Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך להקפיא רקמות שרירות על ידי ותקע אותם ישירות לתוך חנקן נוזלי. פרוטוקול זה גם מדגיש cryovial חדש שיכול למנוע את "אפקט השמיכה" של גז חנקן כאשר מגעי חנקן נוזליים על פני שטח הרקמות של דגימה.
Abstract
מחקרים על פיזיולוגית שרירי שלד להתמודד עם האתגר הטכני של עיבוד הדגימות כראוי להשיג חלקים עם תאי ציטופלסמית נראו בבירור. משוכה נוספת היא למגע ההדוק של myofibers אל הרקמות הסובבות. בגלל התהליך של קיבוע רקמה והטבעת פרפין מוביל ההצטמקות של סיבי שריר, הקפאה היא אמצעי אופטימלי של התקשות רקמת שריר עבור חתך. עם זאת, סוגיה בדרך נתקל, היווצרות של גבישי קרח, מתרחשת במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים בגלל תכולת מים גבוהה של השריר. הפרוטוקול המובא כאן לראשונה מתאר שיטה פשוטה ויעילה עבור מקפיא כראוי ברקמות שרירות על ידי השיקוע שלהם חנקן נוזלי. הבעיה בשימוש בחנקן נוזלי לבד היא שזה גורם להיווצרות מחסום גז חנקן ליד רקמות, אשר משמש כמבודד ומעכבת את הקירור של רקמות. כדי למנוע זאת השפעה "אדי שמיכה", התחלה חדשהcryovial w נועד להגדיל את מהירות זרימת הנוזל סביב משטח רקמה. זו הושגה על ידי ניקוב סך של 14 חורים מפרצון בקיר של הבקבוקון. על פי דינמיקת בועה, שיעור גבוה של תוצאות זרימת נוזל בבועות קטנות סיכויים פחות כדי ליצור מחסום גז. כאשר חנקן נוזלי זורם לתוך cryovial דרך חורי המפרצון, מהירות הזרימה סביב הרקמה היא מהירה מספיק כדי לבטל מחסומי גז. לעומת השיטה של הקפאת רקמות שרירות באמצעות איזופנטאן טרום צונן, פרוטוקול זה הוא פשוט ויעיל יותר וניתן להשתמש בו כדי להקפיא שריר באופן תפוקה. יתר על כן, שיטה זו היא אופטימלית עבור מוסדות שאין להם גישה איזופנטאן, המהווה דליק מאוד בטמפרטורת החדר.
Introduction
שריר שלד הוא המרכיב היקר ביותר של בעלי חיים לייצור בשר מהנקודה התזונתית ועיבוד של השקפה. בתעשיית הבשר, ישנם שני היבטים קריטיים במיוחד: את היעילות של צמיחת שרירים ואיכות הבשר והתוצאה. כרכיב עיקרי של השריר, סיבי שריר שקשורים באופן ישיר על ביצועי צמיחה ואיכות בשר טרי בחי 1. לדוגמא, המספר הכולל של סיבים (TNF) ואת שטח החתך של סיבים (CSAF) בעיקר לקביעת מסת שריר ואיכות בשר; גם, רכב סוג הסיבים (FTC) בחריפות משפיע איכות בשר טרי 2. לכן, המניפולציה של מאפייני סיב שריר בבעלי חיים היא שיטה יעילה מאוד כדי להגדיל את רווחיות ליבה ואת התחרותיות של משקי 1.
נכון להיום, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים זוהו לתמרן characterist סיב שרירICS 1. מניפולציה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הבחירה של חיות הממוקדות עם גנים ספציפיים, כגון גן מיוסטטין בבקר 3, גן Callipyge בכבשים 4, ואת RYR1 וגני IGF2 בחזירים 5. כמו כן, שליטת דיאטה וטיפולים עם הורמונים ספציפיים לשחק תפקיד חשוב מאפייני סיב שריר 6. לפיכך, גישה משלבת גורמים גנטיים ותזונתיים יוכל לשפר תוכן ואיכות בשר בשר רזה. עם זאת, מחקרים על סיבי שריר מוגבלים תעשיית הבשר משום ההבהרה של המבנה סיבי שריר עדיין מהווה אתגר.
תכונות סיב השריר מזוהים באמצעות שיטות histochemical, כגון triphosphatase אדנוזין שרירן (ATPase) assay. שיטה זו מסתמכת על העובדה כי אנזימים הממוקם דקים (6-8 מיקרומטר) קפוא קטעיםסיבי שריר ניתן הגיבו כימי עם מוצרים מסוימים. עם זאת, תכולת המים של שרירים עולה 75% בחזירים, ארנבים, עכברים, ובני אדם, ללא קשר לתפקיד (כלומר, גב, בטן, או hindlimb) 7. לעתים קרובות תוכן לחות גבוה בשרירים גורם לבעיה זו בדרך כלל - הקפאת חפצים - במהלך תקופת ההכנה של cryosections, כפי שתואר לעיל 8, 9. ברוב המקרים, זה כמעט בלתי אפשרי להקפיא כראוי ברקמות שרירות בקו ייצור מטבחיים, על פי הניסיון שלנו.
הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה ויעילה בשימוש במעבדה שלנו להקפיא רקמות שריר עבור Cryosectioning באופן תפוקה גבוהה. גולת הכותרת של שיטה זו היא cryovial חדש אשר נועד עבור רקמות פלאש-הקפאת שרירים בחנקן נוזלי. זרימת העבודה הנוכחית במקביל יכולה להקל רקמותהקפאה ועיבוד עבור cryosection שרירים מעולה, עם תא ציטופלסמית נראה בבירור ואת הפרד ההדוק של myofibers אל הרקמה שמסביב. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של אפשרויות עבור בדיקת רקמות משום חנקן נוזלי אינו מתערבב עם רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השיטה הנוכחית כבר נקבעה ומאומתת לקצור ולאחסן יותר מ -1,000 דגימות שריר מכתים היסטולוגית במעבדה שלנו. כל הנהלים הקשורים לטיפול בבעלי חיים ושימוש בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי משרד החקלאות של סין.
ציוד 1. עבור אוסף דוגמאות
- תווית הזהות מדגם על כל בקבוקון קריוגני.
הערה: בקבוקון קריוגני תוכנן במיוחד כדי להקפיא דגימות רקמה טריות עבור הליך cryosection (איור 1A). צלוחיות עשויות פוליפרופילן במפעל עובש (איור 1C). - השג את הציוד הבא: חנקן נוזלי במיכל חנקן נוזלי המתאים, משקפי בטיחות או מגן פנים, כפפות מקפיא, 10 מלקחיים ס"מ, 25 פינצטה ס"מ, צידנית קלקר (מידות פנימיות: 20 ס"מ x 12 ס"מ רוחב x 13.5 ס"מ ; הממדים החיצוניים: 24 ס"מ x 16 ס"מ רוחב x 15 ס"מ), סרט פלסטי (2.5 ס"מ x 0.8 ס"מ רוחב X 0.1 מ"מ עובי),אזמל, וכיסויים מחייב A4 PVC (21 ס"מ x 29.5 ס"מ) (איור 1B).
2. הכנת דוגמאות שרירים
- מלא את הקל-קר עם דק 5 חנקן נוזלי לפני איסוף דגימה.
הערה: העמודה הגדולה של חנקן נוזלי היא חיונית כי חלק החנקן הנוזלי שחין משם והופך לגז כאשר דגימות טריות לגעת בו. על מנת להפחית את התדירות של העברת חנקן נוזלי כדי לחדש את ההפסד, מצנן קלקר בגודל מתאים חייב להיות רכשה מראש לפי מספר דגימות. - לאחר טיפוס מתקבל, בעדינות ומניחים אותו על פיסת A4 PVC מחייב כיסוי ולבחון את הכיוון של סיבי שריר.
הערה: הנה, השתמשנו החתך של שריר longissimus דוריס מן הראשונים החוליה המותני האחרונה בחזירים. דגימות עומדים ארוכה 12 ס"מ, 8 ס"מ רוחב, ו 5 ס"מ גבוה. - השתמש אזמל לעשות שני חתכים מקבילים דרך i הדגימהn בכיוון של סיבי שריר, כ 3 ס"מ אורך ו 0.6 ס"מ זה מזה. חתוך את השריר חרות למלבן כ 0.6 ס"מ x 0.6 ס"מ x גבוה ארוך 1.5 ס"מ.
הערה: האמינות של מדידת שטח החתך של סיבי השריר בעיקר תלוי כיוון הסיבים של השריר החרות. - השתמשו 10 ס"מ מלקחיים לשים המדגם בעדינות על פיסת סרט פלסטי, עם ציר האורך של מקבילים שרירים חרוט אל הקצה הארוך של (איור 2 א) הסרט.
הערה: סרט הפלסטיק יש שתי פונקציות: פונקציה חזקה המסייע בתיקון האורינטציה של סיבי שריר ואת תפקיד הדבקה שמונע סדקים במדגם בשל להקפאה מהירה. - בעזרת מלקחיים, למקם את רקמת השריר לתוך באמצע התחתון של בקבוקון קריוגני שכותרתו, רק בין החורים מפרצון, ואז בחוזקה מכסה את בקבוקון (איור 2B).
מקפיא 3. ומדגם שרירי אחסוןהים
- באמצעות 25 פינצטה ס"מ, במהירות להטביע את הבקבוקון קריוגני כולו בחנקן נוזלי ב הקל-קר טרום מקורר, מחכה עד חנקן נוזלי לא להרתיח (כ 10-20 s).
הערה: cryovial יצוף כאשר החנקן הנוזלי רותח, כך בזהירות לטבול את הבקבוקון של חנקן הנוזל רותח במשך 10-20 s. - העברת דגימות שריר למיכל האחסון בחנקן נוזלי או במקפיא -80 ° C לאחסון ארוך טווח.
4. שקופיות כנות
- Precool cryostat ל בין C ° -20 ו -22 מעלות צלזיוס.
- הסר וזורקים את הלהב microtome הישן, לנגב בעל סכין צלחת אנטי רול ב cryostat, להתקין להב microtome חדש ב cryostat, ולהגדיר את עובי חיתוך כדי 8 מיקרומטר.
- העברת דגימת שריר בבקבוקון קריוגני מהמיכל אחסון חנקן נוזלי או -80 ° C במקפיא עד cryostat, והובלתו בחנקן נוזלי או על קרח יבש. חכה 30 דקות עבור הדגימה לאזן עם הטמפרטורה של cryostat.
הערה: כל ציוד שעשויה לגעת הדגימה חייבת להיות טרום מקוררת, בגלל טמפרטורה גבוהה עלולה לגרום להיווצרות גבישי קרח הדגימה. - הר המדגם בעל דגימה תחת ניסוח טמפרטורת חיתוך האופטימלי של glycols מסיס במים שרפים (אוקטובר). חותכים סעיפים 8-מיקרומטר.
הערה: כוונן את זווית החיתוך בניצב לכיוון של סיבי השריר, משום CSAF הוא שטח החתך של סיבי שריר. - הר בסעיפים לכיוון המרכז של microslide טמפרטורה בחדר. מיד במקום להחליק לתוך קופסת שקופיות במקפיא -80 מעלות צלזיוס. אל תאפשרו את השקופית לייבש ב RT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור cryovial וציוד המעבדה המשותף מקפיא שרירים במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים מוצגים באיור 1. Cryovials עשויים פוליפרופילן במפעל עובש. לכל בקבוקון סך של 14 חורי מפרצון: אחד הוא על הכובע; עוד נמצא בתחתית; ואת הארבע השורות המקבילות 12 הטופס הנותר, כל אחד עם ארבעה חורים ב 90 מעלות זה לזה. חורי מפרצון אלה יכולים להאיץ את מהירות הזרימה של חנקן נוזלי ליד הרקמות כדי למנוע את האפקט "שמיכת אדי" כאשר מגעי חנקן נוזלי הרקמה. כתוצאה מכך, מעט מאוד גבישי קרח להיווצר דגימות קפואות. חשוב לציין, איזופנטאן, הנוזל נדיפים ודליקים מאוד עם נקודת רתיחה ב 28 מעלות צלזיוס, אין צורך בהליך זה.
כדי להדגיש אף יותר את היתרון של שיטה זו, הקפאנו את השריר הדורס longissimusבחזירים באמצעות חמש שיטות הקפאה ולאחר מכן ציין המאפיינים מכתים שלהם ופרטים היסטולוגית באמצעות כתם Hematoxylin / Eosin (HE) (איור 3). סוגיה בדרך נתקל הייתה היווצרות גבישי קרח במהלך תקופת ההכנה של השרירים עבור cryosection. כאשר המדגם הוצב ישירות (איור 3 א) -80 ° C במקפיא, גבישי קרח גדולים נוצרו ואז נגרמים השפעה ידועה "שויצרית גבינה" ב cryosection השריר. יתר על כן, גבישי קרח נוצר גם כאשר רקמת שריר היה שקוע ישירות בחנקן נוזלי (איור 3B). למרות חנקן נוזלי הוא נוזל קר מאוד (-190 ° C), קבוע החום שלה נמוך מאוד. כאשר כל מגעי דגימת החנקן הנוזלי, שמיכת אדי יכול לבנות ליד הרקמות לבודדות את חדירת הקור לתוך הרקמה. בנוסף, הליך שגרתי עבור מקפיא דגימות במעבדות פתולוגיה עדיין לא החלים ברקמת השריר. אs שמוצג באיור 3C, רבי גבישי קרח מחט דמוי נוצרו בתא ציטופלסמית של myofibers לאחר רקמת השריר הייתה טבלה הרכבה בינונית אוקטובר בכיוון הנכון ואז קפוא במהירות תערובת נוזלית של איזופנטאן (-160 ° C). לסיכום, שיעור ההקפאה המתאים רקמות שריר חייב להתקיים אך ורק במבצע.
הפרוטוקול הנוכחי משיג שלמות דגימה מצוינת, עם תא ציטופלסמית נראה בבירור ואת הפרד ההדוק של myofibers אל הרקמה שמסביב (האיור 3D). היא מאפשרת ויזואליזציה מעולה של תכונות מטבוליות של סיבי השריר באמצעות assay ATPase שרירן (איור 3E). עבור assay זה, פעילות ATPase שרירן נותחה מבוססת על העובדה כי סיבי שריר מהיר קבלנות (2A סוג יונקי 2B) hydrolyze ATP מהר יותר סיבי קבלנות איטית (סוג 1 יונקים). כאשר נתון equivaפעמים מושאלות, סיבי קבלנות מהר להופיע אור, עם שני תארים, וסיבי קבלנות איטית מופיעים שחורים. חשוב לציין, שיטה זו יכולה לשמש ביעילות בסביבת תפוקה גבוהה כי היא קלה לביצוע חוסך זמן (איור 4). כיום, שיטת הקפאה ומבוססת היא להטביע רקמות שריר תערובת נוזלית של איזופנטאן ללא קשר עם הרכבה בינונית אוקטובר, כפי שתואר לעיל 8, 9 (איור 3F). בהליך זה, זה לוקח 30 דקות בקירוב עבור מדינת תרחיף מוצק לנוזל של 240 מיליליטר של איזופנטאן להיות מושגת על ידי טרום קירור איזופנטאן בחנקן נוזלי בחישה עד משקעי לבנים קטנים מופיעים בחלק התחתון (איור 4). ישנם שלושה קשיים מעשיים נתקלו ידי חוקרים תוך ניסיון להקפיא רקמות שריר איזופנטאן טרום צונן: (1) מדינה תרחיף מוצק לנוזל של isopantane קשה לשמור כאשרדגימת הזמן היא יותר מ 1 h. בשנת ניסיונות העבר שלנו, חפצים מקפיאים בדרך כלל התרחשו הדגימות שנעשו בשלבים האמצעיים ומאוחרים של התהליך, כאשר עשרות רקמות שריר נאספו פעם. (2) כנוזל מסוכן, isopantane אסור לשום מקום בתחבורה ציבורית. (3) איזופנטאן אינו זמין למעט מעבדות. חוקרי מדעי בשר רבים בדרך כלל להקפיא רקמות שריר בבית מטבחיים כי הוא רחוק מעבדה וכי אסור להם איזופנטאן. בנוסף, ביופסיות שריר אבחון הם לעתים קרובות תת-אופטימלית מעובד בשל חוסר איזופנטאן במתקנים רפואיים. לפיכך, פרוטוקול שלנו היא התפתחות חשובה עבור מקפיא דגימות שריר במצבים שבהם איזופנטאן אינו זמין.
איור 1: המנגנון להקפאת שרירים. (א) האיוריםשל cryovial השתמשו במחקר זה. 14 חורי מפרצון הם אגרוף בקיר הצינור: אחד הוא על הכובע; עוד נמצא בתחתית; ואת הארבע השורות המקבילות 12 הטופס הנותר, כל אחד עם ארבעה חורים ב 90 מעלות זה לזה. (ב) תצלום של מנגנון ההקפאה. אמצעי בטוח ויעיל של הקפאת שרירי בחנקן נוזלי כרוך בשימוש סרט cryovial, פלסטיק, משקפי בטיחות, כפפות מקפיאות, 10 מלקחי סנטימטר, 25 פינצטה סנטימטר, צידנית קלקר, אזמל, ואת כיסוי מחייב A4 PVC. (ג) איורים של עובש cryovial שמספקת מהנדס, Yonghua וואנג, במפעל עובש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הכנת דוגמאות שרירים. (א (ב) רקמת השריר צריכה להיות ממוקמת בין חורי המפרצון בבקבוקון קריוגני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נציג תמונות של הערכה היסטולוגית של חזיר Longissimus Dorsi שרירים אחרי שהם קפואים באמצעות חמש שיטות שונות.
גבישי קרח להרוס את הקריאות של cryosections השרירים צלם עם HE מכתים כאשר השרירים מוקפאים לניתוח היסטולוגית בשיטות בלתי הולמות, כפי שמוצגים (AC). חפצי הקפאה ניכרים התרחשו כאשר דגימות שריר הונחו ישירות במקפיא 80 ° C (א) או טבולות בתוך נוזלחנקן (B). גבישי מחט דמוי קרח רבים נוצרו בתוך תאי שריר פרט לאחר רקמת השריר הייתה טבלה אוקטובר ולאחר מכן לשים ישירות לתוך תערובת נוזלית של איזופנטאן (C). הפרוטוקול המובא במחקר זה יכול לחסל את היווצרות גבישי קרח כאשר רקמת השריר שקועה פשוט בחנקן נוזלי (D). פרוטוקול זה הוא החלים על ניתוח של פעילות האנזים בשריר קפוא בהתבסס על תבחין ATPase שרירן (E). שיטת הקפאת תקן השריר אינו ביצועים טובים יותר; רקמת שריר היא טבולה תרחיף של איזופנטאן ללא מגע ישיר עם הרכבה בינונית אוקטובר (F). כל התמונות הן תחת מטרת 10X, למעט אלו עם קצוות שחורים (20X). ברי סולם: 100 מיקרומטר. ראש החץ באיור 3C מציין קטן, גבישי קרח דמוי מחט. ראש החץ וטקסט 3E האיור לציין את הסוג סיבי שריר: סוג 1 מייצג את סיבי שרשרת כבדה האיטי שרירן, type 2A אומר סיבי שרשרת כבדה ביניים שרירן, ולהקליד 2B מציין סיבי שרשרת כבדה שרירן מהר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: השוואת הדרכים שבעזרתן ניתן נוזלי חנקן מבוססים איזופנטאן מבוסס נהלים מקפיאים. בפרוטוקול החנקן מבוסס הנוזל, רקמת שריר cryovial החדש שקועה חנקן נוזלי. בפרוטוקול מבוסס איזופנטאן, מדינת תרחיף של איזופנטאן חייבת להיות מושגת מראש על ידי precooling איזופנטאן בחנקן נוזלי בחישה עד משקעים קטנים, לבנה יופיעו בתחתית. ואז, רקמת השריר הוא טבל איזופנטאן precooled. בהשוואת 35 דקות בהליך מבוסס איזופנטאן, כמתואר באיור 3F, זה לוקח רק 5 דקות t o להשלים את הליך ההקפאה שהוצג בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: זרימת חנקן נוזלת דרך נחיר חד. כאשר טבילת cryovial רב-חור כולו בחנקן נוזלי, חנקן נוזלי כוחות לחץ האטמוספרי לתוך הצינור דרך 14 חורי המפרצון. הנוכחות של החורים שהופכת את הזרימה להאיץ דרכם, ובכך להגדיל את המהירות. זרימת סירקולציה (בכחול) מפתחת מייד במורד זרם של הנקב (בכתום). D1 מציין את הקוטר פתח על הקיר של הצינור ו- D2 מייצג את המרחק בין הפתח לבין המדגם השריר (באדום).= "_ Blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים cryovial החדש, רב-חור להקפאה ואחסון רקמות השריר לבצע הערכות היסטולוגית של תפקוד השרירים. הצעד שונה קריטי פרוטוקול זה הוא כי המדגם של cryovial רב-חור שקוע ישירות בחנקן נוזלי. למיטב ידיעתנו, זוהי הדרך הפשוטה rapidest להשיג דגימות קפואות מצוינות cryosectioning השריר בין שיטות הקפאה הקיימות (ראה את תוצאות הנציג).
האתגר הטכני בפני חוקרים שרירים הוא כי גבישי קרח הם סיכוי טובים ביותר להרכיב בעת השימוש מקפיא כאמצעי להקשיח רקמת שריר עבור חתך. כפי שצוינו תוצאות הנציג, שלושה גורמים ממלאים תפקידים משמעותיים בקביעת הקפאה שרירה נכונה עבור מחקרים פתולוגיים, כולל בחירת מקור קר מתאים, מזעור הלחות של הדגימה, והגדלת שיעור השטח הכולל במגע עם המקור הקר. ראשון,שיעור ההקפאה הוא קריטי כדי למנוע ניזק במהלך תקופת ההכנה של הרקמה קפואה עבור חתך. כאשר ההקפאה איטית, שרירים מוקפאים להראות את האפקט הידוע "שויצרית גבינה" בגלל גבישי קרח גדולים נוצרים extracellularly. כאשר ההקפאה מהירה אך לא מהירה מספיק, מספר גדול של קטנים, גבישי קרח דמוי מחט נוצר בתוך תאי שריר פרט. גבישי קרח מחט דמוי אלה לגרום קצת ניזק מבנים לזיהוי, אבל הם מביאים את ההשפעות הבאות: המיטוכונדריה ניזוקו 10, הגודל של סיבי השריר גדל באופן מלאכותי 11, ואת היושרה של מבנים סיביים מושמדת 11. לפיכך, מקור קר בטמפרטורה קרה מספיק מהירות מקפיאה מספיק חיוניים כדי למנוע ההיווצרות של גבישי קרח cryosections השריר.
באופן אידיאלי, המקור הקר הוא בטמפרטורות קרות מאוד מסודר to קשר כל המשטחים. החנקן הנוזלי שניהם (-190 ° C) איזופנטאן במצב מעורב מוצק לנוזל (-160 ° C) למלא תנאי זה. עם זאת, שתי בתקשורת ההקפאה יש חסרונות משלהם. חנקן נוזלי בעל מתמיד חום סגולי נמוך ביותר. התוצאה היא כי הקשר בין חנקן נוזלי הרקמה גורם מחסום אדים שמצטבר ליד הרקמות מאוד מאט את החדירה של קור לתוך הרקמה 12. לפיכך, חפצי הקפאה משמעותיים להתרחש בתוך השריר הקפוא. מדינת התרחיף של איזופנטאן היא מדיום הקפאה אידיאלי שאינו ליצור מחסומים אדי, אבל הבעיה העיקרית היא כי איזופנטאן חייב לשמש בשילוב עם חנקן נוזלי כדי להשיג טמפרטורת אמבטיה נוזלית של 160 מעלות צלזיוס. בנוסף, איזופנטאן הוא נוזל נדיף דליק מאוד בטמפרטורת החדר. שנית, השריר מכיל מים מופרזים (> 75%), ולכן כל דרך להציג לחות אקסוגניים לתוך הדגימה יגרום הקפאת חפצים. לדוגמא, הרכבה בינונית OCT מוסיף מים נוספים לשריר, כך גבישי קרח הם הרבה יותר בולט cryosections השרירים אלה לעומת אלה ללא הרכבה בינונית OCT. לבסוף, את עובי רקמת שריר חשוב גם להקפיא אותו כראוי כי שיעור מקפיא בחלקו תלוי באחוז השטח הכולל במגע עם מקור קר (בדרך כלל, עובי <0.5 ס"מ). לפיכך, הדרך היחידה הקיימת להקפיא רקמת כראוי היא להציף רקמות שריר עם עובי של פחות מ 0.5 ס"מ לתוך איזופנטאן טרום מקורר (160 מעלות צלזיוס), כפי שתואר לעיל 8.
פרוטוקול זה ראשון מתאר כיצד להקפיא שרירים ורקמות כראוי על ידי שיקוע שלהם ישירות בחנקן נוזלי. הבעיה בשימוש בחנקן נוזלי לבד היא ההיווצרות של גז חנקן מעל פני שטח הרקמות, מתנהג כמו כמבודד ועיכוב הקירור של הרקמותf "> 13. כזה שמיכה אדי יכול להיוצר רק כאשר המיזוג של בועות הוא כל כך מהיר כי גז החנקן יכול להפריד את הרקמה מן החנקן הנוזלי. על פי דינמיקת בועה, זרימת נוזל מהר תגרום בועות קטנות יותר, כמו זה יש פחות סיכויים למזג 14. לכן, נקבנו 14 חורים בקיר של cryovial להגדיל את המהירות של זרימת נוזל סביב הרקמה וכדי למנוע את האפקט "שמיכת אדי" כאשר מגעי חנקן נוזלי הרקמה.
בהתחשב בכך הגורם אחד שקובע הצלחה ניסיון הוא המהירות של זרימת נוזל סביב הרקמה, שלושה פרמטרים של cryovial חשובים מאוד, כוללים העמדה ומספר החורים, הקוטר של חורי המפרצון, והמרחק בין הפתח לבין המדגם. דינמיקה נוזלית מראה כי קצב הזרימה דרך נחיר נקבע לפי הקוטר של החורים וכי תזרים סירקולציה מפתח מייד למטהזרם של הנקב (איור 5) 15, 16. במקביל, המרחק בין פתח לבין מדגם בעיקר קובע את שטח המגע בין זרימת נוזל במהירות גבוהה המדגם, כפי שמוצג באיור 5. כתוצאה מכך, cryovial רב-חור איור 1A מתאים מדגם שריר כי הוא 0.6 ס"מ x 0.6 ס"מ x גבוה ארוך 1.5 ס"מ. עבור שברי שרירים גדולים יותר, כדאי לנסות שיטה זו עם צינור גדול וחורה יותר. עם זאת, פרוטוקול זה אינו מתאים מקפיא דגימות שריר מחיות קטנות, כגון במודל בעכברים, כי חורי המפרצון עלולים להיות גדולים מדי עבור מדגמים קטנים.
בנוסף, שלושה שלבים קריטיים שיש אחריו בקפדנות בפרוטוקול. ראשית, החנקן הנוזלי צריך להיות מספיק כדי לטבול את כולו cryovial, ואת הבקבוקון קריוגני חייב להיות לגמרי מתחת לרמה הנוזלית. שנית, יש צורך לקשר מקרה חלל בין שרירים מוקפאים ומיכלים-בטמפרטורת חדר או מכשירים. לדוגמה, בלי תחבורה זהיר, גבישי קרח חדש עשוי להיווצר בעת העברת דגימת קפוא מן מיכל אחסון חנקן נוזלי או -80 ° C במקפיא כדי cryostat. שלישית, לא צריך להיות יותר מדי OCT משמש כאשר הדגימות הם רכובים על הבעל בשל הסבירות הגבוהה של היווצרות קרח קריסטל מסביב לאזור המגע בין שרירים מוקפאים ואוקטובר.
בתעשיית הבשר, הליך cryosection שריר הוא הכרחי בגלל התהליך של הטבעת קיבעון פרפין פורמלין גורם הצטמקות בסיבי שריר, אשר פוגע בהערכה כמה תכונות שרירים, כגון TNF ו CSAF. בנוסף, שריר קפוא נדרש בעת הערכת FTC באמצעות assay ATPase השרירן. כפי שניתן לראות בתרשים 3E, פרוטוקול זה יכול לענות על הדרישות של שניהם ניתוח פתולוגי וכתמי histochemical בשרירים. ההכנהשל cryosection היא פעילות שיגרתית מעבדות פתולוגיה שרירים קליניות. כפי שתואר על ידי מנג ואח. 8, נוהל הפעלה סטנדרטי עבור מקפיא רקמות שרירות הוא להציף דגימות נתיחה ב איזופנטאן טרום מקורר. עם זאת, איזופנטאן אינו זמין להקפיא דגימות נתיחה במוסדות ללא מעבדות פתולוגיה שרירים קליניות. כתוצאה מכך, ביופסיות שריר אבחון קרובות מעובדים תת-אופטימלית על מתקנים רפואיים רבים. לפיכך, הפרוטוקול שלנו יכול לשפר בצורה משמעותית ביכולתו עבור בתי חולים קטנים או מעבדות לבצע ביופסיות שריר אבחון של איכות נאותה. בהתחשב יעילות הגבוהה ותפעול פשוט של פרוטוקול זה, זה יכול להיות חלופה מבטיחה שיטת ההקפאה הנוכחית מבוסס איזופנטאן ויכול להיות מיושם באופן נרחב מחקרים היסטולוגית בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים, כספי או אחר, הם הכריזו על ידי המחברים.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (NSFC): 31,301,950 ו 31,671,288.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10 cm forceps | Commomly-used | ||
| 25 cm tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
