Summary
이 프로토콜은 액체 질소에 직접 급락으로 근육 조직을 동결하는 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 질소 가스의 "블랭킷 효과"를 방지 할 수있는 새로운 cryovial를 강조 할 때, 액체 질소 연락처 검체의 조직 표면.
Abstract
골격 근육의 생리에 대한 연구는 적절하게 명확하게 볼 세포질 구획으로 섹션을 얻기 위해 표본을 처리하는 기술적 과제에 직면 해있다. 또 다른 장애물은 주위 조직에 근섬유의 꽉 동격이다. 조직 고정 및 파라핀 매립 처리는 근섬유의 수축을 초래하기 때문에, 동결 절편을 위해 근육 조직 강화의 최적의 방법이다. 그러나, 일반적으로 발생하는 문제, 얼음 결정의 형성은, 때문에 근육의 높은 수분 함량의 동결 절편의 준비 기간 동안 발생합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 제 적절히 액체 질소에 침지하여 그 근육 조직을 동결하는 간단하고 효율적인 방법을 설명한다. 단독으로 액체 질소를 사용의 문제점은 다음 절연체로서 작용하고 조직의 냉각을 저해 조직에 질소 가스 배리어의 형성을 유발한다는 것이다. 하는 네브라스카이 "증기 담요 '효과를 방지하려면w cryovial은 조직 표면 주위의 액체 흐름 속도를 증가하기 위해 설계되었다. 이것은 병의 벽 (14 개)에 유입 구멍의 총 펀칭에 의해 달성 하였다. 버블 역학에 따르면, 작은 거품 적은 가능성의 액체 흐름의 결과의 높은 속도는 가스 배리어를 형성한다. 액체 질소가 유입 관통 구멍 cryovial로 유입되면, 조직 주변의 유속 가스 배리어를 제거하기에 충분히 빠르다. 미리 냉각 펜탄을 이용하여 근육 조직을 동결하는 방법에 비해,이 프로토콜은보다 간단하고 효율적이며 처리량하게 근육을 고정하기 위해 사용될 수있다. 또한,이 방법은 실온에서 가연성이 매우 이소 펜탄에 액세스 할 수없는 기관에 최적입니다.
Introduction
골격 근육은보기의 영양 및 처리 지점에서 고기를 생산하는 동물의 가장 중요한 구성 요소입니다. 근육 성장의 효율성과 결과 고기의 품질 : 육류 산업에서,이 개 특히 중요한 측면이있다. 근육의 주성분으로, 근육 섬유 성장 성능과 동물 1 신선한 고기의 품질에 직접적으로 관련이 있습니다. 예를 들어, 섬유의 총 수 (TNF)와 섬유의 단면적 (CSAF)은 주로 근육 질량과 고기의 품질을 결정; 또한, 섬유 유형 구성 (FTC)가 강하게 신선한 고기의 품질이 영향을 미칩니다. 따라서, 동물의 근육 섬유 특성의 조작은 코어 수익성 농장 1의 경쟁력을 높이기 위해 매우 효과적인 방법이다.
지금까지 여러 가지 고유 및 외부 요인은 근육 섬유 characterist를 조작 확인 된ICS 1. 이 조작은 돼지 5 소 3 미오 스타틴 유전자 양 4의 Callipyge 유전자 및 RYR1 IGF2 유전자와 같은 특정 유전자와 동물의 대상 선택을 통해 달성 될 수있다. 또한, 다이어트 제어 및 특정 호르몬 치료는 근육 섬유의 특성 (6)에 중요한 역할을한다. 따라서, 유전 및 영양 요소를 결합하는 방법은 살코기의 내용과 고기의 품질을 향상시킬 수 있습니다. 근육 섬유의 구조의 해명은 여전히 도전이기 때문에, 근육 섬유에 대한 연구는 육류 산업에 제한됩니다.
근섬유 특성 등 미오신 triphosphatase 아데노신 (ATP 아제) 조직 화학 분석과 같은 방법을 사용하여 식별된다. 이 방법의 냉동 (6-8 μm의) 얇은 섹션에있는 효소는 사실에 의존근육 섬유는 화학적으로 특정 제품에 반응 할 수있다. 단, 근육의 수분 함량은 위치에 관계없이 (즉, 뒤, 복부 또는 뒷다리) (7), 돼지, 토끼, 마우스 및 인간의 75 % 이상이다. 이전에 8, 9를 설명한 바와 같이, 저온부의 준비 과정 - 유물을 동결 - 근육의 높은 수분 함량은 일반적으로 발생하는 문제가 발생합니다. 대부분의 경우, 적절하게 우리의 경험에 따르면, 도살장 생산 라인에서 근육 조직을 동결하는 것은 거의 불가능하다.
여기에 제시된 프로토콜은 높은 처리량 방식으로 냉동 절편을 위해 근육 조직을 동결하기 위해 실험실에서 사용 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법의 하이라이트는 액체 질소에 냉동 플래시 근육 조직 용으로 설계된 새로운 cryovial이다. 현재 워크 플로우 동시에 조직을 용이하게 할 수명확하게 표시 함과 세포질 주변 조직에 꽉 근섬유의 동격으로 우수한 근육 동결 절단 (Cryosections)에 대한 동결 처리. 액체 질소가 조직과 혼합되지 않기 때문에, 또한,이 프로토콜은 조직 분석 옵션의 다양한 배열에 적용될 수있다.
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Protocol
현재의 방법은 확립 수확하고 실험실에서 조직 학적 염색법 1,000 근육 샘플들을 저장하는 검증되었다. 동물의 관리 및 사용과 관련된 모든 절차는 중국의 농업의 교육부에 의해 설립 된 지침을 따랐다.
샘플 수집 1. 장비
- 각 극저온 유리 병에 샘플 ID를 레이블.
참고 : 극저온 병은 특별히 동결 절단 (Cryosections) 절차 (그림 1A)에 대한 신선한 조직 샘플을 동결하도록 설계되었습니다. 바이알 금형 공장 (도 1C)에 폴리 프로필렌으로 제조된다. - 적절한 액체 질소 탱크에 액체 질소, 보안경 또는 안면 쉴드, 냉동기 장갑 10 개 cm 집게 25 개 cm 핀셋, 스티로폼 쿨러 (내부 치수 : 길이 20cm × 12 cm x 세로 135 cm 높이 아래의 장비를 구하는 ; 외형 치수 : 폭 X 15cm 상위 24 cm × 16 cm 길이), 플라스틱 필름 (폭 0.1 mm 두께 X 2.5 cm X 0.8 cm 길이)메스와 A4 PVC 바인딩 커버 (21cm X 29.5 cm) (도 1b).
근육 샘플의 제조 2
- 앞서 시료 채취의 액체 질소로 5 분 스티로폼 쿨러를 채운다.
참고 : 액체 질소의 일부가 떨어져 종기와 신선한 샘플을 터치하면 가스로 전환하기 때문에 액체 질소의 큰 열이 필수적이다. 손실을 보충하기 위해 액체 질소의 전송의 빈도를 감소시키기 위해, 적절한 크기의 스티로폼 냉각기 샘플의 수에 따라 미리 획득해야한다. - 검체가 획득되면, 부드럽게 A4 PVC 결합 덮개의 부분에 배치하고, 근육 섬유의 방향을 관찰한다.
참고 : 여기, 우리는 돼지의 마지막 허리 뼈에 처음부터 등심의 도리스 근육의 단면을 사용했다. 시편은 약 12cm, 길이 8cm, 폭과 5cm 높다. - 시편 난을 통해 두 개의 평행 한 절개를 만들기 위해 메스를 사용하여N 근육 섬유의 방향, 길이 약 3 cm 및 0.6 cm 이격. 약 0.6 cm x 세로 0.6 cm X 1.5 cm 높이 긴 사각형으로 절개 근육 낸다.
주 : 근육 섬유의 단면적을 측정의 신뢰도는 주로 근육 절개의 섬유 배향에 의존한다. - 부드럽게 막 (도 2A)의 긴 에지에 평행 한 절개 근육의 종축과, 플라스틱 필름의 조각에 시료를 넣어 10cm 집게를 사용한다.
주 : 근육 섬유의 배향 인해 급속 동결을 시료에 균열을 방지하는 접착 기능을 고정하는 데 도움이 유지 기능 : 플라스틱 필름은 두 가지 기능을 갖는다. - 집게를 사용하여, 단지 미소 구멍 사이 표지 저온 바이알의하면 중앙으로 근육 조직을 배치하고 단단히 바이알 (도 2B)를 모자.
3. 냉동 및 보관 근육 샘플에스
- 25cm 핀셋을 사용하여, 신속하게 액체 질소 (약 10-20 S)를 비등하지 않을 때까지 기다리고, 예비 냉각 스티로폼 쿨러에서 액체 질소의 전체 저온 바이알 잠수함.
참고 : 액체 질소가 끓는 때 cryovial이 너무 신중하게 10 ~ 20 초 동안 끓는 액체 질소의 병을 담가 떠. - 액체 질소 저장 탱크 또는 장기간 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 근육 시료를 옮긴다.
4. 슬라이드 제조
- -20 ℃ 및 -22 ° C의 사이에 저온 유지 장치를 사전 냉각.
- 제거 이전 마이크로톰 블레이드 폐기의 저온 유지 장치에서 나이프 홀더 티롤 판을 닦아 저온 유지 장치에서 새 마이크로톰 블레이드를 설치하고, 8 μm의 절삭 두께를 설정.
- 액체 질소 저장 탱크로부터 저온 바이알에서 근육 샘플을 전송 또는 -80 ° C에 냉동 저온 유지 장치로, 액체 질소 나 드라이 아이스에 반송. 시료는 저온 유지 장치의 온도와 평형화 30 분을 기다린다.
참고 : 높은 온도가 시편에서 얼음 결정의 형성을 일으킬 수 있기 때문에 표본을 만지지 수있는 장비는 사전 냉각해야합니다. - 수용성 글리콜 및 수지 OCT ()의 최적 절단 온도 제제 하에서 시험편 홀더에 샘플을 탑재. 8 μm의 단면을 절단.
주 : CSAF 근육 섬유의 단면적이기 때문에, 근육 섬유의 방향에 대해 수직으로 절단 각도를 조정한다. - 방 온도하는 마이크로의 중심을 향해 절을 마운트합니다. 즉시 -80 ° C 냉장고에 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 RT에서 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
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Representative Results
cryovial 그림 및 동결 절편의 준비 기간 동안 근육을 동결에 대한 일반적인 실험실 장비는 그림 1에 나타내었다. 크리오 바이알 (cryovial)는 금형 공장에서 폴리 프로필렌으로 만들어진다. 각 바이알은 입구 구멍 (14)의 총이있다 : 하나는 캡이고; 또 하단이고; 나머지 12 형태 4 개 개의 병렬 라인, 서로 90 °의 4 개 개의 구멍 각각. 이러한 흡입 구멍 때 "증기 블랭킷"효과를 액체 질소와 접촉 조직을 피하기 위해 조직을 다음 액체 질소의 유속을 빠르게 할 수있다. 따라서, 거의 얼음 결정은 냉동 샘플에서 형성한다. 중요한 것은, 이소 펜탄, 28 ° C에서 끓는점 매우 휘발성과 가연성 액체는이 절차에서 필요하지 않습니다.
더이 방법의 장점을 강조하기 위해, 우리는 등심의 dorsi 근육을 동결돼지 다섯 개 동결 방법을 사용하고 그 염색 특성 및 헤 마톡 실린 / 에오신 (HE) 염색 (도 3)를 사용하여 조직 학적 세부를 관찰했다. 일반적으로 발생하는 문제는 동결 절단 (Cryosections)에 대한 근육의 준비 기간 동안 얼음 결정했습니다. 시료는 -80 ° C에 냉동 장치 (도 3a)에 직접 배치했을 때, 큰 얼음 결정을 형성 한 후 근육 동결 절단 (Cryosections)에서 잘 알려진 "스위스 치즈"효과를 야기. 근육 조직을 액체 질소 (도 3b)에 직접 침지 될 때 더욱이, 얼음 결정은 형성되어있다. 액체 질소가 매우 차가운 액체 (-190 ° C에서) 인 경우에도, 그 열 상수는 매우 낮다. 어떤 표본 연락처 액체 질소, 증기 담요 옆에있는 조직을 구축하고 조직으로 감기의 침투를 절연 할 수 있습니다합니다. 또한, 병리 실험실에서 시료를 냉동 일상적인 절차는 근육 조직에 아직 적용되지 않습니다. 에이도 3c에 도시 된 S, 근육 조직이 적절한 방향 OCT로 장착 매체에 침지 한 후 급격히 펜탄 슬러리 냉동 후 근섬유의 세포질 구획에 형성된 다수의 침상 얼음 결정 (-160 ° C). 결론적으로, 근육 조직에 적합한 동결 속도는 엄격하게 작동을 충족해야합니다.
현재 프로토콜은 명확하게 볼 세포질 구획 및 주변 조직 (도 3d)에 꽉 근섬유의 동격으로 우수한 시험편 무결성을 달성한다. 이 미오신 ATP 아제 분석 (도 3E)를 사용하여 근육 섬유의 대사 특성이 우수한 구상 가능하다. 이 분석을 위해, 미오신 ATP 아제 활성을 빠르게 수축 근섬유 (포유류 형 2A 및 2B)가 빨리 느린 수축 섬유 (포유류 유형 1)보다 ATP 가수 분해된다는 사실에 기초하여 분석 하였다. equiva을 부여하는 경우대여 시간, 빠른 계약 섬유는 2 개도에, 빛을 표시하고 느린 계약 섬유는 검은 색이 나타납니다. 이를 수행하기 쉽고 시간 (도 4)에 저장하기 때문에 중요한 것은,이 방법은 높은 처리량 환경에서 효율적으로 이용 될 수있다. 이전에도 8, 9 (도 3f)에 기술 된 바와 같이 현재 잘 확립 된 방법은 동결 간섭 단층 장착 매체와 접촉하지 펜탄 슬러리 근육 조직 잠길 것이다. 이 과정에서, 액체 질소의 펜탄을 예냉 작은 백색 침전물이 아래쪽 (도 4)에 표시 될 때까지 교반함으로써 달성 할 펜탄 240 ㎖가 고체 - 액체 슬러리 상태의 대략 30 분 걸린다. 사전 냉장 이소 펜탄의 근육 조직을 동결하는 동안 연구자들에 의해 발생하는 세 가지 실제적인 어려움이있다 : (1) isopantane의 고체 - 액체 슬러리 상태가 때를 유지하기 어렵다샘플링 시간은 1 시간 이상이다. 우리의 과거 시도에서 동결 유물은 일반적으로 근육 조직 수십 번 수집 과정의 중간 늦은 단계에서 수행 된 샘플에서 발생했습니다. (2) 위험한 액체로서, 대중 교통의 아무 곳이나 isopantane 허용되지 않습니다. (3) 이소 펜탄은 실험실에서 제외 사용할 수 없습니다. 많은 고기 과학 연구원은 일반적으로 멀리 실험실에서하고 그가 이소 펜탄을 할 수 없습니다 도살장에서 근육 조직을 동결. 또한, 진단 근육 생검으로 인해 의료 시설에서 이소 펜탄의 부족으로 종종 하위 최적으로 처리됩니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 이소 펜탄를 사용할 수없는 상황에서 근육 표본을 동결하는 중요한 발전이다.
도 1 : 근육 냉동 장치. (A)의 그림본 연구에 사용 된 cryovial의. 14 개 구멍 입구 튜브 벽에 천공된다 : 하나는 캡이고; 또 하단이고; 나머지 12 형태 4 개 개의 병렬 라인, 서로 90 °의 4 개 개의 구멍 각각. (B) 냉동 장치의 사진. 액체 질소에서 근육 동결 안전하고 효율적인 수단은 cryovial, 플라스틱 필름, 보호 안경, 냉동기 장갑 10cm 집게, 25cm 핀셋, 스티로폼 쿨러 메스 및 A4 PVC 결합 표지의 사용을 포함한다. (C) 금형 공장 기술자, Yonghua 왕에 의해 제공된 cryovial 몰드의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 근육 샘플의 제조. (A (B) 근육 조직은 저온 바이알에서 유입 구멍 사이에 위치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 그들은 다섯 개 가지 방법을 사용하여 냉동 한 후 돼지 등심 Dorsi 근육의 조직 학적 평가의 대표 이미지.
얼음 결정은 그가 (AC)에서와 같이 근육이 부적절한 방법을 사용하여 조직 학적 분석을 위해 냉동 될 때 염색 군데 근육 저온부의 가독성을 파괴한다. 근육 샘플 바로 80 ℃ 냉동고 (A)에 배치 된 액체에 침지했을 때 상당한 동결 아티팩트가 발생질소 (B). 근조직 OCT를 침지 한 후 직접 펜탄 슬러리 (C)에 투입 한 후 많은 침상 얼음 결정은 개별적인 근육 세포 내에 형성. 근조직 단순히 액체 질소 (D)에 침지 될 때 본 연구에 제시된 프로토콜은 얼음 결정의 형성을 제거 할 수있다. 이 프로토콜은 미오신 ATP 아제 분석 (E)에 기초하여 냉동 근육 효소 활성의 분석에 적용 가능하다. 더 잘 수행하지 않는 근육의 표준 동결 방법; 근조직 장착 간섭 단층 매체 (F)와 직접 접촉하지 않고 펜탄 슬러리에 침지된다. 모든 이미지는 블랙 가장자리 (20X)를 가진 것을 제외한, 10 배의 대물 중이다. 스케일 바 : 100 μm의. 도 3c의 작은 화살표는, 바늘 형상의 얼음 결정을 나타낸다. 도 3e의 화살촉과 텍스트 근육 섬유의 종류를 나타낸다 : 제 1 형의 느린 미오신 중쇄 섬유를 나타내고, tYPE 2A 중간 미오신 중쇄 섬유를 의미하며, (b)는 빠른 미오신 중쇄 섬유를 입력 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 : 액체 질소 계 펜탄 계통 동결 절차는 워크 플로우의 비교. 액체 질소 - 기반 프로토콜에서, 새로운 cryovial의 근육 조직을 액체 질소에 침지된다. 펜탄 계통의 프로토콜, 펜탄 슬러리 상태는 액체 질소의 펜탄을 예냉 작은 백색 침전물이 나타날 때까지 바닥 교반 앞서 이루어져야한다. 그런 다음, 근육 조직은 미리 냉각 이소 펜탄에 담근된다. 도 3f에서 설명 된 바와 같이 펜탄 계통의 절차에서 35 분에 비해, 단지 5 분 t 소요 오이 프로토콜에 제시된 동결 절차를 완료합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 날카로운 오리피스를 통해 액체 질소 흐름. 14 개 개의 미소 구멍을 통하여 튜브로 액체 질소 대기압의 힘을 액체 질소에서 전체 다공 cryovial를 침지 시켰을 때. 구멍의 존재는 흐름에 따라서 속도를 증가, 그들을 통해 가속화한다. (파란색) 재순환 흐름 (주황색) 오리피스의 바로 하류 개발하고 있습니다. D1은 튜브의 벽에 오리피스의 직경을 나타내고, D2는 오리피스 (적색) 근육 샘플 사이의 거리를 나타낸다.= "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서는 동결 근육 기능의 조직 학적 평가를 수행하는 근육 조직을 저장하는 새로운 다공 cryovial을 설명한다. 이 프로토콜의 핵심 변성 단계는 다공 cryovial의 샘플은 직접 액체 질소에 침지된다는 점이다. 우리의 지식에, 이것은 기존의 동결 방법 중 근육의 냉동 절편 우수한 냉동 샘플 (대표 결과를 참조)를 얻을 수있는 간단하고 rapidest 방법입니다.
근육 연구자들이 직면 한 기술적 과제는 얼음 결정이 절편을 위해 근육 조직을 강화하는 수단으로 동결 사용할 때 형성 할 가능성이 있다는 것입니다. 대표 결과에서 언급 한 바와 같이, 세 가지 요소는 적절한 차가운 소스를 선택하는 시료의 수분을 최소화하고 차가운 소스와 접촉 전체 표면의 비율을 증가 포함한 병리학 적 연구에 대한 적절한 근육 동결을 결정하는데 중요한 역할을한다. 먼저,동결의 비율은 절편의 냉동 조직의 준비 기간 동안 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 동결이 느린 경우 큰 얼음 결정이 세포 외로 형성되기 때문에, 냉동 근육은 잘 알려진 "스위스 치즈"효과를 보여줍니다. 동결이 충분히 빨리 신속하지만없는 경우, 작은 바늘 모양의 얼음 결정의 많은 수의 개별 근육 세포 내에서 형성된다. 이 바늘 모양의 얼음 결정이 거의 감지 구조적 손상의 원인이 있지만, 다음과 같은 효과를 가져 : 미토콘드리아가 10 손상, 근육 섬유의 크기는 인위적으로 11 증가, 및 섬유 구조의 무결성 (11)를 파괴된다. 따라서, 충분한 저온에서 콜드 소스 충분한 결빙 속도 근육 저온부에 얼음 결정의 형성을 방지하기 위해 필수적이다.
이상적으로, 초기 소스는 극저온 온도이고 t를 배치O 모든 표면 접촉. 고체 - 액체 혼합 된 상태 모두에서 액체 질소 (-190 ℃)은 펜탄 (-160 ° C)이 조건을 만족시킨다. 그러나이 동결 미디어는 자신의 단점이있다. 액체 질소가 매우 낮은 비열 상수를 가진다. 그 결과, 액체 질소와 조직 사이의 접촉이 다음 조직에 크게 축적 조직 (12)에 저온의 침투를 느리게 증기 장벽을 야기한다는 것이다. 따라서, 상당한 냉동 유물은 얼어 붙은 근육 내에서 발생합니다. 펜탄 슬러리 상태 증기 장벽을 형성하지 않는 이상적인 동결 매체이지만, 주요 문제는 펜탄 160 ° C의 액체 조 온도를 달성하기 위해 액체 질소와 함께 사용되어야한다. 또한, 이소 펜탄은 실온에서 매우 휘발성과 가연성 액체이다. 둘째, 근육의 과도한 물 (> 75 %), 그래서 시편에 외생 수분을 소개 할 수있는 방법을 포함 아티팩트를 동결의 원인이됩니다. 얼음 결정이 10월 설치 매체가없는 사람에 비해 훨씬 더 눈에 띄는 그 근육 저온부에서 그래서 예를 들어 간섭 단층 장착 매체는 근육에 여분의 물을 추가합니다. 마지막으로, 근육 조직의 두께는 동결 속도가 부분적으로 냉각 소스 (통상, 두께가 <0.5 cm)에 접촉 총면적의 비율에 의존하기 때문에 적절하게 고정하는 것이 중요하다. 따라서, 적절하게 조직을 고정하기위한 유일한 방법은 기존의 이전 8 바와 같이 미리 냉각 펜탄 (160 °의 C)에 0.5 미만 cm, 두께 근조직 몰입한다.
이 프로토콜은 처음 제대로 액체 질소에 직접 침지하여 근육 조직을 동결하는 방법에 대해 설명합니다. 단독으로 액체 질소를 사용하는 문제점은 조직의 냉각을 절연체로서 작용하고 억제 조직 표면에 질소 가스를 형성하는 것이다F "> 13. 거품의 병합이 질소 가스는 액체 질소의 조직을 분리 할 수 있도록 빠른 경우에는 이러한 기체 블랭킷 거품 역학 방법.에만 형성 할 수는 빠르게 액체 흐름은 그와 같은 작은 기포가 발생할 것 14 병합 적은 가능성이있다. 따라서, 우리는 조직 주위에 액체 흐름의 속도를 증가시키고 "증기 블랭킷"효과를 방지하기 위해 cryovial의 벽에 14 개 홀을 천공 할 때, 액체 질소에 접촉 조직.
실험의 성공을 결정하는 하나의 인자는 조직 주위에 액체 유동의 속도임을 감안 cryovial의 세 개의 매개 변수가 위치와 구멍의 수, 미소 구멍의 직경과 구멍 사이의 거리를 포함하여, 매우 중요한 샘플. 액체 역학 오리피스를 통한 유량이 구멍의 직경에 의해 결정되는 것을 보여준다 재순환 흐름은 즉시 감소한다는 개발오리피스의 스트림 (도 5) (15, 16). 도 5에 나타낸 바와 같이 대응하여, 오리피스와 샘플 사이의 거리가 주로 고속의 유체 흐름과 시료 사이의 접촉 면적을 결정한다. 따라서,도 1a의 다공 cryovial 1.5 cm 길이 X 너비 X 높이 0.6 cm 0.6 cm 인 근육 샘플에 적합하다. 큰 근육 조각의 경우, 더 큰 튜브보다 구멍이 방법을 시도 가치가있다. 입구 구멍이 작은 샘플에 대한 너무 큰 수 있기 때문에 그러나,이 프로토콜은 이러한 생쥐 모델에서와 같은 작은 동물에서 근육 샘플을 동결 적합하지 않습니다.
또한, 세 가지 중요한 단계는 엄격하게 프로토콜에 따라야합니다. 우선, 액체 질소는 전체 cryovial 젖어 적합해야하고, 저온 바이알 완전히 액체 레벨 이하이어야한다. 둘째, 그것은 필요가있다냉동 근육과 상온 용기 나 악기 사이의 빈 접촉 사고. 예를 들어,주의 운송하지 않고, 새로운 얼음 결정은 액체 질소 저장 탱크에서 고정 된 샘플을 전송하거나 -80 C의 냉동고 ° 그라 이오 스탯에 형성 있습니다. 셋째, 표본 인해 냉동 근육 간섭 단층 사이의 접촉 면적의 주위에 얼음 결정 형성의 높은 가능성에 홀더에 장착 될 때 OCT를 사용 너무 많이가 안된다.
포르말린 고정 파라핀 매립 처리는 TNF 및 CSAF 일부 근육 특성의 평가를 손상 근육 섬유의 수축이 발생하기 때문에 육류 산업에서, 근육 동결 절단 (Cryosections) 절차가 필수적이다. 또한, 냉동 근육은 마이 오신 ATP 아제 분석을 사용하여 FTC을 평가할 때 필요합니다. 그림 3E에 나타낸 바와 같이,이 프로토콜은 근육의 양 병리학 분석의 요구 사항과 조직 화학적 얼룩을 만날 수 있습니다. 준비동결 절단 (Cryosections)의 임상 근육 병리 실험실에서 일상적인 작업이다. 멩 동부 등에 의해 설명 된 바와 같이. 도 8은 근육 조직을 동결 표준 작업 절차는 예비 냉각 펜탄 부검 시료 몰입한다. 그러나, 이소 펜탄 임상 근육 병리 실험실없이 기관의 부검 표본을 동결 사용할 수 없습니다. 따라서, 진단 근육 조직 검사는 종종 suboptimally 많은 의료 시설에서 처리됩니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 실질적으로 적절한 품질의 진단 근육 생검을 수행 할 수있는 작은 병원이나 실험실의 능력을 향상시킬 수 있습니다. 높은 효율성과이 프로토콜의 간단한 조작을 고려하면, 현재 펜탄 계통의 동결 방법에 유망한 대안이 될 수 있으며 널리 미래의 조직 학적 연구에 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌은 금융 또는 다른 저자에 의해 선언되지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 중국 국가 자연 과학 재단 (NSFC)에 의해 지원되었다 : 31301950 및 31671288입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10 cm forceps | Commomly-used | ||
| 25 cm tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
