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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Abstract

A migração de neutrófilos e a quimiotaxia são críticas para o sistema imunológico do nosso corpo. Os dispositivos microfluídicos são cada vez mais utilizados para investigar a migração de neutrófilos e a quimiotaxia devido às suas vantagens na visualização em tempo real, controle preciso da geração de gradiente de concentração química e menor consumo de reagentes e amostras. Recentemente, um esforço crescente foi feito pelos pesquisadores microfluídicos para o desenvolvimento de sistemas de análise de quimiotaxia microfluídica integrada e de fácil operação, diretamente do sangue total. Nessa direção, o primeiro método all-on-chip foi desenvolvido para integrar a purificação magnética negativa de neutrófilos e o teste de quimiotaxia a partir de pequenas amostras de volume sanguíneo. Este novo método permite um rápido teste de quimiotaxia de neutrófilos de amostra a resultado em 25 min. Neste artigo, fornecemos métodos detalhados de construção, operação e análise de dados para este ensaio de quimiotaxia com todas as discussões sobre estratégias de solução de problemas, limiTations e direções futuras. Os resultados representativos do ensaio de quimiotaxia de neutrófilos com teste de um quimioatractante definido, N -Formulídeo-Met-Leu-Phe (fMLP) e escarro de um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), usando este método de todo o chip. Este método é aplicável a muitas investigações relacionadas com migração celular e aplicações clínicas.

Introduction

A quimiotaxia, um processo de migração de células direcionadas para gradiente de concentração química solúvel, é criticamente envolvida em muitos processos biológicos, incluindo resposta imune 1 , 2 , 3 , desenvolvimento de tecido 4 e metástase de câncer 5 . Os neutrófilos são o subconjunto mais abundante de glóbulos brancos e desempenham papéis cruciais na habilitação das funções de defesa do hospedeiro inatas do corpo, bem como na mediação das respostas imunes adaptativas 6 , 7 . Os neutrófilos estão equipados com maquinaria quimiotáctica altamente regulada, permitindo que essas células imunes móveis respondam tanto a quimiotratantes derivados de patógenos ( por exemplo, fMLP) como a quimiotractivos derivados do hospedeiro ( por exemplo, interleucina-8) através de quimioestamento 8 . A migração de neutrófilos e a quimiotaxia medem vários problemas fisiológicosE doenças como inflamação e câncer 1 , 9 . Assim, a avaliação precisa da quimiotaxia dos neutrófilos fornece uma leitura funcional importante para estudar a biologia dos neutrófilos e as doenças associadas.

Em comparação com os ensaios de quimiotexia convencional amplamente utilizados ( por exemplo, o ensaio Transwell 10 ), os dispositivos microfluídicos são de grande promessa para a avaliação quantitativa da migração celular e da quimiotaxia devido à geração de gradiente químico e miniaturização com precisão 11 , 12 , 13 . Nas últimas duas décadas, vários dispositivos microfluídicos foram desenvolvidos para estudar a quimiotaxia de diferentes tipos de células biológicas, especialmente neutrófilos 11 . Um esforço significativo foi dedicado a caracterizar a migração de neutrófilos no complexo spatiotemporalmente complexo. Gradientes micos que foram configurados nos dispositivos microfluidicos 14 , 15 . Estratégias interessantes também foram desenvolvidas para estudar a tomada de decisão direcional por neutrófilos usando os dispositivos microfluídicos 16. A partir de pesquisas orientadas biologicamente, as aplicações de dispositivos microfluídicos foram estendidas para testar amostras clínicas para avaliação de doenças 17 , 18 , 19 . No entanto, o uso de muitos dispositivos microfluídicos é limitado a laboratórios especializados de pesquisa e exige um isolamento prolongado de neutrófilos a partir de grandes quantidades de amostras de sangue. Portanto, tem havido uma tendência crescente de desenvolvimento de dispositivos microfluídicos integrados para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue total 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Em direção a esta direção, desenvolveu-se um método todo-on-chip que integra a purificação de neutrófilos negativos magnéticos eo subsequente teste de quimiotaxia em um único dispositivo microfluídico 25 . Este método tudo-em-chip tem os seguintes recursos inovadores: 1) em contraste com as estratégias anteriores sobre o chip que isolam os neutrófilos do sangue por captura de células à base de adesão ou filtragem baseada em tamanho celular 20 , 22 , este novo método permite alta Pureza, separação magnética no chip dos neutrófilos de pequenos volumes de sangue total, bem como medição de quimiotaxia na estimulação quimiotratante; 2) a estrutura de encaixe da célula ajuda a alinhar as posições iniciais dos neutrófilos perto do canal de gradiente químico e permite análise de quimiotexia simples sem rastreamento celular único; 3) a integração do isolamento de neutrófilos e quimioterapiaO ensaio de eixo em um único dispositivo microfluídico permite uma rápida análise de quimiotaxia de amostra a resultado em 25 min quando não há interrupção entre etapas experimentais.

Este artigo fornece um protocolo detalhado para o método de construção, operação e análise de dados deste ensaio de quimiotaxia todo-em-chip. O documento demonstra o uso efetivo do método desenvolvido para realizar a quimiotaxia de neutrófilos, testando amostras chemoatractantes recombinantes recombinantes conhecidas e amostras chemotacticas complexas de pacientes, seguidas de uma discussão sobre estratégias de solução de problemas, limitações e direções futuras.

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Protocol

Todos os protocolos de recolha de amostras humanas foram aprovados pelo Joint-Faculty Research Ethics Board, na Universidade de Manitoba, em Winnipeg.

1. Fabricação de dispositivos microfluídicos ( Figura 1A )

  1. Desenhar e imprimir máscara de transparência.
    1. Designe o dispositivo conforme detalhado anteriormente 25 . Veja a Figura 1A .
      NOTA: O dispositivo inclui duas camadas. A primeira camada (4 μm de altura) define o canal de barreira de encaixe de célula para capturar as células ao lado do canal de gradiente. A segunda camada (60 um de altura) define o canal gerador de gradiente, a porta e o canal para carga celular, os reservatórios de entrada química e a saída de resíduos. As marcas de alinhamento são projetadas para as duas camadas. Para a segunda camada, o comprimento e a largura do canal de entrada em serpentina a montante são de 60 mm e 200 μm, respectivamente; O comprimento e a largura do rio a jusanteO canal de entrada em serpentina é de 6 mm e 280 μm, respectivamente.
    2. Imprima os recursos de primeira e segunda camada em uma máscara de transparência usando uma impressora de alta resolução.
      NOTA: A resolução de impressão depende dos recursos mínimos no projeto. No projeto atual, foram escolhidos 32.000 dpi para características mínimas de 10 μm.
  2. Limpe a bolacha de silício.
    1. Coloque uma bolacha de 3 em silício no limpador de plasma. Aplique o vácuo durante 3 min.
    2. Ative a energia do plasma e defina o nível como ALTO. Use o plasma de oxigênio para tratar a bolacha de silício durante 30 min.
    3. Desligue o limpador de plasma e tire a bolacha de silício; A bolacha de silício está pronta para fabricar o molde do dispositivo.
  3. Fabrique a primeira camada por fotolitografia em uma instalação de sala limpa.
    NOTA: Os parâmetros de fabricação exatos podem variar de acordo com a facilidade de fabricação.
    1. Diluir 10 mL de SU-8 2025 com 10 mL de SU-8 2000 em um disjuntor de vidro para preparar o fotorresist projetado. Deixe a mistura na exaustor durante 10 minutos até as bolhas desaparecerem.
    2. Coloque cuidadosamente a bolacha de silício limpa no girador com o suporte apropriado e aplique o vácuo para imobilizar a bolacha de silício.
    3. Coloque cuidadosamente 3 mL da mistura de fotoresist no centro da bolacha de silício. Girar a 500 rpm por 5 s. Em seguida, gire a 3.000 rpm por 30 s para obter um revestimento de fotossensibilidade final de 4 μm de espessura na bolacha de silício.
    4. Retire cuidadosamente a bolacha de silício da máquina giratória e assegure a bolacha de silício em uma placa quente durante 4 minutos a 95 ° C.
    5. Coloque cuidadosamente a bolacha de silício em um alinhador de máscara e ajuste o tempo de exposição UV para 6 s. Anexe cuidadosamente a máscara de transparência da primeira camada em uma placa de vidro transparente usando fita adesiva.
    6. Coloque suavemente a placa de vidro transparente com a máscara anexada ao alinhador e alinhe a máscara com a bolacha de silício. Exponha o siWafer de licão para UV para padronizar a estrutura de encaixe da célula.
    7. Retire cuidadosamente a placa de vidro e retire a bolacha de silício exposta. Asse a bolacha de silício numa placa quente durante 4 min a 95 ° C.
    8. Transfira a bolacha de silício para uma aspiradora e coloque-a em uma panela de vidro contendo o desenvolvedor SU-8. Agite suavemente isso por 30 s.
    9. Limpe a bolacha de silício usando um desenvolvedor SU-8 fresco seguido de álcool isopropílico (IPA) dentro da exaustão. Secar a bolacha de silício por gás nitrogênio dentro da exaustão; A primeira camada está pronta.
  4. Fabrique a segunda camada na primeira camada.
    1. Use uma fita adesiva para cobrir as marcas de alinhamento na primeira camada. Coloque cuidadosamente a bolacha de silício com a primeira camada no empuxo de vácuo da máquina giratória e aplique vácuo para imobilizar a bolacha de silício.
    2. Despeje 3 mL de fotoresist SU-8 2025 na bolacha de silício. Gire a bolacha de silício a 500 rpm por 5 s. Em seguida, gire a 2000 rpm por 30S para obter um revestimento final de fotoresist de 60 μm de espessura na bolacha de silício.
    3. Retire cuidadosamente a bolacha de silício da máquina giratória e transfira-a para uma placa de aquecimento; Assar a 65 ° C durante 2 min.
    4. Remova cuidadosamente a fita adesiva para expor as marcas de alinhamento na primeira camada. Coloque a bolacha de silício em uma placa quente e asse em 95 ° C durante 6 min.
    5. Coloque cuidadosamente a bolacha de silício em um alinhador de máscara e defina o tempo de exposição UV para 18 s.
    6. Anexe cuidadosamente a máscara de transparência da segunda camada em uma placa de vidro transparente usando fita adesiva.
    7. Coloque cuidadosamente a placa de vidro com a máscara anexada ao alinhador e alinhe a máscara e a primeira camada na bolacha de silício pelas marcas de alinhamento de cruzamento usando o microscópio de inspeção do alinhador.
    8. Exponha a bolacha de silício revestida com fotorresist para UV para padronizar os canais de carga celular e gradiente.
    9. Remova cuidadosamente a placa de vidro e retire o silício wAfer. Asse a bolacha de silício em uma placa quente a 65 ° C durante 2 min e depois transfira a bolacha de silício para outra placa quente a 95 ° C e asse por 6 minutos.
    10. Transfira a bolacha de silício para o aspirador e coloque-a em uma panela de vidro contendo o desenvolvedor SU-8. Agite suavemente isso por 6 min.
    11. Limpe a bolacha de silício usando o desenvolvedor fresco SU-8 seguido de IPA dentro da exaustão.
    12. Secar a bolacha de silício usando gás nitrogênio dentro da exaustão. Coloque a bolacha de silício em uma placa de cozedura e dure o forno a 150 ° C durante 30 min; A segunda camada está pronta.
  5. Modificação de superfície do molde principal.
    NOTA: Um passo de modificação de superfície de silanização é aplicado ao molde SU-8 para facilitar a liberação de polidimetilsiloxano (PDMS) a partir do molde em litografia suave.
    1. Pegue 10 μL de solução tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil (triclorosilano) em uma ponta de micropipeta. Coloque a ponta da micropipleta em um tubo de plástico de 15 mL aE afrouxe a tampa do tubo.
    2. Coloque o tubo e a bolacha de silício padrão SU-8 dentro de um dessecador e aplique o vácuo por 1 h; O molde de máscara está pronto para fabricar o dispositivo PDMS.
  6. Fabricação do dispositivo PDMS.
    1. Prepare a solução PDMS misturando 40 g de base de PDMS e 4 g de agente de cura em um copo de plástico. Coloque o molde principal SU-8 preparado em uma placa de Petri e derrame com cuidado 44 g de solução PDMS no molde.
    2. Coloque a placa de Petri em um dessecador e aplique vácuo para desgasear a solução PDMS por 20 min. Em seguida, coloque a placa de Petri em um forno e cure o PDMS a 80 ° C por 2 h.
    3. Depois de assar, retire a placa de Petri e coloque-a em um banco limpo. Corte com cuidado e remova a placa PDMS do molde SU-8.
    4. Perfure a porta de carregamento da célula usando um perfurador de 3 mm de diâmetro. Retire os reservatórios de entrada química e a saída de resíduos usando um perfurador de 6 mm de diâmetro.
    5. Remova a poeira noSuperfície da placa PDMS usando fita adesiva. Coloque a laje PDMS e uma corrediça de vidro limpa na máquina de plasma. Aplique o vácuo durante 3 min.
    6. Ative a energia do plasma e defina o nível como ALTO. Ajuste suavemente a válvula de ar e aplique a placa de PDMS e o vidro deslize durante 3 min.
    7. Desligue a energia do plasma e solte o vácuo. Retire cuidadosamente a laje do PDMS e o slide de vidro usando uma pinça.
    8. Coloque imediatamente a laje PDMS (com estruturas de canais viradas para baixo) no topo do slide de vidro; Pressione suavemente a placa PDMS para encaixá-la no vidro. Encha o canal microfluídico com água desionizada imediatamente; A fabricação e montagem de dispositivos microfluídicos estão completos.

2. Preparação do ensaio de migração de células microfluídicas

  1. Preparação do dispositivo microfluídico.
    1. Prepare uma solução de fibronectina de 50 μg / mL diluindo 50 μL de solução de fibronectina em estoque (1 mg / mL) para 95081; solução salina tamponada com fosfato de L Dulbecco (DPBS) dentro de um gabinete de biossegurança.
    2. Prepare o meio de migração misturando 9 mL de meio de Instituto Roswell Park Memorial (RPMI-1640) e 1 mL de RPMI-1640 com 4% de albumina de soro bovino (BSA).
    3. Remova a água desionizada do dispositivo.
    4. Adicione 100 μL de solução de fibronectina ao dispositivo da tomada. Aguarde 3 min para garantir que todos os canais sejam preenchidos com solução de fibronectina. Coloque o dispositivo microfluídico em uma placa de Petri coberta durante 1 h à temperatura ambiente.
    5. Remova a solução de fibronectina do dispositivo. Adicione o meio de migração de 100 μL da saída. Aguarde 3 min para garantir que todos os canais estejam preenchidos com o meio de migração.
    6. Incubar o dispositivo por mais 1 h à temperatura ambiente; O dispositivo está pronto para a experiência de quimiotaxia.
  2. Preparação da solução quimiotratante para o experimento de quimiotaxia.
    1. Prepare a solução de fMLP 100 nM em t1 mL de meio de migração. Misture 5 μL de FITC-Dextran em estoque (10 kDa, 1 mM) com a solução fMLP em um tubo de 1,5 mL.
      NOTA: FITC-Dextran é usado para medição de gradiente. Alternativamente, use Rhodamine como indicador de gradiente. A solução de quimiotratante fMLP está pronta para a experiência de quimiotaxia.
  3. Preparação da amostra de escarro.
    NOTA: A quimiotaxia de neutrófilos induzida por um gradiente de amostra de escarro de pacientes com DPOC foi testada como uma aplicação de diagnóstico clínico deste método todo-em-chip.
    1. Obtenha um protocolo de ética humana para coletar amostras de escarro de pacientes com DPOC.
      NOTA: Obtivemos aprovações para coletar amostras no Hospital Geral Seven Oaks em Winnipeg (aprovado pela Universidade de Manitoba).
    2. Obtenha os formulários de consentimento por escrito informado de todas as matérias.
    3. Recolher amostras espontâneas de escarro dos pacientes com DPOC. Coloque 500 μL de amostra de escarro em um tubo de 1,5 mL.
    4. Adicionar 500 μL 0,1% diTioreitol no tubo de 1,5 mL e misture suavemente. Coloque o tubo em banho-maria a 37 ° C durante 15 min.
    5. Centrifugar a amostra a 753 xg durante 10 min e depois recolher o sobrenadante. Centrifugar o sobrenadante a 865 xg durante 5 min e depois recolher o sobrenadante final. Armazene o sobrenadante coletado dentro de um congelador de -80 ° C antes de usar.
    6. Quando estiver pronto para experimentar a quimiotaxia, descongelar a solução de escarro; Transfira 900 μL de meio de migração para um tubo de 1,5 mL e misture com 100 μL de solução de escarro dentro de um gabinete de biossegurança; A solução de escarro está pronta para a experiência de quimiotaxia.
  4. Coleta de amostras de sangue.
    1. Obtenha um protocolo de ética humana para coletar amostras de sangue de doadores saudáveis. Obtenha os formulários de consentimento por escrito informados de todos os doadores de sangue.
      NOTA: Aqui amostras foram obtidas no Hospital Geral de Victoria em Winnipeg (aprovado pelo Joint-Faculty Research Ethics Board da Universidade de ManitOba).
    2. Recolher a amostra de sangue por punção venosa e colocar a amostra em um tubo revestido com EDTA. Mantenha o tubo em um gabinete de biossegurança antes da experiência.

3. Operação de ensaio de quimiotaxis All-on-chip

  1. Isolamento de célula em chip ( Figura 1B ).
    1. Coloque 10 μL de sangue total em um tubo de 1,5 mL dentro de um gabinete de biossegurança.
      NOTA: Os detalhes da coleta de amostras de sangue estão na seção 2.4.
    2. Adicione 2 μL de coquetel de anticorpos (Ab) e 2 μL de partículas magnéticas (MP) do kit de isolamento de neutrófilos (veja a tabela de materiais) no tubo de 1,5 mL e misture suavemente; Isso rotará as células no sangue, exceto os neutrófilos.
    3. Incubar a mistura sanguínea-Ab-MP durante 5 minutos à temperatura ambiente.
      NOTA: Isto irá marcar magneticamente as células marcadas com anticorpos no sangue.
    4. Anexe dois discos magnéticos pequenos aos dois lados do carregamento celularOu do dispositivo. Aspira o meio de todas as portas do dispositivo.
    5. Pentee lentamente 2 μL de mistura sanguínea-Ab-MP no dispositivo microfluídico da porta de carga celular.
      NOTA: As células marcadas magnéticamente são presas nas paredes laterais da porta de carga da célula enquanto os neutrófilos fluem para o dispositivo e ficam presos na estrutura de encaixe da célula.
    6. Aguarde alguns minutos até que os neutrófilos suficientes estejam presos na área de encaixe da célula.
  2. Ensaio de quimiotaxis ( Figura 1C ).
    1. Coloque o dispositivo microfluídico no palco do microscópio controlado por temperatura a 37 ° C.
    2. Adicione 100 μL de solução chemoattractant (solução de fMLP ou escarro) e 100 μL de meio de migração para os reservatórios de entrada designados usando dois pipetadores; Isto irá gerar um gradiente chemoattractant no canal de gradiente por meio de uma mistura química contínua baseada em fluxo laminar assistida por um pressurE estrutura de equilíbrio.
      NOTA: Os detalhes da coleta de escarro de pacientes com DPOC estão na seção 2.3.
      1. Para o experimento de controle médio, adicione apenas meio de migração para ambos os reservatórios de entrada.
    3. Adquira a imagem de fluorescência de FITC-Dextran no canal de gradiente.
    4. Importe a imagem para o software ImageJ usando o comando "Arquivo | Abrir".
    5. Meça o perfil de intensidade de fluorescência no canal de gradiente usando o comando "Analisar | Perfil de plotagem".
    6. Exporte os dados de medição para uma planilha para planejamento adicional.
    7. Incube o dispositivo no estágio do microscópio controlado por temperatura ou em uma incubadora de cultura de células convencional durante 15 min.
    8. Imagem do canal gradiente usando um objetivo 10X para registrar as posições finais das células para a análise de dados.
    9. Se necessário, grave a migração celular no dispositivo por microscopia por lapso de tempo.

4. Migração celular DAta análise ( Figura 1C )

  1. Analise o ensaio de quimiotaxia calculando a distância de migração celular da estrutura de ancoragem conforme descrito abaixo. Veja a Figura 1C .
  2. Importe a imagem para o software NIH ImageJ (ver 1.45).
  3. Selecione o centro de cada célula que se deslocou para o canal de gradiente.
  4. Meça as coordenadas das células selecionadas para suas posições finais. Meça a coordenada de um ponto na borda da estrutura de encaixe como posição de referência inicial.
  5. Exporte os dados de coordenadas medidas para um software de planilha eletrônica ( por exemplo, Excel). Calcule a distância de migração das células como a diferença entre a posição final de uma célula e a posição de referência inicial ao longo da direção do gradiente.
  6. Calibre a distância até um micrômetro. Calcule a média e desvio da distância de migração de todas as células como medida de quimiotaxia.
  7. Compare o migDistância da ração na presença de um gradiente chemoatrayante para o experimento de controle médio usando o teste t de Student.
  8. Se as imagens de lapso de tempo da migração celular forem registradas, a migração celular e a quimiotaxia podem ser analisadas adicionalmente por análise de rastreamento celular 15 .
    NOTA: Os materiais necessários para a construção e realização do ensaio de quimiotaxia todo-em-chip são detalhados na tabela de materiais.

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Representative Results

Os neutrófilos são negativamente selecionados a partir de uma gota de sangue total diretamente no dispositivo microfluídico. A pureza dos neutrófilos isolados foi verificada pela coloração com Giemsa no chip e os resultados mostraram os núcleos típicos em forma de anel e lobo de neutrófilos ( Figura 2A ) 25 . Isto indica um isolamento efetivo de neutrófilos no chip com alta pureza a partir de um pequeno volume de sangue total. Além disso, a estrutura de encaixe pode efetivamente alinhar as células ao lado do canal gradiente antes de aplicar o gradiente químico ( Figura 2B ) 25 .

A geração de gradientes baseia-se na mistura química de fluxo laminar contínuo e os fluxos são conduzidos pela diferença de pressão dos diferentes níveis das soluções de entrada e saída. Não são necessárias bombas externas. O gradien químicoT é estabelecido em poucos minutos no dispositivo microfluídico, que é caracterizado pelo perfil de intensidade de fluorescência de FITC-Dextran através do canal de gradiente. O gradiente é estável por pelo menos 1 h, o que é tempo suficiente para a experiência de quimiotaxia de neutrófilos atual ( Figura 1C ).

Para demonstrar o uso do método all-on-chip para pesquisa de migração celular, a quimiotaxia de neutrófilos em meio solo ou em gradiente fMLP foi comparada. Os resultados do teste mostraram que poucas células passaram pelo canal de barreira na experiência de controle médio. Por outro lado, muitos neutrófilos rapidamente se moveram através do canal de barreira e migraram para o gradiente fMLP de 100 nM ( Figura 2B ) 25 . O teste de migração celular é medido quantitativamente pela distância de migração, que é significativamente maior para o gradiente fMLP do que o controle médio ( 25 .

Além disso, o método all-on-chip foi demonstrado para possíveis aplicações clínicas, comparando a migração de neutrófilos em meio sozinho para um gradiente de amostra de escarro de pacientes com DPOC. Os resultados mostraram uma forte migração celular para o gradiente de escarro da DPOC, que é indicada quantitativamente pela distância de migração significativamente maior em comparação com o controle médio ( Figura 2B - C ) 25 .

figura 1
Figura 1: Ilustração do método all-on-chip para análise de quimiotaxia de neutrófilos. ( A ) Ilustração do dispositivo microfluídico. O dispositivo inclui duas camadas. A primeira camada (4 um de altura) define o celL canal de barreira de ancoragem para capturar as células ao lado do canal de gradiente. A segunda camada (60 um de altura) define o canal gerador de gradiente, a porta e o canal para carga celular, os reservatórios de entrada química e a saída de resíduos. As marcas de alinhamento são projetadas para as duas camadas. Para a segunda camada, o comprimento e a largura do canal de entrada em serpentina a montante são de 60 mm e 200 μm, respectivamente; O comprimento e a largura do canal de entrada em serpentina a jusante são de 6 mm e 280 μm, respectivamente; ( B ) Ilustração do método de isolamento de células all-on-chip; ( C ) Ilustração do teste de quimiotaxia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: resultados representativos deA análise de quimiotaxia de neutrófilos all-on-chip 25 . ( A ) imagem de coloração de Giemsa (usando um objetivo 60X) das células isoladas all-on-chip no canal microfluídico; ( B ) Comparação da distribuição celular no controle médio, um gradiente fMLP de 100 nM e um gradiente de escarro COPD; ( C ) A distância média de migração celular no canal gradiente no controle médio, um gradiente fMLP e um gradiente de escarro COPD. As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). * Indica p <0,05 do teste t de Student. Os números foram adaptados da referência 25 com permissão da World Scientific Publishing. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste trabalho, foi descrito um protocolo detalhado para isolar diretamente os neutrófilos do sangue total seguido do teste de quimiotaxia, tudo em um único microfluídico. Este método oferece recursos úteis em sua operação fácil, seleção negativa de neutrófilos de alta pureza, teste de quimiotaxia rápido de amostra a resultado, reagentes reduzidos e consumo de amostras e análise precisa de dados de migração celular. Como uma estimativa aproximada, pelo menos 25% dos neutrófilos da amostra de sangue total de entrada entraram efetivamente na estrutura de ancoragem no dispositivo e descobrimos que a pureza dos neutrófilos é alta por coloração com Giemsa no chip.

Este método de análise de quimiotaxia todo-em-chip desenvolvido tem um grande potencial em várias pesquisas de migração celular e aplicações clínicas. Uma aplicação de pesquisa deste método foi demonstrada comparando a quimiotaxia de neutrófilos em meio apenas a gradiente de fMLP. Da mesma forma, este método pode ser usado para testar quimiotaxia de neutrófilos em COPD spuComo exemplo de desenvolvimento de um biomarcador funcional celular para o diagnóstico clínico. Com este método, um pesquisador pode testar facilmente a quimiotaxia de neutrófilos em diferentes chemoatractantes individualmente ou em combinações. Os pesquisadores também podem testar a quimiotaxia de neutrófilos para fatores quimiotáticos complexos de pacientes ou testar neutrófilos de pacientes doentes para a resposta quimiotaxis potencialmente alterada utilizando este método. Este método integrado de all-on-chip é particularmente útil para realizar o teste em laboratórios de pesquisa ou clínicos que não possuem cultura celular especializada e instalações de imagens de células vivas. O teste pode ser facilmente operado por pesquisadores ou clínicos seguindo este protocolo. Para aplicações de pesquisa mais avançadas, esse método permite o microscópio de lapso de tempo para rastrear o movimento celular individual.

Em geral, este método de all-on-chip é fácil de operar e o resultado é robusto. Várias lembretes técnicos assegurarão ainda uma experiência bem sucedida. PrimeiroA réplica e PDMS deve ser suavemente pressionada no substrato da classe durante a ligação ao plasma para evitar danificar o canal de barreira muito fino. Em segundo lugar, a evaporação do meio na porta de carga da célula pode perturbar o gradiente químico. Recomenda-se a cobertura da porta de carregamento celular com uma aba de vedação durante o teste de quimiotaxia. Em terceiro lugar, a amostra de sangue deve ser carregada suavemente no dispositivo para evitar a alta pressão que pode empurrar as células sobre o canal de barreira antes da experiência de quimiotaxia. Em quarto lugar, na configuração atual, recomendamos manter os ímãs conectados à porta de carregamento celular durante o teste de quimiotaxia para evitar que células indesejadas entrem no canal. Alternativamente, um pedaço separado de PDMS com um orifício de passagem e os discos magnéticos anexados podem ser alinhados à porta de carregamento celular do dispositivo. Neste caso, a parte superior do PDMS com os discos magnéticos e as células presas pode ser removida do dispositivo após o isolamento da célula.

Este all-on-chO método ip pode ser desenvolvido para superar suas limitações atuais e melhorar e expandir suas funcionalidades. Primeiro, o dispositivo atual só permite um único ensaio de cada vez, limitando assim a taxa de transferência. O desenvolvimento adicional do dispositivo com múltiplas unidades de teste paralelas melhorará o requisito de throughput experimental. Em segundo lugar, o gerador de gradiente químico atual baseado em fluxo limita a geração de gradientes em 1D. O desenvolvimento adicional de geradores de gradiente livre de fluxo 2D ou 3D melhorará as condições do gradiente fisiológico. Em terceiro lugar, além de neutrófilos, este método de all-on-chip em princípio pode ser usado para testar outros tipos de glóbulos brancos, como células T, células B e células NK usando kits similares de isolamento de células magnéticas. Será importante estudar se este método pode ser efetivamente usado para testar populações de células sanguíneas em menor freqüência e aquelas células que requerem ativação e cultura do chip antes do teste de quimiotaxia. Em seguida, o método de isolamento de células all-on-chip caN seja ampliado para algumas outras aplicações. A espessura do canal de barreira diferente foi testada e os resultados mostraram que 3-4 μm é mais adequado para a experiência de migração de neutrófilos; Isto é, capturou o suficiente as células não estimuladas e permitiu que as células rastejassem através do canal de barreira após a estimulação. A dimensão do canal de barreira deve ser otimizada para diferentes tipos de células. Finalmente, este teste de quimiotaxia integrada e rápida permitirá que os pesquisadores explorem aplicações clínicas relevantes. Para habilitar o teste prático em clínicas, desenvolveu um sistema portátil que integra o dispositivo microfluídico, o controle de temperatura e estágio, bem como módulos de análise ótica e de imagem de dados baseados em smartphones. Além do estudo relacionado à DPOC, como demonstrado neste artigo, a migração celular para outras doenças relevantes, como a doença renal crônica, está sendo testada usando este método de todo o chip.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho é parcialmente apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (CRSNG) e os Institutos de Pesquisa em Saúde do Canadá (IRSC). Agradecemos ao Instituto Clínico de Pesquisa Aplicada e Educação no Hospital Geral de Victoria em Winnipeg e ao Hospital Geral Seven Oaks em Winnipeg para o gerenciamento de amostras clínicas de indivíduos humanos. Agradecemos ao Dr. Hagit Peretz-Soroka por uma discussão útil sobre as estratégias de operação do ensaio. Agradecemos a professora Carolyn Ren e Dr. Xiaoming (Cody) Chen da Universidade de Waterloo por seu generoso apoio no processo de filmagem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

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References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

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Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue
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Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

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