillare, il gruppo tubo-ago deve essere mantenuto in posizione verticale quando viene messo a contatto con agarosio e l'ago deve essere mantenuto al centro del tubo. Mantenere l'assieme tubolare ad angolo rispetto alla superficie agarosa promuove il decentramento dell'ago. Tuttavia, queste precauzioni sono difficili da attuare, e l'ago è più spesso che non riposare alonLe pareti dei tubi capillari. Al contrario, l'elemento principale del dispositivo microfabbricato è che presenta fori a spillo concentrati in concentrazione con i canali cilindrici, promuovendo una adeguata centralizzazione dell'ago e del lumen rispetto al canale e alla microcassetta rispettivamente. Inoltre, il dispositivo aumenta il throughput agevolando la fabbricazione di diverse micro-colonne contemporaneamente. Nonostante i vantaggi forniti dal dispositivo, i lumen fuori centro possono ancora essere creati utilizzando aghi bendati di agopuntura. Le tecniche di micro-fabbricazione hanno anche una tolleranza intrinseca che limita la loro efficacia. In generale, la disidratazione a micro-colonna, per la quale è mostrato un caso estremo nella figura 8A , non dovrebbe essere un ostacolo se seguite le raccomandazioni fornite in tutto il protocollo. Si noti che le proprietà fisiche dell'agarosio utilizzato per l'encasement esterno potrebbero essere necessarie ottimizzazioni per sottotipi neuronali alternativi, come miglioramento dei neuroni corticaliÈ stata osservata la crescita urvival e la neurite a concentrazioni più elevate (3-4%) rispetto al basso (1-2%) di agarosio ¹⁰ .

Lo sviluppo di Micro-TENN continua con l'introduzione di ECM nel lume di micro-colonna, che serve a fornire un ambiente adeguato per l'adesione neuronale, la sopravvivenza e l'outgrowth. Inoltre, l'ECM, in combinazione con la restrizione geometrica e la bassa porosità fornita dall'idrogel agarosico, limita la crescita axonale alla direzione longitudinale per produrre l'architettura necessaria. Il contenuto della soluzione ECM può essere ottimizzato per il tipo di neurone utilizzato. Ad esempio, il collageno da solo promuove la sopravvivenza e l'espansione assonica nelle DRG micro-TENN, mentre una combinazione di collagene e laminina è necessaria per i neuroni corticali ¹⁰ . Inoltre, la polimerizzazione ECM all'interno della micro-colonna è critica prima della placcatura cellulare, poiché la co-consegna delle cellule con ECM non polimerizzato porta a un decremento di outgr neuriteAumento e fascicolazione ³¹ . Si noti che anche se la micro-colonna è inizialmente riempita con soluzione ECM, i suoi contenuti polimerizzano in un gel morbido e tendono a contrattare durante il periodo di incubazione, creando uno spazio che consente l'inserimento degli aggregati cellulari. Inoltre, è importante confermare che l'ECM è entrato nell'interiore della micro-colonna controllando sotto lo stereoscopio; L'assenza completa e / o le tasche di ECM mancanti provocano una mancanza di crescita assonale dagli aggregati. La fabbricazione di Micro-TENN culmina nella semina degli aggregati corticali del neurone agli estremi del ponteggio. Questi neuroni sono stati disciolti dai feti del ratto utilizzando procedure note ⁴⁸ . Si può dedurre che la maggior parte delle cellule isolate sono neuroni perché la corteccia del ratto embrionale al tempo di gestazione utilizzato per l'isolamento è costituita da neuroni del 99% e il mezzo di coltura definito utilizzato nel protocollo è limitato metabolicamente per la proliferazione degli iali ⁴⁹ . Di conseguenza, dovrebbe esserci una minima contaminazione agli glial, ma per la conferma è necessaria la colorazione per marcatori specifici. Mentre questo manoscritto presentava la produzione di micro-TENN con neuroni corticali, potrebbero essere utilizzati i neuroni provenienti da diverse regioni del cervello ( ad esempio, nigral, talamico e ippocampale) o con diversi fenotipi ( es. Eccitatori, inibitori e dopaminergici) secondo l'applicazione desiderata Zona di impianto. Le iterazioni precedenti del protocollo di fabbricazione micro-TENN hanno coinvolto le cellule dissocolate ^{10 , 31 , 32} . Sebbene la citoarchitettura desiderata sia stata ottenuta usando il metodo dissociato, non è stato raggiunto in tutti i casi. In molti casi, le cellule dissociate hanno inondato l'interno e hanno portato a diversi cluster di cellule in tutto il lumen, con processi che li collegano in una vasta rete 3DRef "> 10 ^{, 31.} Il metodo aggregato, invece, assicura il contenimento dei corpi cellulari agli estremi ed è pertanto parte integrante del successo della tecnologia micro-TENN ( Figura 5 ). Nelle figure 4-6 sono state fabbricate con aggregati più grandi che non sono stati completamente inseriti, e ciò può occasionalmente provocare gli aggregati che cadono dalle colonne micro-colonne, come gli esempi mostrati nella Figura 8D e 8E . Se questa situazione si presenta anche dopo aver applicato la strategia precedente, il periodo iniziale di incubazione può essere esteso per fornire tempo sufficiente per l'adesione aggregata al ECM. Durante la coltura, la gestione delicatamente micro-TENN è Consigliato per preservare l'integrità dell'involucro idrogelico e della cytoarchitettura; problemi durante la micro-TLa manipolazione ENN è la causa delle curvature ottenute nei tracciati assonali altrimenti allineati ( Figura 5 ). Tuttavia, seguendo il protocollo presentato in questo articolo dovrebbe portare alla costante fabbricazione di micro-TENNs con l'architettura neuronale / axonica attesa, la distribuzione bouton pre-sinaptica e l'attività elettrica intrinseca.

Nonostante la promessa che le micro-TENN abbiano, ci sono ancora delle sfide che potrebbero limitare le applicazioni di questa tecnologia. L'attuale tecnica di fabbricazione della micro-colonna è limitata dal decentramento del lumen di micro-colonna, che può causare una presentazione incoerente di segnali meccanici a cellule ( ad es. Rigidità), rottura della parete di micro-colonna e successiva esposizione di tracce assonali All'esterno e ai problemi durante l'impianto. Anche se l'uso di un dispositivo micro-fabbricato ha migliorato il risultato rispetto ai tubi capillari, la micro-fabricatio di precisione più altaN sono necessarie tecniche per aumentare la riproducibilità dimensionale di questi costrutti. I risultati in questo manoscritto hanno dimostrato che la metodologia micro-TENN può produrre in modo affidabile impalcature di vita costituite da neuroni e tratti asettici che assomigliano alla neuroanatomia nativa, in particolare ai tratti assonali che connettono distinte aree cerebrali. Tuttavia, la lunghezza micro-TENN è un ostacolo, a seconda della lunghezza del percorso osseo ospite che deve essere sostituito. Ad esempio, gli innesti nervosi progettati da tessuti (TENG) sono una strategia di scaffold vivente separata utilizzata dal nostro gruppo di ricerca per riparare lesioni nervose estremamente lunghe. Per sostituire queste lunghe lacune, gli assoni in TENG possono essere allungati a decine di centimetri applicando una tensione meccanica continua in mechano-bioreattori personalizzati ^{1 , 23 , 50} . Questa tecnica di "stretch growth" è stata applicata anche per manipolare la lunghezza del processo astrocitico a betteR imitare la struttura dei percorsi radiali gliali ⁵¹ . Al contrario, l'attuale tecnologia micro-TENN non offre ancora questa misura di controllo; La lunghezza massima raggiungibile è attualmente limitata da quanto tempo i tratti assonali possono crescere in vitro in base all'estensione tradizionale cono-mediata dal cono. Inoltre, sebbene il CNS abbia una capacità intrinseca per il riavvolgimento neurofisiologico in risposta a vari stimoli e le cellule trapiantate hanno la capacità di sinapticamente integrare con la circuiteria nativa, un'altra limitazione di questa tecnologia è che le micro-TENN si basano sulla plasticità del cervello nativo E la capacità delle reti ospite di integrarsi funzionalmente con il costrutto impiantato ^{52 , 53 , 54 , 55} . Infine, una carenza innata di tutti gli approcci basati sull'impianto, come le micro-TENN, è la loro invasività. Poiché i neuroni sonoGeneralmente in prossimità dei capillari, qualsiasi tipo di procedura chirurgica può causare disturbi nella barriera emato-sangue, perdita di fattori di sangue nel cervello parenchima e una risposta infiammatoria acuta (e anche cronica) ³¹ . Questa risposta può danneggiare i neuroni host e micro-TENN, negando gli aspetti benefici di questa tecnica. Tuttavia, le micro-TENN impiantate nel percorso corticotalamico dei ratti hanno sopravvissuto per almeno un mese e hanno dimostrato l'integrazione strutturale con la corteccia cerebrale dell'ospite ^{10 , 31} . Inoltre, una precedente pubblicazione del nostro gruppo di ricerca ha presentato una metodologia che consente l'inserimento senza ago di micro-TENN in brain brain ³¹ . In questo approccio, questa strategia di inclusione di idrogel è stata ampliata includendo un sottile strato di carbossimetilcellulosa (~ 20 μm), che presentava, a lieve disidratazione, una rigidità sufficiente a penetrareIl cervello senza bisogno di un ago o di una guida ³¹ . Questo metodo di impianto senza ago, associato alla piccola sezione trasversale delle micro-colonne, dovrebbe ridurre al minimo i danni al cervello durante e dopo la procedura di impianto stereotatico.

Nonostante il successo preliminare delle micro-TENN in vivo , gli studi futuri dovranno confermare che questi costrutti integrano sinapticamente con il tessuto nativo e per indagare se il recupero funzionale è ottenuto in modelli di lesioni al CNS e malattie neurodegenerative ^{10 , 31} . Ad esempio, le micro-TENN su misura possono essere progettate con specifici fenotipi cellulari e impiantati nel corrispondente percorso degenerato per ricostruire la rete e ripristinare la funzione. Per ridurre la risposta infiammatoria acuta dopo l'impianto, il guscio di idrogel micro-TENN può essere drogato con agenti antinfiammatori e pro-sopravvivenza. Fabbricazione alternativaTecniche ( ad es. Stampe 3D) possono essere sviluppate per generare con maggiore facilità le micro-colonne idrogel e con caratteristiche più precise, tra cui la centralizzazione coerente del lumen e la riproducibilità delle dimensioni. Lo stesso schema biomateriale impiegato con micro-TENN può essere modificato per affrontare altre patologie caratteristiche di lesioni e malattie del CNS. Ad esempio, il nostro gruppo ha precedentemente sviluppato dei costrutti costituiti da fasci astrocitici allineati longitudinalmente lungo il lumeno rivestito in collagene di un idrogel agaroso che emulano strutturalmente i percorsi radiali degli gliali e il tubo gliale per facilitare la rigenerazione assonale e la migrazione neuronale ⁵⁶ . Inoltre, le cellule staminali, come le cellule staminali embrionali umane (HESCs), indotte da cellule staminali pluripotenti (iPSCs) e da cellule staminali derivate dall'adipo (ASC), possono essere incorporate per fabbricare micro-TENN autologhe su base paziente a più Somigliano molto alla citoarchitettura persa e al fenotipo delle cellule. Questi futuNuove modifiche aumenterebbero la capacità delle micro-TENN di sostituire i percorsi degenerati in vivo e consentirebbe la ricostruzione di architetture tissutali più sofisticate, che includano il supporto astroglico e la mielinazione assonica, tra le altre caratteristiche. I neuroni ingegnerizzati geneticamente potrebbero anche essere seminati per aumentare l'azione rigenerativa delle micro-TENN attraverso il rilascio di fattori trofici o per consentire la modulazione del CNS mediante la stimolazione ottogenetica dei canali ionici a luce chiusa ⁴³ . Queste impalcature potrebbero essere fabbricate con neuroni eccitatori o inibitori per modulare sinapticamente le connessioni ospitanti disfunzionali esistenti in condizioni quali epilessia, depressione, dipendenza da farmaci o disturbi del dolore ¹ . Per esempio, le micro-TENN che formano prevalentemente sinapsi GABAergiche o glutamatergiche possono essere costruite per sopprimere o stimolare, rispettivamente, i percorsi di up-o-de-regolati attraverso l'integrazione sinaptica e / o dal neur bulkRilascio dell'ottrasmettitore. Importante, tali costruzioni modulatori autonomi sarebbero teoricamente reattivi basandosi sul feedback dell'host-network ¹ . Allo stesso modo, le micro-TENNs potrebbero essere applicate come interfacce del cervello-computer (BCI), con micro-TENN ideologicamente progettate che fungono da intermedio tra il cervello e dispositivi di stimolazione o di registrazione inorganici. Questa applicazione può essere un'alternativa a BCI a microelettrodi, che non hanno specifico targeting cellulare e stabilità meccanica e che hanno causato risposte infiammatorie, formazione di cicatrici gliali e migrazione neuronale o perdita quando penetrato nel cervello ^{57 , 58} .

Come test- in vitro , le micro-TENN possono fornire una potente piattaforma per lo studio della neurobiologia e dell'elettrofisiologia, che servono come modelli biofidelici del sistema nervoso. Inoltre, i costrutti 3D possono servire come letti di prova per le strategie di trattamento quando utilizzate come inibizioni neuraliUry e malattie ⁵⁹ . Come costrutti 3D, le micro-TENN sono in grado di simulare l'ambiente in vivo , caratterizzato da interazioni complesse di cellule e cellule ECM in tutte le direzioni spaziali che non possono essere rappresentate con precisione nelle culture piane ^{42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65} . Infatti, numerose indagini hanno stabilito che il tipo di ambiente è fondamentale per le cellule presentare la morfologia, la proliferazione, la migrazione, l'espressione genica, la differenziazione e la segnalazione esibita nell'ambiente nativo ⁶⁰ . Le somiglianze tra l'ambiente 3D di questi scaffolds e il cervello stesso sono completati dal grado di controllo che questi costrutti offrono per i loro principi fisici e biochimici⁴² . Ciò consente l'ingegnerizzazione di micro-TENN con diversi set di segnali meccanici, apaptotossici e chemotaxic per studiare l'effetto di questi segnali, individualmente o sinergicamente, sulla sopravvivenza neuronale, la maturazione, l'estensione dell'asse, la sinaptogenesia e la meccanotransduzione ^{32 , 42 , 63} . Inoltre, la flessibilità di progettazione di questa tecnica di ingegneria micro-tessuto consente la costruzione di scaffolds viventi che imitano altre caratteristiche del tessuto cerebrale, come la struttura colonnare e compartimentale del neocortex, spianata dai tratti assonali della connome, per aumentare ulteriormente Potenza di questo sistema come piattaforma in vitro per studiare il cervello ⁶⁵ . Come piattaforme di ricerca, le micro-TENN sfruttano l'impostazione controllata dei modelli tipici in vitro , la disponibilità estesa dei parametri di progettazione in tessutiL'approccio alla progettazione e l'aumento della pertinenza fisiologica e patofisiologica delle piattaforme 3D per diventare un letto ideale per stimolare le conoscenze neurobiologiche. La miriade di direttive future per questa tecnologia implica la versatilità delle micro-TENN. Questo manoscritto ha dimostrato che il protocollo micro-TENN può produrre in modo affidabile scaffold viventi progettati in tessuto che imitano le caratteristiche cruciali della neuroanatomia del cervello per offrire nuove visioni nei fenomeni neurobiologici, inclusi processi di sviluppo, malattia e riparazione. Questi costrutti possono anche essere sinapticamente integrati con il tessuto nativo per ricostruire tratti di materia bianca danneggiati, sostituire le cellule neuronali perse e modulare i percorsi non regolati dopo lesioni e malattie del CNS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	--------------	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.