Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Summary

Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan ​​uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.

Abstract

Functioneel herstel komt zelden voor als gevolg van letsel of door de ziekte veroorzaakte degeneratie in het centrale zenuwstelsel (CNS) door de remmende omgeving en de beperkte capaciteit voor neurogenese. We ontwikkelen een strategie om tegelijkertijd neuronale en axonale wegverlies in het beschadigde CNS aan te pakken. Dit manuscript presenteert het fabricageprotocol voor microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENNs), implanteerbare constructen bestaande uit neuronen en uitgelijnd axonale tracten die het extracellulaire matrix (ECM) lumen van een voorgevormde hydrogelcilinder overspannen, honderden micron in diameter die centimeter kunnen verlengen in lengte. Neuronale aggregaten zijn afgebakend aan de extremen van de driedimensionale omhulling en worden gespannen door axonale projecties. Micro-Tenns zijn uniek gepositioneerd als een strategie voor de reconstructie van het CNS, waarbij aspecten van de hersenbindende cytoarchitectuur worden geïmplementeerd en mogelijk middelen voor netwerkvervanging bieden. De neuRonale aggregaten kunnen samenvallen met gastheerweefsel om nieuwe functionele relais te vormen voor het herstellen en / of moduleren van ontbrekende of beschadigde schakelingen. Deze constructen kunnen ook fungeren als pro-regeneratieve "living scaffolds" die ontwikkelingsmechanismen voor celmigratie en axonale pathfinding kunnen exploiteren, die synergistische structurele en oplosbare signalen op basis van de staat van regeneratie verschaffen. Micro-Tenns worden vervaardigd door vloeibare hydrogel te gieten in een cilindrische vorm die een longitudinale centreerde naald bevat. Zodra de hydrogel gelegerd is, wordt de naald verwijderd, waardoor een holle microkolom wordt gelaten. Een ECM oplossing wordt toegevoegd aan het lumen om een ​​omgeving te verschaffen die geschikt is voor neuronale hechting en axonale uitgroei. Gedissocieerde neuronen worden mechanisch geaggregeerd voor precies zaaien in één of beide uiteinden van de microkolom. Deze methodologie produceert betrouwbaar zelfstandige miniatuurconstructen met langwerpige axonale tracten die de kenmerken van hersenneuranatomie kunnen herkapituleren. Synaptische immNiet-etiketterende en genetisch gecodeerde calciumindicatoren suggereren dat micro-TENN's uitgebreide synaptische verdeling en intrinsieke elektrische activiteit bezitten. Bijgevolg vormen micro-TENNEN een veelbelovende strategie voor gerichte neurochirurgische reconstructie van hersenwegen en kunnen ook worden toegepast als biofidelische modellen om neurobiologische verschijnselen in vitro te bestuderen.

Introduction

Een algemeen kenmerk van aandoeningen en ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS), zoals traumatisch hersenletsel (TBI), ruggenmergletsel (SCI), beroerte, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson, is de ontkoppeling van axonale wegen en neuronale cellen Verlies ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Bijvoorbeeld, wanneer een ischemische beroerte onbehandeld wordt, wordt geschat dat axonen verloren gaan met een snelheid van 7 mijl axonen per minuut ⁵ . In het geval van TBI, die ongeveer 1,7 miljoen mensen elk jaar alleen in de VS ervaren, kan axonale degeneratie jaar na trauma blijven optreden, aangezien de aanvankelijke verwonding een langdurige neurodegeneratieve toestand ⁴ neigt. Versterking van deze schadelijke effecten, het CNS heeft een zeer beperkte capaStad voor regeneratie ^{1 , 7 , 8 , 9} . Na aanleiding van het letsel ontstaat een remmende omgeving die wordt gekenmerkt door een gebrek aan gerichte begeleiding naar verre doelen, de aanwezigheid van myeline geassocieerde remmers die neuritale uitgroei verhinderen en de vorming van een glialeire door reactieve astrocyten ^{8 , 10 , 11 , 12} . Het gliaire doet dienst als een biochemische en fysieke barrière voor regeneratie, met moleculen zoals chondroïtinesulfaatproteoglycanen die axongroei ^{8 , 11} belemmeren. Bovendien, hoewel neurale stamcellen zijn gevonden in het volwassen CNS, is de productie van nieuwe neuronen beperkt, aangezien consistent bewijs van neurogenese alleen is gevonden in de olfactorische bol, de hippocampaleSubgranulaire zone, het periventriculaire gebied en het centrale kanaal van het ruggenmerg ^{13 , 14} . Deze obstakels verhinderen het functionele herstel van verloren neuronen en witte materie architectuur als gevolg van letsel of ziekte, wat resulteert in de vaak veranderende en langdurige effecten van deze omstandigheden.

Ondanks het gebrek aan regeneratieve capaciteit in het volwassen CNS, is aangetoond dat axonale regeneratie mogelijk is als adequate milieueisen worden voorgesteld aan de gastheer neuronen ^{15 , 16 , 17 , 18} . Onderzoekers hebben geprobeerd groeifactoren te leveren en te manipuleren ( bijv. De zenuwgroeifactor, de epidermale groeifactor, de glial-afhankelijke groeifactor en de neurotrofische factor-3) en andere begeleidingsmoleculen om de plasticiteit en axonregeneratie te stimuleren ^{14 , <}/ Sup> ^{18 , 19} . Hoewel deze studies hebben bevestigd dat volwassen axonen in staat zijn om op groeifactoren te reageren, worden deze strategieën beperkt door de lage permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière en de specifieke ruimtelijke en temporale gradiënten die nodig zijn om regeneratie ^{14 , 18 , 19} te bevorderen. Andere benaderingen zijn gebaseerd op de hyperactivatie van regeneratie gerelateerde transcriptiefactoren in CNS neuronen. Bijvoorbeeld stimuleerde overexpressie van de stat3 transcriptiefactor axonale regeneratie in de optische zenuw ²⁰ . Desalniettemin slaan zowel de biomoleculeafgifte als de overexpressie van transcriptiefactoren in de plaats van verloren neuronale populaties. Cell-based strategieën hebben vooral betrekking op transplantatie van neurale stamcellen (NSC's) in het CNS, waarbij zij profiteren van hun capaciteit om CNS neuronen te vervangen, trofische factoren te vrijgeven,En ondersteun de pogingen op neurogenese die zich voordoen na verwonding ¹⁷ . Ondanks dit zijn er nog steeds uitdagende uitdagingen die deze aanpak verhinderen, inclusief het belemmerde vermogen van getransplanteerde neurale cellen om te overleven, integreren met de gastheer en blijven ruimtelijk beperkt tot het gewond gebied ^{6 , 14 , 17 , 21} . Daarnaast is de levering van cellen alleen niet in staat om de cytoarchitectuur van beschadigde of verloren axonale wegen te herstellen. Een alternatieve benadering die betrekking heeft op de problemen die cel- en drug / chemische afleverstrategieën voordoen, combineert deze benaderingen met het gebruik van biomaterialen ^{14 , 22 , 23} . Biomaterialen zoals hydrogelen kunnen de biochemische en fysische eigenschappen van de extracellulaire matrix (ECM) emulerenD retentie binnen het gewond gebied, en het leveren van groeifactoren en andere bioactieve moleculen met gereguleerde afgifte ²² . De aantrekkelijke kenmerken van deze biomaterialen gebaseerde strategieën hebben geleid tot bewijs van in vivo axonale regeneratie na de transplantatie van steigers naar het lesion gebied ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30} . Echter, acellulaire biomaterialestrategieën vervangen geen verloren neuronale populaties; Bij gebruik als leveringsvoertuigen voor neuronale, gliale of neuronale precursorcellen, zijn biomaterialen niet in staat om axonale netwerken op lange afstand te reconstrueren. De uitdaging om een ​​aanpak te ontwikkelen die zowel de axonale wegdegeneratie als neuronale verlies in verband met CNS-letsel en ziekte bestrijkt, blijft <Sup class = "xref"> 31.

Onze onderzoeksgroep heeft eerder de ontwikkeling van implanteerbare microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENN's) gemeld, die een type "levende steiger" zijn die bestaat uit neuronale cellichamen die beperkt zijn tot één of beide uiteinden van een agarose hydrogel-ECM microkolom , Met uitgelijnd axonale tracten die zich uitstrekken over het binnenste van deze driedimensionale (3D) omhulling ^{1 , 10 , 31 , 32} . Een van de belangrijkste verschillen tussen deze techniek en eerdere benaderingen is dat de cytoarchitectuur van micro-TENNEN volledig in vitro wordt gecreëerd en daarna ^{33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38} wordt getransplanteerd <Sup class = "xref"> 39 ^{, 40 , 41} . In vitro fabricage biedt uitgebreide ruimtelijke en temporale controle van cellulaire fenotype en oriëntatie, mechanische / fysische eigenschappen, biochemische signalen en exogene factoren, die de integratie van deze steigers bij de gastheer na de implantatie ^{41 , 42 ten goede komen} . Micro-Tenns zijn anatomisch geïnspireerd omdat ze neuroanatomie van de hersenen emuleren, waarbij axonale tracten worden weergegeven die vergelijkbaar zijn met die welke verschillende functionele gebieden van de hersenen gebruiken ( Figuur 1A ) ¹ . Daarom kan deze strategie fysieke vervanging van verloren witte materiaalkanalen en neuronen na implantatie in een gewaarschelde regio vervangen. Deze techniek wordt ook geïnspireerd door ontwikkelingsmechanismen waarin "natuurlijke levende stellingen" gevormd door radiale gliale cellen en pioniers axonen fungeren als pathfinding gidsen voor celMigratie uit de subventriculaire zone en axonale uitgroei, respectievelijk ⁴³ . Deze mechanismen worden teruggevonden in de uitgelijste axonale tracten van micro-TENNs, die leefwegen voor neurale celmigratie en axonale regeneratie kunnen voorstellen door axon-gemedieerde axonale uitgroei ( Figuur 1C ) ⁴³ . Bovendien maakt deze strategie gebruik van synaptische integratie tussen de micro-TENN-neuronen en de inheemse schakelingen, waarbij nieuwe relais worden gevormd die kunnen bijdragen tot functioneel herstel ( Figuur 1B ) ⁴³ . De capaciteit voor synapsvorming kan deze aanpak ook de mogelijkheid bieden om het CNS te moduleren en te reageren op gastheerweefsel volgens netwerk feedback. Optogenetisch actieve neuronen in de levende stellingen kunnen bijvoorbeeld gestimuleerd worden om gastheerneuronen te moduleren door middel van synaptische interacties ( Figuur 1D ).

Daarnaast heeft de biomaterial-gebaseerde buisvormige constrUitvoering van micro-TENNs biedt een adequate omgeving voor celadhesie, groei, neurietuitbreiding en signalering, terwijl de miniatuurafmetingen van de constructen mogelijk minimaal invasieve implantatie toestaan ​​en een gedeeltelijk gesekwestreerde microomgeving voor geleidelijke integratie in de hersenen mogelijk maken. Inderdaad hebben recente publicaties het potentieel van micro-TENNEN aangetoond om neurale trajecten na implantatie in de ratbrein te nabootsen. Na stereotaxische microinjectie hebben we eerder bewijs van micro-TENN neuronale overleving, onderhoud van axonale tractarchitectuur en neurietuitbreiding in de gastheercortex tot tenminste 1 maand in vivo ^{10 , 31} gemeld. Bovendien gaf etikettering met synapsine histologisch bewijs van synaptische integratie met natief weefsel ^{10 , 31} . In het algemeen kunnen micro-TENNES uniek geschikt zijn om beschadigd te reconstrueren en te modulerenCNS door verloren neuronen te vervangen, synaptisch te integreren met gastheercircuits, herstel van verloren axonale cytoarchitectuur en, in bepaalde gevallen, het regenereren van axonen met de juiste pathfinding cues.

Figuur 1: Principes en inspiratie achter de ontwikkeling van micro-tissue engineered neurale netwerken (micro-TENNs). ( A ) Micro-Tenns nabootsen de cytoarchitectuur van de hersenverbindingen (paars), waarbij functionele afzonderlijke gebieden door middel van lange, uitgelijste axonale tracten in eenrichtingsbewerking (rood, groen) of tweerichtings (blauw) verbonden zijn. Bijvoorbeeld, micro-TENN's kunnen verloren verbindingen in corticothalamus- en nigrostriatale trajecten of in de perforante weg van de entorhinaire cortex tot de hippocampus reconstrueren (aangepast uit Struzyna et al. , 2015) ¹ . ( B ) Diagram van een unidirectionaL en bidirectionele micro-TENN (respectievelijk rood en blauw) synaptisch integreren met de gastheercircuit (paars) om als een functioneel relais tussen beide uiteinden van een letsel te dienen. ( C ) Schematisch van de axonale tracten van een unidirectionele micro-TENN (groen), die dienen als een geleiding voor axon-gefaciliteerde regeneratie van host axons (paars) naar een doel waarmee de micro-TENN in wisselwerking is. ( D ) Conceptueel diagram van het gebruik van optogenetisch actieve micro-TENNS als neuromodulators, die profiteren van synaptische integratie met excitatoire of remmende neuronen (bodem). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het huidige manuscript detaileert de methodologie die wordt gebruikt om micro-TENNEN te vervaardigen met behulp van embryonaal afgeleide cerebrale corticale neuronen. Met name kunnen micro-TENNEN worden vervaardigd met andere soorten neurale cellen. Voor exRuim, de initiële rapporten van succesvolle micro-TENN ontwikkeling gekenmerkt door dorsale root ganglion (DRG) neuronen ³² . De hydrogelmicrokolommen kunnen gegenereerd worden ( Figuur 2A ) door vloeibare agarose aan te voegen aan een op maat gemaakte, lasersnijdende cilindrische kanaalschikking of naar capillaire buizen, die beide uitgelijnd acupunctuurnaalden bevatten. De naald vormt het lumen en bepaalt de binnendiameter (ID) van de microkolom, terwijl de capillaire buis ID en de diameter van de cilinders in het lasergesneden apparaat de buitendiameter (OD) van de constructies dicteren. De OD en ID kunnen volgens de gewenste toepassing worden gekozen door respectievelijk verschillende diameters voor de inrichting / capillaire buizen en de acupunctuurnaalden te selecteren. De lengte van de microkolommen kan ook worden gevarieerd; Tot op heden hebben we de constructie van micro-TENNEN tot 20 mm lang ¹⁰ gerapporteerd en actief nog langere lengtes volgen. Na de agarose gels en de acupunctuur nEedles worden verwijderd, een ECM oplossing die in het algemeen bestaat uit type I collageen en laminine wordt toegevoegd aan het lumen van de constructen ( Figuur 2C ). De ECM-kern biedt een steiger ter ondersteuning van neuronale celadhesie en axonale uitgroei. Aanvankelijk werden primaire ratcorticale neuronen geplateerd in de microkolommen met behulp van gedissocieerde cel suspensies ^{10 , 31 , 32} . Deze aanpak produceerde echter niet in alle gevallen de target cytoarchitectuur, die werd gedefinieerd als de neuronale cellichamen die beperkt waren tot de uiteinden van de microkolommen, waarbij het centrale lumen bestaat uit zuivere uitgelijnd axonale tracten. Sindsdien is het gebruik van een gedwongen neuronale aggregatie methode (gebaseerd op protocols aangepast aan Ungrin et al .) Een betrouwbare en consistente fabricage van micro-TENNEN mogelijk gemaakt met de ideale structuur ( Figuur 2B ) ⁴⁴ . Naast het beschrijven van de huidigeMethodologie, zal dit artikel representatieve fasecontrast- en confocale beelden van micro-TENNs tonen die de vorming van axonale tracten over de tijd tonen, evenals de gefinaliseerde doelcytoorarchitectuur. Dit manuscript zal ook uitbreiden op opmerkelijke aspecten van het protocol en de resterende uitdagingen en toekomstige aanwijzingen van de micro-TENN-technologie.

Figuur 2: Schematisch diagram van het driedimensionale micro-TENN fabricageproces. ( A ) Ontwikkeling van de agarosehydrogel: (i) Aanvankelijk wordt een kleine acupunctuurnaald ( bijv . 180-350 μm in diameter) in de cilindrische kanalen van een op maat gemaakte, lasergesneden vorm of een kapillair buis geplaatst ( bijv. , Diameter 380-700 μm). In de volgende stap wordt vloeibare agarose in DPBS geïntroduceerd in de cilindrische kanalen of capillaire buizen. (Ii) Na de agarosegels wordt de naald verwijderd enDe vorm wordt gedemonteerd om de holle agarose microkolommen te geven. (Iii) Deze constructies worden dan gesteriliseerd en opgeslagen in DPBS. ( B ) Primaire neuroncultuur en de aggregaatmethode: (i) Neuronale aggregatie wordt uitgevoerd in pyramidale micro-well arrays, gegoten uit 3D-gedrukte schimmels, die passen in de putjes van een 12-wells kweekplaat. (Ii) Micro-TENNs omvatten primaire ratneuronen die zijn losgelaten van foetale hersenen van embryonale-dag-18 ratten. Na afloop van weefseldissociatie met trypsine-EDTA en DNase I wordt een celoplossing met een dichtheid van 1,0-2,0 x 106 cellen / ml bereid. (Iii) 12 μl van deze oplossing worden overgebracht naar elke put in de pyramidale micro-put-array. De plaat die deze microputjes bevat, wordt gecentrifugeerd om celaggregaten te produceren. (Iv) Deze worden vervolgens overnacht geïncubeerd voorafgaand aan plating in de microkolommen. ( C ) ECM-kernfabrikatie en celzaden: (i) Vóór het zaaien van een cel, een ECM-oplossing die 1 mg / ml type I collageen en 1 mg / ml bevatLaminine wordt overgebracht naar het interieur van de micro-TENNEN en mag polymeriseren. (Ii) Afhankelijk van de vraag of unidirectionele of bidirectionele micro-TENNEN worden vervaardigd, wordt een aggregaat geplaatst op respectievelijk één of beide uitersten van de microkolom. Iii) Na een periode van incubatie om adhesie te bevorderen, worden micro-TENNEN gekweekt in Petri-schalen die zijn overspoeld met aangevulde embryonale neuronale basale media. Iv) Na 3-5 dagen in de cultuur, moet de uiteindelijke micro-TENN-structuur celaggregaten aantonen bij de uitersten van de microkolom, met axonale tracten die zijn lengte overspannen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle procedures die dieren betreffen, werden goedgekeurd door de Institusionele Diervoeder- en Gebruikscommissies aan de Universiteit van Pennsylvania en het medisch centrum van Michael J. Crescenz Veterans Affairs en voerden zich aan de richtlijnen die zijn uiteengezet in het NIH Public Health Service Beleid inzake Humane Care and Laboratory Dieren (2015).

1. Ontwikkeling van de Agarose Hydrogel (Acellulaire Component van Micro-Tenns)

1. Bereiding van de agaroseoplossing
   1. Maak een reservoir voor de microkolommen in een biosafety-kastje door 20 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) over te brengen op elk van de 10 cm Petri-schotels. Steriliseer fijne tang en microscalpels met een hot bead sterilisator.
   2. Weeg 3 g agarose en draag het over naar een steriele beker in de biosafety-kast. Voeg 100 ml DPBS toe voor een uiteindelijke concentratie van 3% gewicht / volume (w / v). Inclusief een schone magnetische staaf en bedek de beker met aluminiumNum folie.
   3. Met een kookplaat / roerder verwarm de beker bij 100 ° C en roer bij 120-200 rpm om de agarose volledig op te lossen (de oplossing wordt van bewolkt om te wissen). Bewaar de verwarming en roer daarna om gelering te voorkomen en verander de verwarmingstemperatuur als nodig om de agarose te verbranden.
      OPMERKING: De fabricage met zowel het lasergesneden apparaat als de capillaire buizen wordt hieronder weergegeven in respectievelijk de rubrieken 1.2 en 1.3. Ga verder naar paragraaf 1.4 na afronding van de stappen die in een van beide onderdelen worden beschreven. Voor beide micro-kolom fabricagemethoden, voeg de vloeibare agarose snel toe, aangezien agarose snel verdampt als het afkoelt. Bij het steriliseren met een autoclaaf in een van de volgende stappen, gebruik de standaardtoestanden die op glaswerk worden toegepast.
2. Voorbereiding van microkolommen met behulp van een lasergesneden apparaat
   OPMERKING: Het lasergesneden apparaat is gesneden van transparant acryl met een commerciële CO ₂ lasersnijder. De fabriKation van structuren en apparaten via lasersnijden is goed gedocumenteerd voor een scala aan techniek- en onderzoeksaanvragen ^{45 , 46 , 47} . Deze vorm ( Figuur 3 ) bestaat uit een reeks van vijf cilindrische kanalen, elk met een diameter van 398 μm en een lengte van 6,35 mm. Deze cilindrische arrays worden langs twee lengtes gevormd: een onderste helft (lengte: 25,4 mm, breedte: 6,35 mm, hoogte: 6,0 mm) en een bovenste helft (lengte: 31,5 mm, breedte: 6,35 mm, hoogte: 12,7 mm ), Zoals getoond in respectievelijk figuren 3A en 3B . De twee helften kunnen vastgeklemd worden door de voorste en achterste kapjes waargenomen in figuur 3C (lengte: 31,5 mm, breedte: 6,35 mm, hoogte: 12,7 mm), die vier uitlijngaten bevatten die samenvallen met twee gaten, elk boven en onder Stukken en die helpen bij het vastzetten van alle onderdelen bij elkaar. Deze caps ook inclZet vijf gaten, concentrisch op de cilindrische kanalen, waarin de acupunctuurnaalden kunnen worden ingevoegd om het lumen van de microkolommen te vormen.
   1. Steriliseer het in figuur 3 getoonde apparaat door het te bedekken met aluminiumfolie en autoclaving. Monteer het apparaat zoals getoond in Figuur 3D door de voorste en achterste kapjes met slechts het onderste halve stuk te aanpassen en de drie delen met twee # 4-40 schroeven en moeren (draaddiameter: 3,05 mm) in de onderste uitlijning gaten te bevestigen.
   2. Stel een acupunctuurnaald (diameter: 180 μm, lengte: 30 mm) volledig in de naaldgaten aan op de voorste of achterste kap van het apparaat ( Figuur 3D ). Giet met een micropipette voldoende vloeibare agarose (~ 1 ml voor de vijf kanalen) op het onderste halfdeel om elk van de cilindrische kanaalhelften te vullen.
   3. Plaats het bovenste halve stuk van het apparaat onmiddellijk over de onderste helft en druk de druk in tot het stevig in zitPlaats om de cilindrische kanalen te voltooien (wrijving tussen de kappen en het bovenstuk zal de laatste op zijn plaats houden). Wacht ~ 5 min bij kamertemperatuur na agarose-toevoeging om de gelering ervan in de kanalen van het apparaat toe te staan.
   4. Pak de naald handmatig uit elk van de gaten op de kapjes van het apparaat. Verwijder de schroeven en manueel scheid de twee caps en de bovenste helft van het onderste halve stuk, waar de laatste de hydrogelmicrokolommen zal houden.
   5. Gebruik fijne pincet om de microkolommen zachtjes van de kanalen op het onderste halve stuk te verwijderen en plaats ze in de eerder bereide Petri schotel die DPBS bevat (stap 1.1.1). Hergebruik het apparaat voor een andere ronde van microkolomfabrikatie. Ga verder naar deel 1.4.
3. Micro-kolom fabricage met behulp van capillaire buizen
   1. Breng glazen capillaire buizen over (diameter: 398,78 μm, lengte: 32 mm) aan de binnenzijde van de biosafety-kast. Manueel breken deLange buizen in fragmenten van 2,0-2,5 cm en voeg één acupunctuurnaald (diameter: 180 μm, lengte: 30 mm) in elk fragment in ( zie figuur 2A ).
   2. Breng 1 ml vloeibare agarose over van de beker naar het oppervlak van een lege Petri-schotel. Houd de capillaire buis en de geïntroduceerde naald, plaats het ene uiteinde van de buis in contact met het vloeibare agarosepoel om het door capillaire werking te vullen. Roer de buis om de capillaire stijging te bevorderen.
      OPMERKING: Vul de capillaire buizen met vloeibare agarose zo hoog als de capillaire werking toestaat; Daarna kunnen deze microkolommen in kleinere constructies worden gesneden afhankelijk van de gewenste lengte. Het 1 ml agarosepoel wordt typisch gebruikt voor slechts één buis, aangezien de agarose snel koelt en gelegelt, waardoor verdere capillaire werking voorkomt.
   3. Wanneer de vloeistof ophoudt, verwijder de capillaire buis uit het zwembad en plaats hem horizontaal op het oppervlak van een Petri-schotel. Wacht 5 minuten om de agarosegel in de buizen te laten liggen. </ Li>
   4. Plaats de duim en wijsvinger aan weerszijden van de buis en druk er tegen. Gebruik de andere hand om de naald snel uit te trekken terwijl u de duim en wijsvinger gebruikt om te voorkomen dat de microkolom uit de buis glijdt. Steek een 30-gauge naald in de capillaire buis om de microkolom langzaam te duwen in een schotel met DPBS (stap 1.1.1).
4. Micro-kolom trimmen en sterilisatie
   1. Verplaats één micro-kolom van DPBS delicaat naar een lege schotel met fijne tang. Voeg 10 μL DBPS aan de bovenkant van de microkolom toe met een micropipet om drogen te voorkomen. Plaats de laatste schotel onder een stereoscoop voor visuele begeleiding.
      OPMERKING: In het protocol verwijst micro-kolom drogen of uitdroging naar de verwerving van een verfrommelde structuur die visueel onderscheidbaar is met de typische gehydrateerde uitstraling van deze constructen. Uitgedroogde microkolommen stevig vastmaken aan het oppervlak van Petri-schotels en cAnnot kan gemakkelijk verplaatst worden, terwijl gehydrateerde constructen over het oppervlak glijden, na het manipuleren met tang. Een fase-contrastbeeld van een volledig gedroogde microkolom wordt getoond in Figuur 8A .
   2. Trim de microkolom met een microscalpel om het te verkorten tot de gewenste lengte (hier 2-5 mm). Vervoer de getrimde microkolom met fijne tang naar de andere DPBS Petri-schotel, bereid in stap 1.1.1.
   3. Herhaal stappen 1.4.1 en 1.4.2 voor elke vervaardigde microkolom.
   4. Steriliseer de microkolommen in de DPBS-bevattende Petri-schotels onder ultraviolet (UV) licht gedurende 1 uur. Bewaar de Petri-schotels bij 4 ° C voor ECM-toevoeging en celplating.

2. Primêre Neuronkultuur en Gedwongen Cell Aggregatie Methode

1. Voorbereiding van de piramidale micro-well-array
   OPMERKING: In deze sectie wordt een 3D-gedrukte vorm gebruikt die bestaat uit een cilindrische basis (diameter: 2,2 cm, hoogte: 7,0 mm) aNegen vierkante piramides bovenaan (zijlengte: 4,0 mm, schuine hoek: 60 °), georganiseerd in een 3 x 3 array, zoals getoond in figuur 3E . Het additieven productieproces met behulp van commercieel verkrijgbare 3D printers is goed gedocumenteerd. Computer-aided design software kan gebruikt worden om de vorm te ontwerpen. Het resulterende ontwerpbestand kan dan digitaal worden omgezet in een gereedschapspad voor een 3D-printer. Elke printer heeft verschillende specificaties, en de instructies voor het opzetten en bedienen van een 3D-printer variëren dienovereenkomstig.
   1. Gebruik een 3/32 "boorstuk om 16 gaten in een 4 x 4 array te plaatsen (zijlengte: 4 cm, gatafscheiding: 1 cm), centraal in de deksel van een 10 cm Petri-schotel. In een chemische dampkap gebruiken Het onderste stuk van de Petri-schaal om 27 g polydimethylsiloxaan (PDMS) en 3 g hardingsmiddel af te wegen (voor een verhouding 1:10). Roer met een microspatel om het middel gelijkmatig te verdelen.
   2. Bedek het PDMS / uithardingsmiddel met het doorlopen deksel. Sluit het ene uiteinde van een slang aan op de vacuuM poort van de dampkap en steek het andere uiteinde in de steel van een trechter (monddiameter: 10 cm, stamlengte: 3 cm, stengeldiameter: 1,5 cm).
   3. Maak een opening met een 3/32 "boorstuk bovenaan een 1 ml pipetbol en plaats een 1000 μL micropipetpunt in de opening (met het puntige uiteinde naar boven). Plaats de lamp en de tip in de slang en trek De slang naar boven totdat de lamp de slang in de steel van de trechter afdicht.
   4. Zet de trechter op de doorspoelde schaaldeksel en bevestig de slang met een beschikbare stabiele steun. Open de vacuümklep gedurende 5 minuten naar zuigkracht en breng de luchtbellen naar het oppervlak.
   5. Sluit de klep, verwijder de trechter en raak de Petri-schaal tegen het oppervlak van de dampkoker ~ 3 keer om eventuele overblijvende luchtbellen te barsten.
   6. Plaats een pyramidaal-goed-bedrukte schimmel in elk van de putjes in een kweekplaat met 12 putjes, met de piramiden naar boven gericht. Giet het PDMS / verhardingsmiddel bovenop de matrijzen tot elke putje tHij bord is gevuld. Bedek de 12-putjesplaat met deksel en laat het 1 uur bij 60 ° C drogen.
   7. Verwijder voorzichtig alle PDMS micro-bronnen ( Figuur 3F ) van de plaat met een microspatel. Bedek de PDMS-arrays met aluminiumfolie en steriliseer door autoclaving. Plaats in een biosafety-kast een micro-well-array in elke putje van een 12-putjesplaat ( figuur 2B ).
2. Cortische neuron isolatie van ratfetussen
   1. Voeg ~ 20 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) toe aan elk van vier tot zes 10 cm Petri-schotels (een voor elk dissected tissue) in een biosafety-kast. Breng deze gerechten over op een dissectiekap en plaats ze op ijs. Steriliseer dissectie-instrumenten, zoals microscalpels, scharen en tangen, met een hot bead sterilisator.
   2. Pre-warm embryonale neuron basaal medium + 2% serumvrij supplement + 0,4 mM L-glutamine (aangeduid als "cultureel medium" hierafteR) en 0,25% trypsine + 1 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bij 37 ° C. Ontdooi deoxyribonuclease (DNase) I door het op kamertemperatuur te plaatsen. Berei 1,5 ml van een 0.15 mg / ml DNAse I oplossing in HBSS op en houd de oplossing op ijs.
   3. Euthanize een tijd-zwangere embryonale-dag-18-rat door inhalatie van kooldioxide en bevestig de dood door decapitatie. Breng het karkas over naar een steriele dissectiekap en leg het ventraal omhoog. Spoel de buik grondig af met 70% ethanol.
   4. Open de baarmoeder en verwijder de foetussen (gewoonlijk ~ 11) uit de amniotische zakken met een schaar en overzetten met een pincet naar een Petri-schotel met koude HBSS zoals beschreven ⁴⁸ . Plaats een gekoeld granietblok (-20 ° C) onder de stereoscoop. Plaats de Petri schotel op het oppervlak van dit koude blok om de lage temperatuur van de HBSS te behouden tijdens de gehele dissectie procedure.
   5. Spoel de pups door de HBSS rond te zwaaien en over te brengen naar de volgende schone schotelBevattende HBSS. Verwijder met behulp van de stereoscoop en de dissectie-instrumenten de koppen, de hersenhelften en de cortices van de foetussen opeenvolgend en overdragen elk weefsel met tang naar een nieuwe HBSS-gevulde schotel na elke dissectie ⁴⁸ .
   6. Aspiratie alleen de cortices met een Pasteur pipette en plaats het weefsel in een steriele 15 ml centrifugebuis. Gooi de andere gedissendeerde weefsels weg. Spoel de cortices driemaal door opeenvolgend ~ 5 ml HBSS te toevoegen en te verwijderen met een serologische pipet. Plaats de buis op ijs wanneer het niet in gebruik is.
   7. Breng de cortices over met een Pasteur pipette naar een 15 ml buis met vooraf verwarmde trypsine-EDTA (4-6 cortices per 5 ml trypsine-EDTA). Roer de buis manueel handmatig en plaats deze bij 37 ° C. Omkeer de buis om de 3 minuten om te voorkomen dat het weefsel klont.
   8. Stop de blootstelling aan trypsine na ~ 10 minuten door het weefsel te verwijderen met een Pasteur pipette en over te brengen naar een schone 15 ml centrifugebuis. Voeg de 0.15 mg / ml DNase I oplossing (1,5 ml) toe aan de buis met een pipet.
   9. Gebruik een Pasteurpipet om de weefselklompjes handmatig te breken en dan vortex (~ 30 s) tot de oplossing homogeen is en er geen resterende weefselfragmenten in de vloeistof zijn. Als het niet mogelijk is de oplossing volledig te homogeniseren, verwijder u de onoplosbare fragmenten door ze in de punt van een Pasteur pipet te trekken.
   10. Centrifugeer de homogene celoplossing verkregen in stap 2.2.9 bij 200 xg gedurende 3 minuten. Verwijder de supernatant met een Pasteur pipette, let erop dat de gepelleteerde cellen niet worden verstoord. Voeg 2 ml kweekmedium toe met een serologische pipet en vortex om de cellen te resuspenderen.
   11. Tel het aantal cellen in de oplossing bereid in stap 2.2.10 met behulp van een hemocytometer; De verwachte opbrengst is 3,0-5,0 x 106 cellen / corticale hemisfeer. Bereid 1 ml of meer cel suspensie in kweekmedium, met een dichtheid van 1,0-2,0 x 106 cellen / ml.
3. Vorming van neuronale celaggregaten
   1. Voeg bij een micropipet 12 μl van de 1,0-2,0 x 10 ⁶ / ml cel suspensie in elke microput van de PDMS array (die in stap 2.1.7 in de plaat werd geplaatst).
      OPMERKING: De celconcentratie kan worden aangepast afhankelijk van de microkolom ID en de gewenste celaggregaatgrootte, aangezien hogere concentraties grotere aggregaten opleveren.
   2. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten om de aggregatie van cellen aan de onderkant van de microputjes te dwingen ( Figuur 2B ). Voeg voorzichtig ~ 2 ml kweekmedium toe aan de bovenkant van elke PDMS-array om alle gepolijste microbronnen te bedekken, let erop dat de gecombineerde cellen niet worden verstoord.
   3. Als cellen niet met een virale vector worden getransduceerd, incubeer de plaat gedurende 12-24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 en ga verder naar sectie 3. Als de aggregaten worden getransduceerd, sla de incubatie over en ga verder naar sectie 2.4 .
4. TranSductie met een virale vector om calciumsignalen te waarnemen
   Opmerking: Deze stappen worden uitgevoerd om neuronen te transduceren met een virale vector die een genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) bevat. De resultaten in dit artikel werden verkregen met behulp van een commercieel verkrijgbaar adeno-geassocieerd virus (AAV) (serotype 1) met GCaMP6f, een GECI met snelle kinetiek bestaande uit groen fluorescerend eiwit (GFP), calmoduline (CaM) en het M13 peptide, Aangedreven door de menselijke Synapsin I promotor. De virale vectoroplossing kan verdunning nodig hebben in steriele DPBS vóór transductie, afhankelijk van de concentratie van de voorraadoplossing. De celgezondheid / morfologie en GCaMP6f signaalsterkte moeten in de loop van de tijd worden waargenomen voor een reeks vectorconcentraties. Deze optimalisatieprocedure moet door elke onderzoeker worden uitgevoerd om de juiste titer voor hun eigen celculturen te bepalen. De typische GCaMP6f expressietijd is 7-8 dagen na de transductie die plaatsvindt tijdens de incubatie die in stEp 2.4.2.
   1. Voeg bij een micropipette het vereiste volume van de virale vectoroplossing toe (voor een uiteindelijke concentratie van ~ 3,0 x 10 ⁹ genomische kopieën per aggregaat) naar het kweekmedium dat de aggregaten bedekt. Langzaam pipetten omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat de vectoroplossing homogeen verdeeld is door het kweekmedium.
   2. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 om de virale transductie van GCaMP6f toe te laten met de gepoederde pyramidale microbronnen.
      

3. Ontwikkeling van de cellulaire component van micro-TENNs

1. ECM kernfabriek
   1. Na gecombineerde incubatie, voeg type I collageen en laminine toe aan het kweekmedium (voor een concentratie van 1 mg / ml elk) in een microcentrifugebuis om de ECM-oplossing te bereiden. Voer stap 3.1.2-3.1.4 bij kamertemperatuur uit, maar houd de buis met ECM op ijs wanneer het niet gebruikt wordt om te vroegtijdige gelering te voorkomen.
      
   2. Pas de pH van de ECM-oplossing aan door 1-2 μL op litmuspapier over te brengen om de initiële pH te verifiëren, waar nodig 1 μL 1 N natriumhydroxide (NaOH) en / of 1 N zoutzuur (HCl) aan de ECM toevoegen, En herhalen tot de pH 7,2-7,4 is. Zorg voor homogenisatie van de ECM-oplossing door pipettering omhoog en omlaag, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
   3. Breng de microkolommen met gesteriliseerde tang uit de afwas in stap 1.4.3 om lege 35- of 60-mm Petri-schotels leeg te maken. Werk op 4-5 microkolommen tegelijkertijd om uitdroging te voorkomen. Bevestig een 10-uL-tip die is bevestigd aan een 1000-uL-tip aan een micropipette. Met behulp van de stereoscoop voor visuele begeleiding, plaats de tip aan het ene uiteinde van de microkolommen en zuig om resterende DPBS en luchtbellen uit het lumen te verwijderen.
   4. Maak snel 4-5 μL ECM in een micropipette. Observeren onder een steReoscoop, plaats de punt van de micropipet aan één van de uiteinden van de microkolommen en ontlont voldoende ECM om het lumen te vullen. Bevestig de afwezigheid van luchtbellen in het lumen, omdat deze de axonale uitgroei door de ECM kunnen remmen. Als er luchtbellen bestaan, verwijder de ECM, zoals beschreven in stap 3.1.3, en voeg de ECM opnieuw toe.
   5. Om uitdroging te voorkomen, voeg ~ 2 μL ECM om elke microkolom toe. Incubeer de hydrogel / ECM microkolommen in de Petri schalen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 25 minuten. Ga onmiddellijk na het zaaien van de cel na directe incubatie.
      OPMERKING: De incubatieperiode in stap 3.1.5 is bedoeld om tijd te geven voor de polymerisatie van collageen en laminine in de microkolommen.
2. Neuronale cel zaaien in de microkolommen
   OPMERKING: Om het kweekmedium van de getransduceerde aggregaten te veranderen, kantelt u de plaat aan, gebruik een micropipette om het medium dat op de muur van de put zwemt te verwijderen en voeg vervolgens langzaam ~ 1 ml toe tegen deMuur (om de aggregaten in de pyramidale microbronnen te voorkomen). Herhaal deze gemiddelde verandering een tweede keer.
   1. Na de incubatieperiode in stap 3.1.5, overbrengen ongeveer 10-20 μL kweekmedium naar twee vrije gebieden in de Petri-schotels die de microkolommen houden. Gebruik een micropipette om de aggregaten individueel over te brengen naar de Petri-schotel die de constructen bevat en hen te verplaatsen naar een van de kleine pools van cultuurmedium om de gezondheid van de cellen te behouden.
   2. Terwijl u onder een stereoscoop observeert, voegt u een aggregaat in elk uiteinde van de microkolommen voor bidirectionele micro-TENN's of in één uiteinde voor een unidirectionele architectuur (zoals gewenst) met behulp van tang. Bevestig de plaatsing van de aggregaten in de microkolommen met behulp van de stereoscoop. Gebruik pincet om de zaaide microkolommen naar het andere kleine zwembad van cultuurmedium te verplaatsen om uitdroging te voorkomen en om de totale gezondheid te behouden.
   3. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO ₂ gedurende 45 minuten tot aLaat de aggregaten letten op de ECM. Controleer of de aggregaten aan de uiteinden van de microkolommen blijven, met behulp van de stereoscoop; Herplaats de celaggregaten opnieuw en herhaal de incubatietrap als nodig.
   4. Overstrom de Petri-schotels met de micro-TENNEN voorzichtig met kweekmedium (3 of 6 ml voor respectievelijk een 35 of 60 mm petrischaal) met behulp van een serologische pipet. Zet de afwas in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor de lange termijncultuur.
   5. Doe de halfmediawijzigingen elke 2 dagen met kweekmedium. Verwijder de helft van het oude medium met een pipet voorzichtig en gebruik de stereoscoop voor visuele begeleiding om de micro-tennens niet te zuigen. Vervang door langzaam toevoegen van vers, voorverwarmd medium met een pipet.
   6. Om de PDMS micro-well-arrays opnieuw te gebruiken, verwijder het kweekmedium, kook de arrays in gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten en steriliseer in een autoclaaf voor een andere ronde van de aggregatievorming en -cultuur.
      OPMERKING: Bij gewenste tijdstippen, deCytoarchitecture van micro-TENNs kan worden geverifieerd met behulp van fase-contrast microscopie. Hier werd gebruik gemaakt van een belichtingstijd van 5-8 ms en 10X (0,64 μm / pixel) en 20x (0,32 μm / pixel) doelstellingen om de fase-contrastbeelden vast te leggen. De fluorescentie geassocieerd met calciumconcentratieveranderingen in virale transduced micro-TENNEN werd gevangen met een fluorescentiemicroscoop met een hoge snelheid met een blootstellingsduur van 50 ms, een 10x objectief (0,64 μm / pixel) en solid state licht met bandpasfilters van ~ 480 Nm en ~ 510 nm voor excitatie en emissie, om het GCaMP6f fluorescentiesignaal te visualiseren.

4. Immunocytochemie voor In Vitro Studies

Opmerking: Voor de hier weergegeven beelden werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: muis anti-Tuj-1 / beta-III tubuline (1: 500) en konijn-anti-synapsine-1 (1: 500) voor de etikettering van axonen en pre -synaptische boutons, respectievelijk. De secundaire antilichamen waren donkey anti-mouse 568 (1: 500) en ezel anti-konijn 488 (1: 500). De vereiste volumes van de bereide primaire en secundaire antilichaamoplossingen, evenals de volumes van de formaldehyde-, paardserum- en detergentoplossingen, zijn afhankelijk van het volume dat nodig is om de constructies volledig te bedekken. Deze volumes kunnen worden geminimaliseerd met behulp van een hydrofobe barrière pen om het gebied rond elke microkolom te beperken.

VOORZICHTIG: In deze sectie worden formaldehyde en Hoechst gebruikt. Formaldehyde is een giftige verbinding die kankerverwekkend is en Hoechst is een bekende mutage. Daarom moeten deze verbindingen in een geschikte afvalcontainer worden verwijderd. Hanteer ze altijd in een chemische afzuigkap terwijl u passende persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt, zoals een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen.

1. Bereid een formaldehydeoplossing van 4,0% volume / volume (v / v) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een chemische dampkap.
2. Verwijder het kweekmedium uit de Petri dishesNg de micro-TENNEN met een micropipette. Voeg voldoende volume van de formaldehydeoplossing toe aan de afwas om de micro-TENNELS volledig te bedekken. Week de micro-TENNEN in de formaldehydeoplossing gedurende 35 minuten bij 18-24 ° C om de cellen in de microkolommen vast te zetten.
3. Verwijder de 4,0% formaldehydeoplossing uit de Petri-schotels met een pipet en gooi ze weg volgens passende richtlijnen voor verwijdering van gevaarlijke stoffen.
4. Voer twee snelle spoelen uit door voldoende PBS toe te voegen om de vaste micro-TENNELS volledig te bedekken en vervolgens de PBS te verwijderen met een pipet. Voer een derde lange spoel uit door de constructies gedurende 10 minuten in de PBS te laten ontdoen.
   VOORZICHTIG: Verwijder de PBS die wordt gebruikt voor het spoelen, eventueel met sporen formaldehyde.
5. Bereid een 0,3% v / v oplossing van niet-ionisch detergens in 4% v / v paardserum in PBS. Verwijder de PBS uit de petrischalen die de vaste micro-TENNEN bevatten en voeg een voldoende volume van de 0,3% wasmiddeloplossing toe om de constructies te bedekken. Week 60 minuten om 18-24 & #176; C om de cellen te permeabiliseren.
6. Verwijder de wasmiddeloplossing met een pipet. Voer twee snelle spoeltjes uit door de PBS toe te voegen en vervolgens te verwijderen. Vervolgens, voer drie langer spoelwater door de constructies gedurende 5 minuten gedurende elke 5 minuten in de PBS in te slikken.
7. Verdun primaire antilichamen in 4% paardserum. Verwijder de PBS uit de petrischalen die de vaste en doorlaatbare micro-TENNEN bevatten. Voeg voldoende primaire antilichaamoplossing toe aan de microkolommen om ze volledig te bedekken. Verzegel de petrischalen met parafilm om verdamping te voorkomen en incubatie gedurende de nacht (12-16 uur) bij 4 ° C.
8. Verwijder de primaire antilichaamoplossing uit de afwas en spoel zoals beschreven in stap 4.6. In het donker bereiden u de secundaire antilichaamoplossing in 4,0% paardserum. Voeg voldoende secundaire antilichaamoplossing toe om de constructies volledig te bedekken, de afwas met aluminiumfolie te bedekken en gedurende 2 uur bij 18-24 ° C te incuberen.
9. Bereid de Hoechst-oplossing (1: 10.000) in PBS om de kernen te vleken.
OPMERKING: Beelden voor de immunomerkte micro-TENNEN werden genomen met een laser confocale microscoop met een resolutie van 2.048 (~ 8 s / frame), een 10X objectief (0,64 μm / pixel), 487 nm excitatie en ~ 525 nm emissie golflengten voor Groene fluorescentie, 561 nm excitatie en ~ 595 nm emissie golflengten voor rode fluorescentie en ~ 3,22 μm / plakje met ~ 60 snijden gemiddeld voor de z-stapels.

Representative Results

Micro-TENN's werden gecontroleerd met behulp van fase-contrast microscopie om hun cytoarchitectuur en axonale uitgroei te beoordelen ( Figuur 4 ). Binnen unidirectionele 2 mm lange micro-TENNEN werden neuronale aggregaten beperkt tot het ene uiteinde van de microkolom en geprojecteerd een bundel axonen door de binnenste kern. Axons strekte de volledige lengte van de kolom door 5 dagen in vitro (DIV) ( Figuur 4A ). Er was een grotere aanvankelijke axonale groeitempo in tweerichtige 2 mm lange micro-TENNEN, aangezien de axonen de 3-DIV door de hele microkolom overschreden ( figuur 4B ). Bij 5 DIV, tweerichtings micro-TENNs gekenmerkt door dichte axonale tracten die de aggregaten verbinden die aan de uitersten van de microkolom werden gehouden. Deze cytoarchitectuur werd ook waargenomen in 5-mm micro-TENNs, waarbij axonen de microkolom met 5 DIV ( Figuur 4C ) uitstrekken. Zoals in alle gevallen waargenomen, de ECM in het lumen en de geometrische restriCtion die door de agarose wordt gepresenteerd, verschaft de richting die nodig is om axonale tracten te vormen die structurele eigenschappen van inheemse neuroanatomie nabootsen.

Immunocytochemie technieken werden toegepast in dit protocol, en confocal beelden werden genomen om de componenten van de micro-TENN architectuur te verifiëren. Celkernen die met Hoechst (blauw) werden gekleurd waren bijna uitsluitend binnen aggregaten gelokaliseerd aan de uitersten van eenrichtings- en tweerichtingsmicrokolommen, met in hoofdzaak geen Hoechst-kleuring in het interieur ( Figuur 5 ). Deze waarneming bevestigde wat werd afgeleid van de fase-contrastbeelden: neuronale populaties waren beperkt tot de uiteinden, en alleen axonen (in het rood) spannen het lumen van de micro-TENNEN. Echter, nadat axonen de aggregaten overschreden werden celmigratie langs de axonale tracten in het binnenlumen waargenomen, zoals waargenomen door de aanwezigheid van kernen (blauw) in het interieur bij 28 DIV voor een 2 mm lange bidirektoraatCtional micro-TENN ( Figuur 6 ). Bovendien werd synapsine I immunolabelling (groen) gevonden in de cellichamen en axonale tracten ( Figuur 6 ). Synapsine I is een pre-synaptische terminale eiwit die betrokken is bij de regulatie van neurotransmitter vrijlating en is indicatief voor de aanwezigheid van pre-synaptische terminals wanneer gevonden in een punctaatverdeling; Het is eerder gecorreleerd met de vorming van actieve synaptes door volledige patchopnamen ⁴⁹ . De synapsine kleuring in de axonrijke centrale zone van de micro-TENN is waarschijnlijk een combinatie van puncta en synapsine die naar beneden worden vervoerd naar pre-synaptische terminals. Niettemin suggereert de aanwezigheid van synapsine puncta binnen de micro-TENN aggregaten dat deze constructen de mogelijkheid hebben om door middel van synaptes te communiceren, hoewel de colocalisatie van synapsine met een postsynaptisch eiwit nodig zou zijn voor verdere structurele bewijzen van functionele synaptes. </ P>

Micro-Tenns werden ook vervaardigd met geaggregeerde neuronen die werden getransduceerd met een AAV die de GCaMP6f calcium-indicator bevat om de elektrofysiologische eigenschappen van deze constructen voorlopig te onderzoeken. Deze constructen uiten de calciumindicator gedurende hun gehele lengte, zoals blijkt uit fluorescentie in zowel de neuronale aggregaten als de axonale tracten ( Figuur 7A ). Merk op dat de fluorescentie in de axonale tracten, door middel van microscoopinstellingen gericht op het maximaliseren van de intensiteit in de aggregaten, zwakker bleek. Deze getransduceerde micro-TENNEN werden in de loop van de tijd geanalyseerd met high-speed fluorescentiemicroscopie (zonder externe elektrische stimulatie), en een aantal cellulaire gebieden van belang (ROI's) werden willekeurig geselecteerd in een representatieve micro-TENN om de signaleringscapaciteit van deze construeert. Calciumconcentratie bursts werden waargenomen in bijna alle ROI's, zoals weerspiegeld met assocFluctuerende fluorescentie intensiteiten gedurende de tijd ( Figuur 7B ). In het bijzonder bleken verschillende ROI's een bijna constante periodiciteit van calciumconcentratieverhogingen te tonen ( Figuur 7B ). Deze veranderingen in calciumconcentraties worden afgeleid van het resultaat van spontane, inherente actiepotenties, celsignalen binnen individuele aggregaten en / of signalering over axonen uit verschillende aggregaten. Verdere analyses zijn nodig om de elektrofysiologische eigenschappen van neuronen en axonale tracten binnen micro-TENNEN volledig te karakteriseren. Toch tonen deze initiële resultaten aan dat micro-TENNEN robuuste endogene / baseline elektrische activiteit vertoonden.

Figuur 3: Blueprints van het laser-cut micro-kolom fabricage apparaat en de 3D-gedrukte pyramidale micro-well vorm voor cel aggregatie. ( A) - ( B ) Blauwdruk en afbeelding van respectievelijk de onderste en bovenste helften van de cilindrische kanaalgroep, die gebruikt worden om de hydrogelmicrokolommen te vervaardigen. ( C ) Blauwafdruk en beeld van de caps die gebruikt werden om het apparaat samen te houden. Zowel de voorste als de achterste delen hebben dezelfde afmetingen. ( D ) Afbeelding van het gemonteerde apparaat dat nodig is om de microkolommen te vervaardigen. Alleen de twee kappen en de onderste helft zijn vastgeklemd met schroeven in de onderste twee uitlijning gaten (links). De gebroken lijnen tonen de plaatsing van de acupunctuurnaalden door de vijf gaten op elke pet. De vloeibare agarose wordt aan de onderste helft van de cilinders toegevoegd en daarna wordt de bovenste helft (rechts) op het apparaat geplaatst om de vloeibare agarose in vorm te vormen. ( E ) Blueprint van de 3D-gedrukte schimmels gebruikt om PDMS micro-well-arrays te maken. ( F ) Beelden van de 3D-gedrukte vorm (links) en de PDMS micro-well-arrays (rechts). Alle afmetingen zijn in milli Meter (mm). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Observatie van axonale groei in micro-TENNS door fase-contrast beeldvorming van unidirectionele en bidirectionele constructen als een functie van dagen in vitro . ( A ) Unidirectionele 2 mm lange micro-TENNs tonen axonale tracten die bijna de hele lengte van de microkolom met 5 DIV verlengen. ( B ) In vergelijking met unidirectionele micro-TENNEN vertoont bidirectionele 2 mm micro-TENNEN een snellere axonale groeitempo. ( C ) Voor 5 mm bidirectionele micro-TENNEN bevolken axonale gebieden de lengte van de microkolom bij 5 DIV. Deze architectuur wordt minstens gehandhaafd tot 10 DIV. Schaalstaven = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 5: Micro-TENN cytoarchitectuur waargenomen met confocale afbeeldingen van immunomerkte unidirectionele en bidirectionele micro-TENNs. Cellen werden gekleurd voor celkernen (Hoechst; blauw) en axonen (Tuj1; rood). ( A ) Fase-contrastbeeld van een 5 mm bidirectionele micro-TENN (28 DIV). Confocal reconstructies ( D ) - ( F ) en ( I ) - ( K ) van een 5 mm bidirectionele (28 DIV) en een unidirectionele (25 DIV) micro-TENN, tonen gemerkte celkernen ( D ), ( I ) En axonen ( E ), ( J ), evenals de overlay ( F ), ( K ). Schaalstaven: 500 μm. Insetsen in ( A F ) en ( K ) verwijzen naar fase-contrast ( B ) - ( C ) en confocal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) inzoomen van neuronale aggregaten en axonale tracten . De afbeeldingen tonen de aggregaten die zijn beperkt tot de uiteinden van de micro-TENN, terwijl het lumen wordt gespannen door uitgelijnd axonale tracten. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Uitdrukking van de pre-synaptische terminale eiwitsynapsine I in een representatieve bidirectionele micro-TENN. Het construct werd gekleurd voor celkernen (Hoechst; blauw), axonen (Tuj1; rood) en pre-synaptische boutons (synapsine I; groen). ( A ) Fase-contrAst beeld van een 2 mm bidirectionele micro-TENN op 28 DIV. ( D ) - ( G ) Confocal reconstructies die de celkernen ( D ), axonen ( E ), presynaptische boutons ( F ) en een overlay ( G ) van de drie kanalen tonen. Dozen tonen zoom-ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) van de fase-contrast en overlaybeelden voor respectievelijk de neuronale aggregaten. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Spontane signalering activiteit in een tweerichtings micro-TENN waargenomen door de expressie van een genetisch gecodeerde calcium indicator. ( A ) FluorescensE microscopie bevestigde de expressie van de GCaMP reporter, zoals waargenomen door fluorescentie door de aggregaten en axonen. Schaalbalk = 100 μm. ( B ) Fluorescentieveranderingen geassocieerd met calciumconcentratievariaties werden gemeten zonder externe stimulatie bij verschillende regio's van belangstelling (ROI's) als een functie van de tijd. De genummerde gekleurde cirkels in ( A ) wijzen op deze ROI's. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Fase-contrastbeelden van gemeenschappelijke foutenmethoden in de micro-TENN-methodologie. ( A ) Een volledig gedroogde / gedroogde agarose microkolom als gevolg van de verwijdering en / of verdamping van DPBS in de initiële stadia van fabricage. Schaalbalk = 5081, m. ( B ) Hydrogel-microkolom met het lumen dat de buitenwand van het constructie bekleedt door het gebrek aan concentrische uitlijning van de acupunctuurnaald met de capillaire buis. Schaalbalk = 100 μm. ( C ) Gezaagde micro-TENN met beide aggregaten aanwezig op 1 DIV. ( D ) Een van de aggregaten viel uit dezelfde microkolom als ( C ) bij 3 DIV. ( E ) Unidirectionele micro-TENN op 4 DIV. ( F ) De aggregaat- en axonale tracten vielen uit de microkolom in ( E ) en bleven drijvend in het kweekmedium bij 5 DIV. Schaalbalk voor ( C ) - ( E ) = 300 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

CNS letsel en ziekte resulteert typisch in het verlies of de disfunctie van de long-distance axonale pathways die de hersenverbinding omvatten, met of zonder gelijktijdige neuronale degeneratie. Dit wordt gecompenseerd door de beperkte capaciteit van het CNS om neurogenese en regeneratie te bevorderen. Ondanks het streven naar herstelstrategieën zoals groeifactor-, cel- en biomateriaalafgifte als individuele of combinatorische benaderingen, falen deze technieken tegelijkertijd niet alleen de degeneratie van neuronale cellen en het verlies van axonale verbindingen ^{14 , 22} . Deze leemten in technologie beperken de mogelijkheid om neurale netwerken op een gecontroleerde en duurzame manier te repareren, te wijzigen en te detecteren. Bijgevolg is de micro-TENN-technologie ontwikkeld om de behoefte aan een neurale herstelstrategie aan te pakken die, in tegenstelling tot bestaande methoden, zowel neuronale vervanging als de reconstructie van lange axonale verbindingen vergemakkelijkt. MicRo-TENNs zijn implanteerbare levende steigers met een voorgevormde cytoarchitectuur die de bouwstenen op het niveau van de hersenen aansluiten die specifiek zijn ontworpen voor de gerichte reconstructie, vervanging en wijziging van gastrale neurale circuits. Deze steigers bestaan ​​uit discrete populaties van neuronen verbonden door lange axonale tracten binnen het ECM-bevattende lumen van miniatuurcilindrische agarose hydrogelen. Deze constructen kunnen functioneren als synaptische relais ter vervanging van verloren wegen en dynamisch modulerende inheemse schakelingen. Daarnaast kunnen micro-TENNEN in gevallen van geïsoleerde axonale degeneratie (met bronneuronen intact blijven) mogelijk dienen als geleiders voor axonale regeneratie op basis van het mechanisme van axon-gefaciliteerde axonregeneratie. Dit manuscript presenteerde het fabricageprotocol om op een betrouwbare manier micro-TENNEN te creëren, met gecontroleerde geometrie, fenotype en functionele kenmerken. Fase-contrast microscopie, immunocytochemieStry en confocal microscopie aangetoond dat micro-TENN's die met het protocol zijn geproduceerd, de vereiste cytoarchitectuur tonen en de pre-synaptische terminale proteïne synapsine uitdrukken. Verder werd aangetoond dat micro-TENN's intrinsieke signaleringsactiviteit bezitten, mogelijk wegens actiepotenties, bij gebrek aan externe simulatie. Dit werd vastgesteld door de aanwezigheid van bijna-synchrone fluctuaties in de fluorescentie geassocieerd met een genetisch gecodeerde calcium reporter.

Micro-TENN-ontwikkeling kan worden samengevat door drie stappen: (1) de vervaardiging van de holle hydrogelbuis, (2) de toevoeging van ECM-oplossing aan het lumen van de buis en (3) het zaaien van aggregaten van geïsoleerde neuronen in de Uiteinden van de buis. De microkolommen kunnen worden vervaardigd met glazen capillaire buizen of met een microfabrikant die cilindrische kanalen bevat. Dit apparaat kan worden gecreëerd met elke micro-fabricagemethode met een hoge precisie die beschikbaar is voor de onderzoeker. VloeistofAgarose wordt gegoten in de kanalen van het apparaat of in capillaire buizen die een gecentreerde acupunctuurnaald bevatten om de hydrogelmicrokolommen te creëren. Na de agarose gelering wordt de acupunctuur naald verwijderd om het holle lumen te produceren. Verschillende gangbare valkuilen die zich voordoen tijdens fabricage of groei worden in figuur 8 gemarkeerd. Houd er rekening mee dat sommige van de afbeeldingen die in Figuur 4 zijn weergegeven en een extreem geval in Figuur 8B het luminale gedeelte voorzichtig dicht bij de wand van de cilinder tonen. Om een ​​evenwanddikte te maken bij het gebruik van de capillairbuismethode, moet de buis-naald assemblage rechtop gehouden worden wanneer het in contact komt met agarose, en de naald moet in het midden van de buis worden gehandhaafd. Door het buis-naaldsamenstel in een hoek ten opzichte van het agarose-oppervlak te houden, wordt de naald gedecentraliseerd. Niettemin zijn deze voorzorgsmaatregelen moeilijk te implementeren, en de naald is vaker dan niet rustendG de muren van de capillaire buizen. Integendeel, het belangrijkste vermogen van het microfabrikaat is dat het nålgaten heeft die concentrisch in lijn zijn met de cilindrische kanalen, waarbij een adequate centralisatie van de naald en het lumen ten opzichte van het kanaal en de microkolom wordt bevorderd. Bovendien verhoogt het apparaat doorvoer door tegelijkertijd de fabricage van meerdere microkolommen te vergemakkelijken. Ondanks het voordeel dat door het apparaat wordt geleverd, kunnen off-center lumens nog gecreëerd worden door gebruik te maken van gebogen acupunctuurnaalden. Micro-fabricage technieken hebben ook een inherente tolerantie die hun effectiviteit beperkt. In het algemeen mag de uitdroging van microkolommen, waarvoor een extreem geval in figuur 8A is getoond, geen belemmering zijn als de aanbevelingen die in het protocol worden verstrekt, worden gevolgd. Houd er rekening mee dat de fysische eigenschappen van de agarose die worden gebruikt voor de buitenste omhulling mogelijk optimalisatie nodig hebben voor alternatieve neuronale subtypes, zoals verbeterde corticale neuronen sUrvival en neurietgroei bij hogere (3-4%) versus lagere (1-2%) agaroseconcentraties werden waargenomen ¹⁰ .

De ontwikkeling van micro-TENNEN gaat door met de introductie van ECM in het microkolomumen, dat dient om een ​​omgeving te verschaffen die geschikt is voor neuronale hechting, overleving en uitgroei. Bovendien beperkt de ECM in combinatie met de geometrische beperking en de lage porositeit die door de agarosehydrogel wordt verschaft axonale groei in de lengterichting om de vereiste architectuur te produceren. De inhoud van de ECM-oplossing kan worden geoptimaliseerd voor het gebruikte type neuron. Bijvoorbeeld bevordert collageen alleen overleving en axonale uitgroei in DRG micro-TENNEN, terwijl een combinatie van collageen en laminine nodig is voor corticale neuronen ¹⁰ . Bovendien is ECM-polymerisatie binnen de microkolom kritisch voorafgaand aan celplating, aangezien de co-afgifte van cellen met niet-gepolymeriseerde ECM leidt tot verminderde neurite-outgrOwth en fasciculation ³¹ . Houd er rekening mee dat, hoewel de microkolom aanvankelijk met ECM-oplossing wordt gevuld, de inhoud ervan in een zachte gel polymeriseert en in de incubatieperiode een contract vormt, waardoor een ruimte wordt gecreëerd die de inbreng van de celaggregaten toestaat. Daarnaast is het belangrijk om te bevestigen dat de ECM binnen het microkolom binnenkomt door te inspecteren onder de stereoscoop; Volledige afwezigheid en / of zakken van ontbrekende ECM resultaten in een gebrek aan axonale uitgroei uit de aggregaten. Micro-TENN fabricage culmineert bij het zaaien van corticale neuron aggregaten aan de uitersten van de steiger. Deze neuronen werden gescheiden van ratfetussen onder toepassing van bekende procedures ⁴⁸ . Het kan worden afgeleid dat de meerderheid van geïsoleerde cellen neuronen is omdat de embryonale ratcortex tijdens de zwangerschapstijd gebruikt voor isolatie bestaat uit 99% neuronen en het gedefinieerde cultuurmedium dat in het protocol wordt gebruikt, metabolisch beperkt voor gliale proliferatie ⁴⁹ . Bijgevolg zou er een minimale gliale besmetting moeten zijn, hoewel het vlek voor specifieke markers nodig is voor bevestiging. Terwijl dit manuscript micro-TENN-fabricage met corticale neuronen heeft gepresenteerd, kunnen neuronen uit verschillende hersengebieden ( bijv. Nigral, thalamus en hippocampus) of met verschillende fenotypes (bijvoorbeeld excitatoire, remmende en dopaminergische) worden gebruikt volgens de gewenste toepassing en Gebied van implantatie. Vorige iteraties van het micro-TENN-fabricageprotocol betroffen het zaaien van gedissocieerde cellen ^{10 , 31 , 32} . Hoewel de gewenste cytoarchitectuur is verkregen met behulp van de gedissocieerde methode, werd het in alle gevallen niet bereikt. In veel gevallen daalden dissocieerde cellen het interieur en resulteerden in verschillende cellichaamclusters in het lumen, met processen die ze verbinden in een uitgebreid 3D-netwerkRef "> 10 ^{, 31.} De aggregatiewijze zorgt daarentegen voor het vasthouden van cellichamen tot de uitersten en is daarom integraal bij het succes van de micro-TENN-technologie ( figuur 5 ). De representatieve micro-TENNEN getoond In de figuren 4-6 werden gefabriceerd met grotere aggregaten die niet volledig ingevoegd waren, en dit kan soms resulteren in aggregaten die uit de microkolommen in cultuur vallen, zoals de voorbeelden die zijn weergegeven in Figuur 8D en 8E . Om dit te voorkomen kunnen de aggregaten Volledig ingebracht in het interieur van de microkolom. Als deze situatie zich voordoet, zelfs na toepassing van de vorige strategie, kan de initiële incubatieperiode worden verlengd om voldoende tijd te geven voor aggregatieve hechting aan de ECM. Tijdens de cultuur is de zachte behandeling van micro-TENNEN Aanbevolen om de integriteit van de hydrogelverpakking en de cytoarchitectuur te behouden; problemen tijdens micro-TENN-manipulatie is de oorzaak van de krommingen die zijn verkregen in de anders-uitgelijste axonale tracten ( Figuur 5 ). Niettemin, in navolging van het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, moet de consistente fabricage van micro-TENNEN resulteren in de verwachte neuronale / axonale architectuur, pre-synaptische boutonverdeling en intrinsieke elektrische activiteit.

Ondanks de belofte die micro-TENN's houden, zijn er nog steeds uitdagingen die de toepassingen van deze technologie kunnen beperken. De huidige microkolom fabricage techniek is beperkt door de decentralisatie van het micro-kolom lumen, waardoor een inconsistente presentatie van mechanische cues kan leiden tot cellen (bijvoorbeeld stijfheid), breuk van de microkolomwand en de daaropvolgende blootstelling van axonale tracten Naar buiten, en problemen tijdens implantatie. Hoewel het gebruik van een microfabrikant het resultaat heeft verbeterd in vergelijking met capillaire buizen, hogere precisie micro-fabricatioN technieken zijn nodig om de dimensionale reproduceerbaarheid van deze constructen te vergroten. De resultaten in dit manuscript toonden aan dat de micro-TENN-methodologie betrouwbaar levensstelsels kan produceren die bestaan ​​uit neuronen en axonale tracten die lijken op inheemse neuroanatomie, met name de axonale tracten die verschillende hersengebieden verbinden. Niettemin is de micro-TENN lengte een hindernis, afhankelijk van de lengte van de gastheer axonale weg die moet worden vervangen. Bijvoorbeeld, weefselvervaardigde zenuwtransplantaten (TENG's) zijn een aparte levende steigerstrategie die door onze onderzoeksgroep wordt gebruikt om extreem lange zenuwbesmettingen te repareren. Om deze lange gaten te vervangen, kunnen de axonen in TENG's verlengd worden tot tientallen centimeter door continu mechanische spanning in aangepaste mechano-bioreactoren ^{1 , 23 , 50 toe te passen} . Deze "stretch growth" -techniek is ook toegepast om de astrocytische proceslengte te manipuleren naar betteR de structuur van radiale gliale paden ⁵¹ imiteren. Integendeel, de huidige micro-TENN-technologie biedt nog niet deze mate van controle aan; De maximale bereikbare lengte is momenteel beperkt door hoe lang de axonale tracten in vitro kunnen groeien op basis van traditionele groei-cone-gemedieerde extensie. Bovendien, hoewel het CNS een intrinsieke capaciteit heeft voor neurofysiologische rewiring als reactie op verschillende stimuli, en getransplanteerde cellen de capaciteit hebben om synaptisch te integreren met de inheemse schakelingen, is een andere beperking van deze technologie dat micro-TENN's afhankelijk zijn van de plasticiteit van de native hersenen En het vermogen van gastheernetwerken om functioneel te integreren met het geïmplanteerde constructie ^{52 , 53 , 54 , 55} . Tenslotte is een aangeboren tekort aan alle implantaat gebaseerde benaderingen, zoals micro-TENNs, hun invasieve kracht. Aangezien neuronen zijnOver het algemeen in de nabijheid van capillairen kan elk type chirurgische procedure verstoring veroorzaken in de bloed-hersenbarrière, lekkage van bloedfactoren in het hersenparenchym en een acute (en zelfs een chronische) ontstekingsrespons ³¹ . Dit antwoord kan gastheer- en micro-TENN-neuronen beschadigen, waardoor de gunstige aspecten van deze techniek negeren. Niettemin, micro-TENN's geïmplanteerd in de corticothalamusweg van ratten overleefd gedurende ten minste 1 maand en bleek bewijs van structurele integratie met de gastheer cerebrale cortex ^{10 , 31} . Daarnaast presenteerde een vorige publicatie van onze onderzoeksgroep een methodologie waarmee de naaldloze implantatie van micro-TENN's in rathersenen ^{31 mogelijk was} . In die aanpak werd deze hydrogel-omhullingstrategie versterkt om een ​​dunne (~ 20 μm) coating van carboxymethylcellulose te omvatten, die bij milde uitdroging voldoende stijfheid voordreef om door te dringenDe hersenen zonder een naald of gids te vragen ³¹ . Deze naaldloze implantatiemethode, gekoppeld aan het kleine doorsnede van de microkolommen, moet de schade aan de hersenen minimaliseren tijdens en na de stereotaxische implantatieprocedure.

Ondanks het voorlopige succes van micro-TENNs in vivo zullen toekomstige studies moeten bevestigen dat deze constructies synaptisch integreren met nierweefsel en om te onderzoeken of functioneel herstel is verkregen in modellen van CNS letsel en neurodegeneratieve ziekte ^{10 , 31} . Bijvoorbeeld, op maat gemaakte micro-TENN's kunnen worden ontworpen met specifieke celfenotypes en geïmplanteerd in de bijbehorende gedegenereerde weg om het netwerk en herstelfunctie te reconstrueren. Om de acute ontstekingsrespons na implantatie te verminderen kan de micro-TENN hydrogelhuid gedoteerd worden met anti-inflammatoire en overlevende middelen. Alternatieve fabricageTechnieken ( bijv. 3D-afdrukken) kunnen worden ontwikkeld om de hydrogelmicrokolommen met grotere gemak en nauwkeuriger kenmerken te genereren, inclusief consistente centralisatie van het lumen en reproduceerbaarheid van afmetingen. Hetzelfde biomaterialenschema dat gebruikt wordt met micro-TENN's kan worden aangepast om andere karakteristieke pathologieën van CNS letsel en ziekte aan te pakken. Onze groep heeft bijvoorbeeld eerder ontwikkelde constructen ontwikkeld die bestaan ​​uit longitudinale uitgelijste astrocytische bundels langs het collageen gecoate lumen van een agarose hydrogel die radiale gliale pathussen en de gliale buis structureel emuleren om axonale regeneratie en neuronale migratie ^{56 te} vergemakkelijken. Daarnaast kunnen stamcellen, zoals menselijke embryonale stamcellen (HESC's), geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en adipose-afgeleide stamcellen (ASC's) worden opgenomen om autologe micro-TENNEN op per patiënt basis te fabriceren tot meer Lijken op de verloren cytoarchitectuur en celfenotype. Deze futuRe-modificaties zouden de mogelijkheid van micro-TENNs verhogen om degenerate pathways in vivo te vervangen en zouden de reconstructie van meer geavanceerde weefselarchitecturen mogelijk maken, met inbegrip van astrogliale ondersteuning en axonale myelinatie, onder andere kenmerken. Genetisch gemanipuleerde neuronen zouden ook kunnen worden gezaaid om de regeneratieve werking van micro-TENN's te vergroten door het vrijkomen van trofische factoren of het mogelijk maken van modulatie van het CNS door de optogenetische stimulatie van lichtgated ion-kanalen ⁴³ . Deze steigers kunnen worden vervaardigd met excitatoire of remmende neuronen om bestaande dysfunctionele gastheerverbindingen synaptisch te moduleren in omstandigheden zoals epilepsie, depressie, drugsverslaving of pijnstoornissen ¹ . Bijvoorbeeld kunnen micro-TENNEN die overwegend GABAergische of glutamatergische synapsen vormen, worden geconstrueerd om respectievelijk op- of afgereguleerde wegen te onderdrukken of te stimuleren via synaptische integratie en / of door bulk neurusOtransmitter vrijgave. Het is belangrijk dat dergelijke zelfstandige modulerende constructies theoretisch reageren op basis van feedback van gastnetwerk ¹ . Op dezelfde manier kunnen micro-TENNEN worden toegepast als brein-computer interfaces (BCI's), met optogenetisch ontworpen micro-TENN's die dienen als tussenproducten tussen de hersenen en anorganische stimulerende of opname-apparaten. Deze applicatie kan een alternatief zijn voor microelectrode BCI's, die geen specifieke cel targeting en mechanische stabiliteit hebben en hebben ontstekingsreacties, gliale littekenvorming en neuronale migratie of verlies veroorzaakt bij penetratie in de hersenen ^{57 , 58} .

Zoals in vitro testbedden kunnen micro-TENNs een krachtig platform bieden voor de studie van neurobiologie en elektrofysiologie, die dienen als biofidelische modellen van het zenuwstelsel. Bovendien kunnen 3D-constructies dienen als testbedden voor behandelingsstrategieën bij gebruik als neurale injUry- en ziektemodellen ⁵⁹ . Als 3D-constructies kunnen micro-TENNEN de in vivo-omgeving simuleren, die wordt gekenmerkt door complexe cel-cel- en cel-ECM-interacties in alle ruimtelijke richtingen die niet accuraat kunnen worden weergegeven in platte culturen ^{42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65} . Inderdaad, talrijke onderzoeken hebben vastgesteld dat het type milieu cruciaal is voor cellen om de morfologie, proliferatie, migratie, genuitdrukking, differentiatie en signalering aan te tonen in de native setting ⁶⁰ . De overeenkomsten tussen de 3D-omgeving van deze steigers en de hersenen zelf worden aangevuld met de mate van controle die deze constructies bieden over hun fysieke en biochemische prOperties ⁴² . Dit laat de techniek van micro-TENNs toe met verschillende sets van mechanische, haptotaxische en chemotaxische signalen om het effect van deze signalen individueel of synergistisch te bestuderen op neuronale overleving, rijping, axonale verlenging, synaptogenese en mechanotransductie ^{32 , 42 , 63} . Bovendien maakt de ontwerp flexibiliteit van deze microweeftechniek techniek de bouw van levende steigers mogelijk die andere eigenschappen van het hersenweefsel nabootsen, zoals de kolomvormige, compartimentaliseerde structuur van de neocortex, die door de axonale tracten van de connectoom wordt gespannen, om de Kracht van dit systeem als een in vitro platform om de hersenen te bestuderen ⁶⁵ . Als onderzoekplatforms maken micro-TENNEN gebruik van de gecontroleerde instelling van typische in vitro modellen, de uitgebreide beschikbaarheid van ontwerpparameters in weefsel enGineering benaderingen, en de verhoogde fysiologische en pathofysiologische relevantie van 3D-platforms om een ​​ideaal testbed te worden om neurobiologische kennis te bevorderen. De talloze toekomstige aanwijzingen voor deze technologie leggen de veelzijdigheid van micro-TENNEN uit. Dit manuscript heeft aangetoond dat het micro-TENN-protocol op betrouwbare wijze weefselontwikkelde levende steigers kan produceren die cruciale kenmerken van neuroanatomie van de hersenen nabootsen om nieuwe inzichten te geven in neurobiologische verschijnselen, waaronder ontwikkelings-, ziekte- en herstelprocessen. Deze constructen kunnen ook synaptisch integreren met inheemse weefsel om beschadigde witte materiaalkanalen te reconstrueren, verloren neuronale cellen te vervangen, en gedisreguleerde pathussen te moduleren na het CNS letsel en ziekte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	--------------	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.