Summary
このプロトコルは、液体窒素に直接それらを沈めることにより、筋肉組織を凍結する手順を説明します。このプロトコルはまた、試料の窒素ガス際に液体窒素に接触組織表面の「ブランケット効果」を回避することができ、新たなクライオバイアルを強調しています。
Abstract
骨格筋生理学の研究は、適切にはっきりと見える細胞質コンパートメントでセクションを取得するために検体を処理する技術的な課題に直面しています。もう一つのハードルは、周囲の組織への筋線維のタイト同格です。組織固定し、パラフィン包埋のプロセスは、筋線維の収縮につながるので、凍結は切片のための筋肉組織を硬化させるのに最適な手段です。しかし、一般的に遭遇する問題、氷の結晶の形成は、理由は筋肉の高含水率の凍結切片の調製の間に発生します。ここで紹介するプロトコルは、最初に適切に液体窒素中でそれらを浸漬することにより、筋肉組織を凍結するための簡単で効率的な方法を説明します。単独で、液体窒素を使用しての問題は、次絶縁体として作用し、組織の冷却を阻害する、組織、窒素ガス障壁の形成を引き起こすことがあります。この「蒸気毛布」効果、NEを回避するために、Wクライオバイアルは、組織表面付近の液体の流れの速度を増大させるように設計しました。これは、バイアルの壁14個の入口穴の総数をパンチングすることによって達成されました。気泡力学によれば、より小さな気泡より少ないチャンスで液体流結果のより高い速度は、ガス障壁を形成します。液体窒素は、入口孔からクリオバイアルに流入すると、組織の周りの流速は、ガス障壁を排除するのに十分に高速です。予め冷却したイソペンタンを用いて、筋肉組織の凍結方法に比べて、このプロトコルは単純で、より効率的であり、スループット様式で筋肉を凍結するために使用することができます。さらに、この方法は、室温で非常に可燃性であるイソペンタン、へのアクセスを持っていない機関に最適です。
Introduction
骨格筋は、ビューの栄養と処理ポイントから肉を生産する動物の最も貴重なコンポーネントです。筋肉の成長の効率、そして得られた肉の品質：食肉業界では、二つの特に重要な側面があります。筋肉の主成分としては、筋線維は、成長のパフォーマンスと動物1新鮮な肉質に直接関連しています。例えば、繊維の合計数（TNF）及び繊維の断面積（CSAF）は主に筋肉量と肉の品質を決定します。また、ファイバ型の組成物（FTC）が強く、新鮮な肉質2に影響を与えます。したがって、動物における筋線維特性の操作は、農場1のコア収益性と競争力を高めるために非常に有効な方法です。
現在までに、いくつかの内因性および外因性の要因が筋線維を操作することが確認されているcharacteristICS 1。この操作は、牛3におけるミオスタチン遺伝子 、ヒツジ4 Callipyge遺伝子 、およびブタ5 RYR1及びIGF2遺伝子として、特定の遺伝子を有する動物の標的選択によって達成することができます。また、特定のホルモンとダイエットの制御および治療は、筋線維特性6において重要な役割を果たしています。このように、遺伝的および栄養要因を組み合わせたアプローチは、赤身の肉の量と肉の品質を向上させることができるかもしれません。筋線維の構造の解明は依然として難題であるしかし、筋線維の研究では、食肉産業に限定されています。
筋肉繊維特性は、ミオシンアデノシントリホスファターゼ（ATPアーゼ）アッセイなどの組織化学的方法を用いて同定されます。この方法は、酵素が薄い（6-8ミクロン）の凍結切片に位置しているという事実に依存しています筋線維は、化学的に特定の製品と反応させることができます。しかし、筋肉の水分含有量にかかわらず位置（ すなわち、バック、腹部、または後肢）7の、ブタ、ウサギ、マウス、およびヒトにおいて75％以上です。以前に8,9を説明するように、凍結切片の調製中-成果物を凍結-筋肉のような高水分含有量は一般的に遭遇する問題の原因となります。ほとんどの場合、適切に我々の経験によると、食肉処理場の生産ラインで筋肉組織を凍結することはほとんど不可能です。
ここで紹介するプロトコルは、ハイスループットな方法で凍結切片のための筋肉組織を凍結する私たちの研究室で使用されるシンプルかつ効率的な方法を説明します。この方法のハイライトは、液体窒素中でフラッシュ凍結筋肉組織のために設計された新しいクライオバイアルです。現在のワークフローは、同時に組織を容易にすることができますはっきりと見え、細胞質コンパートメントおよび周囲組織への筋線維の緊密な並置と、優れた筋肉凍結切片のために凍結して処理。液体窒素は、組織と混合しないので、また、このプロトコルは、組織分析のためのオプションの広い配列に適用することができます。
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Protocol
現在の方法が確立され、私たちの研究室で組織染色のために1,000人以上の筋肉サンプルを収穫し、保存することが確認されています。動物のケアと使用を含むすべての手順は、中国の農業省によって確立されたガイドラインに従いました。
サンプル採取のために1.機器
- 各極低温バイアル上のサンプルのアイデンティティにラベルを付けます。
注：極低温バイアルを特別に凍結切片手順（ 図1A）のために、新鮮な組織サンプルを凍結するように設計されています。バイアルを金型工場（ 図1C）にポリプロピレンで作られています。 - 適切な液体窒素タンク内の液体窒素、安全眼鏡、またはフェイスシールド、冷凍手袋、10cmの鉗子25センチピンセット、発泡スチロールのクーラー（内寸：20センチ×12センチ幅X 13.5センチメートル高い次の装置を得ます;外形寸法：幅×15センチメートル上位24センチ×16センチ）、プラスチックフィルム（幅×厚さ0.1mm長さ2.5cm×0.8 cm）で、メス、及びA4 PVC結合カバー（21センチメートル29.5センチX）（ 図1B）。
筋肉試料の調製
- 先にサンプル収集の液体窒素を5分で発泡スチロールのクーラーを記入してください。
注：液体窒素の一部が離れて沸騰し、新鮮なサンプルがそれに触れるとガスに変わるので、液体窒素の大きな柱が不可欠です。損失を補充する液体窒素の移送の頻度を低減するために、適切なサイズの発泡スチロールのクーラーは、サンプルの数に応じて予め取得されなければなりません。 - 試料が得られたら、優しくA4 PVC結合カバーの上に置きますし、筋線維の方向を観察します。
注：ここでは、豚の最後の腰椎に最初から最長ドリス筋の断面を使用しました。標本は約12センチ、長さは8センチ幅、5センチの高さです。 - 試料Iを介して2つの平行切開を作るためにメスを使用N筋繊維の方向、長さが約3cmと0.6センチメートル離れ。約0.6センチ幅×0.6センチメートル1.5×高cmの長さの長方形に切開筋肉をトリム。
注：筋線維の断面積を測定の信頼性は、主に切開筋肉の繊維配向に依存します。 - 穏やか膜（ 図2A）の長辺に切開筋平行の長手方向軸と、プラスチックフィルムの一片上に試料を置くために10cmの鉗子を使用しています。
注：筋線維の配向性と急速な凍結試料中のクラックを防止する接着機能を固定するのに役立つ保持機能：プラスチックフィルムは2つの機能を有しています。 - 鉗子を使用して、ちょうど入口穴との間、標識された極低温バイアルの下部中央に筋肉組織を配置し、その後しっかりバイアル（ 図2B）をキャップ。
3.筋肉サンプルを凍結して保存しますS
- 25センチメートルピンセットを使用して、迅速に液体窒素（約10~20秒）沸騰しなくなるまで待って、予め冷却した発泡スチロールのクーラーに液体窒素中で全体極低温バイアルを水没。
注：凍結バイアルを液体窒素が沸騰しているとき、慎重に10〜20秒間、沸騰液体窒素中でバイアルを浸すフロートします。 - 液体窒素貯蔵タンクや長期保存のために-80℃の冷凍庫に筋肉のサンプルを転送します。
4.スライドの調製
- -20℃と-22℃の間にクライオスタットを予冷。
- 取り外し、古いミクロトーム刃を破棄し、クライオスタットでナイフホルダーとアンチロールプレートを拭う、クライオスタットの新しいミクロトーム刃をインストールして、8ミクロンに切断厚さを設定します。
- 液体窒素貯蔵タンクから極低温バイアル中に筋肉のサンプルを転送するか、-80℃の冷凍庫°クライオスタットに、液体窒素中またはドライアイスの上にそれを運びます。 試料はクライオスタットの温度と平衡に30分待ちます。
注：高い温度は、試料中の氷結晶の形成を引き起こす可能性があるため、標本に触れる可能性のある機器は、事前に冷却しなければなりません。 - 水溶性グリコール及び樹脂（OCT）の最適切断温度製剤下試料ホルダーに試料をマウントします。 8-μmのセクションをカット。
注：CSAFは、筋線維の断面積であるため、筋線維の配向に垂直に切断角度を調整します。 - 室温マイクロスライドの中心に向かってセクションをマウントします。すぐに-80℃の冷凍庫でスライドボックスにスライドを置きます。スライドを室温で乾燥させないでください。
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Representative Results
クライオバイアル例示および凍結切片の調製の間に筋肉を凍結するための一般的な実験装置は、 図1に示されています。クライオバイアルは、金型工場にポリプロピレンから作られます。各バイアルは、14の入口孔の合計を持っている：一つはキャップ上にあります。別のは一番下にあります。残りの12形成する4本の平行線、互いに90°の4つの穴とそれぞれ。これらの入口穴は、場合「蒸気ブランケット」効果液体窒素に接触組織を回避するために、次の組織に液体窒素の流速を速めることができます。その結果、非常に少数の氷の結晶が凍結サンプルで形成します。重要なことには、イソペンタン、28°Cでの沸点を有する極めて揮発性及び可燃性の液体が、この手順で必要ではありません。
さらに、この方法の利点を強調するために、我々は最長dorsi筋を凍結しましたブタで5つの凍結方法を用いて、次いでその染色特性、ヘマトキシリン/エオシン（HE）染色（ 図3）を用いて組織学的細部を観察しました。一般的に遭遇する問題は、凍結切片のための筋肉の準備中に氷の結晶の形成しました。サンプルを-80℃のフリーザー（ 図3A）内に直接配置されたとき、大きな氷結晶が形成され、次いで筋肉凍結切片ではよく知られている「スイスチーズ」効果を引き起こしました。筋肉組織は、液体窒素（ 図3B）に直接浸漬したときさらに、氷晶も形成されています。液体窒素は、非常に冷たい液体（-190゜C）であっても、その熱定数が極めて低いです。場合、任意の検体に接触する液体窒素、蒸気ブランケットは、次の組織に蓄積し、組織内への冷の浸透を絶縁することができます。さらに、病理検査室で標本を凍結するためのルーチンの手順は、まだ筋肉組織には適用されません。 A図3Cに示すS、筋肉組織が適切な方向におけるOCT封入剤に浸漬した後、急速にイソペンタンのスラリー中で凍結させた後に筋線維の細胞質コンパートメントに形成された多数の針状氷結晶（-160℃）。結論として、筋肉組織のための適切な凍結率は、厳密には、操作に満たされなければなりません。
現在のプロトコルは、明らかに目に見える細胞質コンパートメントおよび周囲の組織（ 図3D）に筋線維の緊密な並置と、優れた検体の完全性を達成します。これは、ミオシンATPアーゼアッセイ（ 図3E）を使用して筋線維の代謝特性の優れた視覚化を可能にします。このアッセイのために、ミオシンATPアーゼ活性は、高速収縮筋線維（哺乳類タイプ2Aおよび2B）は速い遅い収縮繊維（哺乳類タイプ1）よりもATPを加水分解するという事実に基づいて分析しました。 equivaを与えられたとき貸与回、高速収縮繊維は、2度と、光が現れ、低速収縮繊維は黒く見えます。実行が容易であり、時間（ 図4）を保存するので重要なことに、この方法は、高スループット環境で効率的に使用することができます。先に図8、 図9（ 図3F）に記載されているように、今日、十分に確立された凍結方法は、10月マウンティング媒体と接触することなく、イソペンタンのスラリーに筋肉組織を浸すことです。この手順では、液体窒素中でイソペンタンを予冷し、小さな白い沈殿物が底（図4）に表示されるまで撹拌することによって達成されるイソペンタンの240ミリリットルの固体-液体スラリー状態のために約30分を要します。予備冷却したイソペンタンで筋肉組織を凍結しようとしたときに、研究者が直面する3つの実用的な困難があります：（1）isopantaneの固体 - 液体スラリー状態は時に維持することは困難ですサンプリング時間は1時間以上です。過去の試みでは、凍結アーティファクトは、通常、筋肉組織の数十を一度に収集した際に、プロセスの中期および後期の段階で行ったサンプルで発生しました。 （2）危険な液体として、公共交通機関のどこにでもisopantane許可されていません。 （3）イソペンタンは、研究室以外では使用できません。多くの食肉科学の研究者は、通常、遠くの研究室からで、それはイソペンタンを持つことが許されていない食肉処理場で筋肉組織を凍結します。また、診断筋肉生検はしばしばサブ最適に起因する医療施設でのイソペンタンの欠如に加工されています。したがって、我々のプロトコルは、イソペンタンが利用できない状況で筋肉標本を凍結するための重要な開発です。
図1：筋凍結するための装置。 （A）イラスト本研究で用いたクライオバイアルの。 14の導入孔は、チューブ壁に打ち抜かれている：一つはキャップ上にあります。別のは一番下にあります。残りの12形成する4本の平行線、互いに90°の4つの穴とそれぞれ。 （B）冷凍装置の写真。液体窒素中で筋肉を凍結の安全かつ効率的な手段クリオバイアル、プラスチックフィルム、安全メガネ、冷凍庫手袋、10cmの鉗子25センチピンセット、発泡スチロールの冷却器、メス、及びA4 PVC結合カバーの使用を含みます。 （C）金型工場でエンジニア、ヨンフア・ワングによって提供クライオバイアル型のイラスト。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：筋肉試料の調製。 （A （B）筋肉組織は、低温バイアル中に導入孔との間に配置されるべきです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：彼らは、5つの異なる方法を用いて凍結された後の豚最長Dorsi筋肉の組織学的評価の代表的な画像。
氷の結晶は、彼が（AC）に示すように筋肉が、不適切な方法を使用して組織学的分析のために凍結されたときに染色して画像化され、筋肉の凍結切片の可読性を破壊します。筋肉サンプルを直接80℃のフリーザー（A）中に入れ、または液体中に浸漬したときに、かなりの凍結アーチファクトが発生しました窒素（B）。筋肉組織は、10月中に浸漬した後、直接イソペンタン（C）のスラリーに投入した後、個々の筋細胞内に形成された多数の針状氷結晶。筋肉組織は、単に液体窒素（D）中に浸漬されたときに、この研究で提示されたプロトコルは、氷結晶の形成を排除することができます。このプロトコルは、ミオシンATPアーゼアッセイ（E）に基づいて、凍結筋における酵素活性の分析にも適用可能です。筋肉のための標準的な凍結方法は、より良い実行しません。筋肉組織をOCTマウンティング培地（F）に直接接触することなく、イソペンタンのスラリーに浸漬されます。全ての画像は、黒の縁（20X）を有するものを除いて、10倍の対物レンズ下にあります。スケールバー：100μmです。図3Cの矢印は、小型、針状の氷の結晶を示しています。図3Eに矢印およびテキストが筋線維のタイプを示す：タイプ1が遅いミオシン重鎖線維を表し、TYPE 2Aは、中間ミオシン重鎖の繊維を意味し、そして（b）を入力し、高速ミオシン重鎖の繊維を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：液体窒素ベースおよびイソペンタン系凍結手順のワークフローの比較。液体窒素ベースのプロトコルでは、新たなクライオバイアル中に筋肉組織を液体窒素中に浸漬されます。イソペンタンベースのプロトコルでは、イソペンタンのスラリーの状態は液体窒素中でイソペンタンを予冷し、小さな、白い析出物が下部に表示されるまで撹拌することにより、事前に達成されなければなりません。その後、筋肉組織は、予冷したイソペンタンに浸漬されます。図3Fに記載されているようにイソペンタンベースの手順で35分と比較し、それはわずか5分のtをとり Oこのプロトコルで提示凍結手続きを完了します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：鋭利なオリフィスを通る液体窒素の流れ。液体窒素中で全マルチホールクリオバイアルを浸漬し、大気圧力液体窒素チューブに14の入口スルーホール。孔の存在は、このように速度を増加させる、流れがそれらを介して加速させます。 （青）再循環流は、（橙色）オリフィスのすぐ下流に発達します。 D1は、管の壁にオリフィスの直径を示し、D2は、オリフィスと（赤で）筋肉試料との間の距離を表します。=「_空白」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、筋機能の組織学的評価を行うために筋肉組織を凍結保存するための新しい、マルチホールクライオバイアルを記述する。このプロトコルにおいて重要な変性ステップは、マルチホールクリオバイアルに試料を直接液体窒素中に浸漬することです。我々の知る限り、これは既存の凍結方法のうち、筋肉凍結切片のための優れた凍結サンプル（代表的な結果を参照）を取得する最も簡単かつrapidest方法です。
筋肉の研究者が直面する技術的課題は、氷の結晶が区画する筋肉組織を強化する手段として凍結使用しているとき形成する可能性が最も高いということです。代表的な結果で述べたように、3つの要因が、適切な冷却源を選択する試料の水分を最小限に抑え、かつ冷熱源と接触して全表面のパーセンテージを増加させるなどの病理学的研究のための適切な筋肉の凍結を決定する際に重要な役割を果たしています。最初、凍結の割合は、区画する凍結組織の準備中に損傷を避けるために重要です。凍結が遅い場合には、大きな氷の結晶が細胞外に形成されているので、凍結された筋肉は、よく知られた「スイスチーズ」効果を示します。凍結が十分に速い急速ではない場合は、小型、針状の氷の結晶の多数は、個々の筋肉細胞内に形成されています。これらの針状の氷の結晶が少し検出可能な構造的損傷の原因となり、彼らは次のような効果をもたらす：ミトコンドリアは10破損している、筋線維の大きさは、人為的に11に増加しており、繊維状構造の整合性は、11を破壊しています。したがって、十分に低温で冷源及び十分な凍結速度は、筋肉凍結切片における氷結晶の形成を避けるために不可欠です。
理想的には、低温源は、非常に冷たい温度であり、t配置されていますOすべての表面にお問い合わせください。液体窒素（-190℃）と固液混合状態でイソペンタン（-160℃）、この条件を満たすの両方。しかし、2つの凍結メディアは、自分の欠点を持っています。液体窒素は極めて低い比熱定数を有します。結果は、液体窒素と組織との間の接触は、次の組織へと大幅に構築組織12内へ冷の浸透を遅らせる蒸気バリアを引き起こすことです。このように、重要な凍結アーチファクトが凍結された筋肉の内部で発生します。イソペンタンのスラリー状態が蒸気バリアを形成しない理想的な凍結メディウムであるが、主な問題は、イソペンタンが160℃の液体浴温度を達成するために、液体窒素と一緒に使用しなければならないことです。また、イソペンタンは、室温で非常に揮発性で可燃性の液体です。第二に、筋肉が過度の水（> 75％）が含まれているため、試料への外来水分を導入する方法成果物を凍結引き起こします。氷の結晶が10月マウンティング媒体なしのものに比べてはるかに顕著これらの筋肉の凍結切片であるので、例えば、10月マウンティング培地は、筋肉に余分な水を追加します。最後に、筋肉組織の厚さは、凍結の速度は、部分的に冷熱源（通常、厚さ<0.5センチ）と接触する全表面の割合に依存するため、適切に凍結することも重要です。従って、適切に組織を凍結するための唯一の既存の方法は、以前8に記載されているように予め冷却したイソペンタン（160゜C）に0.5cm未満、厚さの筋肉組織を浸漬することです。
このプロトコルは、最初に適切に液体窒素中で直接それらを浸漬することにより、筋肉組織を凍結する方法を説明します。単独で、液体窒素を使用しての問題点は、絶縁体として作用し、組織表面上に窒素ガスの形成であり、組織の冷却を阻害しますF "> 13。このような蒸気ブランケットは、気泡の合体が窒素ガスを液体窒素から組織を分離することができるように急速である場合にのみ形成することができる。気泡力学によれば、迅速に液体の流れは、それように、より小さな気泡になり14をマージする少ないチャンスを持っている。したがって、我々は組織の周りの液体の流れの速度を上げるためにと「蒸気毛布」効果を避けるために低温バイアルの壁に14個の穴を打ち抜いたときに、液体窒素の連絡組織。
実験の成功を決定する一つの要因は、組織の周りに液体流の速度であることを考慮すると、クライオバイアルの3つのパラメータは、位置及び穴の数、入口穴の直径、及びオリフィスとの間の距離を含む、非常に重要です標本、見本。液体ダイナミクスは、オリフィスを通る流量は、孔の直径によって決定されることを示し、再循環流は、すぐ下に発達することをオリフィスの流れ（ 図5）15、16。 図5に示すように対応して、開口部と試料との間の距離はほとんど、高速流体流とサンプルとの間の接触面積を決定します。従って、 図1Aのマルチホールクリオバイアルを1.5 cmの長さX幅×0.6センチメートル高い0.6センチメートルある筋肉試料に適しています。大きな筋肉の断片のために、より大きなチューブと複数の穴と、この方法を試してみる価値あり。しかしながら、このプロトコルは、入口孔が小さいサンプルには大きすぎるかもしれないので、そのようなマウスモデルのように、小さな動物からの筋肉試料を凍結するには適していません。
また、3つの重要なステップは、厳密には、プロトコルに従わなければなりません。まず、液体窒素全体クライオバイアルを浸漬するのに十分であるべきであり、極低温バイアルを完全に液体レベルより下でなければなりません。第二に、それはする必要があります凍結された筋肉や室温の容器や機器間の偶発的な接触を失います。たとえば、慎重に輸送することなく、新しい氷の結晶が液体窒素貯蔵タンクから凍結サンプルを転送するときに形成するか、または-80クライオスタットへの℃の冷凍庫かもしれません。第三に、あまりにも多くの10月があってはならない標本は、凍結筋肉と10月の間の接触面積の周りに氷の結晶形成の可能性が高いのためにホルダーに装着されているときに使用されます。
ホルマリン固定パラフィン包埋のプロセスは、このようなTNFやCSAFなど、いくつかの筋形質の評価を損なう筋線維の収縮を引き起こすため、食肉業界では、筋肉の凍結切片手順が不可欠です。また、凍結された筋肉は、ミオシンATPアーゼアッセイを使用して、FTCを評価する際に必要とされます。 図3Eに示すように、このプロトコルは、筋肉の病理学的分析および組織化学染色の両方の要件を満たすことができます。準備凍結切片の臨床筋肉の病理学研究所では日常の動作です。蒙らによって記載されているように。 図8は 、筋肉組織を凍結するための標準的な操作手順は、予め冷却イソペンタン中で剖検標本を浸漬することです。しかし、イソペンタンは、臨床筋肉の病理検査室なし機関の剖検標本を凍結する使用できません。その結果、診断筋肉生検はしばしば次善多くの医療施設で処理されます。したがって、我々のプロトコルは、実質的に適切な品質の診断筋肉生検を実行するための小さな病院や研究室のための能力を向上させることができます。高効率で、このプロトコルの簡単な操作を考慮すると、現在のイソペンタンベースの凍結方法に有望な代替物である可能性があり、将来的に組織学的研究に広く適用することができます。
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Disclosures
利害の衝突は、金融またはそれ以外の場合は、著者によって宣言されていません。
Acknowledgments
31301950と31671288：このプロジェクトは、中国の国家自然科学基金（NSFC）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10 cm forceps | Commomly-used | ||
| 25 cm tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
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