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मकाक में लिवर और mesenteric लिम्फ नोड्स के सीरियल संग्रह के लिए लेप्रोस्कोपिक तकनीक

Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55617
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Pharmaceutics, Washington National Primate Research Center, University of Washington, 2Division of Primate Resources, Washington National Primate Research Center, University of Washington

Summary

यहाँ, हम macaques में जिगर और mesenteric लिम्फ नोड्स (मिलियन) के सीरियल नमूना है कि वृद्धि हुई नमूना आवृत्ति के लिए अनुमति देता है, और शल्य जटिलताओं के लिए क्षमता को कम कर देता है जब एक laparotomy प्रदर्शन की तुलना के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक तकनीक का वर्णन।

Abstract

mesenteric लिम्फ नोड्स (मिलियन) और जिगर रोगाणुओं और जठरांत्र (जीआई) पथ से सूक्ष्म उत्पादों के संपर्क में हैं, उन्हें प्रतिरक्षा के रूप में अद्वितीय बना रही है। GI पथ और संबद्ध MLN मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) संक्रमण के शुरू में वायरल प्रतिकृति के स्थल हैं और MLN संभावना महत्वपूर्ण जलाशय साइटों है कि लंबे समय तक एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (एआरटी) के बाद भी गुप्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं बंदरगाह हैं। जिगर lentiviruses के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है और प्रचलन से वायरस की निकासी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रकट होता है। गैर-प्राइमेट (NHP) एचआईवी और एक्वायर्ड इम्यूनो सिंड्रोम (एड्स) के लिए मॉडल बारीकी से एचआईवी संक्रमण और वायरल प्रतिकृति और इस मॉडल में जुड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्राथमिक साइटों के सीरियल अनुदैर्ध्य नमूना के इन पहलुओं की नकल संक्रमण में महत्वपूर्ण घटनाओं स्पष्ट करने में मदद मिलेगी, रोगजनन , और इन घटनाओं पर विभिन्न हस्तक्षेप योजनाओं के प्रभाव पर। कुरईएनटी प्रकाशित तकनीक जिगर नमूने के लिए और MLN एक साथ बड़ी सर्जरी और / या शव-परीक्षा, जो एक ही जानवर में एक सीरियल फैशन में इन महत्वपूर्ण साइटों की जांच करने की क्षमता को सीमित करता है शामिल है। हम पहले से MLN के संग्रह के लिए एक लेप्रोस्कोपिक तकनीक का वर्णन किया है। यहाँ, हम MLN के संग्रह के लिए आवश्यक एक ही दो बंदरगाह स्थानों के माध्यम से जिगर और MLN के सीरियल अनुदैर्ध्य नमूना के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक तकनीक का वर्णन। वही दो बंदरगाहों के उपयोग पशुओं के लिए प्रभाव को कम करता है के रूप में कोई अतिरिक्त चीरों की आवश्यकता है। इस तकनीक को प्रमुख पेट की सर्जरी की तुलना में वृद्धि हुई नमूना आवृत्ति के साथ प्रयोग किया जा सकता है और शल्य जटिलताओं की संभावना कम कर देता है और स्थानीय और प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रियाओं है कि परिणाम की व्याख्या को मुश्किल कर सकता है जुड़ा हुआ है। यह प्रक्रिया NHP मॉडल को शामिल करते हुए पशु कल्याण में सुधार लाने के अध्ययन की सुविधा के लिए की क्षमता है।

Introduction

जठरांत्र (जीआई) पथ शरीर की सबसे बड़ी श्लैष्मिक सतह है और भोजन, रोगाणुओं, और एंडोसिम्बायोटक बैक्टीरियल समुदायों से प्राप्त एंटीजन के असंख्य सामान्यतः Microbiome 1, 2 के रूप में भेजा के संपर्क में है। Mesenteric लिम्फ नोड्स (मिलियन) GI पथ लाइन और इन विविध एंटीजन की ओर सूजन या tolerogenic प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए प्रतिरक्षा के कार्य का एक प्रमुख साइट है। MLN के भौतिक संगठन एक बंटे प्रणाली है कि स्थानीय स्तर पर प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं 3 eliciting बिना एंटीजन को प्रतिक्रिया कर सकते हैं बनाता है। इसी तरह, परिसंचरण की ओर लौटने, और इस तरह रोगाणुओं और सूक्ष्म उत्पादों कि GI पथ से लामिना प्रोप्रिया में translocated और खून 4 में प्रवेश किया है के संपर्क में है इससे पहले कि पोर्टल शिरा के माध्यम से जिगर को GI पथ नालियों से खून। जिगर भी एक माध्यमिक लसीकावत् अंग एक के रूप में कार्यnd प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या, विशेष मैक्रोफेज सहित translocated रोगाणुओं 5, 6 दूर करने के लिए है। इस प्रकार, MLN और जिगर प्राथमिक प्रतिरक्षा GI पथ से सहभोजी और रोगजनक बैक्टीरिया के संपर्क में अंगों, साथ ही अन्य स्रोतों से एंटीजन की परिवेश, उन्हें अद्वितीय और एक प्रतिरक्षा के नजरिए से महत्वपूर्ण बना रहे हैं।

MLN मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) या रोगजनक बंदर इम्यूनो वायरस (SIV) संक्रमण के वायरस विज्ञान संबंधी और immunologic प्रभाव के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण साइटों रहे हैं, और संभावना intrarectal चुनौती निम्नलिखित SIV के प्रारंभिक प्रसार में शामिल हैं। आंत से जुड़े लसीकावत् ऊतक आधुनिक एंटीरेट्रोवाइरल उपचारों (एआरटी) 7 से viremia के प्रभावी नियंत्रण के बावजूद लगातार एचआईवी प्रतिकृति का एक प्रमुख साइट माना जाता है। SIV के संक्रमण मॉडल में, MLN अव्यक्त वायरस के महत्वपूर्ण जलाशयों होना दिखाया गया है और हो सकता हैप्राथमिक जलाशय 8, 9 हो। जिगर के रूप में तीव्र SIV के संक्रमण 10 के दौरान macaques के जिगर में SIV के विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं के संचय इसका सबूत भी lentiviral संक्रमण में महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह प्रमुख अंग संचलन 11 से वायरस को साफ करने के लिए जिम्मेदार है।

एचआईवी और SIV के संक्रमण बदल सैनिक माइक्रोबायोटा साथ जुड़े रहे हैं, बाधित सैनिक उपकला अखंडता, और परिधि और संचलन 12, 13 में पेट से रोगाणुओं और सूक्ष्म उत्पादों की अनुवादन वृद्धि हुई है। इन प्रक्रियाओं स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिरक्षा सक्रियण के साथ जुड़े, और एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों 14 में वृद्धि हुई रुग्णता और मृत्यु दर कर रहे हैं। SIV के संक्रमण में, translocated बैक्टीरिया MLN 15 में देखा गया है, जबकि माइक के संचयजिगर में robial उत्पादों अंग से 16 सूजन और नुकसान हो दिखाया गया है। इस प्रकार, एचआईवी और SIV के संक्रमण के संदर्भ में, MLN और जिगर सैनिक-निवासी बैक्टीरिया द्वारा संचालित भड़काऊ प्रक्रियाओं को समझने के लिए उच्च जानकारीपूर्ण हो सकता है।

यहाँ, हम गैर मानव प्राइमेट (NHPs) में MLN के सीरियल नमूना और जिगर के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक तकनीक प्रस्तुत करते हैं। हम दो स्वस्थ महिला रीसस macaques (RMS) पर इस तकनीक का सफल प्रदर्शन का प्रदर्शन प्रत्येक सर्जरी के बीच में प्रत्येक जानवर दो बार, 160 दिनों के साथ नमूना। हम दो समय बिंदुओं के बीच अत्यधिक सुसंगत डेटा का मूल्यांकन और प्रवाह cytometry का उपयोग प्रत्येक अंग के भीतर प्रमुख ल्युकोसैट और लिम्फोसाइट आबादी की तुलना करें और प्रदर्शित करने के लिए इन नमूनों का उपयोग करने पर चलते हैं।

Protocol

पशु रखे और मूल्यांकन एवं प्रत्यायन प्रयोगशाला पशु की देखभाल के अंतरराष्ट्रीय (AAALACi) से मान्यता प्राप्त सुविधाओं के लिए एसोसिएशन में देखभाल कर रहे थे, और सभी पशु प्रक्रियाओं वाशिंगटन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया वाशिंगटन नेशनल प्राइमेट रिसर्च सेंटर।

1. सर्जिकल तैयारी, संज्ञाहरण, और Analgesia

  1. बेहोश करने की क्रिया और प्रेरण
    1. शांत 10 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 0.015 मिलीग्राम / किग्रा dexmedetomidine (एक सिरिंज में संयुक्त) के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ मकाक। पिंजरे से हटाने से पहले वापसी सजगता के अभाव सुनिश्चित करें।
    2. पशु नली लगाना, और isoflurane का उपयोग सामान्य संज्ञाहरण के एक विमान में पशु बनाए रखने के (1.0 - 2.5%) और 100% ऑक्सीजन। , इंटुबैषेण और macaques 17 में सामान्य संज्ञाहरण के बारे में अधिक जानकारी के लिए संदर्भ देखेंरेफरी "> 18, 19।
  2. संज्ञाहरण समर्थन और निगरानी
    1. एक परिधीय शिरापरक कैथेटर डालें और संज्ञाहरण और सर्जरी भर 5 एमएल / किलोग्राम / घंटा की दर से (जैसे Lactated Ringers समाधान के रूप में) नसों में तरल पदार्थ isotonic प्रदान करते हैं। कॉर्निया सूखापन को रोकने के लिए बाँझ आंख स्नेहक लागू करें।
    2. इस तरह के buprenorphine की एक निरंतर रिलीज निर्माण (0.2 मिलीग्राम / किग्रा, subcutaneously) के रूप में analgesia प्रदान करते हैं।
      नोट: एक NSAID (जैसे meloxicam या ketoprofen के रूप में) भी है, बशर्ते कि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल NSAID को सुविधाजनक बना देती संवेदनाहारी वसूली के दौरान प्रदान किया जा सकता है और है कि पशु normotensive और संज्ञाहरण के दौरान अच्छी तरह से जलयोजित न हो जाए।
    3. संवेदनाहारी गहराई (जैसे जबड़े टोन), हृदय गति, श्वसन दर, ईकेजी, रक्तचाप, नाड़ी ऑक्सीजन, अंत ज्वार सीओ 2, और शरीर के तापमान संज्ञाहरण और सर्जरी भर की निगरानी करें।
      ध्यान दें: जब पेट होता है और पशु hypoventilate सकता है।श्वसन दर कम हो जाती है, या अंत ज्वार सीओ 2 का स्तर 45 mmHg ऊपर है अगर यांत्रिक वेंटीलेशन प्रदान करें।
    4. सर्जरी के बाद, dexmedetomidine उत्क्रमण के लिए atipamezole (0.15 मिलीग्राम / किग्रा, पेशी) के लिए प्रशासन।
  3. सर्जिकल तैयारी
    1. पेट में मल की मात्रा कम करने के लिए प्रक्रिया 20 के दौरान दृश्य और पेट में गड़बड़ी सहायता करने के लिए एक से अधिक गर्म पानी एनिमा निष्पादित करें।
    2. एक नंबर 40 ब्लेड के साथ कतरनी उपयोग शल्य क्षेत्र से बालों को हटाने के लिए। जघनरोम के तटीय रिज से और सही दिशा को बाएं से दाढ़ी।
    3. Aseptically ऐसे chlorhexidine-शराब या povidone आयोडीन-शराब स्क्रब बारी के रूप में उपयुक्त रोगाणुरोधकों, का उपयोग कर सर्जिकल क्षेत्र तैयार करते हैं।
    4. इसके ऊर्ध्व भाग पर ऑपरेटिंग मेज पर पशु स्थिति, पृष्ठीय और सही पार्श्व अवलंबन के बीच एक कोण से आधे रास्ते पर। एक विस्तारित स्थिति में रस्सी के साथ हाथ और पैर बाँध। एक अंतिम chlorhexi प्रदान करेंभोजन और शराब तैयार एक बार पशु ऑपरेटिंग कमरे में चला जाता है और शल्य चिकित्सा के लिए स्थिति में है।

2. सर्जरी

नोट: छोटे जानवरों में लेप्रोस्कोपी की अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 21 देखें।

  1. लेप्रोस्कोपिक साधन तैयार करना
    1. एक बाँझ गवाक्षित टांगना के साथ पशु कपड़ा।
    2. एक गैर बाँझ सहायक की मदद से, बाँझ कैमरा टांगना के साथ डिजिटल कैमरा लपेट और टावर के लिए केबल देते हैं। कैमरा सिर करने के लिए कठोर गुंजाइश देते हैं।
    3. कठोर गुंजाइश के लिए बाँझ प्रकाश केबल संलग्न करें और प्रकाश स्रोत के लिए केबल कनेक्ट करें। व्हाइट निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैमरा संतुलन।
    4. insufflator को बाँझ insufflator ट्यूबिंग देते हैं।
  2. लेप्रोस्कोपिक एंट्री
    1. एक # 15 स्केलपेल का उपयोग करना, पेट की मांसलता, एप्लिकेशन की गहराई तक त्वचा के माध्यम से एक ~ 5 मिमी वार चीरा बनानेroximately 1 - नाभि के बाईं ओर 2 सेमी।
    2. गैर प्रमुख हाथ का उपयोग करना, चाकू चीरा की साइट के लिए पेट की दीवार कपाल उठा। प्रमुख हाथ के साथ, चीरा और कोण टिप cranially के माध्यम से Veress सुई की नोक जगह।
      नोट: Veress सुई के प्रवेश कोण जानवर के शरीर स्थिति के आधार पर अलग-अलग होंगे। उदाहरण के लिए, एक मोटे जानवर में, Veress सुई लगभग पेट की दीवार करने के लिए खड़ा सम्मिलित करने के लिए की आवश्यकता होगी। एक पतली पशु में, Veress सुई आंत से संपर्क करने के जोखिम को कम करने के लिए cranially angled किया जाना चाहिए।
      1. Veress सुई की शाफ्ट (हब नहीं) होल्डिंग, मजबूती से सुई धक्का उदर गुहा में पेट की दीवार घुसना करने के लिए। एक विशिष्ट "क्लिक" और के रूप में तेज टिप पेरिटोनियम और उदर गुहा में आगे की Veress सुई स्प्रिंग्स कुंद टिप प्रवेश प्रतिरोध में कमी महसूस किया जाएगा।
        नोट: सुई वीं में उचित तरीके से गुजरता हैई उदर गुहा, वहाँ थोड़ा प्रतिरोध किया जाएगा जब यह उन्नत और वापस ले लिया है 1 - 2 सेमी।
    3. सुई के लिए सीओ 2 insufflator ट्यूबिंग कनेक्ट और पानी निकलने की टोंटी खोलें। कोई 10-12 से ज्यादा mmHg के पेट पर दबाव एक pneumoperitoneum बनाने के लिए।
      नोट: पेट आदर्श साँस हासिल की है जब यह संतुलित विस्तार किया गया है और वहाँ तटीय मार्जिन के सामान्य तेज समोच्च का नुकसान है। दबाव आंत से संपर्क करने के जोखिम के बिना प्रवेशनी / trocar की प्रविष्टि के लिए पर्याप्त स्थान उपलब्ध कराने चाहिए।
  3. प्रवेशनी प्लेसमेंट
    1. पिछले पसली के लिए 4 सेमी दुम - पेट की मांसलता ~ 2 के लिए छोड़ दिया कपाल पेट की त्वचा के माध्यम से एक # 15 स्केलपेल ब्लेड के साथ 7 मिमी चीरा - एक बार पेट पूरी तरह से होता है और एक ~ 5 बनाते हैं।
    2. 60 डिग्री caudomedially - त्वचा चीरा और कोण यह ~ 45 के माध्यम से एक 5 मिमी trocar-प्रवेशनी विधानसभा रखें। 1-2 सेमी की गहराई तक उदर गुहा घुसना। screडब्ल्यू प्रवेशनी (~ 0.5 - 1 सेमी आगे) घूर्णन द्वारा पेट में थ्रेडेड प्रवेशनी 1.5 की गहराई तक - 3 सेमी, और trocar को हटा दें।
    3. Veress सुई से insufflator ट्यूबिंग निकालें, पानी निकलने की टोंटी बंद कर देते हैं, और सुई को हटा दें। प्रवेशनी को insufflator ट्यूबिंग कनेक्ट और कोई 10 से अधिक पर पानी निकलने की टोंटी एक pneumoperitoneum बनाए रखने के लिए खोलने - 12 mmHg।
    4. प्रवेशनी के माध्यम से और उदर गुहा में कठोर गुंजाइश डालें।
    5. कैमरा दृश्य के तहत, एक # 15 स्केलपेल ब्लेड Veress सुई प्रविष्टि के लिए इस्तेमाल पिछले त्वचा चीरा पर पेट की मांसलता और पेरिटोनियम के माध्यम से के साथ एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए जारी है। कैमरा जहाजों से बचने और खून बह रहा है कम करने के लिए चीरा के पेट की ओर कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
      नोट: पेशी के माध्यम से चीरा सुनिश्चित करें और पेरिटोनियम इतना बड़ा अन्त्रपेशी (~ 0.5 सेमी) की जांच के प्रवेश और बाह्यीकरण की सुविधा के लिए है। एक बड़ा चीरा mesent अमल में लाना आवश्यक हो सकता हैअत्यधिक mesenteric वसा के साथ पशुओं में ery।
    6. सिर के ऊपर 30 डिग्री - पैर लगभग 15 से ऊपर उठाया के साथ Trendelenburg स्थिति 21 में पशु रखें। यह वैकल्पिक है लेकिन पेट की mesenteric लिम्फ नोड्स के लिए आसान पहुँच, छोटे आंत्र पथ के रूप में अनुमति दे सकता है एक और अधिक कपाल स्थिति में चले जाएँगे।
  4. Mesenteric लिम्फ नोड बायोप्सी
    1. कैमरा दृश्य के तहत, पेट कदम 2.3.5 में बनाया चीरा के माध्यम से एक ठोस जांच डालें।
    2. omentum और आंत्र के बीच जांच रखें और एक व्यापक प्रस्ताव का उपयोग धीरे आंत्र बंद omentum स्वीप करने के लिए अंतर्निहित अन्त्रपेशी के दृश्य अनुमति देने के लिए। कपाल पेट को दुम से व्यापक प्रस्ताव का उपयोग करने के लिए जारी है। omentum सही कपाल पेट में रखा जा सकता है तो यह ऑपरेटिव क्षेत्र से बाहर है।
    3. बाईं या दाईं पेट की दीवार की ओर उतरते बृहदान्त्र स्थानांतरित करने के लिए जांच का प्रयोग करें। यह टी के बेहतर दृश्य की अनुमति देगावह mesenteric लिम्फ नोड्स के लिए खोज में सहायता करने के अन्त्रपेशी।
    4. अन्त्रपेशी के माध्यम से स्वीप करने के लिए पेट के और mesenteric वाहिकाओं साथ mesenteric लिम्फ नोड्स पता लगाने के लिए जांच का प्रयोग करें।
      नोट: पेट की mesenteric सीमा पर चलाने बृहदान्त्र नोड्स, बाईं पेट का दर्द नोड्स जहाजों की शाखा अंक के पास पाया जा सकता है, और अवर mesenteric नोड्स अवर mesenteric वाहिकाओं के साथ पाया जा सकता है। Mesenteric लिम्फ नोड्स दुबला पशुओं में आसानी से दिखाई दे रहे हैं। जब mesenteric वसा में दफन वे अक्सर overlying अन्त्रपेशी के लिए एक से थोड़ा उठाया, चमकदार उपस्थिति उधार दे जाएगा और यह बहुत अधिक भूरा तन रंग तो mesenteric वसा आसपास हो सकता है। साथ ही, mesenteric लिम्फ नोड्स lymphatics और mesenteric वाहिका संरचना पर ही स्थित हैं के लिए करते हैं।
    5. एक बार एक लिम्फ नोड की पहचान की है, जांच को हटाने और उदर गुहा में मैरीलैंड ratcheted संदंश डालें। अन्त्रपेशी आसन्न लक्ष्य नोड समझ संदंश का प्रयोग करें। inci की ओर अन्त्रपेशी खींचोसायन, और प्रवेशनी से दायरे को हटा दें।
    6. insufflator बंद कर दें और प्रवेशनी पानी निकलने की टोंटी खुला छोड़ पेट depressurize को अन्त्रपेशी की बाह्यीकरण की सुविधा के लिए। चीरा के माध्यम से शरीर के बाहर अन्त्रपेशी खींच लें। एक बार जब exteriorized, चीरा के माध्यम से पहुंच सुनिश्चित करने के घुमावदार मच्छर hemostats या अंगूठे संदंश के साथ अन्त्रपेशी समझ।
    7. मजबूत लिम्फ नोड और / या grayer रंग या लिम्फ नोड के गांठदार उपस्थिति के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए छूकर लिम्फ नोड (रों) exteriorized अन्त्रपेशी के भीतर की पहचान करें।
      1. नोड घुमावदार hemostats का उपयोग कर के पास अन्त्रपेशी में - (5 मिमी ~ 3) एक बार पहचान, एक छोटे से खोलने बनाते हैं। अन्त्रपेशी घुमावदार hemostats के साथ कुंद विच्छेदन का उपयोग करने के नि: शुल्क संलग्नक। 4-0 गैर अवशोषित monofilament सीवन के रूप में आवश्यक के साथ वाहिका ligate। एक छुरी के साथ तेज विच्छेदन का उपयोग करें लिम्फ नोड दूर करने के लिए। रोजवेल पार्क मेमोरियल संस्थान में नोड्स (RPMI) 1640 मध्यम पर रखेंबर्फ।
    8. खून बह रहा है के लिए exteriorized अन्त्रपेशी की जांच करना। खून बह रहा है का उल्लेख किया गया है, तो hemostats या संयुक्ताक्षर (4-0 गैर अवशोषित monofilament सीवन) के साथ जहाजों occluding, या दाग़ना के उपयोग के द्वारा द्वारा उचित hemostasis प्रदान करते हैं। अन्त्रपेशी को छोड़ दें और 10 पेट वापस Insufflate - 12 mmHg अन्त्रपेशी उदर गुहा पर लौटने के लिए अनुमति देने के लिए।
    9. चरण दोहराएं 2.4.8 के माध्यम से 2.4.1 अतिरिक्त लिम्फ नोड बायोप्सी प्राप्त करने के लिए।
  5. लीवर बायोप्सी
    1. एक क्षैतिज स्थिति के लिए मेज पर लौटें।
    2. पेट में एक पिरोया प्रवेशनी चीरा पहले से लिम्फ नोड बायोप्सी संग्रह (चीरा कदम 2.3.5 में किए गए) के लिए इस्तेमाल किया के माध्यम से रखें। सुनिश्चित करें चीरा काफी बड़ी है - trocar प्रविष्टि रहित प्रवेशनी प्लेसमेंट के लिए अनुमति देने के लिए (~ 5 7 मिमी)। कपाल उदर गुहा की ओर इस प्रवेशनी के माध्यम से कठोर गुंजाइश डालें और कपाल पेट और जिगर कल्पना।
    3. कैमरा दृश्य के तहत, सम्मिलित बायोप्सी चप्रवेशनी के माध्यम से orceps पहले छोड़ दिया कपाल पेट (कदम 2.3.1 में बनाया चीरा) में रखा गया।
    4. जिगर बायोप्सी प्राप्त करने के लिए, जबड़े जिगर का सामना करना पड़ की चल भाग के साथ चयनित लीवर पालि मार्जिन नीचे बायोप्सी संदंश जगह, संदंश खोलें, और मार्जिन खुला जबड़े में गिर करने देते हैं। सुनिश्चित करें कि कोई omentum जिगर और बायोप्सी संदंश के बीच है। संदंश की स्थिति को समायोजित करें और वांछित नमूना क्षेत्र पर साधन बंद कर दें।
      1. दबाव बनाए रखने के लिए लगभग 20 - 30 रों hemostasis सुनिश्चित करने के लिए। साथ संदंश बंद कर दिया, धीरे प्रवेशनी के माध्यम से संदंश खींचकर नमूना हटा दें। यह धीरे जिगर से बायोप्सी आंसू होगा। 1640 RPMI मध्यम में जिगर बायोप्सी बर्फ पर रखें।
        नोट: यकृत की बायोप्सी का आकार लगभग 5 मिमी x 2 मिमी x 2 मिमी 5 मिमी बायोप्सी संदंश का उपयोग कर रहा है।
    5. कैमरा दृश्य का उपयोग कर नकसीर के लिए बायोप्सी साइट की जांच करना। नकसीर मनाया जाता है, तो एक खारा moistene जगहप्रवेशनी के माध्यम से घ बाँझ कपास पट्टी और बायोप्सी साइट के लिए दबाव डालते हैं। वैकल्पिक रूप से, hemostasis सहायता करने के लिए बाँझ जेल फोम के साथ बायोप्सी साइटों पैक।
    6. चरण दोहराएं 2.5.5 के माध्यम से 2.5.3 अतिरिक्त जिगर बायोप्सी प्राप्त करने के लिए।
      नोट: यहाँ, प्रक्रिया के अनुसार पशु प्रति 3 बायोप्सी एकत्र किए गए थे, जो सभी नीचे की ओर विश्लेषण के लिए पर्याप्त है।
  6. सर्जिकल बंद
    1. खून बह रहा है के लिए उदर गुहा की जांच करना।
      नोट: यह तारीख करने के लिए नहीं हुआ। हालांकि, अगर बहुत ज्यादा खून बहने का उल्लेख किया है, नकसीर की साइट का निर्धारण और बाँझ कपास के फाहे या जेल फोम के उपयोग के साथ दबाव के माध्यम से उचित hemostasis प्रदान करते हैं।
    2. insufflator बंद कर दें और प्रवेशनी stopcocks खोलें। पेट के लिए कोमल मैनुअल दबाव लागू पूरी तरह से पेरिटोनियल गुहा depressurize करने के लिए। cannulas निकालें।
    3. साइट प्रति 1 से 2 सरल बाधित टांके के साथ पेट की दीवार चीरों में से प्रत्येक को बंद करें। 4-0 से अवशोषित टांका सिफारिश की है।
    4. स्थानीय analgesia के लिए त्वचा बंद करने से पहले प्रत्येक चीरा में 0.1-0.3 सीसी Bupivacaine रखकर एक छप ब्लॉक निष्पादित करें।
    5. साइट प्रति 2 दफन बाधित टांके (4-0 अवशोषित टांका की सिफारिश की है) - 1 के साथ त्वचा को बंद करें। ऊतक गोंद लागू किया जा सकता है।

3. यकृत की बायोप्सी प्रसंस्करण और लिम्फोसाइट विश्लेषण

  1. जिगर ऊतक के कई टुकड़े स्टोर (लगभग 0.5 मिमी x 0.5 मिमी x 0.5 आकार में मिमी) क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूबों में, एक पसंदीदा आरएनए भंडारण समाधान में, और भविष्य आणविक और ऊतकीय के लिए 10% formalin विश्लेषण करती है।
    1. 50 RPMI के एमएल 1640 मध्यम एक ढक्कन के साथ एक बाँझ 250 एमएल प्लास्टिक कप में 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलैजिनेज़ समाधान के 40 माइक्रोग्राम / एमएल, और 4 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर DNase के साथ पूरक में शेष जिगर बायोप्सी रखें। सख्ती एक चुंबकीय हलचल बार और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हलचल प्लेट का उपयोग कर हलचल।
  2. समान रूप से पचा ऊतक डालने का कार्य द्वारा वितरित करते हैं। जीआरदो 70 सुक्ष्ममापी फिल्टर से अधिक (कदम 3.1.1 से) पचा ऊतक इंडस्ट्रीज़ एक बाँझ 5 एमएल सिरिंज के अंत का उपयोग कर किसी एकल कक्ष निलंबन में दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में फिट। 1640 मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (R10) के साथ पूरक RPMI में 50 एमएल के लिए दोनों ट्यूबों की मात्रा ले आओ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 840 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना। 5 एमएल R10 में दोनों ट्यूबों से कोशिकाओं को निलंबित और एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में संयोजन के द्वारा एक भी 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं ध्यान लगाओ। R10 का उपयोग कर 50 एमएल मात्रा ले आओ। एक hemocytometer का उपयोग सेलुलर उपज निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गणना करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 840 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। , 1 एमएल R10 में कोशिकाओं Resuspend दो 5 एमएल दौर नीचे polystyrene ट्यूबों में समान रूप से वितरित करने और R10 के साथ 4 एमएल के लिए प्रत्येक ट्यूब की मात्रा लाने के लिए, प्रत्येक ट्यूब में> 500,000 कोशिकाओं के लिए चुन सकते हैं।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 840 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। छानना रोंupernatant और 4 एमएल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में सेल गोली resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 840 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. सतह पर तैरनेवाला छानना और धीरे vortexing से पीबीएस के 100 μL में कोशिकाओं resuspend। एक सुधारी जा सकने वाली मृत सेल दाग के 1.5 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  6. निर्माता द्वारा सिफारिश की titers में निम्नलिखित undiluted सतह धुंधला एंटीबॉडी जोड़ें: CD45-PerCP (क्लोन D058-1283), CD3-PE-CF594 (क्लोन SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (क्लोन 2H7), सीडी 4-BV605 ( क्लोन OKT4), CD8-BV570 (क्लोन जन प्रतिनिधि कानून-T8), और CD14-BV785 (क्लोन M5E2)। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 840 XG पर 4 एमएल पीबीएस और अपकेंद्रित्र जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला छानना और पीबीएस में 1% paraformaldehyde के 250 μL में कोशिकाओं resuspend।
    सावधानी: Paraformaldehyde विषैला होता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  8. कोशिकामापी के रूप में संदर्भ 22 में वर्णित एक प्रवाह का उपयोग कोशिका जनसंख्या का विश्लेषण करें।

Representative Results

इन अंगों में laparoscopically एकत्र MLN के प्रसंस्करण के लिए विस्तृत तरीकों, साथ ही सेलुलर पैदावार, और ल्युकोसैट फ़्रीक्वेन्सियों का 13 सूचित किया गया है। चित्रा 1 सेलुलर उपज और व्यवहार्यता डेटा MLN तुलना और जिगर बायोप्सी इस लेप्रोस्कोपिक तकनीक का उपयोग कर दो स्वस्थ महिला आरएमएस से 160 दिनों के अलावा दो समय बिंदुओं पर एकत्र पता चलता है। हमने पाया MLN से सेलुलर उपज जिगर (पी = 0.0021) से की तुलना में काफी अधिक था कि, प्राप्त क्रमश: 33.5 x 10 6 और 6.74 x 10 6 कोशिकाओं के औसत के साथ। मृत सेल धुंधला और फ्लो द्वारा विश्लेषण संकेत दिया कि दोनों अंगों से अलग कोशिकाओं के> 90% व्यवहार्य थे।

प्रवाह cytometry का उपयोग करना, हम मूल्यांकन और ल्यूकोसाइट्स और MLN और जिगर में लिम्फोसाइटों की बहुतायत की तुलना में। जिगर के लिए एक प्रतिनिधि gating योजना में दिखाया गया है + कोशिकाओं, और अंत में CD3 + कोशिकाओं के चयन के द्वारा, एकल कोशिकाओं पर गेटेड समुच्चय को बाहर करने के पीछे हो लिए। CD3 + जनसंख्या से, हम सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं की प्रचुरता का मूल्यांकन किया है, हम CD3- आबादी से CD14 + और CD20 + कोशिकाओं की प्रचुरता का मूल्यांकन किया है। 0 दिवस और दिन 160 में CD45 + और CD3 + MLN से आबादी और दोनों पशुओं के जिगर दिखा भूखंडों cytometry प्रतिनिधि प्रवाह, 3 चित्र में दिखाया जाता है, जबकि चित्रा 4 दो जानवरों के दो नमूनों के लिए ल्युकोसैट और लिम्फोसाइट प्रचुरता को दर्शाता है। MLN से यकृत (औसत 76.9% और व्यवहार्य कोशिकाओं क्रमशः 7.66%, पी = 0.0002) किया CD45 + कोशिकाओं की काफी अधिक प्रचुरता से पता चला है। आश्चर्य नहीं कि MLN CD3 + टी कोशिकाओं की काफी अधिक अनुपात (पी से पता चला0; 0.0001) और सीडी 4+ टी कोशिकाओं (पी = 0.0004)। इसके विपरीत, जिगर काफी MLN (पी = 0.0036) की तुलना में CD14 + ल्यूकोसाइट्स के लिए समृद्ध किया गया था। MLN CD8 + टी कोशिकाओं के एक उच्च औसत से पता चला है, लेकिन इस महत्वपूर्ण नहीं था। हैरानी की बात है, इन दोनों जानवरों के लिए दोनों अंगों CD20 + बी कोशिकाओं के समान प्रचुरता का प्रदर्शन किया। सेलुलर पैदावार और MLN से अलग ल्युकोसैट और लिम्फोसाइट सबसेट की प्रचुरता इस अध्ययन पहले से इस बात की पुष्टि में मानों 23 की सूचना दी।

आकृति 1
चित्र 1 कुल सेलुलर यील्ड (ऊपर) और सेल व्यवहार्यता (नीचे) Serially एकत्र MLN और लीवर बायोप्सी से। MLN काफी अधिक सेल पैदावार से जिगर किया दिखाया। हालांकि, दोनों नमूना प्रकार नीचे की ओर विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान की है। सेल व्यवहार्यता, प्रवाह cytom द्वारा मापाetrically एक सुधारी जा सकने वाली मृत सेल अमाइन दाग का उपयोग कर, पता चला है कि दोनों नमूना प्रकार आम तौर पर सामने आए ऊतक पृथक्करण के बाद> 90% सेल व्यवहार्यता। त्रुटि बार नमूने के बीच मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि फ्लो गेटिंग रणनीति। सबसे पहले, एकत्रित कोशिकाओं एक सुधारी जा सकने वाली मृत सेल अमाइन दाग का उपयोग कर धुंधला के बाद बाहर रखा गया, केवल व्यवहार्य कोशिकाओं के चयन के बाद। इसके बाद, CD45 + ल्यूकोसाइट्स, चयन किया गया था CD3 + टी कोशिकाओं के चयन के बाद। CD3 + जनसंख्या से, सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं विश्लेषण किया गया। CD3 से - जनसंख्या, CD14 + और CD20 + कोशिकाओं विश्लेषण किया गया। थी रों gating रणनीति भी MLN के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
MLN और दो पशु Longitudinally के लीवर से चित्रा 3. फ्लो भूखंड। MLN और जिगर नमूने दोनों जानवरों के लिए 160 दिनों के अलावा एकत्र किए गए थे। (ए)। MLN CD45 + कोशिकाओं (ल्यूकोसाइट्स); (बी) लिवर CD45 + कोशिकाओं (ल्यूकोसाइट्स); (सी) MLN + CD3 + कोशिकाओं (टी कोशिकाओं); (डी) लिवर CD3 + कोशिकाओं (टी कोशिकाओं)। दोनों जानवरों के लिए, MLN जिगर की तुलना में CD45 + और CD3 + कोशिकाओं की उच्च अनुपात दिखाया। समय के पार, इन आबादियों की आवृत्तियों दोनों जानवरों के लिए समान थे।एस / ftp_upload / 55,617 / 55617fig3large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. CD45 + कोशिकाओं (बाएं) की आवृत्ति और विभिन्न ल्युकोसैट और लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या (दाएं) 23 अलग-अलग नमूनों के पार। MLNs, CD45 +, CD3 +, और सीडी 4 + कोशिकाओं के अधिक से अधिक महत्वपूर्ण आवृत्तियों दिखाया गया है, जबकि जिगर CD14 + ल्यूकोसाइट्स का अधिक से अधिक महत्वपूर्ण आवृत्तियों से पता चला है, प्रत्येक अंग की अनूठी कार्यों का प्रदर्शन है। त्रुटि बार नमूने के बीच मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम MLN के सीरियल संग्रह और जिगर बायोप्सी के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक है कि इस अध्ययन में वर्णित नहीं इन और अन्य जानवरों में एक 100% सफलता दर पड़ा का प्रदर्शन। इसके अलावा, समय में एक ही जानवरों पर इस तकनीक का उपयोग किसी भी प्रतिकूल घटनाओं के साथ जुड़ा नहीं किया गया है। दरअसल, कोई जानवरों के अन्य साथियों में इस तकनीक कि SIV, बंदर / मानव इम्यूनो वायरस (शिव), या Zika वायरस (अप्रकाशित डेटा) से संक्रमित थे के उपयोग से उत्पन्न जटिलताओं किया गया है। इसी तरह, इस सर्जरी जानवरों है कि पहले, प्रमुख पेट की सर्जरी आया था में भी और थ्रोम्बोसाइटोपेनिक जानवरों (अप्रकाशित डेटा) में सफल साबित हुई। हम दिखा दिया है कि इन नमूनों जब जिगर को MLN से स्विच अतिरिक्त चीरों के लिए जरूरत से बचने कैमरा स्थान पीछे से एक ही दो बंदरगाहों के माध्यम से एकत्र किया जा सकता। MLN के संग्रह प्रभावित करने वाले कारक पहले से 13 सूचित किया गया है।

पूरा करने के लिए 45 मिनट और दो ~ 0.5 सेमी चीरों के माध्यम से पूरा किया है - पूरी प्रक्रिया आम तौर पर 30 लेता है। मोटापे से ग्रस्त पशुओं में, यह एक बड़ा चीरा बनाने के लिए आवश्यक हो सकता है (~ 1 - 1.5 सेमी) के माध्यम से MLN पुनः प्राप्त करने और पूरा करने के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता हो सकती है। व्यापक mesenteric वसा के साथ पशु अक्सर घ के लिए महत्वपूर्ण अनुभव की आवश्यकताआसपास के वसा से MLN ifferentiate। MLN अक्सर mesenteric वाहिका संरचना के साथ मिल गया और जहाजों में शाखा अंक के पास और अधिक प्रचलित होने लगते रहे हैं। इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि यह चयनित MLN की आवश्यकता है अन्त्रपेशी में पर्याप्त गतिशीलता के लिए पेट चीरा के माध्यम से exteriorized जा रहा है। नतीजतन, इस तकनीक अन्त्रपेशी की जड़ तक MLN पास इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। आवर्धन के कारण, यह आसान कई बार कैमरे के साथ MLN पहचान करने के लिए, और MLN के करीब निकटता में लोभी पता लगाने और एक बार यह exteriorized है नोड की पहचान करने के साथ मदद कर सकते हैं।

Trendelenburg स्थिति का उपयोग हमेशा MLN संग्रह के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है, और अगर MLN आसानी से Trendelenburg स्थिति के उपयोग के बिना प्राप्त किया जा सकता है यह जिगर बायोप्सी आसान के रूप में यह cranially स्थानांतरण से अंगों पाएगा कर सकते हैं। कभी-कभी, Trendelenburg स्थिति में नियुक्ति के बाद, जिगर अप डायाफ्राम और चाहिए के खिलाफ स्थानांतरित कर दिया है धीरे स्थिति बायोप्सी संग्रह करने से पहले में वापस हेरफेर किया जा। MLN संग्रह के लिए बंदरगाह नियुक्ति बाईं ओर है, जिगर बायोप्सी आमतौर पर छोड़ दिया पार्श्व और बाईं औसत दर्जे का जिगर पालियों से लिया के रूप में वे प्रवेशनी के करीब हैं कर रहे हैं।

MLN एकत्र और जिगर बायोप्सी नीचे की ओर विश्लेषण की एक किस्म के लिए पर्याप्त सेल पैदावार प्रदान की है और एकत्र कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता दिखाया। इधर, कोशिकाओं ल्युकोसैट और लिम्फोसाइट आबादी के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए दाग रहे थे, और इन दो महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा अंगों के बीच मुख्य अंतर स्पष्ट कर रहे थे। उदाहरण के लिए, MLN अत्यधिक, जिगर की तुलना में सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध थे भड़काऊ के प्रबंधन के लिए एकत्र करने और, साथ ही सीडी 4+ टी के महत्व को अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रसार के लिए केंद्रीय बिंदु के रूप में MLN के महत्व के कारण और परिवेश को tolerogenic प्रतिक्रियाओं आहार का सेवन और सैनिक-निवासी सूक्ष्मजीवों से व्युत्पन्न एंटीजनरों = "xref"> 24। हालांकि, जिगर काफी MLN की तुलना में CD14 + ल्यूकोसाइट्स के लिए समृद्ध किया गया था। CD14 monocytes और मैक्रोफेज पर मुख्य रूप से व्यक्त किया है और बैक्टीरियल lipopolysaccharide (LPS) 25 रिसेप्टर परिसर का एक महत्वपूर्ण घटक है है। दरअसल, घुलनशील CD14 की वृद्धि की प्लाज्मा सांद्रता माइक्रोबियल अनुवादन और एचआईवी प्रतिरक्षा सक्रियण और रोगजनक SIV के संक्रमण 26 के साथ जुड़े रहे हैं। इस प्रकार, जिगर में CD14 + ल्यूकोसाइट्स का उच्च आवृत्तियों की संभावना इस अंग में एक बड़ी बैक्टीरियल बोझ से परिणाम जब MLN की तुलना में।

यहाँ, हम MLN के सीरियल संग्रह और जिगर बायोप्सी लेप्रोस्कोपिक प्रविष्टि है कि किसी भी प्रतिकूल परिणामों के लिए नेतृत्व नहीं किया है के लिए केवल दो छोटे चीरों प्रयोग करने के लिए एक तेजी से और न्यूनतम इनवेसिव सर्जिकल तकनीक का प्रदर्शन। इन नमूनों कुंजी प्रतिरक्षाविज्ञानी, विषाणुजनित, और सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रक्रियाओं है कि पीएलए लेने का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी मार्ग प्रदानMLN और जिगर, जो अलग और प्रणालीगत प्रतिरक्षा से अलग हैं इस में सीई। इसी तरह, जिगर बायोप्सी एचआईवी / SIV, नशीली दवाओं के उपचार, और translocated रोगाणुओं का प्रभाव है, जो अक्सर महत्वपूर्ण जिगर की क्षति 16 प्रेरित करने के लिए गठबंधन की लंबी अवधि के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, चूंकि MLN और जिगर प्रतिरक्षा सैनिक माइक्रोबायोटा के संपर्क में अंग होते हैं, की क्षमता समय में इन अंगों में प्रतिरक्षा मूल्यांकन करने के लिए भूमिका है कि Microbiome मेजबान प्रतिरक्षा homeostasis को बनाए रखने में नाटकों को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है। एक साथ लिया, जिगर के मूल्यांकन और MLN टीका और चिकित्सीय efficacies, SIV वायरल जलाशय निकासी, और सामान्य श्लैष्मिक उन्मुक्ति के संदर्भ में प्रमुख महत्व का है। एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण के माध्यम से इन नमूनों को इकट्ठा करने की क्षमता का मतलब प्रक्रिया वर्तमान में प्रकाशित तकनीक और पशुओं के शरीर क्रिया विज्ञान पर कम प्रभाव के साथ मौजूद है की तुलना से संबंधित सूजन का जोखिम कम होता है। फू मेंसंरचना, हम प्रतिरक्षा प्रणाली का एक अन्य महत्वपूर्ण और विशिष्ट बात यह है कि में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है के नमूने के लिए अनुमति देने के लिए एक ही दो बंदरगाह स्थानों के माध्यम से तिल्ली का संग्रह के साथ MLN के संग्रह और जिगर गठबंधन करने के लिए संभावित मूल्यांकन करेंगे रोग मॉडल की एक संख्या।

Disclosures

लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।

Acknowledgments

इस काम एनआईएच अनुदान संख्या P51OD010425 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment Patterson Veterinary 97-890-8152
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub Patterson Veterinary 07-842-6153
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% Patterson Veterinary 07-869-6434
Vedco Vetadine Scrub Patterson Veterinary 07-869-6772
Hospira Lactated Ringer's 250 mL Patterson Veterinary 07-800-9325
Adolescent Laparotomy Surgical Drape Medline DYNJP3004
Access 40 L Insufflator Dyonics 7205832
300XL Xenon Light Source Dyonics 7206084
460P 3 – CCD Digital Camera with Head Dyonics 72200086
Universal Camera Drape, 7” x 96” Endoscopy Support Services ESS-6920
Universal Light Guide, 7.5 Ft Endoscopy Support Services US.OU225
Insufflator Tubing Endoscopy Support Services TM-102
Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree Endoscopy Support Services B30-0007-00
Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock Endoscopy Support Services B10-0025-00
Rigid scope, 5 mm x 300 mm Endoscopy Support Services B30-0071-00
Veress Needle, 2 mm x 80 mm  Endoscopy Support Services 8302.08
Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm Endoscopy Support Services 8383.661
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm   Endoscopy Support Services 8390.2054
Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm R. Wolf 8391.4063
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm Endoscopy Support Services 8903.072
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm Endoscopy Support Services 8919.333
Blunt Tip Trocar Endoscopy Support Services 8903.101
Pyramidal Tip Trocar Endoscopy Support Services 8903.121
CO2 Airgas CD USPE
RPMI 1640 Fisher Scientific SH30027FS with L-Glutamine
RNAlater Stabilization Solution ThermoFisher Scientific AM7021
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Liberase TM Research Grade Sigma Aldrich 5401119001 Commercially available colleganse solution
Dnase I from bovine pancrease Sigma Aldrich D5025
70 µm cell strainers Morganville Scientific CSS0200
5 mL Syringe BD 309646
50 mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339652
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003
5 mL Round-Bottom polystyrene tubes Fisher Scientific 14-959A
PBS Fisher Scientific SH3025601
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34957 Amine dead cell stain
CD45-PerCP (clone D058-1283) BD Biosciences 558411
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) BD Biosciences 562406
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) Biolegend 317438
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) BD Biosciences 560179
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) BD Biosciences 555624
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) BD Biosciences 563698
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN Fisher Scientific 50-980-487
LSR II Flow Cytometer BD NA

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References

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Zevin, A. S., Moats, C., May, D.,… More

Zevin, A. S., Moats, C., May, D., Wangari, S., Miller, C., Ahrens, J., Iwayama, N., Brown, M., Bratt, D., Klatt, N. R., Smedley, J. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. J. Vis. Exp. (123), e55617, doi:10.3791/55617 (2017).

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