Summary
이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.
Abstract
호중구의 이동과 주 화성은 우리 몸의 면역계에 중요합니다. 미세 유체 장치는 실시간 시각화, 화학 물질 농도 구배 생성의 정확한 제어, 시약 및 시료 소비 감소 등의 이점 때문에 호중구 이동 및 주 화성을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 최근에, 전체 혈액으로부터 직접적으로 통합되고 용이하게 작동되는 미세 유체 주 화성 분석 시스템을 개발하기위한 노력이 마이크로 유체 연구원에 의해 이루어졌다. 이 방향에서, 첫 번째 all-on-chip 방법은 작은 혈액량 샘플에서 호중구의 자기 음성 정화와 주 화성 분석을 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 새로운 방법은 25 분 내에 신속한 시료 - 결과 호중구 주 화성 시험을 허용합니다. 본 백서에서는 문제 해결 전략, limi에 대한 토론과 함께 온칩 주 화성 분석을위한 상세한 구성, 작동 및 데이터 분석 방법을 제공합니다미래 방향. 이 all-on-chip 방법을 사용하여 정의 된 chemoattractant, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) 및 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD) 환자의 객담을 테스트하는 호중구 주 화성 분석의 대표 결과가 표시됩니다. 이 방법은 많은 세포 이동 관련 조사 및 임상 적용에 적용 가능합니다.
Introduction
화학 주성은 용해성 화학 물질 농도 구배로 이동하는 세포 이동 과정으로 면역 반응 1 , 2 , 3 , 조직 발달 4 및 암 전이 5를 포함한 많은 생물학적 과정에 결정적으로 관여합니다. 호중구는 가장 풍부한 백혈구 하위 집합이며 신체의 타고난 숙주 방어 기능을 가능하게하고 적응 면역 반응을 중재하는 데 중요한 역할을합니다 6 , 7 . 호중구에는 고도로 조절 된 주 화성 기계가 장착되어있어이 운동성 면역 세포가 병원체에서 유도 된 화학 유인 물질 ( 예 : fMLP)과 호스트 유래 화학 유인 물질 ( 예 : 인터루킨 -8)을 통과 할 수 있습니다. 호중구의 이동과 주 화성은 다양한 생리 학적 문제를 매개한다.염증 및 암과 같은 질병 1 , 9 . 따라서, 호중구 주 화성의 정확한 평가는 호중구 생물학 및 관련 질병 연구에 중요한 기능적 판독을 제공한다.
널리 사용되는 기존의 chemotaxis assays ( 예 : transwell assay 10 )와 비교하여 microfluidic 장치는 정확하게 제어 된 화학 구배 생성 및 소형화로 인해 세포 이동 및 화학 주성의 정량적 평가에 큰 가능성을 보여줍니다 11 , 12 , 13 . 지난 20 년 동안 다양한 생물학적 세포 유형, 특히 호중구의 화학 주성을 연구하기 위해 다양한 미세 유체 장치가 개발되었습니다. Spatiotemporally complex che에서 호중구의 이동을 특성화하는데 많은 노력이 기울여졌다. 마이크로 유체 장치 ( 14 , 15)에 구성된 미세 기울기를 나타낸다. 흥미로운 전략은 또한 microfluidic 장치를 사용하여 neutrophils에 의해 방향 결정을 연구하기 위해 개발되었습니다. 생물 학적 연구 이외에도, microfluidic 장치의 응용 프로그램은 질병 평가 17 , 18 , 19 임상 샘플을 테스트하기 위해 확장되었습니다. 그러나, 많은 미세 유체 장치의 사용은 전문 연구 기관에만 국한되어 많은 양의 혈액 샘플로부터 오랫동안 호중구를 분리해야합니다. 따라서, 신속한 호중구 주 화성 분석을위한 통합 마이크로 유체 장치를 개발하는 추세가있어왔다. 20 , 21 , 22 ,ef "> 23 , 24 .
이 방향으로, 단일 음향 소자에 자기 음성 호중구 정제와 후속 화학 주성 분석을 통합 한 all-on-chip 방법이 개발되었습니다 25 . 이 올 온칩 방법은 다음과 같은 새로운 특징을 가지고 있습니다. 1) 접착 기반 세포 포착이나 세포 크기 기반 필터링을 통해 혈액으로부터 호중구를 분리하는 이전의 온칩 전략과는 달리,이 새로운 방법은 높은 chemoattractant 자극에 chemotaxis 측정뿐만 아니라 전체 혈액의 소량에서 neutrophils의 고순도, 온 - 자기 분리, 2) 세포 도킹 구조는 화학 기울기 채널에 가까운 호중구의 초기 위치를 정렬하는 데 도움이되며 단일 세포 추적없이 간단한 화학 주성 분석을 가능하게합니다. 3) 호중구 격리와 chemot의 통합axis 분석은 실험 단계 사이에 중단이 없을 때 25 분 안에 빠른 시료 - 결과 주 화성 분석을 가능하게합니다.
이 백서는이 온칩 주 화성 분석의 구성, 작동 및 데이터 분석 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 논문은 알려진 재조합 화학 주성분 및 복잡한 chemotactic 샘플을 환자에게 테스트 한 다음 호중구 화학 주 화성을 수행하기 위해 개발 된 방법을 효과적으로 사용하고 문제 해결 전략, 한계 및 향후 방향에 대한 토론을 보여줍니다.
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Protocol
모든 인간 샘플 수집 프로토콜은 위니펙의 매니토바 대학 (University of Manitoba)의 공동 연구 교수 윤리위원회 (Joint-Faculty Research Ethics Board)의 승인을 받았습니다.
1. 미세 유체 장치 제작 ( 그림 1A )
- 디자인 및 인쇄 투명 마스크.
- 이전에 자세히 설명한대로 장치를 설계하십시오. 그림 1A를 참조하십시오.
참고 :이 장치에는 두 개의 레이어가 있습니다. 첫 번째 층 (4 μm 높이)은 그라디언트 채널 옆의 셀을 트랩하는 셀 도킹 차단 채널을 정의합니다. 두 번째 층 (높이 60μm)은 기울기 생성 채널, 세포 로딩을위한 포트 및 채널, 화학 물질 유입구 저장소 및 폐기물 배출구를 정의합니다. 정렬 마크는 2 개의 층을 위해 설계된다. 두 번째 레이어의 경우, 업스트림 채널의 길이와 너비는 각각 60 mm와 200 μm입니다. 하류의 길이와 너비구불 구불 한 입력 채널은 각각 6 mm와 280 μm입니다. - 고해상도 프린터를 사용하여 투명 필름 마스크에 첫 번째 및 두 번째 레이어 피쳐를 인쇄합니다.
참고 : 인쇄 해상도는 디자인의 최소 기능에 따라 다릅니다. 현재 디자인에서 10μm 최소 피쳐에 대해 32,000dpi가 선택되었습니다.
- 이전에 자세히 설명한대로 장치를 설계하십시오. 그림 1A를 참조하십시오.
- 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오.
- 실리콘 웨이퍼를 플라즈마 세정기에 넣으십시오. 3 분간 진공을가한다.
- 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 HIGH로 설정하십시오. 30 분 동안 실리콘 웨이퍼를 처리하기 위해 산소 플라즈마를 사용하십시오.
- 플라즈마 세정 장치를 끄고 실리콘 웨이퍼를 꺼냅니다. 실리콘 웨이퍼는 디바이스 몰드를 제조 할 준비가된다.
- 클린 룸 시설에서 사진 석판 술을 사용하여 첫 번째 레이어를 제작하십시오.
참고 : 정확한 제조 매개 변수는 제조 시설에 따라 다를 수 있습니다.- 10 mL SU-8 2025를 10 mL SU-8 2000을 유리 브레이커로 사용하여 설계된 포토 레지스트를 준비한다. 거품이 사라질 때까지 퓸 후드에 혼합물을 10 분 동안 두십시오.
- 조심스럽게 적절한 척으로 스피너에 세척 된 실리콘 웨이퍼를 놓고 진공을 적용하여 실리콘 웨이퍼를 고정시킵니다.
- 조심스럽게 실리콘 웨이퍼 중앙에 포토 레지스트 혼합물 3 mL를 붓습니다. 500rpm에서 5 초 동안 스핀합니다. 그런 다음 30 초 동안 3,000 rpm으로 회전시켜 실리콘 웨이퍼에 최종 4 μm 두께의 포토 레지스트 코팅을 얻습니다.
- 조심스럽게 스피너에서 실리콘 웨이퍼를 꺼내고 핫 플레이트에서 95 ° C로 4 분간 실리콘 웨이퍼를 베이킹합니다.
- 조심스럽게 실리콘 웨이퍼를 마스크 정렬기에 놓고 UV 노출 시간을 6 초로 설정합니다. 접착 테이프를 사용하여 투명 유리판에 첫 번째 레이어의 투명 마스크를 조심스럽게 부착합니다.
- 부착 된 마스크가있는 투명 유리판을 정렬 장치에 천천히 올려 놓고 마스크를 실리콘 웨이퍼에 맞 춥니 다. 시를 드러내시오.licon 웨이퍼를 UV에 연결하여 셀 도킹 구조를 패턴 화합니다.
- 조심스럽게 유리판을 제거하고 노출 된 실리콘 웨이퍼를 꺼내십시오. 95 ° C에서 4 분간 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 베이킹합니다.
- 실리콘 웨이퍼를 흄 후드에 옮기고 SU-8 개발자가 들어있는 유리 팬에 넣으십시오. 30 초 동안 부드럽게 흔드십시오.
- 신선한 SU-8 현상액을 사용하여 흄 후드 내부의 이소 프로필 알콜 (IPA)을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. 흄 후드 내부의 질소 가스로 실리콘 웨이퍼를 건조시킨다; 첫 번째 레이어가 준비되었습니다.
- 첫 번째 레이어에 두 번째 레이어를 만듭니다.
- 접착 테이프를 사용하여 첫 번째 레이어의 정렬 표시를 덮으십시오. 조심스럽게 첫 번째 레이어와 함께 실리콘 웨이퍼를 스피너의 진공 척 위에 놓고 진공을 적용하여 실리콘 웨이퍼를 고정시킵니다.
- 실리콘 웨이퍼에 3 mL의 SU-8 2025 포토 레지스트를 붓습니다. 5 초 동안 500 rpm으로 실리콘 웨이퍼를 회전시킵니다. 그런 다음 2000 rpm으로 30 회전실리콘 웨이퍼 상에 최종 60㎛ 두께의 포토 레지스트 코팅을 얻는다.
- 실리콘 웨이퍼를 조심스럽게 스피너에서 꺼내 핫 플레이트로 옮깁니다. 65 ° C에서 2 분간 구우십시오.
- 부드럽게 접착 테이프를 제거하여 첫 번째 레이어의 정렬 표시를 노출하십시오. 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 놓고 95 ° C에서 6 분 동안 베이킹합니다.
- 조심스럽게 실리콘 웨이퍼를 마스크 정렬 장치에 놓고 UV 노출 시간을 18 초로 설정합니다.
- 접착 테이프를 사용하여 투명 유리판에 두 번째 레이어의 투명 마스크를 조심스럽게 부착합니다.
- 부착 된 마스크가있는 유리판을 조심스럽게 정렬 장치에 놓고 마스크와 정렬 장치의 검사 현미경을 사용하여 교차 정렬 표시로 실리콘 웨이퍼의 첫 번째 레이어를 정렬합니다.
- 포토 레지스트 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 UV에 노출시켜 셀 로딩 및 그래디언트 채널을 패턴 화하십시오.
- 조심스럽게 유리판을 제거하고 실리콘을 꺼내십시오.어퍼. 실리콘 웨이퍼를 2 분 동안 65 ° C에서 핫 플레이트에 베이킹 한 다음 실리콘 웨이퍼를 다른 95 ° C 핫 플레이트로 옮기고 6 분 동안 베이킹합니다.
- 실리콘 웨이퍼를 연기 후드로 옮기고 SU-8 개발자가 들어있는 유리 팬에 넣으십시오. 부드럽게 6 분 동안 이것을 흔드십시오.
- 신선한 SU-8 현상액을 사용하여 흄 후드 내부의 IPA를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오.
- 흄 후드 내부에 질소 가스를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 건조시킵니다. 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 놓고 금형을 150 ° C에서 30 분 동안 하드 베이킹합니다. 두 번째 레이어가 준비되었습니다.
- 마스터 몰드 표면 수정.
참고 : silanization 표면 수정 단계는 soft-lithography에서 금형으로부터 PDMS (polydimethylsiloxane) 방출을 촉진하기 위해 SU-8 몰드에 적용됩니다.- Micropipette tip에 트리 데카 플루오로 -1,1,2,2- 테트라 히드로 옥틸 (트리클로로 실란) 용액 10 μL를 넣습니다. 15 ML 플라스틱 튜브에 micropipette 팁을 넣어튜브의 캡을 느슨하게하십시오.
- 튜브와 SU-8 패턴 실리콘 웨이퍼를 데시 케이 터 내부에 놓고 1 시간 동안 진공을가한다. 마스크 몰드는 PDMS 장치를 제조 할 준비가된다.
- PDMS 장치를 제작하십시오.
- 플라스틱 비커에 PDMS베이스 40g과 경화제 4g을 혼합하여 PDMS 솔루션을 준비하십시오. 페트리 접시에 준비 SU - 8 마스터 금형을 놓고 조심스럽게 금형에 44 g PDMS 솔루션을 부어.
- 페트리 접시를 데시 케이 터에 넣고 20 분 동안 PDMS 용액을 탈기시키기 위해 진공을가하십시오. 그런 다음 페트리 접시를 오븐에 넣고 PDMS를 80 ° C에서 2 시간 동안 경화시킵니다.
- 굽기 후에, 페트리 접시를 가지고 가고 청결한 벤치에 두십시오. 조심스럽게 자르고 SU - 8 곰팡이에서 PDMS 슬랩을 벗겨.
- 직경 3mm의 펀처를 사용하여 셀로드 포트를 펀치 아웃합니다. 직경 6mm의 천공기를 사용하여 화학 물질 주입구 저장소와 폐기물 배출구를 펀치하십시오.
- 에 먼지를 제거접착 테이프를 사용하여 PDMS 슬래브의 표면 플라즈마 기계에 PDMS 슬래브와 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 진공을 3 분 동안 적용하십시오.
- 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 HIGH로 설정하십시오. 부드럽게 공기 밸브를 조정하고 3 분 동안 PDMS 슬래브와 유리 슬라이드 plasmatreat.
- 플라즈마 전원을 끄고 진공을 해제하십시오. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 PDMS 슬래브와 유리 슬라이드를 꺼내십시오.
- 유리 슬라이드 위에 PDMS 슬라브 (채널 구조가 아래를 향한 상태)를 즉시 놓습니다. 부드럽게 PDMS 슬래브를 눌러 유리에 접착시킵니다. 즉시 마이크로 유체 채널을 탈 이온수로 채 웁니다. 미세 유동 장치 제조 및 조립이 완료된다.
2. Microfluidic 세포 이동 분석 준비
- 미세 유체 장치 준비.
- 950에 재고 fibronectin 솔루션 (1 MG / ML)의 50 μL를 희석하여 50 μg / ML fibronectin 솔루션을 준비81; 바이오 안전성 캐비닛 내 Dulbecco의 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS).
- 로스웰 파크 기념 연구소 (Rotwe Park Memorial Institute) 배지 (RPMI-1640) 9 mL와 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)이 첨가 된 RPMI-1640 1 mL를 혼합하여 이동 배지를 준비합니다.
- 장치에서 탈 이온수를 제거하십시오.
- 콘센트에서 100 μL의 fibronectin 용액을 장치에 첨가하십시오. 모든 채널이 fibronectin 용액으로 채워지는지 3 분간 기다립니다. 덮인 페트리 접시에 microfluidic 장치를 실온에서 1 시간 놓습니다.
- 장치에서 피브로넥틴 용액을 꺼냅니다. 콘센트에서 100 μL 이동 매체를 추가하십시오. 모든 채널이 이동 매체로 채워지는지 3 분간 기다리십시오.
- 실온에서 1 시간 더 장치를 품는다; 장치는 화학 주성 실험을위한 준비가 완료됩니다.
- chemotaxis 실험을위한 chemoattractant 솔루션 준비.
- t에서 100 nM fMLP 용액 준비1mL 이동 매체. 1.5 ML 튜브 fMLP 솔루션 주식 FITC - Dextran (10 kDa, 1 MM) 5 μL를 섞는다.
참고 : FITC-Dextran은 기울기 측정에 사용됩니다. 또는 그라디언트 표시기로 Rhodamine을 사용하십시오. fMLP 화학 유인 물질 용액은 화학 주성 실험을위한 준비가 완료되었습니다.
- t에서 100 nM fMLP 용액 준비1mL 이동 매체. 1.5 ML 튜브 fMLP 솔루션 주식 FITC - Dextran (10 kDa, 1 MM) 5 μL를 섞는다.
- Sputum 샘플 준비.
참고 : COPD 환자의 객담 검체로 유도 된 호중구 주 화성을이 올 온칩 방법의 임상 진단 응용으로 테스트했습니다.- COPD 환자로부터 객담 샘플을 수집하기위한 인간 윤리 규약을 얻습니다.
참고 : 우리는 위니펙의 Seven Oaks General Hospital (매니토바 대학 승인)에서 샘플을 수집 할 수있는 승인을 받았습니다. - 모든 과목에서 정보에 근거한 서면 동의서를받습니다.
- COPD 환자의 자발적 객담 샘플을 수집하십시오. 500 mL의 가래 샘플을 1.5 mL 튜브에 넣으십시오.
- 500 μL 0.1 % 디 첨가thiothreitol을 1.5 mL 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다. 튜브를 37 ° C의 수조에 15 분간 놓습니다.
- 753 XG에서 10 분 동안 시료를 원심 분리 한 후 상등액을 수집한다. 상등액을 865 xg에서 5 분간 원심 분리하고 최종 상등액을 수집한다. 사용하기 전에 수집 된 상등액을 -80 ° C의 냉동고에 보관하십시오.
- 주 화성 실험 준비가되었을 때, 객담 용액을 녹인다; 900 μL 이동 매체를 1.5 mL 튜브에 옮기고 바이오 안전성 캐비닛 안의 100 μL 가래 용액과 혼합하십시오. 가래 용액은 화학 주성 실험을 위해 준비된다.
- COPD 환자로부터 객담 샘플을 수집하기위한 인간 윤리 규약을 얻습니다.
- 혈액 샘플 수집.
- 건강한 기증자로부터 혈액 샘플을 채취하기 위해 인간 윤리 강령을 취득하십시오. 모든 헌혈자로부터 서면 동의서를받습니다.
참고 : 위니펙 빅토리아 종합 병원 (Winnipeg)의 샘플 (University of Manit의 공동 교수 연구 윤리위원회 승인)오바). - 정맥 천자에 의해 혈액 샘플을 수집하고 EDTA 코팅 튜브에 샘플을 넣으십시오. 실험 전에 튜브를 바이오 안전성 캐비닛에 보관하십시오.
- 건강한 기증자로부터 혈액 샘플을 채취하기 위해 인간 윤리 강령을 취득하십시오. 모든 헌혈자로부터 서면 동의서를받습니다.
3. All-on-chip 화학 주성 분석 실험
- 온칩 셀 분리 ( 그림 1B ).
- 바이오 안전성 캐비닛 안에 1.5 mL 튜브에 10 μL 전혈을 놓습니다.
참고 : 혈액 샘플 채취의 세부 사항은 2.4 절에 있습니다. - 호중구 격리 키트 (물질 표 참조)에서 2 μL 항체 칵테일 (Ab)과 2 μL 자성 입자 (MP)를 1.5 ML 튜브에 넣고 부드럽게 섞으십시오. 이것은 호중구를 제외한 혈액 세포를 표시합니다.
- 상온에서 5 분간 혈액 - Ab - MP 혼합물을 품어.
참고 : 이것은 혈액 내 항체 표지 세포를 자기 적으로 표시합니다. - 두 개의 작은 자기 디스크를 셀 로딩 p의 양면에 부착하십시오.장치의 오르 트. 장치의 모든 포트에서 매체를 토출하십시오.
- 세포로드 포트에서 microfluidic 장치로 천천히 피펫 2 μL 혈액 - Ab - MP 혼합물.
참고 : 자기 적으로 분류 된 세포는 호중구가 장치로 흘러 들어가고 세포 도킹 구조에 갇히게되는 동안 세포 로딩 포트의 측면 벽에 갇혀 있습니다. - 충분한 호중구가 세포 도킹 영역에 갇힐 때까지 몇 분간 기다립니다.
- 바이오 안전성 캐비닛 안에 1.5 mL 튜브에 10 μL 전혈을 놓습니다.
- 화학 주성 분석 ( 그림 1C ).
- 37 ° C에서 온도 제어 현미경 스테이지에 microfluidic 장치를 놓습니다.
- 2 개의 피펫 터를 사용하여 지정된 입구 저장소에 100 μL 화학 유인 물질 용액 (fMLP 또는 가래 용액)과 100 μL 이동 매체를 첨가하십시오. 이것은 압력에 의해 보조되는 연속적인 층류 - 화학적 혼합에 의해 구배 채널에서 화학 유인 물질 구배를 생성 할 것이다균형 구조.
참고 : 만성 폐쇄성 폐 질환 환자의 가래 수집에 대한 자세한 내용은 2.3 절에 나와 있습니다.- 배지 대조 실험의 경우, 유입 배지 모두에 이동 배지를 첨가하십시오.
- 그라디언트 채널에서 FITC-Dextran의 형광 이미지를 얻습니다.
- "File | Open"명령을 사용하여 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다.
- "Analyze | Plot Profile"명령을 사용하여 그라디언트 채널에서 형광 강도 프로파일을 측정합니다.
- 추가 플로팅을 위해 측정 데이터를 스프레드 시트로 내 보냅니다.
- 온도 제어 현미경 스테이지 또는 15 분 전통적인 세포 배양 보육에서 장치를 품어.
- 10X 대물 렌즈를 사용하여 데이터 분석을 위해 셀의 최종 위치를 기록하는 그래디언트 채널을 이미지화합니다.
- 필요한 경우 시간 경과 현미경으로 장치에 세포 이동을 기록하십시오.
4. 세포 이동 Data 분석 ( 그림 1C )
- 아래 설명 된대로 도킹 구조에서 세포 이동 거리를 계산하여 주 화성 분석을 분석합니다. 그림 1C를 참조하십시오.
- 이미지를 NIH ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다 (버전 1.45).
- 그라디언트 채널로 이동 한 각 셀의 가운데를 선택합니다.
- 최종 위치에 대해 선택한 셀의 좌표를 측정합니다. 도킹 구조의 가장자리에있는 점의 좌표를 초기 참조 위치로 측정하십시오.
- 측정 된 좌표 데이터를 스프레드 시트 소프트웨어 ( 예 : Excel)로 내 보냅니다. 셀의 이동 거리를 셀의 최종 위치와 그라디언트 방향을 따른 초기 참조 위치의 차이로 계산합니다.
- 마이크로 미터까지의 거리를 보정하십시오. chemotaxis의 측정으로 모든 세포의 이동 거리의 평균과 편차를 계산합니다.
- Mig 비교Student 's t -test를 사용하는 배지 대조 실험에 대한 화학 자극기 기울기가있는 배양 거리.
- 세포 이동의 시간 경과 이미지가 기록되면, 세포 이동 분석 및 chemotaxis는 세포 추적 분석 15 로 더 분석 할 수 있습니다.
참고 : all-on-chip chemotaxis assay를 만들고 수행하는 데 필요한 자료는 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다.
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Representative Results
호중구는 미세 유체 장치에서 직접 한 방울의 전체 혈액에서 부정적으로 선택됩니다. 분리 된 호중구의 순도는 Giemsa 염색에 의해 확인되었으며, 결과는 호중구의 전형적인 고리 모양과 엽 모양의 핵을 보였다 ( 그림 2A ) 25 . 이것은 소량의 전혈에서 고순도의 효과적인 칩 중성구 분리를 나타냅니다. 또한, 도킹 구조는 화학 구배 ( 그림 2B ) 25 를 적용하기 전에 그래디언트 채널 옆의 셀을 효과적으로 정렬 할 수 있습니다.
기울기 생성은 연속적인 층류 화학 약품 혼합을 기반으로하며, 흐름은 입구 및 출구 용액의 서로 다른 레벨로부터의 압력 차에 의해 유도됩니다. 외부 펌프가 필요 없습니다. 화학적 인 그라디언트t는 그라디언트 채널을 가로 지르는 FITC- 덱스 트란의 형광 강도 프로파일을 특징으로하는 미세 유체 장치에서 수분 이내에 설정된다. 농도 구배는 적어도 1 시간 동안 안정적이며, 이는 현재 호중구 주 화성 실험을위한 충분한 시간입니다 ( 그림 1C ).
세포 이동 연구를위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법의 사용을 입증하기 위해, 배지 단독 또는 fMLP 구배에서의 호중구 주 화성을 비교 하였다. 실험 결과 배지 조절 실험에서 장벽 채널을 통과하는 세포는 거의 없다는 것을 보여 주었다. 대조적으로, 많은 호중구는 빠르게 장벽 채널을 통해 이동하고 100 NM fMLP 그라디언트 ( 그림 2B ) 25로 마이 그 레이션. 세포 이동 시험은 이동 거리에 의해 정량적으로 측정되며, 이는 매체 대조군보다 fMLP 기울기에 대해 상당히 더 높다 ( 25 .
또한, 온 - 칩 방법은 매체 단독에서의 호중구 이동과 만성 폐쇄성 폐 질환 환자의 객담 구배를 비교함으로써 잠재적 인 임상 적용에 대해 입증되었다. 그 결과는 COPD 가래 구배에 대한 강한 세포 이동을 보였으며, 이는 중형 대조군 ( 그림 2B - C ) 25에 비해 현저히 높은 이동 거리로 정량적으로 나타냅니다.
그림 1 : 호중구 주 화성 분석을위한 all-on-chip 방법의 예. ( A ) 미세 유체 장치의 그림. 이 장치는 두 개의 레이어를 포함합니다. 첫 번째 층 (4 μm 높이)은 셀을 정의합니다l 그라디언트 채널 옆의 셀을 트랩하기위한 장벽 채널 도킹. 두 번째 층 (높이 60μm)은 기울기 생성 채널, 세포 로딩을위한 포트 및 채널, 화학 물질 유입구 저장소 및 폐기물 배출구를 정의합니다. 정렬 표시는 두 레이어에 대해 설계되었습니다. 두 번째 레이어의 경우, 업스트림 채널의 길이와 너비는 각각 60 mm와 200 μm입니다. 하류의 사행 형 입력 채널의 길이와 폭은 각각 6 mm와 280 μm입니다. ( B ) 온칩 세포 분리 방법의 예; ( C ) chemotaxis 테스트의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 2 :의 대표 결과all-on-chip 호중구 주 화성 분석 25 . ( A ) Giemsa 얼룩진 이미지 (60X 대물 렌즈 사용) - 마이크로 유체 채널에서 온 - 온 격리 세포의; ( B ) 배지 조절에서의 세포 분포, 100 nM fMLP 기울기 및 COPD 객담 기울기의 비교; ( C ) 매체 제어에서 그라디언트 채널의 평균 세포 이동 거리, fMLP 그라디언트 및 COPD 가래 그라디언트. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타냅니다. *는 Student 's t -test에서 p <0.05를 나타냅니다.이 수치는 World Scientific Publishing의 허락을 얻어 참고 문헌 25 에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에서는 호중구를 전혈에서 직접 분리하고 화학 주성 테스트를 단일 미세 유체 칩에 직접적으로 분리하는 상세한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 이 방법은 간편한 조작, 고순도 호중구의 부정적 선택, 신속한 샘플 - 결과 화학 주성 테스트, 감소 된 시약 및 샘플 소비 및 정확한 세포 이동 데이터 분석에서 유용한 기능을 제공합니다. 대략적으로, 입력 된 전체 혈액 샘플로부터의 호중구의 적어도 25 %가 장치의 도킹 구조에 효과적으로 들어가고, 우리는 칩식 Giemsa 염색에 의해 호중구 순도가 높다는 것을 발견했다.
이 개발 된 all-on-chip chemotaxis 분석 방법은 다양한 세포 이동 연구 및 임상 응용 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법의 연구 응용은 배지에서의 호중구 주 화성을 fMLP 구배와 비교함으로써 입증되었다. 마찬가지로,이 방법은 COPD spu에서 호중구 화학 주성을 시험하는데 사용될 수있다임상 진단을위한 세포 기능성 바이오 마커를 개발하는 사례로서 이 방법으로 연구자는 호중구의 화학 주성을 서로 다른 화학 유인 물질에 대해 개별적으로 또는 조합하여 쉽게 테스트 할 수 있습니다. 연구원은 또한이 방법을 사용하여 잠재적으로 변경된 주 화성 반응에 대해 환자의 복잡한 주 화성 요소에 대한 호중구 화학 주 화성을 테스트하거나 질병 환자의 호중구를 테스트 할 수 있습니다. 이 통합 올 온칩 방법은 특별한 세포 배양 및 살아있는 세포 이미징 시설이없는 연구 또는 임상 실험실에서 테스트를 수행하는 데 특히 유용합니다. 시험은이 프로토콜에 따라 연구자 또는 임상의가 쉽게 수행 할 수 있습니다. 더 진보 된 리서치 어플리케이션을 위해,이 방법은 시간 경과 현미경으로 개별 세포 운동을 추적 할 수 있습니다.
일반적으로이 온칩 방식은 작동하기 쉽고 그 결과는 견고합니다. 몇 가지 기술적 인 알림은 성공적인 실험을 보장합니다. 첫째, th매우 얇은 배리어 채널을 손상시키지 않도록 플라즈마 결합 중에 PDMS 복제물을 클래스 기판 위에 가볍게 눌러야합니다. 둘째로, 세포 로딩 포트에서 배지의 증발은 화학적 구배를 방해 할 수 있습니다. chemotaxis 테스트 동안 셀 로딩 포트를 밀봉 탭으로 덮는 것이 좋습니다. 셋째, chemotaxis 실험 전에 배리어 채널을 통해 세포를 밀어 수있는 높은 압력을 피하기 위해 혈액 샘플은 장치에 부드럽게로드해야합니다. 넷째, 현재 설정에서, 우리는 바람직하지 않은 세포가 채널을 입력하지 않도록 chemotaxis 분석하는 동안 세포로드 포트에 첨부 된 자석을 유지하는 것이 좋습니다. 대안 적으로, 관통 구멍 및 자기 디스크가 부착 된 PDMS의 분리 된 부분은 장치의 셀 로딩 포트에 정렬 될 수있다. 이 경우, 자기 디스크 및 갇힌 셀이있는 상단 PDMS 부품을 셀 분리 후 장치에서 제거 할 수 있습니다.
이 올 온 채널ip 방법은 현재의 한계를 극복하고 그 기능을 개선하고 확장하기 위해 추가로 개발 될 수 있습니다. 첫째, 현재 장치는 한 번에 하나의 분석 만 허용하므로 처리량이 제한됩니다. 다중 병렬 테스트 유닛을 갖춘 디바이스의 추가 개발은 실험 처리량 요구 사항을 향상시킵니다. 두 번째로, 현재의 흐름 기반 화학 구배 생성기는 1D에서 구배 생성을 제한합니다. 2D 또는 3D 플로우 프리 그라디언트 생성기의 추가 개발은 생리적 그라디언트 조건을 더 잘 나타냅니다. 셋째, 호중구 외에도 원칙적으로이 올 온칩 방법을 사용하여 유사한 자성 세포 격리 키트를 사용하여 T 세포, B 세포 및 NK 세포와 같은 다른 백혈구 유형을 테스트 할 수 있습니다. 이 방법이 저주파수에서 혈액 세포 집단을 시험하는데 효과적으로 사용될 수 있는지, 그리고 화학 주성 테스트 전에 온칩 활성화 및 배양이 필요한 세포를 연구하는 것이 중요 할 것이다. 그런 다음 온칩 셀 격리 방법 can 다른 응용 프로그램을 위해 더 확장되어야합니다. 다른 장벽 채널 두께를 테스트 한 결과, 호중구 이동 실험에 3-4 μm가 가장 적합하다는 결과가 나타났습니다. 즉, 자극받지 않은 세포를 충분히 갇히고 세포가 자극시 장벽 채널을 통과하도록 허용합니다. 장벽 채널 치수는 다른 셀 유형에 맞게 최적화되어야합니다. 마지막으로,이 빠르고 통합 된 화학 주성 테스트를 통해 연구자는 관련 임상 응용 분야를 탐구 할 수 있습니다. 클리닉에서 실용적인 테스트를 가능하게하기 위해 마이크로 유체 장치, 온도 및 스테이지 제어는 물론 스마트 폰 기반 광학 이미징 및 데이터 분석 모듈을 통합하는 휴대용 시스템이 개발되었습니다. 이 논문에서 제시된 COPD 관련 연구 외에도, 만성 신장 질환과 같은 다른 관련 질병에 대한 세포 이동은이 올 온칩 (all-on-chip) 방법으로 시험되고있다.
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Disclosures
공개 할 이익 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 부분적으로 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 및 캐나다 보건 연구원 (CIHR)의 연구비 지원에 의해 지원됩니다. 위니펙의 빅토리아 종합 병원 (Victoria General Hospital)과 위니펙의 세븐 옥스 종합 병원의 임상 연구 및 응용 연구소 (Clinical Institute of Applied Research and Education)에 감사드립니다. Hagit Peretz-Soroka 박사에게 분석 작동 전략에 대한 도움이되는 토론에 감사드립니다. 워털루 대학교 (University of Waterloo)의 캐롤린 렌 (Carolyn Ren) 교수와 닥터 (Xiaoming, Cody) Chen 박사는 촬영 과정에서 관대 한 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
References
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