В этой рукописи подробно описывается изготовление микросердечных нейронных сетей: трехмерные микронные конструкции, состоящие из длинных выровненных аксональных трактов, охватывающих совокупную совокупность нейронов, заключенных в трубчатый гидрогель. Эти живые леса могут служить в качестве функциональных реле для восстановления или модуляции нейронных схем или в виде биофиделических пробирок, имитирующих нейроанатомию серо-белого вещества.
Функциональное восстановление редко происходит после травмы или вызванной болезнью дегенерации в центральной нервной системе (ЦНС) из-за тормозной среды и ограниченной способности к нейрогенезу. Мы разрабатываем стратегию одновременного устранения нейронных и аксональных потерь пути в поврежденной ЦНС. В этой рукописи представлен протокол изготовления микроштучных инженерных нейронных сетей (micro-TENNs), имплантируемых конструкций, состоящих из нейронов и выровненных аксональных трактов, охватывающих просвет внеклеточного матрикса (ECM) из предварительно сформированного цилиндра гидрогеля диаметром в сотни микрон, который может увеличиваться в сантиметрах в длину. Нейронные агрегаты разделены на крайности трехмерной оболочки и натянуты на аксонные проекции. Микро-TENN уникально сбалансированы как стратегия реконструкции ЦНС, имитируя аспекты цитоархитектуры мозговых соединений и потенциально обеспечивая средства для замены сети. НейРональные агрегаты могут синаптироваться с тканями хозяина, чтобы сформировать новые функциональные реле для восстановления и / или модуляции отсутствующих или поврежденных схем. Эти конструкции могут также выступать в качестве провосстановительных «живых лесов», способных использовать механизмы развития миграции клеток и аксоновского пути, обеспечивая синергические структурные и разрешимые сигналы на основе состояния регенерации. Микро-TENN изготавливают путем заливки жидкого гидрогеля в цилиндрическую форму, содержащую иглу с продольным центрированием. Как только гидрогель гелеобразно, игла удаляется, оставляя полый микроколонец. К просвету добавляют ECM-раствор для обеспечения среды, подходящей для адгезии нейронов и роста аксонов. Диссоциированные нейроны механически агрегируются для точного посева на одном или обоих концах микроколони. Эта методология надежно создает самодостаточные миниатюрные конструкции с длинно проецирующими аксональными трактами, которые могут повторять признаки нейроанатомии мозга. Synaptic immНеметаллические и генетически закодированные индикаторы кальция свидетельствуют о том, что микро-TENN обладают обширным синаптическим распределением и собственной электрической активностью. Следовательно, микро-TENN представляют собой перспективную стратегию для целенаправленной нейрохирургической реконструкции путей мозга и могут также применяться в качестве биофиделических моделей для изучения нейробиологических явлений in vitro .
Общей характеристикой расстройств и заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как травматическая травма головного мозга (TBI), травма спинного мозга (SCI), инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, является разъединение аксональных путей и нейронных клеток Потери 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Например, когда ишемический инсульт не лечится, считается, что аксоны теряются со скоростью 7 миль аксонов в минуту 5 . В случае TBI, который ежегодно испытывает приблизительно 1,7 миллиона человек в США, аксональная дегенерация может продолжаться и после нескольких лет после травмы, поскольку первоначальная травма ускоряет долгосрочное нейродегенеративное состояние 4 . Усугубляя эти вредные эффекты, ЦНС имеет строго ограниченный capaГород для регенерации 1 , 7 , 8 , 9 . После травмы развивается тормозная среда, которая характеризуется отсутствием направленного руководства к отдаленным мишеням, наличию ингибиторов, связанных с миелином, которые препятствуют росту нейритов и образованию глиального шрама реактивными астроцитами 8 , 10 , 11 , 12 . Глиальный шрам служит биохимическим и физическим барьером для регенерации, причем молекулы, такие как протеогликаны хондроитинсульфата, препятствуют росту аксонов 8 , 11 . Кроме того, несмотря на то, что нейронные стволовые клетки обнаружены во взрослой ЦНС, производство новых нейронов ограничено, поскольку последовательные доказательства нейрогенеза были обнаружены только в обонятельной луковице, гиппокампеСубгранулярная зона, перивентрикулярная область и центральный канал спинного мозга 13 , 14 . Эти препятствия препятствуют функциональному восстановлению потерянных нейронов и архитектуры белого вещества после травмы или заболевания, что приводит к часто меняющимся и продолжительным последствиям этих состояний.
Несмотря на отсутствие регенерационной способности у взрослых ЦНС, было продемонстрировано, что регенерация аксонов возможна, если адекватные экологические сигналы представлены в принимающих нейронах 15 , 16 , 17 , 18 . Исследователи пытались доставить и манипулировать факторами роста ( например, фактором роста нервов, эпидермальным фактором роста, глиально-зависимым фактором роста и нейротрофическим фактором-3) и другими молекулами наведения для стимулирования пластичности и регенерации аксонов 14 , </ Sup> 18 , 19 . Несмотря на то, что эти исследования подтвердили, что взрослые аксоны способны реагировать на факторы роста, эти стратегии ограничены низкой проницаемостью гематоэнцефалического барьера и специфическими пространственными и временными градиентами, необходимыми для стимулирования регенерации 14 , 18 , 19 . Другие подходы основывались на гиперактивации факторов транскрипции, связанных с регенерацией, в нейронах ЦНС. Например, сверхэкспрессия фактора транскрипции Stat3 стимулировала регенерацию аксонов в зрительном нерве 20 . Тем не менее, как доставка биомолекулы, так и избыточная экспрессия факторов транскрипции не позволяют заменить потерянные популяции нейронов. Клеточные стратегии в основном сосредоточены на трансплантации нервных стволовых клеток (НСК) в ЦНС, используя их способность заменять нейроны ЦНС, высвобождать трофические факторы,И поддерживать попытки нейрогенеза, которые возникают после травмы 17 . Несмотря на это, все еще существуют насущные проблемы, мешающие этому подходу, в том числе затрудненная способность пересаженных нейронных клеток выжить, интегрироваться с хозяином и оставаться пространственно ограничена поврежденной областью 6 , 14 , 17 , 21 . Кроме того, доставка клеток сама по себе неспособна восстановить цитоархитектуру поврежденных или потерянных аксональных путей. Альтернативный подход, который решает проблемы, стоящие перед стратегиями доставки клеток и наркотиков / химических веществ, сочетает эти подходы с использованием биоматериалов 14 , 22 , 23 . Биоматериалы, такие как гидрогели, способны эмулировать биохимические и физические свойства внеклеточного матрикса (ECM), помогая в доставке клетокD в пределах поврежденной области и доставки факторов роста и других биоактивных молекул с контролируемым высвобождением 22 . Привлекательные характеристики этих стратегий на основе биоматериалов привели к доказательству регенерации аксонов in vivo после трансплантации лесов в пораженные участки 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Однако стратегии бесклеточного биоматериала не заменяют потерянные нейронные популяции; При использовании в качестве средств доставки для нейронных, глиальных или нейронных клеток-предшественников, биоматериалы не способны восстанавливать сети аксонов на большие расстояния. Задача разработки подхода, который решает как дегенерацию аксонального пути, так и потерю нейронов, связанную с повреждением ЦНС и заболеванием, по-прежнему остается <Sup class = "xref"> 31.
Наша исследовательская группа ранее сообщала о разработке имплантируемых микро-тканевых нейронных сетей (micro-TENNs), которые являются типом «живого леса», состоящего из тел нейронных клеток, ограниченных одним или обоими концами микроколона с агарозным гидрогелем-ECM , С выровненными аксональными трактами, проходящими по всему внутреннему пространству этого трехмерного (3D) корпуса 1 , 10 , 31 , 32 . Одним из основных различий между этим методом и предыдущими подходами является то, что цитоархитектура микро-TENN создается полностью in vitro и затем трансплантируется 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , <Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . Изготовление in vitro предлагает обширный пространственный и временный контроль клеточного фенотипа и ориентации, механические / физические свойства, биохимические сигналы и экзогенные факторы, что выгодно для интеграции этих лесов с хозяином после имплантации 41 , 42 . Micro-TENN анатомически вдохновлены, потому что они эмулируют нейроанатомию мозга, отображая аксональные тракты, похожие на те, которые соединяют различные функциональные области мозга ( рис. 1A ) 1 . Таким образом, эта стратегия может быть в состоянии физически заменить потерянные участки белого вещества и нейроны после имплантации в поврежденную область. Этот метод также вдохновлен механизмами развития, в которых «естественные живые леса», образованные радиальными глиальными клетками и пионерскими аксонами, действуют в качестве направляющих пути для клетокМиграция из субвентрикулярной зоны и рост аксонов соответственно 43 . Эти механизмы рекапилируются в выровненных аксональных участках микро-TENN, которые могут представлять живые пути миграции нейронных клеток и регенерации аксонов с помощью аксоноподобного аксонового выроста ( рис. 1C ) 43 . Кроме того, в этой стратегии используется синаптическая интеграция между нейронами микро-TENN и собственной схемой, образуя новые реле, которые могут способствовать функциональному восстановлению ( рис. 1B ) 43 . Способность к образованию синапсов также может предоставить этому подходу способность модулировать ЦНС и реагировать на ткань хозяина в соответствии с сетевой обратной связью. Например, оптогенетически активные нейроны в живых каркасах могут стимулироваться для модуляции нейронных хозяев через синаптические взаимодействия ( рис. 1D ).
Кроме того, трубчатый контур на основе биоматериаловМикроэнтенозы обеспечивают адекватную среду для клеточной адгезии, роста, расширения нейритов и сигнализации, в то время как миниатюрные размеры конструкций потенциально допускают минимально инвазивную имплантацию и обеспечивают частично секвестрированную микроокружение для постепенной интеграции в мозг. Действительно, недавние публикации продемонстрировали потенциал микро-TENN для имитации нейронных путей после имплантации в мозг крысы. После стереотаксической микроинъекции мы ранее сообщали об обнаружении выживаемости нейронов микро-TENN, поддержании архитектуры аксонального тракта и расширении нейритов в корте головного мозга до, по меньшей мере, 1 месяца in vivo 10 , 31 . Более того, маркировка синапсином давала гистологические свидетельства синаптической интеграции с нативной тканью 10 , 31 . В целом, микро-TENN могут быть уникальными для восстановления и модуляции поврежденныхCNS путем замены потерянных нейронов, синаптической интеграции с хост-схемой, восстановления утраченной аксонной цитоархитектуры и, в некоторых случаях, обеспечения регенерации аксонов соответствующими сигналами пути.
Рисунок 1: Принципы и вдохновение для разработки микросердечных нейронных сетей (микро-TENN). ( A ) Микро-TENN имитируют цитоархитектуру мозгового соединения (фиолетового), в котором функционально различные области связаны длинными выровненными аксональными трактами в однонаправленном (красном, зеленом) или двунаправленном (синем) порядке. Например, микро-TENN могут восстанавливать утраченные связи в кортикоталамическом и нигростриаторном путях или в перфорантном пути от энторинальной коры до гиппокампа (адаптировано из Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Диаграмма однонаправленногоL и двунаправленный микро-TENN (красный и синий соответственно), синаптически интегрируемые с главной схемой (фиолетовый), чтобы служить функциональным реле между обоими концами поражения. ( C ) Схема аксональных трактов однонаправленного микро-TENN (зеленая), служащая в качестве ориентира для облегченной аксоном регенерации аксонов хозяина (фиолетового) в направлении мишени, с которой взаимодействует микро-TENN. ( D ) Концептуальная схема использования оптико-активных микро-TENNS в качестве нейромодуляторов, с использованием синаптической интеграции с возбуждающими или тормозящими нейронами (снизу). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В настоящей рукописи подробно изложена методология, используемая для изготовления микро-TENN с использованием эмбрионально полученных церебральных кортикальных нейронов. Примечательно, что микро-TENN могут быть изготовлены с использованием других типов нейронных клеток. ДляДостаточно, исходные сообщения об успешной разработке микро-TENN показали нейроны дорзального корня ганглия (DRG) 32 . Микроэлементы гидрогеля могут быть сгенерированы ( рис. 2А ) путем добавления жидкой агарозы к изготовленной на заказ цилиндрической канальной решетке с лазером или к капиллярным трубкам, содержащим выровненные иглы для иглоукалывания. Игла образует просвет и определяет внутренний диаметр (ID) микроколоны, в то время как идентификатор капиллярной трубки и диаметр цилиндров в устройстве для лазерной резки определяют внешний диаметр (OD) конструкций. OD и ID могут быть выбраны в соответствии с желаемым применением путем выбора различных диаметров для устройства / капиллярных труб и игл для иглоукалывания соответственно. Также можно варьировать длину микроколонок; На сегодняшний день мы сообщили о строительстве микро-ТЭНД длиной до 20 мм в длину 10 и активно преследуем еще более длинные длины. После агарозных гелей и иглоукалывания nЭдельы удаляются, к просвету конструкций добавляется раствор ECM, обычно состоящий из коллагена I типа и ламинина ( фиг. 2C ). Ядро ECM обеспечивает эшафот для поддержки адгезии нейронных клеток и роста аксонов. Первоначально первичные крысиные нейроны крыс были высеяны в микроколонах с использованием диссоциированных клеточных суспензий 10 , 31 , 32 . Однако этот подход не вызывал целевой цитоархитектуры во всех случаях, которая определялась как тела нейронных клеток, ограниченные концами микроколонок, причем центральный просвет состоял из чистых выровненных аксональных трактов. С тех пор использование метода агрегации принудительных нейронов (на основе протоколов, адаптированных из Ungrin и др .) Позволило более надежную и последовательную разработку микро-TENN с идеальной структурой ( рис. 2B ) 44 . В дополнение к описанию текущегоМетодологии, в этой статье будут представлены типичные фазоконтрастные и конфокальные изображения микро-TENN, которые демонстрируют формирование аксональных трактов с течением времени, а также завершенную целевую цитоархитектуру. Эта рукопись также расширит заслуживающие внимания аспекты протокола и остающиеся проблемы и будущие направления технологии микро-TENN.
Рисунок 2: Принципиальная схема трехступенчатого процесса изготовления микро-TENN. ( A ) Разработка агарозного гидрогеля: (i) первоначально небольшая иглоукалывающая игла ( например , диаметр 180-350 мкм) вставляется в цилиндрические каналы изготовленной на заказ пресс-формы для лазерной резки или капиллярной трубки ( например, , 380-700 мкм в диаметре). На следующем этапе жидкая агароза в DPBS вводится в цилиндрические каналы или капиллярные трубки. (Ii) После агарозных гелей игла удаляется иПресс-форму разобрали, чтобы получить полые агарозные микроколоны. (Iii) Эти конструкции затем стерилизуют и хранят в DPBS. ( B ) Первичная культура нейронов и агрегированный метод: (i) Агрегирование нейронов выполняется в пирамидальных массивах микроячейки, отлитых из трехмерных печатных форм, которые помещаются в лунки 12-луночного планшета. (Ii) Микро-TENN включают первичные нейроны крыс, диссоциированные от эмбриональных мозгов крыс эмбрионального дня-18. После диссоциации ткани трипсином-EDTA и ДНКазой I готовят клеточный раствор с плотностью 1,0-2,0 × 10 6 клеток / мл. (Iii) 12 мкл этого раствора переносят в каждую лунку в пирамидальной микроячейке. Пластину, содержащую эти микро-лунки, центрифугируют для получения клеточных агрегатов. (Iv) Затем их инкубируют в течение ночи перед нанесением покрытия в микроколонах. ( C ) Изготовление сердечника ECM и клеточного посева: (i) Перед посевом клеток, ECM-раствор, содержащий 1 мг / мл коллагена I типа и 1 мг / млЛаминин переносят внутрь микро-TENN и дают возможность полимеризоваться. (Ii) В зависимости от того, изготавливаются ли однонаправленные или двунаправленные микро-TENN, агрегат помещается в одну или обе крайности микроколона соответственно. (Iii) После периода инкубации для содействия адгезии микро-TENN культивируют в чашках Петри, залитых добавленной эмбриональной нейронной базальной средой. (Iv) Через 3-5 дней в культуре окончательная микро-TENN-структура должна демонстрировать клеточные агрегаты в экстремумах микроколона, с аксональными трактами, охватывающими ее длину. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Повреждение и заболевание ЦНС обычно приводят к потере или дисфункции дальних аксональных путей, которые включают мозговое соединение, с или без сопутствующей нейронной дегенерации. Это усугубляется ограниченной способностью ЦНС способствовать нейрогенезу и регенерации. Несмотря н…
The authors have nothing to disclose.
Финансовую поддержку оказали Национальные институты здравоохранения U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) и F31-NS090746 (Katiyar)), Фонд Майкла Дж. Фока (Программа терапевтического трубопровода № 9998 (Каллен)), Пилотная награда Центра медицины в Пенне (Каллен), Национальный научный фонд (Высшие научные стипендии DGE-1321851 (Стружина и Адевола)), Департамент по делам ветеранов (RR & D Merit Review № B1097-I (Каллен)), Американская ассоциация Неврологических хирургов и Конгресса неврологических хирургов (2015-2016 гг. Codman Fellowship of Neurotrauma and Critical Care (Петров)), а также Медицинское исследование и материальное обеспечение армии США (# W81XWH-13-207004 (Cullen) и W81XWH-15-1- 0466 (Каллен)).
Laser cutter | Universal Laser Systems | PLS4.75 | Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold. |
Laser-cut micro-column fabrication device | Custom-made | ————– | Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript. |
Screws | ————– | ————– | #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm |
Nuts | ————– | ————– | #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm |
Acupuncture needle (180 µm diameter) | Lhasa Medical | sj.16X40 | The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen. |
Petri dish | Fisher | 08772B | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14200075 | |
Polystyrene disposable serological pipet | Fisher | 13-678-11D | |
Agarose | Sigma | A9539-50G | |
Capillary tube (398 µm diameter) | Fisher | 21170D | The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell. |
Hot plate | Fisher | SP88857200 | |
Magnetic bar | Fisher | 1451352 | |
Micropipette | Sigma | Z683884-1EA | |
25 mm gauge needle | Fisher | 14-826-49 | |
Microscalpel | Roboz Surgical | RS-6270 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | |
Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
Hot bead sterilizer | Sigma | Z378550-1EA | |
Stereoscope | Nikon | SMZ800N | Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication. |
Rat tail type I collagen | Corning | 354236 | Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use. |
Microcentrifuge tube | Fisher | 02-681-256 | |
Mouse laminin | Corning | 354232 | Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use. |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use. |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | SS2661 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher | SA48-1 | |
Litmus paper | Fisher | 09-876-18 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14170112 | Store at 4 ºC. |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I | Sigma | 10104159001 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
B-27 Supplement | Invitrogen | 12587010 | Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
Sprague Dawley embryonic day 18 rats | Charles River | Strain 001 | |
Pasteur pipette | Fisher | 22-042816 | |
15 mL centrifuge tube | EMESCO | 1194-352099 | |
Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
Centrifuge | Fisher | 05-413-115 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
Objet30 3D-Printer | Stratasys | ————– | Used to fabricate the pyramidal micro-well molds. |
3D-printed pyramidal well mold | Custom-made | ————– | Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript. |
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Fisher | NC9285739 | Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood. |
Funnel | Fisher | 10-348C | |
1 ml pipette bulb | Sigma | Z509035 | |
Micro-spatula | Fisher | S50821 | |
12-well culture plate | EMESCO | 1194-353043 | |
Oven | Fisher | 11-475-154 | |
Incubator | Fisher | 13 998 076 | |
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | UPenn Vector Core | 36373 | Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator. |
Formaldehyde 40% | Fisher | F77P-4 | Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes. |
Horse serum | Gibco | 16050-122 | |
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody | Sigma | T8578-200UL | Store at -20ºC. |
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody | Synaptic Systems | 106-001 | Store at -20ºC. |
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody | Invitrogen | A10037 | Store at 4ºC. |
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody | Invitrogen | A21206 | Store at 4ºC. |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Invitrogen | H3570 | Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container. |
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ————– | Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs. |
Eclipse Ti-S Microscope | Nikon | ————– | Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01). |
High-speed Fluorescence Microscope | Nikon | ————– | Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging. |
NIS Elements AR 4.50.00 Software | Nikon Instruments | ————– | Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. |