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Neuroscience

से पूरे सेल वोल्ट क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि Published: June 13, 2017 doi: 10.3791/55627
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge
* These authors contributed equally

Summary

ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर से होल-सेल रिकॉर्डिंग, विभिन्न स्थितियों के तहत सहज अंधेरे धक्कों, क्वांटम बाम्प्स, प्रकाश के लिए मैक्रोस्कोपिक प्रतिक्रियाओं, और वर्तमान-वोल्टेज रिश्तों की माप को सक्षम करते हैं। डी। मेलानोगस्टर आनुवंशिक हेरिपूल उपकरण के संयोजन के साथ, यह विधि सर्वव्यापी इनोसिटोल-लिपिड सिग्नलिंग मार्ग और उसके लक्ष्य, टीआरपी चैनल के अध्ययन को सक्षम बनाता है।

Abstract

ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर से पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग ने एकल-अणु स्तर पर inositol-lipid सिग्नलिंग और क्षणिक रिसेप्टर पोटेंशियल (टीआरपी) चैनलों का अध्ययन करने के लिए डी। मेलेनोगास्टर आणविक आनुवंशिकी के उपयोग को सक्षम करने के लिए, अकशेरुकीय दृश्य ट्रांसडक्शन के क्षेत्र में क्रांति लाई है। कुछ उपयोगी प्रयोगशालाओं ने इस शक्तिशाली तकनीक को हासिल किया है, जो अत्यधिक नियंत्रित परिस्थितियों में प्रकाश के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। इस तकनीक को इंट्रासेल्युलर और बाह्य मीडिया पर नियंत्रण की अनुमति है; झिल्ली वोल्टेज; और फार्माकोलॉजिकल यौगिकों का तेजी से प्रयोग, जैसे विभिन्न प्रकार के ईओणिक या पीएच संकेतक, इंट्रा- और बाह्य मीडिया के लिए। एक असाधारण उच्च संकेत-टू-शोर अनुपात के साथ, यह विधि अंधेरे सहज और हल्के प्रेरित एकात्मक धाराओं ( यानी सहज और क्वांटम बाउंस) और मैक्रोस्कोपिक हल्की प्रेरित धाराओं (एलआईसी) के पाप से सक्षम बनाता हैगैले डी। मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर इस प्रोटोकॉल का विस्तार, महान विवरण में, इस तकनीक को करने के लिए आवश्यक सभी प्रमुख कदम हैं, जिसमें इलेक्ट्रोफिजिकल और ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग दोनों शामिल हैं। बाथ चेंबर में बरकरार और व्यवहार्य पूर्व विवो पृथक ओम्पटिडिया की प्राप्ति के लिए मक्खी रेटिना विच्छेदन प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। पूरे सेल और प्रतिदीप्ति इमेजिंग मापन करने के लिए आवश्यक उपकरण भी विस्तृत हैं। अंत में, विस्तारित प्रयोगों के दौरान इस नाजुक तैयारी का उपयोग करने में नुकसान समझाया गया है।

Introduction

फलों के उड़ने के व्यापक आनुवंशिक अध्ययन, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ( डी। मेलेनोगस्टर) , 100 से ज्यादा साल पहले की शुरुआत की, ने डी। मेलेनोगास्टर फ्लाई को जटिल जैविक प्रक्रियाओं के आनुवंशिक विच्छेदन के लिए एक अत्यंत उपयोगी प्रायोगिक मॉडल के रूप में स्थापित किया है। नीचे वर्णित पद्धति डी। मेलेनोगास्टर आणविक जेनेटिक्स की संचित शक्ति को पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के उच्च संकेत-टू-शोर अनुपात के साथ जोड़ती है। यह संयोजन डी। मेलेनोगास्टर फोटोट्रैंसडक्शन के अध्ययन के लिए इनोसिटोल -लिपिड सिग्नलिंग और टीआरपी चैनल विनियमन और सक्रियण के एक मॉडल के रूप में, देशी वातावरण में और एकल अणुओं के उच्चतम संकल्प में, दोनों के लिए अनुमति देता है।

डी। मेलेनोगास्टर फोटोरिसेप्टर के लिए पूरे सेल रिकॉर्डिंग विधि के आवेदन ने अकशेरुबेट फोटोट्रैंसडक्शन के अध्ययन में क्रांति ला दी है। यह विधि हार्डी 1 और इंडेप द्वारा विकसित की गई थीअंततः रंगनाथन और सहयोगियों द्वारा 2 ~ 26 साल पहले और डी। मेलेनोगास्टर के व्यापक आनुवंशिक हेरिपूल टूल का फायदा उठाने के लिए डिजाइन किया गया था और उन्हें फोटोट्रैंसडक्शन और इनॉसिटोल-लिपिड सिग्नलिंग के तंत्र को उजागर करने के लिए उपयोग किया गया था। सबसे पहले, इस तकनीक को प्रकाश संवेदनशीलता में तेजी से कमी और विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान ओम्पटिडिया की कम उपज से सामना करना पड़ा, जिससे विस्तृत मात्रात्मक अध्ययनों को रोका गया। बाद में, पैट विंदुक में एटीपी और एनएडी के अलावा नाटकीय रूप से लंबे समय तक मात्रात्मक रिकॉर्डिंग की तैयारी की उपयुक्तता बढ़ गई है। इसके बाद, आणविक स्तर पर संकेत-पारगमन तंत्र के व्यापक लक्षण वर्णन का एहसास हो गया।

वर्तमान में, डी। मेलेनोगास्टर फोटोट्रैंसडक्शन, कुछ प्रणालियों में से एक है जिसमें फ़ॉस्फोइनोसिटि सिग्नलिंग और टीआरपी चैनल एकल-अणु संकल्प पर पूर्व विवो का अध्ययन किया जा सकता है। यह डी। मेलानोगास्टर फोटोट्रैंसडक्शन बनाता है और मुझेथोडोलॉजी इस तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उच्च संवेदनशील मॉडल प्रणाली का विकास किया। इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि डी। मेलेनोगास्टर रेटिना का टुकड़ा कैसे निकालना है और आसपास के रंगद्रव्य (ग्लिया) कोशिकाओं से अलग-थलग ओम्पटिडिया को यंत्रवत् रूप से पोंछते हैं। यह फोटोकॉसेप्टर सेल बॉडी पर गिगा-सील और पूरे सेल पैच क्लैंप के गठन को सक्षम करता है। सौभाग्य से, सबसे सिग्नल प्रोटीन रबदोमरे तक सीमित हैं और फैलाना नहीं है। इसके अलावा, सिग्नलिंग कम्पार्टमेंट और सेल बॉडी 3 , 4 और माइक्रो + 5 सीए में Na + / Ca 2+ एक्स्चेंजर (कैलक्स) के उच्च अभिव्यक्ति स्तर के बीच स्थित कैल्फोटीन नामक एक स्थिर सीए 2 + बफर है। साथ में, रबदोमरे, कैल्फोोटिन बफर और कैल्क्स की उच्च अभिव्यक्ति के लिए प्रोटीन कारावास अपेक्षाकृत लंबे समय तक ( अर्थात ~ 20 मिनट तक) पूरे सेल रिकॉर्डिंग, आवश्यक घटकों के नुकसान के बिना अनुमति देता हैफोटोट्रैंसडक्शन प्रक्रिया की और प्रकाश को उच्च संवेदनशीलता बनाए रखते हुए निम्न प्रोटोकॉल का वर्णन है कि पृथक ओम्पटिडिया कैसे प्राप्त करें और पूरे सेल रिकॉर्डिंग को प्रदर्शित करें जो फोटोट्रैंसडक्शन कैस्केड के मूल गुणों को संरक्षित करते हैं। अलग-अलग तिलचट्टा ( पेरिप्लानेटा अमेरीकाना ) 6 और क्रिकेट ( ग्रीलस बिमानुलेटस ) पर पूरे सेल पैच क्लैंप प्रयोग 7 ओममटिडिया इसी तरह डी। मेलेनोगास्टर के लिए वर्णित किए गए थे। इसके अलावा, फ़ाइल क्लैम, ( लीमा स्कैरा ) और स्कैलप ( पक्टेन ईराडियन ) के अलग-अलग फोटोरिसेप्टर पर पैच क्लैंप प्रयोगों को डी। मेलेनोगास्टर पर आयोजित एक अलग तरीके से किया गया , जिससे पूरे सेल 8 और सिंगल-चैनल माप की अनुमति मिलती है 9 यहां, इस तकनीक का उपयोग करके डी। मेलेनोगास्टर में प्राप्त प्रमुख उपलब्धियों का वर्णन किया गया है। चर्चा iइस तकनीक के कुछ नुकसान और सीमाओं के वर्णन को शामिल नहीं करता है।

Protocol

1. अभिकर्मक तैयारी

नोट: तालिका 1-4 में दिए गए निर्देशों के अनुसार सभी समाधान तैयार करें

  1. अतिरिक्त समाधान के साथ 10 एमएल सिरिंज भरें (ES या ES-0Ca 2+ ; आवश्यकतानुसार, तालिका 1 देखें) और इसे बर्फ पर रखें
  2. ट्राटट्यूशन सॉल्यूशन (टीएस; तालिका 2 ; यानी ईएस या ईएस -1 सीए 2 + + एफबीएस और सोक्रोस देखें) के एक शीशी को तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें
  3. प्रयोग के लिए पर्याप्त ES तैयार करें और जब तक आवश्यक न हो तब तक इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: सतत स्नान छिड़काव की आवश्यकता नहीं है, इसलिए ES की मात्रा कुछ दर्जन एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  4. एक 22 माइक्रोन पीवीडीएफ फिल्टर का प्रयोग, लम्बी टिप भरने वाले इलेक्ट्रोड के साथ 1 एमएल सिरिंज में इंट्रासेल्युलर समाधान ( तालिका 3 या तालिका 4 देखें ) लोड करें इसे बर्फ पर रखें

2. विदारक उपकरण के सामान्य सेटअप


चित्रा 1: अलग-अलग Ommatidia तैयारी बनाने के लिए आवश्यक उपकरणों और उपकरणों। अलग-अलग प्रोटोकॉल में बताए गए अनुसार, अलग-अलग ओम्पटिडिया तैयारी बनाने के लिए आवश्यक विभिन्न डिवाइस चित्र दिखाते हैं। दो बीकर, एक पानी ( ए ) से भरा हुआ और दूसरा ट्रिटिंग पॉइप्टेस ( डी ) को साफ करने के लिए इथेनॉल ( बी ) से भर गया, जो टयूबिंग ( सी ) से जुड़ा हुआ है। विच्छेदन उपकरण हैं: ठीक के 2 जोड़े और मोटे चिमटी ( एफ ) और एक रेटिना स्कूपर ( ई ) की 1 जोड़ी। रेटिना स्कूटर को तैयार करने के लिए, एक सूक्ष्म विच्छेदन सुई ( एच ) को दो खराद उपकरणों के बीच दबाया जाता है जो सुई ( I ) के शीर्ष को समतल करने के लिए उपाध्यक्ष ( जी ) के रूप में कार्य करते हैं। तो यह एक लम्बी पीआई से जुड़ा हुआ है गोंद ( जे ) का उपयोग धातु की ईसीई और सुई धारक ( ई ) पर घुड़सवार। रेज़र ब्लेड चिप और धारक: रेजर ब्लेड होल्डर ( कश्मीर ) का उपयोग करके रेजर ब्लेड की एक छोटी त्रिकोणीय चिप को तोड़कर माउंट करें। विच्छेदन कार्य क्षेत्र दो प्रकाश गाइड ( एन ) के साथ एक द्विनेत्री ( एल ) और एक शांत लाल बत्ती स्रोत (( एम) ) से बना है। चिमटी ( एफ ), रेटिना स्कूअर ( ई ), बीकर ( ए और बी ), लाल फिल्टर ( क्यू ) के साथ एक टॉर्च, और नाजुक वाइपर ( आर ) द्विनेत्री के दोनों किनारों पर स्थित विच्छेदन उपकरण शामिल हैं ES के साथ एक बर्फ की बाल्टी, एफबीएस-ईएस, इंट्रासेल्युलर सॉल्यूशन सिरिंज, 60 मिमी पेट्री डिश ( एस ), और इलेक्ट्रोड धारक ( पी ) को भी मेज पर रखा गया है। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड क्षैतिज पुलर ( टी ) का उपयोग कर खींच रहे हैंE.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. रेटिना को अलग करने के लिए एक रेटिना स्कूटर का निर्माण करें
    1. दो विषाणु जबड़े के बीच सूक्ष्म विच्छेदन की सुई (कीटनाशक सुई, 12 मिमी लंबाई, 0.1 मिमी व्यास) के बिंदु (1-4 मिमी) डालें और उसे एक छोटे हथौड़ा से दोहन करके समतल करें।
    2. एक सूक्ष्म विदारक सुई धारक (सामग्री की तालिका देखें) पर चपटा सुई माउंट करें।
    3. चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके, सुई के चोटीदार अंत को वक्र बनाना, ~ 2.5 मिमी की वक्रता के साथ एक हुक बनाने के लिए।
  2. Ommatidia जुदाई के लिए ट्रिप्रेशन पिपेट बनाएं।
    1. 1.2 इंच 0.68 मिमी (ओडी एक्स आईडी) ग्लास केशिका को एक खुली लौ पर रखें और फायर पॉलिश करें ताकि इसे खोलने के लिए कम किया जा सके।
    2. माइक्रोस्कोप के तहत केशिका खोलने के आकार को मापें। बनाये गये ओम्पटिडियल ट्रिप्रेशन पिपेट को सीवे में सॉर्ट करेंअपने समूहों के आकार के अनुसार एन समूह ( यानी 0.2-0.5 मिमी) उन्हें अलग उपयुक्त कंटेनर ( उदाहरण के लिए टेस्ट ट्यूब) में रखें।
    3. डबल डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीडब्ल्यू) के साथ एक छोटे से बीकर और 70% इथेनॉल के साथ एक और छोटी बीकर भरें। प्रत्येक बीकर को पैराफिन फिल्म शीट के साथ कवर करें
    4. डीडीडब्ल्यू बीकर को कवर पैराफिन फिल्म शीट में एक छोटा छेद लगाओ ( चित्रा 1 ए देखें)।
    5. इरेनॉल बीकर को कवर करने वाली पैराफिन फिल्म शीट में सात छोटे छेदों को छूएं और 0 से 6 तक छेदों की संख्या देखें ( चित्रा 1 बी देखें)।
    6. हर पैराफिन फिल्म छेद में प्रत्येक आकार समूह से एक ओम्मेटिडिअल ट्रिप्रेशन विंदुक रखें, जैसे कि सबसे बड़ा उद्घाटन वाला विंदुक 0 वीं छेद में स्थित है और सबसे छोटा खोलने वाला विंदुक 6 छेद में स्थित है।
    7. एक 35 सेमी लंबे, 1.57 एक्स 1.14-मिमी (ओडी एक्स आईडी) पॉलीथीन टयूबिंग का टुकड़ा करने के लिए एक प्लास्टिक 200 μL विंदुक टिप से कनेक्ट करें। कनेक्शनटयूबिंग के दूसरे छोर को ओम्मॅटिडियल ट्रिप्रेशन पाइपेट्स में से किसी एक को खोलने ( यानी 0.46 - 0.5 मिमी) के साथ, यह सुनिश्चित करना कि ट्रिटिशन विंदुक के बिंदु को टयूबिंग में नहीं सामना करना पड़ रहा है।
  3. 1 x 0.58 मिमी (ओडी एक्स आईडी) से पैच दबाना पिपेट खींचकर संपूर्ण सेल रिकॉर्डिंग पिपेट तैयार करें जिसमें ग्लास केशिकाओं वाले बोरोजिलेट फिलामेंट हैं।
    नोट: पोटेशियम ग्लूकोनेट-आधारित इंट्रासेल्युलर सॉल्यूशन (आईएस 1) का प्रयोग करते समय पिपेट्स का प्रतिरोध 8-15 एम.ओ. होना चाहिए। किसी भी उपयुक्त पैच विंदुक खींचने का इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें) आग-चमकाने की आवश्यकता नहीं है
  4. पिघला हुआ पैराफिन या उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल का उपयोग करते हुए स्नान कक्ष के नीचे एक कवरलिप (सामग्री की तालिका देखें) फिक्स करके एक रिकॉर्डिंग चैंबर तैयार करें ( चित्रा 2 देखें)। इलेक्ट्रोड का उपयोग और छिड़काव की अनुमति देता है कि किसी भी उपयुक्त घर का बना या वाणिज्यिक कक्ष का उपयोग करें।
  5. औंधा माइक्रोस्कोप के स्तर पर स्नान माउंट करें स्नान में छिड़काव प्रणाली ट्यूब, चूषण प्रणाली और जमीन ( यानी एजी-एजीसीएल तार / गोली) रखें ( सामग्रियों की तालिका और चित्रा 2 देखें )।
  6. रेटिना विच्छेदन और ommatidia अलगाव चरणों के दौरान उपयोग के लिए काम की सतह पर ठीक # 5 चिमटी ( चित्रा 1 ) के दो जोड़े रखें।

3. डी। मेलानोगास्टर पालन

  1. उठाना डी। मेलानोगास्टर एक कम जनसंख्या घनत्व ( यानी ~ 6 ऑउंस बोतल में 20 मक्खियों) में 1 9-24 डिग्री सेल्सियस पर बोतल की बोतलों में मक्खियों के साथ मक्खियों को उगलता है।
    नोट: यह अंधेरे से अनुकूलित मक्खियों पर काम करने के लिए बेहतर है। प्रकाश को उच्च संवेदनशीलता बनाए रखने के लिए, विविधता को कम करें और उत्परिवर्ती मक्खियों में रेटिनल अपसरण को रोकें।
  2. प्रयोग से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए अंधेरे में मक्खियों को रियर करें।
    नोट: प्रयोगों के लिए प्रयुक्त मक्खियों को प्राप्त होना चाहिएNtly eclosed (<2 घंटे) और अभी भी नरम, पीला, और meconium प्रदर्शित। ओममेटिडीया भी प्यूपी से तैयार हो सकते हैं, हालांकि उनकी संवेदनशीलता तब होती है जब 10 साल की उम्र में उनकी निर्भरता काफी अधिक होती है।

4. रेटिना विच्छेदन और ओममैटिडिया अलगाव: विकल्प 1

नोट: तैयारी को ठीक से देखने के लिए उपयुक्त एक प्रवर्धन का उपयोग कर त्रिविम ज़ूम माइक्रोस्कोप के तहत निम्नलिखित सभी चरणों को पूरा करें ( चित्रा 1 देखें)।

  1. एएस -0 सीए 2 + के चार बूंदों को रखें और 60 मिमी पेट्री डिश पर टीएस समाधान की एक बूंद रखें जो कि चालू हो गया है।
  2. किसी न किसी चिमटी का उपयोग करते हुए, अपने पंखों या शरीर के द्वारा उड़ने वाला एक नया घिसा हुआ (एक्सलोजन के बाद <2 घंटे) पकड़ो। इस बिंदु से, सभी प्रक्रियाओं को तेजी से और मंद लाल रोशनी के तहत 20 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर करें
  3. अभी तक किसी न किसी चिमटी के साथ मक्खी को पकड़ते समय, शरीर से मक्खी सिर को अलग करने के लिए ठीक चिमटी की पहली जोड़ी का उपयोग करें। Submeपहली ES-0Ca 2+ बूंद में सिर दबाएं
  4. दही चिमटी की दूसरी जोड़ी का उपयोग करते हुए बाण के समान विमान के साथ आधे में सिर काटना। सुनिश्चित करें कि, इस चरण के अंत में, दोनों आंखें अभी भी बरकरार हैं।
  5. दूसरे ES-0Ca 2+ ड्रॉप और दूसरे आधे से तीसरे ES-0Ca 2+ ड्रॉप के लिए सिर का एक आधा स्थानांतरण करें।
  6. ठीक चिमटी का उपयोग करना, संभव के रूप में आंख के आस-पास के ऊतकों को हटा दें और सुनिश्चित करें कि रेटिना के कारण कोई नुकसान नहीं होता है।
  7. ठीक से चिमटी के साथ एक कॉर्निया के किनारे को समझें और स्कूपर का उपयोग करके रेटिना को बाहर निकालना।
    नोट: इस चरण के पूरा होने पर, कॉर्निया खाली और अक्षुण्ण छोड़ा जायेगा, एक अक्षुण्ण रेटिना से अलग हो जाएगा।
  8. डीडीडब्ल्यू के साथ टयूबिंग से जुड़े ट्राटट्रेशन विंदुक को कुल्ला और चौथी बूंद से ईएस-0 सीए 2 + की छोटी मात्रा में पिपेट को भरें।
    नोट: हर बार जब कोई नई ओम्पटिडिया-विभक्त विंदुक का इस्तेमाल किया जाता है और इसे हटा दिया जाता है, तो यह कदम निष्पादित किया जाना चाहिएएम इथेनॉल बीकर (पिपेट को भरने वाला समाधान उस समाधान से मेल खाना चाहिए जिसमें रेटिना डूबे हुए है)।
  9. विंदुक में पृथक रेटिना को आकर्षित करने के लिए मुंह से धीरे-धीरे महाप्राणियों की तरक्की करें। विंदुक में हवा के बुलबुले को खड़ा करने के लिए अति सावधानी बरतें।
  10. टीएस के ड्रॉप में पृथक रेटिना स्थानांतरण। दूसरी आंखों पर भी 4.6-4.10 कदम उठाएं।
  11. नाजुक पोंछे का उपयोग करके ES-0Ca 2+ की बूंदों को मिटा दें, पेट्री डिश पर टेटीज़ की दोनों बूंदों को छोड़ दें। पेट्री डिश के शीर्ष पर टीएस के छह और बूँदें जोड़ें दोनों टीटीएस ड्रॉप में से एक को retinas हस्तांतरण
  12. एक छोटे-व्यास खोलने की विंदुक के साथ त्रिचलन विंदुक बदलें चरण 4.8 में वर्णन के अनुसार, विंदुक को भरने के लिए समाधान के रूप में टीएस का उपयोग करके इसे कुल्ला।
  13. पूरी रेटिना से वर्णक कोशिकाओं को पृथक पृथक ओम्पटिडिया के पृथक्करण से शुरू करने के लिए तेजी से और बार-बार महाद्वीप और दोनों रास्तों को समाप्त करना।
    नोट: पृथक ओममाटीआईडीएस टीएस ड्रॉप में दिखाई दे रहे हैं, और अलगाव की प्रक्रिया की प्रगति के रूप में, टीएस ड्रॉप कम पारभासी होता है।
  14. शेष टीटीआई को अगले टीएस ड्रॉप में स्थानांतरित करें पूरे पूर्व टीएस ड्रॉप (पृथक ओम्पटिडिया युक्त) के साथ विंदुक भरें और स्नान कक्ष में गिरावट को समाप्त करें।
  15. अधिकतम पृथक ओम्पटिडिया को प्राप्त करने के लिए चरण 4.12-4.14 दोहराएं। पृथक ओम्पटिडिया को सिंक करने और स्नान कक्ष के निचले हिस्से में बाँध करने की अनुमति देने के लिए लगभग 1 मिनट की प्रतीक्षा करें।
  16. छिड़काव प्रणाली का प्रयोग, बाथ-चेंबर में 1.5 एमएम सीए 2 + के साथ ES-0Ca 2+ के प्रवाह को प्रारंभ करें। यह सुनिश्चित करें कि कक्ष पूरी तरह से समाधान से भरा है, नीचे से ऊपर, और यह कि जमीन पूरी तरह से समाधान में जलमग्न है। स्नान 4-5x धोने के लिए जारी रखें

5. रेटिना विच्छेदन और ओममैटिडिया अलगाव: विकल्प 2

नोट: एक एम्पली का उपयोग करते हुए, त्रिविम ज़ूम माइक्रोस्कोप के तहत निम्नलिखित सभी चरणों को पूरा करेंतैयारी को ठीक से देखने के लिए उपयुक्त ( चित्रा 1 ) देखें।

  1. रेज़र ब्लेड चिप और धारक तैयार करें। रेजर ब्लेड होल्डर ( चित्रा 1 ) का उपयोग करके रेजर ब्लेड की एक छोटी त्रिकोणीय चिप को तोड़कर माउंट करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सिलिकॉन विच्छेदन डिश / ब्लॉक तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें)
  3. विच्छेदन के लिए, सिलिकॉन विच्छेदन ब्लॉक पर एक बड़ी बूंद (<0.5 एमएल) ईएस समाधान बनायें। एक 60 मिमी पेट्री डिश के लिए टीएस समाधान के दो "जलाशय" बूंदों (~ 50 μL प्रत्येक) जोड़ें
  4. एक नवनिर्मित (<2 एच पोस्ट-इकलोसियन) को स्थिर करें, एक गिलास ट्यूब में बर्फ पर उड़ो और चिमटी का उपयोग करके अपने पंखों से इसे उठाएं। इस बिंदु से, सभी प्रक्रियाओं को तेजी से और मंद लाल रोशनी के तहत 20 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर करें
  5. चिमटी के साथ उड़ान भरने, एक धारक में घुड़सवार एक रेज़र ब्लेड चिप का उपयोग कर उड़ के सिर काट दिया। एक कीट पिन (12 मिमी लंबा,0.1 मिमी व्यास) चिमटी के साथ और आंखों के बीच के सिर को दोहराएं।
  6. संक्षेप में 70% इथेनॉल में सिर डूब; यह सिर के बुलबुले को सिर / आंख की सतह पर बनाने से रोकता है सिलिकॉन विच्छेदन डिश पर ईएस ड्रॉप के तहत सिर को पिन।
  7. आँख के ललाट मार्जिन की रेखा के साथ एक साइडिंग गति का उपयोग करके रेजर ब्लेड चिप का उपयोग करके दोनों आँखों को काट लें।
  8. ठीक से चिमटी के साथ एक कॉर्निया के किनारे को मजबूती से समझें
  9. स्कूटर का उपयोग करके रेटिना को बाहर निकालना।
    नोट: इस चरण के पूरा होने पर, कॉर्निया खाली और अक्षुण्ण छोड़ा जायेगा, एक अक्षुण्ण रेटिना से अलग हो जाएगा।
  10. रेटिना को नुकसान पहुंचाने के बिना, हवा के थैले और अतिरिक्त मस्तिष्क के ऊतकों को दूर करने के लिए धीरे-धीरे हटाने के लिए चिमटी और स्कूपर का उपयोग करें।
    नोट: पृथक रेटिना की तैयारी पश्चिमी ब्लोट के लिए भी उपयोगी है, गैर-विशिष्ट रेटिना प्रोटीन 11 , पूरे माउंट हिस्टोलोजी और पूरे रेटिना इमेजिंग का विश्लेषण। पैच दबाना रिकॉर्डिंग भी पीएच पर आयोजित किया जा सकता हैपूरे रेटिना 12 से ओटोरेसेप्टर
  11. सबसे बड़ा व्यास के साथ ट्रिट्रेशन विंदुक लें, इसे टयूबिंग से कनेक्ट करें, और पेट्री डिश में से एक में से एक से टीएस से थोड़ी सी टीएस के साथ विंदुक बैकफिल, कोमल चूषण (मुंह से) इस कदम को हर बार एक नई ओम्पटिडिया ट्रिप्रेशन विंदुक के लिए इस्तेमाल किया जाता है।
  12. धीरे-धीरे मुंह के द्वारा दो रेटिना पर टीएस उड़ाने और फिर पृथक रेटिनेई को विंदुक में खीचें जिससे कोमल चूषण का उपयोग किया जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरतें कि कोई हवा के बुलबुले विंदुक में प्रवेश न करें।
  13. पेट्री डिश में पृथक रेटिना को स्थानांतरित करें, एक छोटी सी बूंद (~ 20 μL) का निर्माण करें, और जलाशय की बूंदों में से एक से टीएस के साथ एक या दो बार उन्हें धो लें।
  14. 20-25 मिनट के लिए अंधेरे में रेटिना को सेते हैं
  15. Ommatidia trituration pipette को छोटे-व्यास खोलने के साथ विंदुक के साथ बदलें (पिपेट को बैकफिल करने के लिए चरण 4.6 में जलाशय में से एक से ताजा टीएस का प्रयोग करके)।
  16. तेजी सेपृथक ओम्पटिडिया के पृथक्करण को शुरू करने के लिए एक छोटे से बूंद (~ 20 μL) में दोनों रेटिनेइ को ग्रहण करना और समाप्त करना।
    नोट: पहले चरण में, आसपास के पेग्मेंटमेंट ग्लिया को विघटन करना चाहिए, जिससे समाधान में दृश्यमान छोटे मलबे निकल जाएंगे।
  17. पर्याप्त छोटे मलबे जमा हो जाने के बाद, लेकिन कई ओमटिटिडिया अलग होने से पहले, एक जलाशय की बूंदों से ताजा टीएस का उपयोग करें और रेटिना को एक छोटे से छोटे बूंद में स्थानांतरित करें।
  18. एक छोटे व्यास trituration विंदुक, backfill का चयन करें, और triturate करने के लिए जारी
    नोट: चूंकि ओम्पटिडिया अब अलग होने लगती हैं, उनके विस्तारित रूपों को स्टीरियोमोरिकोस्कोप की उच्च शक्ति के तहत स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो ओममटिडिया की अच्छी उपज दिखाई देने तक ट्रिट्यूशन पिपेट को छोटे व्यास तक बदलते रहें
  19. ओममटिडिया की एक उचित उपज दिखाई देने के बाद और ड्रॉप अब पारदर्शी नहीं है, विंदुक को अलग बूंद वाले ओममटिडिया युक्त पूरी बूंद से भरें और बूंदों को धीरे से मिटानास्नान कक्ष के नीचे ES से भरा हुआ
  20. पृथक ओम्माटीडिया को स्नान कक्ष के नीचे सिंक और व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए लगभग 1 मिनट की प्रतीक्षा करें।
  21. छिड़काव प्रणाली का उपयोग करना, स्नान कक्ष में ES के प्रवाह को प्रारंभ करना। यह सुनिश्चित करें कि कक्ष पूरी तरह से समाधान से भरा है, नीचे से ऊपर तक, और यह कि जमीन समाधान में पूरी तरह से जलमग्न है। स्नान 4-5x धोने के लिए जारी रखें
    नोट: इसके बाद, सतत छिड़काव की आवश्यकता नहीं है, हालांकि एक नया पैच विंदुक पेश करने से पहले स्नान को संक्षेप में फ्लाई किया जाना चाहिए।

6. पूरे सेल रिकॉर्डिंग

चित्र 2
चित्रा 2: इलेक्ट्रोफिजिकल और ऑप्टिकल सेटअप का अवलोकन सेटअप में एक लोहा, काले रंग वाले फैराडे पिंजरे ( एफ ) शामिल हैं। सामने की ओर तांबा जाल के साथ एक काले पर्दे का उपयोग कर कवर किया गया है। यह कॉन्फ़िगअवधि में पूरी तरह से किसी भी आवारा प्रकाश से बंद होने की तैयारी सक्षम होती है और यह अंधेरे सहज गति से होने वाली बाधाओं को रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त है। उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप ( ए ) एक विरोधी कंपन तालिका ( ई ) के लिए तय हो गई है फोटोरिसेप्टर रिकॉर्डिंग उपकरण में छिड़काव इनपुट ( क्यू ), एक चूषण विंदुक ( एस ), और एक चांदी-चांदी क्लोराइड ग्राउंड ( पी ) के साथ एक घर का बना ऐक्रेलिक कांच स्नान कक्ष ( हे ) होता है। स्नान कक्ष को घर का बना एडाप्टर के साथ माइक्रोस्कोप स्टेज ( टी ) पर रखा गया है। रिकॉर्डिंग विंदुक चांदी-चांदी क्लोराइड तार के माध्यम से एक ऐक्रेलिक ग्लास धारक से जुड़ा हुआ है, जो एम्पलीफायर सिर स्टेज ( सी ) से जुड़ा हुआ है। सिर के चरण को एक मोटे micromanipulator पर लगाया जाता है जो एक ठीक एक्सवाईजेड मैकेनिकल माइक्रोमैनिपुलेटर ( बी ) पर रखा जाता है। छिड़काव प्रणाली ( डी ) एक सिरिंज सेट से बना है, जबकि तरल के प्रवाहडी चुटकी वाल्व ( एच ) द्वारा नियंत्रित किया जाता है रैक विद्युत रूप से उसी केंद्रीय जमीन से जुड़ा हुआ है, जहां फैराडे पिंजरे के अंदर सभी उपकरण जुड़ा हुआ है और इसमें पैच क्लैम्प एम्पलीफायर ( एन ), एक ऑसिलोस्कोप ( जे ), एक नाड़ी / फ़ंक्शन जनरेटर (के), ए ए डी कनवर्टर ( एल ), एक पेरिअ्यूज़ कंट्रोलर ( आई ), और एक फिल्टर व्हील और शटर नियंत्रक ( एम )। इमेजिंग प्रयोगों के लिए, एक ठंडा (-110 डिग्री सेल्सियस, सामग्री की तालिका देखें) सीसीडी कैमरा एक बंदरगाह ( जी ) के माध्यम से जुड़ा हुआ है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

नोट: निम्न सभी चरणों के दौरान, केवल मंद प्रकाश की रोशनी का प्रयोग करें और यह सुनिश्चित करें कि ओममटिडिया के प्रकाश का प्रकाश न्यूनतम है ( यानी काम तेजी से औरविकृत प्रकाश स्रोत और कक्ष लाल रोशनी को बंद करें, जब ommatidia को देखने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्यों को पूरा करते हैं)। इसके अलावा, मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रोटोकॉल के अनुसार निम्न चरणों का पालन करें।

  1. उल्टे माइक्रोस्कोप (40 एक्स उद्देश्य) के तहत, बाथ में सभी ओमटिटिडिया का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें और प्रयोग के लिए एक उपयुक्त ओम्पटिडियम चुनें।
    1. सुनिश्चित करें कि ommatidium के बाहरी झिल्ली चिकनी और अक्षुण्ण है, कि लंबे अक्ष लगभग इलेक्ट्रोड दृष्टिकोण की दिशा के अनुसार सही कोण पर है (जैसा कि चित्रा 3 ए में देखा गया है), और ओम्मटिडिमियम के बाहर का हिस्सा किसी भी से घिरा नहीं हुआ है अतिरिक्त ऊतक वर्दी रोशनी सुनिश्चित करने के लिए उद्देश्य लेंस (दृष्टि के क्षेत्र के केंद्र में) के ऑप्टिकल अक्ष पर चुना ओम्पटिडियम रखें।
  2. इंट्रासेल्युलर समाधान (आईएस 1 या आईएस 2) के साथ एक पैच विंदुक भरें।
    नोट: मेरे लिएसुनिश्चित करें कि तीव्रता की प्रतिक्रिया और टक्कर विश्लेषण, IS1 का उपयोग करें प्रकाश-संवेदनशील चैनलों की उलटाव क्षमता को मापने के लिए, IS2 का उपयोग करें।
  3. इलेक्ट्रोड धारक पर पैच विंदुक माउंट।
  4. इलेक्ट्रोड धारक से जुड़े ट्यूब के माध्यम से मुंह से विंदुक में उड़ा, जिससे यह सकारात्मक दबाव से भर जाता है। दबाव बनाए रखने के लिए ट्यूब वाल्व को बंद करें।
  5. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके, इलेक्ट्रोड को स्नान कक्ष में डालें।
  6. ऑम्पटिडियम के बाह्य भाग के करीब इलेक्ट्रोड को मार्गदर्शित करें, जैसे इलेक्ट्रम और ओममटिडियम के बीच कोई संपर्क नहीं है, जब तक कि ओममटिडियम में एक छोटा खराद (पैच विंदुक में सकारात्मक दबाव के कारण) देखा जा सकता है।
  7. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिका देखें) 100 मील प्रति घंटे के सतत वर्ग वोल्टेज दालों को 100 हर्ट्ज पर लागू करने के लिए "झिल्ली परीक्षण मॉड्यूल" खोलें।
  8. उपयुक्त घुमक्कड़ को समायोजित करके जंक्शन क्षमता को "शून्य" निर्धारित करेंख "चालू" करने के लिए वर्ग नाड़ी का आधार सेट करने के लिए पैच दबाना एम्पलीफायर में b
    नोट: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सेटअप में एम्पलीफायर ( यानी द्वितीय चरण के प्रवर्धन) से जुड़ा एक प्रमुख अवस्था ( यानी प्रथम चरण प्रवर्धन) शामिल है। प्रवर्धित एनालॉग सिग्नल ए / डी कनवर्टर का उपयोग करते हुए एक डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित हो जाता है, जो पीसी कंप्यूटर पर स्थापित सॉफ़्टवेयर द्वारा नियंत्रित होता है।
  9. इलेक्ट्रोड धारक से जुड़े ट्यूब के वाल्व को खोलकर विंदुक में सकारात्मक दबाव जारी करें। धीरे से ट्यूब से बाहर चूसने के द्वारा विंदुक में नकारात्मक दबाव बनायें, जिससे विंदुक के सेल झिल्ली को मिला। दबाव बनाए रखने के लिए ट्यूब वाल्व को बंद करें।
  10. सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर स्क्रीन पर देखा गया इलेक्ट्रोड प्रतिरोध 100 से 150 एमई तक बढ़ गया है। इलेक्ट्रोड धारक से जुड़ी ट्यूब के वाल्व को मैन्युअल रूप से खोलकर विंदुक में नकारात्मक दबाव जारी करें।
  11. सुनिश्चित करें कि एलएक्रटोड प्रतिरोध को कम से कम 1-2 GΩ तक बढ़ाया गया है
    नोट: इस बिंदु पर, इलेक्ट्रोड और फोटोरिसेप्टर के बीच एक सील का गठन किया गया है।
  12. पैच दबाना एम्पलीफायर में उपयुक्त घुंडी का समायोजन करके विंदुक के कैपेसिटिव धाराओं को ऑफसेट करें।
  13. इलेक्ट्रोड में नकारात्मक दबाव के तीव्र, लघु और सशक्त बटाफों को बनाने के लिए, इलेक्ट्रोड धारक से जुड़ी ट्यूब के मुंह से चूसने से फोटोरिसेप्टर झिल्ली में "ब्रेक" करने के लिए और एक पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन बनाएं। वैकल्पिक रूप से, "0.1 एमएस" की अवधि के साथ शुरू, लघु, आयताकार विद्युत दालों को लागू करने के लिए "जैप बटन" का उपयोग करें या दोनों तरीकों के संयोजन को लागू करें।
    नोट: पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की पीढ़ी विंदुक समाई में अचानक वृद्धि (आमतौर पर ~ 60 पीएफ, एक wildtype R1-6 फोटोरिसेप्टर के लिए होती है, केवल ~ 20 पीएफ का समाई एक R7 फोटोरिसेप्टर से एक रिकॉर्डिंग इंगित करता है; ऊपर एक समाई ~ 90 पीएफ दो से एक रिकॉर्डिंग को इंगित करता हैफोटोरिसेप्टर)।
  14. फोटोरिसेप्टर को आवश्यक वोल्टेज (आमतौर पर, -70 एमवी) के लिए होल्डिंग की क्षमता सेट करें, मैन्युअल रूप से पैच दबाना एम्पलीफायर में उचित घुंडी का उपयोग करें।
    नोट: सील प्राप्त करने के बाद (चरण 6.11) और पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन हासिल किए जाने से पहले यह चरण निष्पादित करना संभव है।
  15. कैपेसिटिव धाराओं और सीरीज प्रतिरोध (25 मेगावाट से अधिक मापा मापा श्रृंखला प्रतिरोध मान ऑफसेट करता है कि इलेक्ट्रोड विंदुक भरा हुआ है) और, यदि आवश्यक हो ( यानी बड़ी धाराओं के लिए), पैच दबाना एम्पलीफायर में उपयुक्त घुंडी का उपयोग करके श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा लागू करें ।
  16. फैराडे पिंजरे के काले सामने पर्दा को बंद करने के लिए अधिक से अधिक अंधेरे और बिजली के अलगाव प्राप्त करें।
  17. वांछित प्रयोगात्मक प्रक्रिया के अनुसार सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रिकॉर्डिंग प्रक्रिया शुरू करें और प्रकाश उत्तेजनाओं और / या औषधीय पदार्थों को व्यवस्थित करें।

7. एक साथ क्यूऑल-सेल रिकॉर्डिंग और सीए 2+ इमेजिंग

  1. आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए 2+ संकेतकों के लिए, डी। मेलेनोगास्टर का उपयोग कर ऊपर वर्णित के अनुसार ommatidia को अलग करना GCaMP6f 13 को अभिव्यक्त करता है। प्रतिदीप्ति माप के लिए एक सीसीडी कैमरा (सामग्री की सारणी देखें) का प्रयोग करें और सुनिश्चित करें कि खुर्दबीन उचित उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर और एक डिक्रौइक दर्पण (सामग्री की तालिका देखें) 4 से सुसज्जित है ।
  2. बाहरी सीए 2+ संकेतक ( चित्रा 4 ; सामग्री की तालिका देखें) के उपयोग के लिए, उपर्युक्त वर्णित ommatidia को अलग करें। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि पिपेट समाधान में 20-100 माइक्रोन कैल्शियम सूचक शामिल है।
  3. 40 हर्ट्ज की दर से छवियां प्राप्त करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की सारणी देखें) का उपयोग करें। 10 सेकंड के अंधेरे अवधि के दौरान गहन 2 एस प्रकाश एसटीआई के बाद छवि अधिग्रहण करनाmulation।
  4. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें (आरओआई)। आरओआई में प्रतिपूरक तीव्रता का मूल्यांकन करें अंधेरे प्रतिदीप्ति औसत (एफ डी ) और प्रकाश (एफ एल ) उत्तेजना (एफ एल- एफ डी ) के दौरान प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग से इसे घटाना। प्रकाश उत्तेजना (एफ एल 0 ) की शुरुआत में प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुसार इन मापों को सामान्य करें।

Representative Results

वर्णित पद्धति ने मौलिक एकाग्र धाराओं की सटीक रिकॉर्डिंग को सक्षम किया है जो सहज और हल्के उगने वाले क्वांटम बाउंस उत्पन्न करते हैं, जो परिभाषित परिस्थितियों के तहत प्रकाश के लिए मैक्रोस्कोपिक प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए योग करता है। इसके अलावा, उन जंगली और उत्परिवर्ती मक्खियों के बीच तुलना की अनुमति दी गई है जो महत्वपूर्ण संकेत देने वाले अणुओं ( आंकड़े 3 और 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 में दोष हैं। इसके अलावा, द्वि-आयनिक स्थितियों के तहत उत्क्रमण की संभावनाओं को मापने की क्षमता ने टीआरपी और टीआरपी-जैसे (टीआरपीएल) चैनल 18 , 1 9 के मूलभूत भौगोलिक गुणों का पता चला है। यह टीआरपी के ताकद क्षेत्र में एमिनो एसिड प्रतिस्थापन के प्रभावों का माप भी सक्षम करता है जो कि इसकी सीए 2+पारगम्यता 20

पैच क्लैंप पूरे सेल रिकॉर्डिंग द्वारा प्राप्त प्रकाश प्रतिक्रिया परिमाण के कम से कम 4 ऑर्डर के लिए हल्के तीव्रता पर निर्भर करती है। यह एआरजी और इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग विधियों का उपयोग करके हल नहीं किया जा सकता है। तदनुसार, बढ़ती तीव्रता और तीव्रता प्रतिक्रिया समारोह की एक साजिश की संक्षिप्त चमक के लिए प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला ने प्रकाश की तीव्रता बढ़ने के साथ फ्लैश प्रतिक्रिया की एक सख्त लाइनरिटी का खुलासा किया। सख्त लाइनरिटी कम से कम कई सौ पीए तक पहुंचती है, लेकिन यह विवादास्पद है कि उसके बाद यह रैखिकता या दबाना नियंत्रण होता है जो टूट जाती है ( चित्रा 6 )। ये परिणाम बताते हैं कि रोशनी के लिए मैक्रोस्कोपिक प्रतिक्रियाएं प्रकाश के लिए एकात्मक प्रतिक्रियाओं ( यानी क्वांटम बाउंस) के रैखिक योग हैं।

यह अच्छी तरह से वोल्टेज रिकॉर्डिंग का उपयोग कर स्थापित किया गया है जो मंद प्रकाश उत्तेजना इंडस्ट्रीज़ हैसबसे अपर्याप्त प्रजातियों में असतत वोल्टेज उतार-चढ़ाव ( यानी क्वांटम बाँध) डी। मेलेनोगास्टर क्वांटम बाँध के परिणामस्वरूप ~ 15 टीआरपी चैनलों और ~ 2 टीआरपीएल चैनलों के संगठित खंभा से टक्कर 18 प्रत्येक बंप एक फोटान के अवशोषण से उत्पन्न होता है, जबकि अधिक तीव्र रोशनी के लिए मैक्रोस्कोपिक प्रतिक्रिया ये प्राथमिक प्रतिक्रियाएं 14 , 21 का योग है। बाधाएं विलंबता, समय-सारिणी और आयाम में काफी भिन्न होती हैं, भले ही उत्तेजना की स्थिति समान होती है। टक्कर पीढ़ी पॉसॉन के आँकड़ों द्वारा वर्णित एक स्टेचैस्टिक प्रक्रिया है, जिससे प्रत्येक प्रभावी रूप से अवशोषित फोटान केवल एक टक्कर को दर्शाता है। सिंगल फोटॉन-सिंगल-बाम्प रिश्ते के लिए जरूरी है कि झरना में प्रत्येक चरण में न केवल एक कुशल "टर्न-ऑन" तंत्र शामिल है, बल्कि एक समान प्रभावी "टर्न-ऑफ़" तंत्र भी शामिल है। कार्यात्मक लाभ एक का उत्पादन होता है Iबहुत संवेदनशील फोटॉन काउंटर, तेजी से क्षणिक प्रतिक्रिया के साथ बहुत संवेदनशीलता और विज़ुअल सिस्टम द्वारा आवश्यक अस्थायी संकल्प दोनों के लिए अनुकूल है। एक कुशल मोड़-बंद तंत्र की आवश्यकता पता चल जाती है कि सक्रिय फोटोपैगमेंट ( यानी मेट्रोपोडाप्सिन, एम) या इसका लक्ष्य, जी क्यू α, निष्क्रिय करने में विफल रहता है और प्रकाश के बंद होने के बाद लंबे समय तक बाधाओं के निरंतर उत्पादन की ओर जाता है ( चित्रा 3 ) 15 , 22 , 23 , 24

टक्कर टीआरपी / टीआरपीएल चैनलों की सहकारी गतिविधि को माइक्रोवेलिसिस में दर्शाता है। जैसे, चैनल सक्रियण की कोई भी अवधारणा को सहकारी चैनल सक्रियण समझा जाना चाहिए। हाल ही में, हार्डी और सहकर्मियों ने यह दर्शाया है कि प्रकाश ने फोटोरिसेप्टरों के तेजी से संकुचन का उदाहरण दिया है, जिससे कि प्रकाश-संवेदीई चैनल (टीआरपी / ट्रिपल) यांत्रिक रूप से 25 हो सकते हैं। यह मैकेनिकल सक्रियण, पीएलसी द्वारा मध्यस्थता वाले पीआईपी 2 हाइड्रोलिसिस द्वारा मनाया गया प्रोटॉन के साथ, टीआरपी / ट्रिपल चैनलों के उद्घाटन को बढ़ावा देता है और टक्कर उत्पादन की सहकारी प्रकृति 26 को समझाता है। वर्तमान में, डी। मेलेनोगास्टर फोटोरिएप्टर कुछ ऐसे सिस्टमों में से एक हैं जिसमें फ़ॉस्फोइनॉसेटिड सिग्नलिंग और टीआरपी चैनल का उपयोग विवो में किया जा सकता है, इस प्रकार डी। मेलानोगास्टर फोटोट्रैंसडक्शन और इस तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित की जाने वाली पद्धति एक उच्च मूल्यवान मॉडल प्रणाली है।

चित्र तीन
चित्रा 3: आईएसी पी 20 9 और आईएएनडी पी 215 म्यूटेंट लाइट और एकल क्वांटम बाम्प्स को मैक्रोस्कोपिक रिस्पांस के धीमे प्रतिक्रिया समाप्ति का पता चलता है। ( ए ) अलग ommatidium prepaएक पूरे सेल रिकॉर्डिंग के दौरान फ्लोरोसेंट लूसिफ़ेर पीला सीएच डाई (उत्तेजना: 430 एनएम; उत्सर्जन: 540 एनएम) से भरा पैच विंदुक वाला राशन ध्यान दें कि फ्लोरोसेंट डाई एक एकल फोटोरिसेप्टर सेल बॉयलर को फैलाने और लेबल करता है और यह कि फोटोरिसेप्टर कोशिका निकायों को अपने लम्बी अक्षांशों से अलग किया जाता है, लेकिन फिर भी व्यवहार्यता को बनाए रखता है। यह तैयारी एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग और इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयुक्त है। ( बीडी ) ऊपरी पैनल: डब्ल्यूटी, आईएसी पी 20 9 में निरंतर मंद प्रकाश (खुली बार) और इंजेक्शन पी 215 उत्परिवर्ती मक्खियों को क्वांटम बाम्प प्रतिक्रियाएं लगाए गए पूरे सेल वोल्टेज। बाधाओं का एक धीमा समापन इनएसी पी 209 में देखा गया है और डब्ल्यूटीटी मक्खियों के सापेक्ष इनएडी पी 215 म्यूटेंट है। नीचे इनसेट सिंगल पर्पों की बढ़ी हुई आकार को दर्शाता है। निचला पैनल: सामान्यीकृत पूरे सेल ने ऊपर की wildtype के 500-एमएस प्रकाश नाड़ी (1.5 x 10 5 फोटॉन प्रति एस) में मैक्रोस्कोपिक प्रतिक्रिया दर्ज की और उत्परिवर्ती मक्खियों (ईजी) ऊपरी पैनल: पूरे सेल वोल्टेज क्वांटम बाम्प प्रतिक्रियाएं एक संक्षिप्त (1 एमएस), मंद प्रकाश को जंगली रूप में एक-फोटॉन प्रतिक्रियाओं, एआर 2 3 , और नीना सी पी 235 उत्परिवर्ती मक्खियों को चिपकाने के लिए दबा हुआ । एक फोटान अवशोषण के जवाब में एआर 2 3 और नीना सी पी 235 उत्परिवर्ती मक्खियों में मनाए गए बाउंस की ट्रेन को नोट करें। निचला पैनल: इसी म्यूटेंट में 500 एमएस लाइट पल्स (1.5 x 10 4 फोटॉन / एस) के लिए पूरे सेल वोल्टेज ने सामान्यीकृत प्रतिक्रियाएं दबरे। एरो 2 3 में मनाए गए मैक्रोस्कोपिक प्रतिक्रियाओं की धीमी समाप्ति पर ध्यान दें और एनएएनसी पी 235 उत्परिवर्ती मक्खियों को डब्ल्यूटीटी के सापेक्ष इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

डी / 55627 / 55627fig4.jpg "/>
चित्रा 4: सेल्यूलर सीए 2+ डायनेमिक्स सिग्नल से प्रेरित सीए 2 + कैल्फोटीन द्वारा प्रभावित होता है। प्रकाश उत्तेजना के दौरान सीआई 2 + संकेतक के प्रतिदीप्ति दिखाए जाने वाले जंगली स्वरूप और सीपीएन 1% की फोटोरिसेप्टर छवियों की समय श्रृंखला कच्ची तीव्रता वाली छवियों को झूठी-रंगीन कोडिंग (बार = 10 माइक्रोन; तीर के किनारों से पिपेट इंगित करते हैं) का उपयोग करके प्लॉट किया जाता है। विसे एट अल से अनुमति के साथ पुनः चित्रित चित्रा 4 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: डब्ल्यूटी, ट्रिप, और ट्रिप म्यूटेंट की इलेक्ट्रोफिशिओलॉजिकल गुण। ( ए ) पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप रेकोडब्ल्यूटी में निरंतर मंद प्रकाश (खुली बार) के जवाब में क्वांटम बाधाओं के आर डी आरिंग, ट्रिप 302 , और टीआरपी पी 343 नल उत्परिवर्ती मक्खियों। ट्रिप पी 34 के बहुत कम एम्पलीपिट्यूशन मनाए गए हैं। इनससेट: जंगली प्रकार के विशाल चौड़े और trp P343 नल उत्परिवर्ती मक्खियों को दिखाया गया है। ( बी ) वन्यजीव के 3 एस प्रकाश नाड़ी और इसी म्यूटेंट के जवाब में पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग। Trp P343 उत्परिवर्ती के क्षणिक स्थिर-राज्य प्रतिक्रिया मनाया जाता है। इनसेट: WT और trp P343 उत्परिवर्ती की व्यापक प्रतिक्रियाएं दिखाए गए हैं। ( सी ) उपरोक्त मक्खी के उपभेदों के अधिरोपित प्रकाश प्रेरित धाराओं का एक परिवार, उत्परिवर्तनीय क्षमता (ईआरवी) के आसपास मापा गया 3 एमवी के वोल्टेज चरणों पर 20 मील की हल्की नाड़ी के जवाब में प्राप्त किया गया था। ( डी ) एक हिस्टोग्राम जिसका मतलब है कि जंगली शैली के मध्य ई रेग और विभिन्न उत्परिवर्तनts। त्रुटि सलाखों एसईएम हैं WT की उत्क्रमण क्षमता (ई संशोधन) trpl 302 के सकारात्मक ई Rev के बीच है , जो कि केवल टीआरपी और trp P343 नल उत्परिवर्ती का ईआर है , जो केवल ट्रिपल को व्यक्त करता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: फ्लैश रिस्पांस बढ़ती हल्की तीव्रता के साथ सख्ती से रैखिक है।
हल्की तीव्रता की बढ़ती चमक और संक्षिप्त प्रकाश चमक की बढ़ती तीव्रता पर हल्की प्रतिक्रिया के चोटी आयाम की निर्भरता की एक छोटी सी रपट की वर्तमान प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला। इस रिश्ते से फ़्लैश रिस्पांस और बढ़ती हल्की तीव्रता के बीच एक सख्त रेखाचित्र दिखाई देता है। यह सख्त रेखाचित्रपरिमाण के 4 आदेशों पर फैले हल्के तीव्रता के साथ कम से कम कई सौ पीए, तक धारण करता है, जबकि यह विवादास्पद है कि यह रैखिकता है या उसके बाद टूटने वाले दबाना नियंत्रण है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

पीएच 7.15 (NaOH के साथ समायोजित करें)
अभिकर्मक एकाग्रता (एमएम)
सोडियम क्लोराइड 120
KCl 5
एमजीसीएल 2 4
टीईएस 10
प्रोलाइन 25
alanine 5
-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
2+ मुक्त है, लेकिन इसमें कोई Ca 2+ बफ़र्स जोड़ा नहीं है और इसलिए इसमें लगभग 5-10 माइक्रोन ट्रे सीए 2 + होगा । एक्स्ट्रासेल्युलर सॉल्यूशन (ईएस) = 1.5 एमएम CaCl 2 वाला ES-0Ca 2+, जो ES-0Ca 2+ के लिए 0.5 या 1 एम स्टॉक समाधान से CaCl 2 जोड़कर बनाया गया है।

तालिका 1: सीए +2 -फ्री एक्सेलसुलर सॉल्यूशन (ईएस) रासायनिक वर्णन और सीए +2 फ्री ई का उत्पादन करने के लिए आवश्यक विशिष्ट मात्रा

अभिकर्मक रकम
एफबीएस 15 एमएल
सुक्रोज 1.5 ग्राम
1.5 एमएल शीशियों में 150 μL अल्कोहटों में विभाजित करें और -20 में स्टोर करें 76, सी।
विचलन समाधान (टीएस) विच्छेदन के दौरान उपयोग किए गए समाधान से मेल खाने के लिए 1,350 एमएल ES या ES-0Ca 2+ के साथ स्टॉक समाधान के 150 एमएल के 1 शीशी को भरें।

तालिका 2: भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) + सुक्रोज - स्टॉक सोल्यूशन रासायनिक विवरण और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) + सुक्रोज - स्टॉक समाधान का निर्माण करने के लिए आवश्यक विशिष्ट मात्रा।

पीएच 7.15 (कोह के साथ समायोजित करें)
अभिकर्मक एकाग्रता (एमएम)
पोटेशियम ग्लूकोनेट (कल्लू) 140
एमजीसीएल 2 2
टीईएस 10
एटीपी मैग्नीशियम नमक (एमजीएटीपी) 4
जीटीपी सोडियम नमक (ना 2 जीटीपी) 0.4
Β-निकोटीनामाइड एडिनिन डिन्यूक्लियोटाइड हाइड्रेट (एनएडी) 1
-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

तालिका 3: इंट्रासेल्युलर सॉल्यूशन (आईएस 1)। रासायनिक वर्णन और IS1 का उत्पादन करने के लिए आवश्यक विशिष्ट मात्रा, जिसका उपयोग तीव्रता की प्रतिक्रिया और क्वांटम टक्ਪ माप के लिए किया जाता है।

पीएच 7.15 (सीएसओएच से समायोजित करें)
अभिकर्मक एकाग्रता (एमएम)
CsCl 120
एमजीसीएल 2 2
टीईएस 10
एटीपी मैग्नीशियम नमक (एमजीएटीपी) 4
जीटीपी सोडियम नमक (ना 2 जीटीपी) 0.4
Β-निकोटीनामाइड एडिनिन डिन्यूक्लियोटाइड हाइड्रेट (एनएडी) 1
टेट्रा एथिल-अमोनियम क्लोराइड (टीएई) 15
-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

तालिका 4: इंट्रासेल्युलर सॉल्यूशन (आईएस 2) रासायनिक विवरण और इंट्रासेल्युलर सॉल्यूशन आईएस 2 का उत्पादन करने के लिए आवश्यक विशिष्ट मात्रा, जिसका उपयोग प्रकाश-प्रेरित वर्तमान के उत्क्रमण संबंधी संभावित माप के लिए किया जाता है।

Discussion

डी। मेलेनोगास्टर फोटोरएप्टरों के लिए पूरे सेल रिकॉर्ड्स के आवेदन की खोज और उपन्यास सिग्नल प्रोटीन, जैसे टीआरपी चैनल 27 , 28 , 29 और आईएनएडी 30 , 31 , 32 स्कैफोल्ड प्रोटीन की कार्यात्मक व्याख्यान के लिए अनुमति दी गई है। इस तकनीक का प्रारंभिक परिचय होने के बाद से, यह ईओण तंत्र और प्रकाश प्रतिक्रिया के वोल्टेज निर्भरता के संबंध में दीर्घकालिक बुनियादी प्रश्नों के समाधान को सक्षम करता है। यह झिल्ली वोल्टेज और बाह्य और इंट्रासेल्युलर आयनिक संरचना 19 , 28 को सटीक रूप से नियंत्रित करने की प्रदत्त क्षमता की वजह से हुई।

डी। मेलेनोगास्टर में पैच क्लैम्पिंग तकनीक की एक बड़ी बाधा पृथक ओम्पटिडिया प्रीपा की नाजुकता रही हैराशन। विस्तृत अध्ययनों से पता चला है कि फोटोट्रैंसडक्शन मशीनरी की अखंडता एटीपी की लगातार आपूर्ति पर निर्भर करती है, विशेष रूप से प्रकाश जोखिम के दौरान, जो एटीपी की बड़ी खपत का कारण बनती है दुर्भाग्य से, रंजक ( यानी ग्लिया) कोशिकाओं के मैकेनिकल स्ट्रिपिंग, जो पैच विंदुक के साथ फोटोरिसेप्टर झिल्ली तक पहुंचने की आवश्यकता होती है, एटीपी उत्पादन 33 के लिए आवश्यक चयापचयों के मुख्य स्रोत को समाप्त करता है। रिकॉर्डिंग विंदुक में बहिर्जात एटीपी के आवेदन केवल आंशिक रूप से एटीपी की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता को पूरा करता है। एटीपी की एक छोटी आपूर्ति टीआरपी चैनलों के सहज सक्रियण और प्रकाश-सक्रिय चैनलों से फोटोट्रैंसडक्शन मशीनरी के पृथक्करण की ओर ले जाती है, जिससे सेल्यूलर सीए 2+ में बड़ी वृद्धि हो सकती है और प्रकाश 34 , 35 के सामान्य प्रतिक्रिया को समाप्त नहीं किया जा सकता है। घटनाओं का यह क्रम क्षतिग्रस्त नहीं हैविच्छेदन प्रक्रिया द्वारा फोटोरिसेप्टर, लेकिन एटीपी की सेलुलर कमी के बजाय। होने वाली घटनाओं को रोकने के लिए और सामान्य हल्के प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए, फोटोरिसेप्टर तीव्र रोशनी से अवगत नहीं होना चाहिए, जो बड़ी मात्रा में एटीपी का उपयोग करता है। इसके अलावा, एनएडी को रिकॉर्डिंग विंदुक में शामिल किया जाना चाहिए, संभवतः मिटोचोनड्रिया 18 , 36 में एटीपी उत्पादन की सुविधा के लिए। सहज और क्वांटम बाम्प्स की मापन के लिए, ऊपर की कठिनाई कम है क्योंकि केवल मंद रोशनी का उपयोग किया जाता है। व्यवहार में, एक स्थिर पूरे सेल रिकॉर्डिंग को ~ 20-25 मिनट तक बनाए रखा जा सकता है, हालांकि इस अवधि में प्रतिक्रिया धीमी गति के लिए कैनेटीक्स की प्रवृत्ति होती है। अलग-अलग ओम्पटिडिया की एक भी तैयारी 2 घंटे तक के लिए व्यवहार्य बना सकती है।

पृथक ओम्पटिडिया तैयारी की एक अतिरिक्त कमी microvilli की अनुपलब्धता है, जो कि टीआरपी की अनुपलब्धता औररिकॉर्डिंग विंदुक के लिए ट्रिपल चैनल, एकल चैनल रिकॉर्डिंग को रोकने। उन्होंने विकसित एक विधि का उपयोग करते हुए, बासिगलुपो और उनके सहकर्मियों ने सीधे रुबोडोररे 37 से एकल-चैनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने में सफलता प्राप्त की। हालांकि, यह चैनल गतिविधि टीआरपीयूएल चैनलों से भिन्न है जो ऊतक संवर्धन कोशिकाओं 38 में व्यक्त की गई है और टीआरपी चैनल गतिविधि से पृथक ओम्माटीडिया 34 से प्राप्त शोर शोर विश्लेषण से प्राप्त हुई है। संभवतः, इस पद्धति का उपयोग करते समय विच्छेदन प्रक्रिया ने फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को काफी नुकसान पहुंचाया।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध का प्रायोगिक हिस्सा यूएस-इजरायल द्विपक्षीय राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (बीएम और आईएल), इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ), जर्मन-इजरायल प्रोजेट्कोएपोरेशन (डीआईपी) (बीआईएम), और जैव प्रौद्योगिकी से अनुदान द्वारा समर्थित था और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी अनुदान संख्या: बीबी / एम 007006/1 और बीबी / डी 0757585/1) आरसीएच से

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringe
5 mL syringe
1 mL syringe with elongated tip
Petri dish 60 mm
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter 
Capillaries (for omatidia separation) Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)
Polyethylene Tubing Becton Dickinson 1.57 x 1.14 mm (35 cm)
 2 small beakers 50 mL or less
2 paraffin film sheets Parafilm M ~5 x 5 cm
Bath chamber home-made
Cover slips 22 x 22 mm No. 0
Paraplast Plus Sigma Paraffin – polyisobutylene mixture To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber
Ground Warner Instruments  64-1288 Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly
Headless micro dissection needle Entomology, 12 mm
Micro dissecting needle holder
Vise
2 fine tweezers + 1 rough tweezers Dumont #5, Biology  0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox
Stereoscopic zoom Microscope  Nikon SMZ-2B
Cold light source Schott KL1500 LCD
Filter (Color) for cold light source Schott RG620
Delicate wipers Kimtech Kimwipes
Electrode holder Warner Instruments QSW-T10P Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style
Silver Wire Warner Instruments 0.25 mm diameter, needs to be chloridized
Micromanipulator Sutter Instruments MP 85 Huxley-Wall Style Micromanipulator
Faraday cage home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01
Osilloscope GW GOS-622G
Perfusion system Warner Instruments VC-8P Pinch valve control system
Perfusion valve controller Scientific instruments BPS-8
Suction system
Amplifier Molecular Device Axopatch-1D
Head-stage Molecular Device CV - 4 Gain: x 1/100
A/D converter Molecular Device Digidata 1440A
Clampex Molecular Device 10 software
pCLAMP Molecular Device 10 software
Light source (Xenon Arc lamp) Sutter Instruments Lambda LS
Light detector home made phototransistor
Filter wheel and shutter controller Sutter Instruments Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter
Filters (Natural density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElecftronic JML-C2
Light guide Quartz 
Pulse generator AMPI Master 8
Microscope Olympus IX71, Inverted
Red illumination filter (Microscope) RG630 / RG645 ø45mm
Microscope objective Olympus X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil
CCD Camera Andor iXon DU885K
NIS Element  Nikon AR software
Ca+2 indicator Invitrogen Calcium green 5N
Excitation & emission filters and dichroic mirror Chroma 19002 - AT - GFP/FITC Longpass set
Vertical pipette puller Narishige  Model PP83 Use either vertical or horizontal puller, as preferred.
Horizontal pipette puller Sutter Instrument  Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller
Filament Sutter Instrument 3 mm trough or square box
Capillaries Harvard Apparatus borosilicate glass capillaries 1 x 0.58 mm

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References

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से पूरे सेल वोल्ट क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; फोटोरिसेप्टर
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Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (124), e55627, doi:10.3791/55627 (2017).

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