Summary
Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.
Abstract
Whole-cell voltage voltage opnames van Drosophila melanogaster photoreceptors hebben het gebied van de invertebrate visuele transductie, waardoor het gebruik van D. melanogaster moleculaire genetica inositol-lipid signalering en transient receptor receptor potentiële (TRP) kanalen op het single-molecuul niveau kunnen onderzoeken. Een handvol labs hebben deze krachtige techniek beheerd, waardoor de fysiologische responsen op licht onder zeer gecontroleerde omstandigheden kunnen worden geanalyseerd. Deze techniek zorgt voor controle over de intracellulaire en extracellulaire media; De membraanspanning; En de snelle toepassing van farmacologische verbindingen, zoals een verscheidenheid aan ionische of pH-indicatoren, op de intra- en extracellulaire media. Met een uitzonderlijk hoge signaal-ruisverhouding kan deze methode de meting van donkere spontane en licht geïnduceerde eenheidstromen ( dwz spontane en kwantumstoten) en macroscopische licht-geïnduceerde stromingen (LIC) van de zondeGle D. melanogaster fotoreceptoren. Dit protocol schetst in groot detail alle belangrijke stappen die nodig zijn om deze techniek uit te voeren, die zowel elektrofysiologische als optische opnamen omvat. De procedure voor de retina dissectie voor het bereiken van intacte en levensvatbare ex vivo geïsoleerde ommatidia in de badkamer wordt beschreven. De apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van full-cell en fluorescentie beeldvorming metingen zijn ook gedetailleerd. Tenslotte worden de valkuilen in het gebruik van deze delicate voorbereiding tijdens uitgebreide experimenten toegelicht.
Introduction
Uitgebreide genetische studies van de vruchtvlieg , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , die meer dan 100 jaar geleden zijn ingezet, hebben de D. melanogastervliegtuig opgezet als een extreem nuttig experimenteel model voor de genetische dissectie van complexe biologische processen. De hierna beschreven methodologie combineert de geaccumuleerde kracht van de D. melanogaster moleculaire genetica met de hoge signaal- ruisverhouding van volledige-cel patch klemopnamen. Deze combinatie zorgt voor de studie van D. melanogaster phototransduction als een model van inositol-lipid signalering en TRP kanaal regulatie en activatie, zowel in de native omgeving als bij de hoogste resolutie van enkele moleculen.
Toepassing van de hele cel opname methode op D. melanogaster photoreceptors heeft de studie van invertebrate phototransduction omgezet. Deze methode is ontwikkeld door Hardie 1 en indepEindelijk door Ranganathan en collega's 2 ~ 26 jaar geleden en was ontworpen om de uitgebreide genetische manipulatie-instrumenten van D. melanogaster te exploiteren en ze te gebruiken om mechanismen van fototransductie en inositol-lipide signalering te ontdekken. In de eerste plaats leed deze techniek aan een snelle vermindering van de lichtgevoeligheid en een lage opbrengst van ommatidia tijdens het dissectieproces, waardoor gedetailleerde kwantitatieve studies werden voorkomen. Later verhoogde de toevoeging van ATP en NAD aan de patchpipet de geschiktheid van het preparaat voor langdurige kwantitatieve opnames. Vervolgens werd uitgebreide karakterisering van het signaal-transductiemchanisme op het moleculaire niveau gerealiseerd.
Momenteel is D. melanogaster phototransduction één van de weinige systemen waarin fosfoinositide-signalering en TRP kanalen ex vivo kunnen worden bestudeerd bij een molecuulresolutie. Dit maakt D. melanogaster phototransduction en de mijThodology ontwikkeld om dit mechanisme een zeer gevoelig modelsysteem te bestuderen. Dit protocol beschrijft hoe het D. melanogaster retina dissecteert en de geïsoleerde ommatidia van de omliggende pigment (glia) cellen mechanisch afbreken. Dit stelt de vorming van een giga-seal en een hele-cel patch klem op de photoreceptor cel lichamen mogelijk. Gelukkig zijn de meeste signaalproteïnen beperkt tot de rhabdomere en diffunderen ze niet. Bovendien is er een immobiele Ca 2+ buffer genaamd calphotin, gelegen tussen het signaalcompartiment en het cellichaam 3 , 4 en een hoog expressieniveau van de Na + / Ca 2+ wisselaar (CalX) in de microvilli 5 . Samen vormen de eiwitbevestiging aan de rhabdomere, de calphotinbuffer en de hoge expressie van de CalX relatief langdurige ( dwz maximaal ~ 20 minuten) volledige celopnamen zonder verlies van essentiële componentenVan het fototransductieproces en met behoud van hoge gevoeligheid voor licht. Het volgende protocol beschrijft hoe u geïsoleerde ommatidia kunt verkrijgen en volledige cilinderopnamen uitvoeren die de inheemse eigenschappen van de fototransductiekascade voorkomen. Hele-cel patch klem experimenten op gedissocieerde kakkerlak ( Periplaneta americana ) 6 en cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia werden op dezelfde wijze uitgevoerd als die beschreven voor D. melanogaster . Daarnaast werden patchclamp-experimenten op gedissocieerde fotoreceptoren van het bestandsbloem, ( Lima scabra ) en sint- jakobsschelp ( Pecten-irradians ) op een enigszins andere manier uitgevoerd dan die uitgevoerd op D. melanogaster , waardoor zowel de hele cel 8 als een kanaalsmeting 9 . Hier worden de belangrijkste prestaties verkregen in D. melanogaster met behulp van deze techniek beschreven. De discussie iBevat de beschrijving van sommige valkuilen en beperkingen van deze techniek.
Protocol
1. Reagensbereiding
OPMERKING: Bereid alle oplossingen volgens de instructies in Tabel 1-4 aan .
- Vul een 10 ml spuit met extracellulaire oplossing (ES of ES-0Ca 2+ , indien nodig, zie tabel 1 ) en houd het op ijs.
- Maak een injectieflacon van Trituration Solution (TS, zie tabel 2 , dat wil zeggen ES of ES-0Ca 2+ + FBS en sucrose) en houd dit op ijs.
- Bereid voldoende ES voor het experiment en houd dit op ijs totdat het nodig is.
OPMERKING: Doorlopende bad perfusie is niet nodig, dus het volume van ES hoeft niet meer dan een paar dozijn ml te zijn. - Met behulp van een 22 μm PVDF filter, laad de intracellulaire oplossing (zie tabel 3 of tabel 4 ) in een 1 ml spuit met een elektrode vulling langwerpige tip. Hou dit op ijs.
2. Algemene instellingen van ontkoppelingshulpmiddelen
Figuur 1: Gereedschappen en apparaten die nodig zijn voor het maken van de geïsoleerde Ommatidia-voorbereiding. De foto's tonen de verschillende apparaten die nodig zijn voor het maken van de geïsoleerde ommatidia voorbereiding, zoals beschreven in het gedetailleerde protocol hierboven. Twee bekers, één gevuld met water ( A ) en de andere gevuld met ethanol ( B ) voor het reinigen van de afbraakpipetten ( D ), die verbonden zijn met de buis ( C ). De dissecting tools zijn: 2 paar fijne en 1 paar grove pincet ( F ) en een retina scooper ( E ). Om de retina scooper voor te bereiden, wordt een micro dissectie naald ( H ) tussen twee draaibankgereedschappen gedraaid die als onderstuk ( G ) werken om de bovenkant van de naald ( I ) te platen. Dan is het verbonden met een langwerpige pi Einde van metaal met lijm ( J ) en gemonteerd op een naaldhouder ( E ). Razor blade chip en houder: Breek een kleine driehoekige chip van een scheermesje af met een razor blade holder ( K ). Het dissectie werkgebied bestaat uit een binoculaire ( L ) en een koele rode lichtbron (( M), ) met twee lichtgeleiders ( N ). De dissectie gereedschappen, inclusief tweezers ( F ), de retina scooper ( E ), bekers ( A en B ), een zaklamp met een rood filter ( Q ) en delicate wissers ( R ) zijn aan beide kanten van de verrekijker geplaatst. Een ijsbak met ES, de FBS-ES, de injectiespuiten voor intracellulaire oplossingen, de 60 mm Petri-schotel ( S ) en de elektrodehouder ( P ) worden ook op de tafel geplaatst. De opnamelektroden worden getrokken met behulp van een horizontale trekker ( T ).E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
- Construeer een retina scooper om de retinae te isoleren.
- Steek de punt (1-4 mm) van een microdissectie naald (entomologische naald, 12 mm lengte, 0,1 mm diameter) tussen de twee wipkaken en platte het door te tikken met een kleine hamer.
- Monteer de geplateerde naald op een micro-dissecterende naaldhouder (zie de Tafel van Materialen ).
- Gebruik een paar pincetjes om het vlakke uiteinde van de naald te buigen om een haak met een kromming van ~ 2,5 mm te vormen.
- Maak trituratiepipetten voor ommatidia-scheiding.
- Plaats een glazen capillair van 1,2 x 0,68 mm (OD x ID) over een open vlam en brand een poetsmiddel om de opening te verminderen.
- Meet de grootte van de capillaire opening onder een microscoop. Sorteer de gecreëerde ommatidiale trituratiepipetten in seveN groepen volgens de grootte van hun openingen ( dwz 0,2-0,5 mm). Bewaar ze in aparte geschikte containers ( bijv. Proefbuizen).
- Vul een kleine beker met dubbel gedestilleerd water (DDW) en een andere kleine beker met ethanol 70%. Bedek elke beker met een paraffine filmplaat.
- Punch een klein gat in de paraffine filmplaat die de DDW beker (zie afbeelding 1A ) bedekt.
- Punch zeven kleine gaten in het parafinfolieblad dat de ethanolbekers bedekt en de gaten van 0 tot 6 cijferen (zie figuur 1B ).
- Plaats een ommatidiale trituratiepipet uit elke groottegroep in elk paraffinefilmgat, zodat de pipet met de grootste opening in het 0 ste gat zit en de pipet met de kleinste opening in het 6e gat bevindt.
- Sluit een plastic 200 μL pipetpunt aan op een 35 cm lang, 1,57 x 1,14 mm (OD x ID) stuk polyethyleenslang. ConnecT het andere uiteinde van de buis aan een van de ommatidiale trituratiepipetten met de grootste opening ( dwz 0,46 - 0,5 mm), om ervoor te zorgen dat het puntige uiteinde van de trituratiepipet niet in de buis staat.
- Bereid de hele celopnamepipetten door patchpipetten uit een 1 x 0.58 mm (OD x ID) borosilicaatfilament met glazen capillairen te trekken.
OPMERKING: De weerstand van de pipetten moet 8-15 MΩ zijn bij gebruik van intracellulaire oplossing op basis van kaliumgluconaat (IS1). Elk geschikt patchpipetrek kan gebruikt worden (zie bijvoorbeeld de Tabel van Materialen ). Brandpolen is niet nodig. - Maak een opnamekamer op (zie figuur 2 ) door een deklaag (zie de Tabel van Materialen ) aan de onderkant van de badkamer te bevestigen met behulp van gesmolten paraffine of hoogvakstof siliconenvet . Gebruik een geschikte zelfgemaakte of commerciële kamer die toegang tot elektroden en perfusie mogelijk maakt.
- Monteer het bad op het podium van een omgekeerde microscoop. Plaats de buis van het perfusiesysteem, het zuigsysteem en de grond ( dwz Ag-AgCl draad / pellet) in het bad (zie de tabel van materialen en figuur 2 ).
- Plaats twee paar fijne # 5 pincetjes ( Figuur 1 ) op het werkoppervlak voor gebruik tijdens de retina dissectie en ommatidia isolatie stappen.
3. D. Melanogaster Achteruitgang
- Raise D. Melanogaster vliegt bij een lage bevolkingsdichtheid ( dwz ~ 20 vliegt in een 6 oz. Fles) in flessen die standaard maïsmeelvoer bij 19-24 ° C bevatten.
OPMERKING: Het is beter om te werken aan donkere aangepaste vliegen. Om de hoge gevoeligheid voor licht te behouden, verminder de diversiteit en voorkom retinale degeneratie in mutante vliegen. - Achter de vliegen in het donker voor minstens 24 uur voor het experiment.
OPMERKING: De vliegen die voor de experimenten werden gebruikt, dienen te zijnNtly verduisterd (<2 uur) en nog steeds zacht, bleek en laat het meconium zien. Ommatidia kan ook gemakkelijk van poppen worden bereid, hoewel hun gevoeligheid voor licht dan steil afhankelijk is van de leeftijd van 10 .
4. Retina Dissectie en Ommatidia Isolatie: Optie 1
OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit onder de stereoscopische zoommicroscoop met behulp van een versterking die geschikt is om de voorbereiding goed te bekijken (zie afbeelding 1 ).
- Plaats vier druppels ES-0Ca 2+ en een druppel TS oplossing op een 60 mm Petri schotel dat is omgedraaid.
- Met behulp van ruwe pincetten, pak een nieuw afgesloten (<2 uur na eclosie) door zijn vleugels of lichaam. Voer vanaf dit punt alle procedures snel en onder dim rode verlichting uit bij 20 ± 1 ° C.
- Gebruik de eerste paar fijne pincetjes nog steeds om het vlieghoofd van het lichaam los te maken terwijl u de vlieg met de ruwe pincet vasthoudt. SubmeDraai het hoofd in de eerste ES-0Ca 2+ druppel.
- Dissecteer het hoofd half in het sagittale vlak met behulp van het tweede paar fijne pincetjes. Zorg ervoor dat aan het eind van deze stap beide ogen nog steeds intact zijn.
- Breng de helft van het hoofd over naar de tweede ES-0Ca 2+ druppel en de andere helft naar de derde ES-0Ca 2+ druppel.
- Gebruik de fijne pincetjes, verwijder zoveel mogelijk weefsel om het oog en zorg ervoor dat er geen schade aan het netvlies wordt veroorzaakt.
- Pak de rand van een hoornvlies goed met de fijne pincet en schop het retina uit met behulp van de scooper.
OPMERKING: Na afloop van deze stap zal de hoornvlies leeg en intact worden, gescheiden van een intacte retina. - Spoel de trituratiepipet die met DDW is aangesloten, en vul de pipet met een kleine hoeveelheid ES-0Ca 2+ uit de vierde druppel.
OPMERKING: deze stap moet elke keer worden uitgevoerd als er een nieuwe ommatidia-scheidingspipet wordt gebruikt en verwijderd van vorenM de ethanolbeker (de oplossing die de pipet vult moet overeenkomen met de oplossing waarin het netvlies onderdompeld is). - Spoel voorzichtig door de mond om het geïsoleerde netvlies in de pipet te trekken. Wees uiterst voorzichtig om luchtbellen niet in de pipet te streven.
- Plaats het geïsoleerde netvlies naar de druppel TS. Voer ook stappen 4.6-4.10 uit op het tweede oog.
- Verwijder de druppels ES-0Ca 2+ met behulp van delicate doekjes, waarbij alleen de druppel TS die beide retinae op de Petri-schotel bevat, weglaten. Voeg zes druppels TS toe aan de top van de Petri-schotel. Breng beide retinas naar één van de andere TS-druppels over.
- Vervang de trituratiepipet met een pipet met een opening met een kleinere diameter. Spoel het zoals beschreven in stap 4.8, met behulp van TS als de oplossing om de pipet te vullen.
- Snel en herhaaldelijk aspireren en vervallen beide retinae in de oplossing om de afscheiding van geïsoleerde ommatidia te beginnen, die van pigmentcellen van het hele netvlies verwijderd zijn.
OPMERKING: De geïsoleerde ommaTidia zijn zichtbaar in de TS-daling, en als het isolatieproces vordert, wordt de TS-daling minder doorschijnend. - Breng de overige retinae over naar de volgende TS-daling. Vul de pipet met de hele voormalige TS-druppel (met de geïsoleerde ommatidia) en doei de druppel in de badkamer.
- Herhaal stappen 4.12-4.14 om maximale geïsoleerde ommatidia te bereiken. Wacht ongeveer 1 minuut om de geïsoleerde ommatidia te laten zinken en te binden aan de bodem van de badkamer.
- Met behulp van het perfusiesysteem start de stroming van ES-0Ca 2+ met 1,5 mM Ca 2+ in de badkamer. Zorg ervoor dat de kamer volledig met de oplossing is gevuld, van onder naar boven, en dat de grond volledig in de oplossing is ondergedompeld. Blijf het bad 4-5x wassen.
5. Retina Dissectie en Ommatidia Isolatie: Optie 2
Opmerking: Voer alle volgende stappen uit onder de stereoscopische zoommicroscoop, met behulp van een ampliFicatie geschikt om de voorbereiding goed te bekijken (zie figuur 1 ).
- Bereid een razor blade chip en houder. Afbreek en monteer een kleine driehoekige chip van een scheermesje met behulp van een razor blade holder ( figuur 1 ).
- Bereid een siliconen dissectie schotel / blok volgens de instructies van de fabrikant (zie de Tabel van Materialen ).
- Voor de dissectie, creëer een grote druppel (<0,5 ml) ES oplossing op het siliconen dissectieblok. Voeg twee "reservoir" druppels (~ 50 μL elk) van TS-oplossing toe aan een 60 mm Petri-schotel
- Immobiliseer een nieuw gesloten (<2 uur na-eclosie) vlieg in een glazen buis op ijs en pak het op met zijn vleugels met behulp van een pincet. Voer vanaf dit punt alle procedures snel en onder dim rode verlichting uit bij 20 ± 1 ° C.
- Houd de vlieg met pincet vast, snijd het hoofd van de vlieg af met behulp van een razor blade chip in een houder. Pak een insectenpin (12 mm lang,0,1 mm in diameter) met de pincet en de kop tussen de ogen doorbreken.
- Onderdompel het hoofd kort in 70% ethanol; Dit voorkomt dat luchtbellen op het hoofd / oogoppervlak vormen. Knip het hoofd onder de ES-druppel op de siliconen dissectie schotel.
- Knip beide ogen af met behulp van de scheermesjeschip door gebruik te maken van een zaagbeweging langs de lijn van de voorste marge van het oog.
- Pak de rand van een hoornvlies goed met de fijne tweezers.
- Scoop het retina uit met behulp van de scooper.
OPMERKING: Na afloop van deze stap zal de hoornvlies leeg en intact worden, gescheiden van een intacte retina. - Zonder de retina te beschadigen, gebruik de pincet en scooper om de hechtende luchtzakken en overtollige hersenweefsel voorzichtig te verwijderen.
OPMERKING: De bereiding van geïsoleerde retinae is ook bruikbaar voor Western blot-analyses van niet-specifieke retinae-eiwitten 11 , full-mount histologie en full-retina imaging. Patch clamp opnames kunnen ook worden uitgevoerd op phOtoreceptoren van het hele netvlies 12 . - Neem de trituratiepipet met de grootste diameter, verbind het met de slang en vul het pipet met een kleine hoeveelheid TS uit een van de reservoirdruppels in de Petri-schotel door zachtjes aan te zuigen ( dwz door de mond). Voer deze stap uit elke keer als er een nieuwe ommatidia-trituratiepipet wordt gebruikt.
- Blaas de TS voorzichtig over de twee retinae door de mond en trek de geïsoleerde retinae in de pipet met behulp van zachte zuigkracht. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de pipet komen.
- Breng de geïsoleerde retinae naar de Petri-schotel, vorm een kleine druppel (~ 20 μL) en was ze een of twee keer met TS uit een van de reservoirdruppels.
- Incubeer het netvlies 20-25 minuten in het donker.
- Vervang de ommatidia trituratiepipet met een pipet met een opening met een kleinere diameter (met behulp van verse TS uit een reservoirdruppel zoals in stap 4.6 om de pipet te vullen).
- SnelAspireren en uitlopen beide retinae in een kleine daling (~ 20 μL) om de afzonderlijke ommatidia te scheiden.
OPMERKING: In de eerste fase moet de omliggende gepigmenteerde glia desintegreer, waardoor zichtbare kleine puin in de oplossing wordt gelaten. - Nadat er aanzienlijke kleine puin is verzameld, maar voordat er veel ommatidia zijn gescheiden, gebruik verse TS uit een reservoirdruppel en draag de retinae over naar een nieuwe kleine druppel.
- Selecteer een trituratiepipet met kleiner diameter, vul de vulling en ga verder tritureren.
OPMERKING: Aangezien ommatidia nu begint te scheiden, moeten hun langwerpige vormen duidelijk zichtbaar zijn onder de hoge kracht van de stereomicroscoop. Houd indien nodig de trituratiepipetten aan kleinere diameters aan tot een goede opbrengst van ommatidia zichtbaar is - Zodra een redelijke opbrengst van ommatidia zichtbaar is en de druppel niet langer doorzichtig is, vul de pipet met de volledige druppel die de geïsoleerde ommatidia bevat en doei de druppel voorzichtig naar deOnderkant van de badkamer voorgevuld met ES.
- Wacht ongeveer 1 minuut om de geïsoleerde ommatidia te laten zinken en op de bodem van de badkamer te vestigen.
- Met behulp van het perfusiesysteem start u de stroom ES in de badkamer. Zorg ervoor dat de kamer helemaal vol is van de oplossing, van onder naar boven, en dat de grond helemaal ondergedompeld is in de oplossing. Blijf het bad 4-5x wassen.
OPMERKING: daarna is continue perfusie niet nodig, hoewel het bad kort wordt gespoeld voordat een nieuwe patchpipet wordt geïntroduceerd.
6. Whole Cell Recording
Figuur 2: Overzicht van de elektrofysiologische en optische installatie. De installatie bevat een ijzeren, zwartverfde Faraday kooi ( F ). De voorzijde is bedekt met een zwart gordijn met koperdraad binnen. Deze configUratie zorgt ervoor dat het preparaat volledig afgedicht kan worden van enig lichtstraal en geschikt is voor het opnemen van donkere spontane bultjes. De omgekeerde fluorescentiemicroscoop ( A ) wordt bevestigd aan een anti-trillingslijst ( E ). De fotoreceptor opnameapparaat bestaat uit een zelfgemaakte acrylglasbadkamer ( O ) met een perfusie-ingang ( Q ), een zuigpijp ( S ) en een zilver-zilverchloride-grond ( P ). De badkamer is op de microscoopfase ( T ) gemonteerd met een zelfgemaakte adapter. De opnamepipet is verbonden met zilver-zilverchloride-draad naar een acrylglashouder, die verbonden is met het versterkerhoofdstadium ( C ). De hoofdfase wordt dan gemonteerd op een grove micromanipulator die is gemonteerd op een fijne XYZ mechanische micromanipulator ( B ). Het perfusie systeem ( D ) is samengesteld uit een spuitenset, terwijl de vloeistofstroom isD wordt geregeld door nippelkleppen ( H ). Het rack is elektrisch verbonden met dezelfde centrale grond waarop alle apparatuur in de Faraday kooi is aangesloten en bestaat uit een patch klemversterker ( N ), een oscilloscoop ( J ), een puls / functie generator ( K ), een A naar D-omvormer ( L ), een perfusiecontroller ( I ) en een filterwiel- en sluiterregelaar ( M ). Voor beeldvormingsexperimenten, een gekoelde (-110 ° C, zie de Tabel van Materialen ) CCD camera is aangesloten via een zijpoort ( G ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: Gebruik gedurende alle volgende stappen alleen dim dimlichtverlichting en zorg ervoor dat de blootstelling van de ommatidia aan het licht minimaal is ( dwz snel werken enZet de dissecterende lichtbron uit en de kamer rode verlichting die gebruikt wordt om de ommatidia te bekijken bij het uitvoeren van taken die het ommatidium niet nodig hebben. Voer daarnaast alle volgende stappen uit volgens het standaard elektrofysiologische protocol.
- Onder een omgekeerde microscoop (40X objectief), inspecteer alle ommatidia in het bad zorgvuldig en kies een geschikt ommatidium voor het experiment.
- Zorg ervoor dat het buitenmembraan van het ommatidium glad en intact is, zodat de lange as ongeveer in de juiste hoek is ten opzichte van de elektrodeaanpakrichting (zie figuur 3A ) en dat de distale sectie van het ommatidium niet omringd is door een Overtollig weefsel. Plaats het gekozen ommatidium op de optische as van de objectieflens (in het midden van het gezichtsveld) om een uniforme verlichting te waarborgen.
- Vul een patchpipet met intracellulaire oplossing (IS1 of IS2).
OPMERKING: Voor mijZeker de intensiteits respons en bump analyse, gebruik IS1. Om het omkeerpotentieel van de lichtgevoelige kanalen te meten, gebruik IS2. - Monteer de patchpipet op de elektrodehouder.
- Blaas in de pipet door de mond door de buis verbonden met de elektrodehouder, waardoor het met positieve druk kan vullen. Sluit de buisklep om de druk te onderhouden.
- Plaats de elektrode in de badkamer met behulp van de micromanipulator.
- Leid de elektrode dicht bij de distale sectie van het ommatidium, zodat er geen contact is tussen de elektrode en het ommatidium, tot een klein dimple (door de positieve druk in de patchpipet) in het ommatidium kan worden waargenomen.
- Open de opnamesoftware (zie de Tabel van Materialen ). Open de "membraan test module" om continu vierkantspanningspulsen van 2 mV toe te passen op een snelheid van 100 Hz.
- Stel het verbindingspotentieel in op "nul" door de juiste kno aan te passenB in de patchversterker versterker om de basis van de vierkante puls in te stellen op "nulstroom"
OPMERKING: De elektrofysiologische opstelling omvat een hoofdfase ( dwz eerste fase versterking) die verbonden is met een versterker ( dwz tweede fase versterking). Het versterkte analoge signaal wordt omgezet naar een digitaal signaal met behulp van de A / D converter, die wordt geregeld door software geïnstalleerd op een pc computer. - Laat de positieve druk in de pipet los door de klep van de buis die op de elektrodehouder is aangesloten te openen. Maak zachtjes druk in de pipet door te zuigen uit de buis, wat leidt tot de associatie van het pipet naar het celmembraan. Sluit de buisklep om de druk te onderhouden.
- Zorg ervoor dat de elektrodebestendigheid die op het computerscherm wordt bekeken, verhoogd is tot 100 - 150 MΩ. Laat de negatieve druk in de pipet los door de klep van de buis die op de elektrodehouder is aangesloten, handmatig te openen.
- Zorg ervoor dat de elEctrode weerstand wordt verhoogd tot tenminste 1-2 GΩ.
OPMERKING: Op dit punt is een verbinding gevormd tussen de elektrode en de fotoreceptor. - Controleer de capacitieve stromingen van de pipet door de juiste knop in de patch klemversterker aan te passen.
- Maak snelle, korte en krachtige botsingen van negatieve druk in de elektrode, die door de mond uit de buis die op de elektrodehouder is aangesloten, in de fotoreceptormembraan breekt en een volledige celconfiguratie creëert. Alternatief, gebruik de "Zap-knop" om korte, rechthoekige elektrische pulsen aan te passen, beginnend met een duur van 0,1 ms, of gebruik een combinatie van beide methoden.
OPMERKING: De generatie van de volledige celconfiguratie blijkt uit een plotselinge toename van de pipetcapacitantie (typisch ~ 60 pF voor een wildtype R1-6 fotoreceptor; een capaciteit van slechts ~ 20 pF duidt op een opname van een R7 fotoreceptor, een capaciteit boven ~ 90 pF geeft een opname van twee aanfotoreceptoren). - Stel het vasthoudpotentieel van de fotoreceptor in op de benodigde spanning (gewoonlijk -70 mV), handmatig met de juiste knop in de patch-klemversterker.
OPMERKING: het is mogelijk om deze stap uit te voeren nadat een zegel is verkregen (stap 6.11) en voordat de volledige celconfiguratie is bereikt. - Controleer de capacitieve stromingen en serieweerstand (een gemeten serieweerstandswaarde groter dan 25 MΩ geeft aan dat de elektrodepipet verstopt is) en indien nodig ( dwz voor grotere stromingen) de weerstandscompensatie compenseren met behulp van de juiste knoppen in de patchklemversterker .
- Sluit het zwarte voorgordijn van de Faraday kooi om maximale duisternis en elektrische isolatie te verkrijgen.
- Begin het opnameproces met behulp van de software en geef lichte stimuli en / of farmacologische stoffen aan volgens de gewenste experimentele procedure.
7. Gelijktijdige WhOle-cel opnames en Ca 2+ beeldvorming
- Voor genetisch gecodeerde Ca 2+ indicatoren, isoleer de ommatidia zoals hierboven beschreven met behulp van D. melanogaster vliegen die GCaMP6f 13 uitdrukken. Gebruik een CCD-camera (zie de Tabel van Materialen ) voor de fluorescentiemeting en zorg ervoor dat de microscoop uitgerust is met goede excitatie- en emissiefilters en een dichroïsche spiegel (zie de Tabel van Materialen ) 4 .
- Voor het gebruik van exogene Ca 2+ indicator ( Figuur 4 , zie de tabel van materialen ), isoleer de ommatidia zoals hierboven beschreven. Zorg er ook voor dat de pipetoplossing een calciumindicator van 20-100 μM bevat.
- Gebruik de beeldsoftware (zie de Tabel van Materialen ) om beelden te verkrijgen met een snelheid van 40 Hz. Doe een beeldverzameling gedurende een donkere periode van 10 s, gevolgd door een intense 2 s lichtstiopeenstapeling.
- Gebruik de beeldsoftware en definieer een regio van belang (ROI). Meet de florescentie-intensiteit in de ROI. Gemiddelde de donkere fluorescentie (F D ) en trek het af van de fluorescentieopnamen tijdens de stimulatie van het licht (FL) (F L -F D ). Normaliseer deze metingen volgens de fluorescentie-intensiteit aan het begin van de lichtstimulatie (F L 0 ).
Representative Results
De beschreven methode heeft de nauwkeurige registratie van de fundamentele eenheidstromen mogelijk die spontane en lichtgemaakte kwantumstoten genereren, die de macroscopische respons op licht produceren onder bepaalde omstandigheden. Het liet ook de vergelijking tussen wildtype en mutantvliegen toe die defecten hebben in kritische signaalmoleculen ( figuren 3 en 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Bovendien bleek het vermogen om terugkeerpotentieel te meten onder biionische omstandigheden de fundamentele biofysische eigenschappen van de TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen 18 , 19 . Het zorgde ook voor de meting van de effecten van aminozuur substituties in het poriëngebied van TRP dat zijn Ca 2+ veranderdeDoorlaatbaarheid 20 .
Het lichte antwoord verkregen door patchclamp-heel-cel opnames hangt lineair af van de lichtintensiteit voor ten minste 4 grootteordeningen. Dit kan niet opgelost worden door gebruik te maken van ERG- en intracellulaire opnamemethoden. Bijgevolg bleek een reeks reacties op korte flitsen van toenemende intensiteit en een plot van de intensiteitsresponsfunctie een strikte lineariteit van de flitsrespons met toenemende lichtintensiteit. De strikte lineariteit duurt tenminste een paar honderd pA, maar het is debatbaar of er vervolgens lineariteit of klemregeling is die afbreekt ( figuur 6 ). Deze resultaten suggereren dat de macroscopische reacties op het licht een lineaire opsomming zijn van de unitaire responsen op licht ( dwz kwantumstoten).
Het is goed gevestigd met behulp van spanningsopnames die dim stimulatie indemenUces discrete spanningsfluctuaties ( dwz kwantumstoten) bij de meeste ongewervelde soorten. De D. melanogaster quantum bumps komen uit de gecoördineerde opening van ~ 15 TRP kanalen en ~ 2 TRPL kanalen op de top van de bump 18 . Elke stoot wordt gegenereerd door de opname van een enkel foton, terwijl de macroscopische respons op meer intense lichten de summatie van deze elementaire reacties 14 , 21 is . De hobbels variëren aanzienlijk in latentie, tijdcursus en amplitude, zelfs wanneer de stimulusomstandigheden identiek zijn. Bumpgeneratie is een stochastisch proces dat wordt beschreven door Poisson-statistieken, waarbij elke effectief geabsorbeerde foton slechts één bult uitstraalt. De single-foton-single-bump relatie vereist dat elke stap in de cascade niet alleen een efficiënt "turn-on" -mechanisme bevat, maar ook een even effectief "uitschakel" -mechanisme. Het functionele voordeel is de productie van aZeer gevoelige fotonenteller met een snelle transiënte respons, zeer geschikt voor zowel de gevoeligheid als de tijdelijke resolutie die door het visuele systeem nodig is. De eis voor een efficiënt uitschakelmechanisme wordt aangetoond wanneer het actieve fotopigment ( dat wil zeggen metarhodopsin, M) of het doel ervan, de G q α, niet inactivert en leidt tot de voortdurende productie van bultjes lang nadat het licht is uitgeschakeld ( figuur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 .
De bump vertegenwoordigt de coöperatieve activiteit van de TRP / TRPL kanalen in een microvillus. Als zodanig moet elke hypothese van kanaalactivatie ook coöperatieve kanaalactivering verklaren. Recentelijk hebben Hardie en collega's aangetoond dat licht een snelle samentrekking van de fotoreceptoren oproept, wat suggereert dat de lichtgevoeligeE kanalen (TRP / TRPL) kunnen mechanisch gated zijn 25 . Deze mechanische activatie, samen met de waargenomen protonen die door PLC-gemedieerde PIP 2- hydrolyse worden vrijgegeven, bevorderen de opening van de TRP / TRPL kanalen en verklaren de coöperatieve aard van de bumpproductie 26 . Momenteel zijn D. melanogaster fotoreceptoren een van de weinige systemen waarin fosfoinositide signalering en TRP kanalen in vivo kunnen worden bestudeerd , waardoor D. melanogaster phototransduction en de methodologie ontwikkeld om dit mechanisme een zeer waardevol model systeem te bestuderen.
Figuur 3: De inaC P209 en inaD P215 Mutanten onthullen Slow Response Beëindiging van het Macroscopische Respons op Licht en van de Single Quantum Bumps. ( A ) De geïsoleerde ommatidiumprepaRantsoen met een patchpipet gevuld met fluorescerende Lucifer Yellow CH kleurstof (excitatie: 430 nm, emissie: 540 nm) wordt gepresenteerd tijdens een volledige opname van een cel. Merk op dat de fluorescerende kleurstof een enkel fotoreceptor cellichaam verspreidde en gemerkt heeft en dat de fotoreceptor cellichamen los zijn van hun langwerpige axonen, maar toch levensvatbaarheid behouden. Dit preparaat is geschikt voor gelijktijdige full-cell opnames en imaging experimenten. ( BD ) Bovenste panelen: Geheel-spanningsklemmen kwantumbumpreacties op continu dimlicht (open staaf) in WT, inaC P209 en inaD P215 mutantvliegen . Een langzame beëindiging van de stoten wordt waargenomen in inaC P209 en inaD P215 mutanten ten opzichte van WT vliegen. De onderstaande inzet toont de vergrote vorm van enkele stoten. Bodempanelen: Genormaliseerde macroscopische reacties van hele cellen op een 500-ms lichtpuls (1,5 x 10 5 fotonen per s) van de bovengenoemde wildtype En mutante vliegen. (EG) Bovenste panelen: Volle celspanningsklemmen kwantumbotsreacties op een korte (1 ms) dimlichtende single-foton respons in wildtype, arr2 3 en ninaC P235 mutantvliegen . Let op de treinstoot waargenomen in arr2 3 en ninaC P235 mutantvliegen als reactie op een enkele fotonabsorptie. Onderpanelen: Volkscelspanning klemde genormaliseerde reacties op een 500 ms lichtpuls (1,5 x 104 fotonen / s) in de overeenkomstige mutanten. Let op de langzame beëindiging van de macroscopische reacties waargenomen in arr2 3 En ninaC P235 mutant vliegen ten opzichte van WT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
D / 55627 / 55627fig4.jpg "/>
Figuur 4: Cellulaire Ca 2+ Dynamica Na aanleiding van door de signaal geïnduceerde Ca 2+ Influx wordt beïnvloed door Calphotin. Een tijdreeks van fotoreceptorbeelden van wildtype en Cpn 1% vliegen die de fluorescentie van de Ca 2+ -indicator tonen tijdens lichtstimulatie. Ruwintensiteitbeelden worden getekend met behulp van valse kleurcodering (bar = 10 μm; pijlpunten geven de pipet aan). Figuur herdrukt met toestemming van Weiss et al. 4 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De elektrofysiologische eigenschappen van WT-, trp- en trpl-mutanten. ( A ) Whole-cell voltage clamp recoRdings van quantum bumps in reactie op continu dim light (open bar) in WT, trpl 302 en trp P343 null mutant vliegen. Zeer verminderde amplitude van trp P34 3 stoten worden waargenomen. Inset: Vergrote single quantum bumps van wildtype en trp P343 null mutant vliegen worden getoond. ( B ) Whole-cell voltage clamp opnames in reactie op een 3 s lichtpuls van wildtype en de overeenkomstige mutanten. De transiënte steady state reactie van de trp P343 mutant wordt waargenomen . Inset: Vergrote lichte responsen van WT en trp P343 mutant worden getoond. ( C ) Een familie van overbelichte lichtgeïnduceerde stromingen van de bovengenoemde vliegstammen, opgewekt als reactie op een 20 ms lichtpuls, bij spanningsstappen van 3 mV, gemeten rond de omkeerpotentiaal (E rev ). ( D ) Een histogram dat de gemiddelde E rev van wildtype en de verschillende mutan plottets. De foutbalken zijn de SEM De omkeerpotentieel (E rev ) van WT ligt tussen de positieve E rev van trpl 302 , die alleen TRP uitmaakt en de E rev van de trp P343 null mutant, die alleen TRPL uitmaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De flitsrespons is strikt lineair met toenemende lichtintensiteit.
Een reeks actuele reacties op korte flitsen van toenemende lichtintensiteit en een plot van de afhankelijkheid van de piekamplitude van het lichtrespons op de toenemende intensiteit van korte lichtflitsen. Deze relatie laat een strikte lineariteit zien tussen de flitsrespons en de toenemende lichtintensiteit. Deze strenge lineariteitBevat tenminste een paar honderd pA, met lichtintensiteit die meer dan 4 orders van grootte overschrijdt, terwijl het debat kan zijn of het lineariteit of de klemregeling daaruit is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| pH | 7,15 (pas met NaOH) |
| Reagens | Concentratie (mM) |
| NaCl | 120 |
| KCl | 5 |
| MgCl2 | 4 |
| TES | 10 |
| proline | 25 |
| alanine | 5 |
| Bewaren bij -20 ° C. | |
| 2+ vrij, maar heeft geen Ca 2+ buffers toegevoegd en heeft derhalve ongeveer 5 - 10 μM trace Ca 2+ . Extracellulaire oplossing (ES) = ES-0Ca 2+ met 1,5 mM CaCl2, gemaakt door CaCl2 toe te voegen uit een 0,5 of 1 M voorraadoplossing aan ES-0Ca 2+ . |
Tabel 1: Ca +2- vrije extracellulaire oplossing (ES). Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn om Ca +2 -vrij ES te produceren.
| Reagens | Bedrag |
| FBS | 15 ml |
| sucrose | 1,5 g |
| Verdeel in 150 μl porties in 1,5 ml flacons en sla het op -20 76; C. | |
| Trituratieoplossing (TS) | Vul 1 injectieflacon met 150 ml voorraadoplossing met 1,350 ml ES of ES-0Ca 2+ , om de oplossing te gebruiken die tijdens de dissectie wordt gebruikt. |
Tabel 2: Fetische Bovine Serum (FBS) + Sucrose - Voorraadoplossing. Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn voor het produceren van foetale boviene serum (FBS) + sucrose-voorraadoplossing.
| pH | 7.15 (pas bij KOH) |
| Reagens | Concentratie (mM) |
| Kaliumgluconaat (Kglu) | 140 |
| MgCl2 | 2 |
| TES | 10 |
| ATP magnesiumzout (MgATP) | 4 |
| GTP natriumzout (Na2 GTP) | 0.4 |
| Β-Nicotinamide-adenine-dinucleotidehydraat (NAD) | 1 |
| Bewaren bij -20 ° C. |
Tabel 3: Intracellulaire Oplossing (IS1). Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn voor het produceren van IS1, die voornamelijk wordt gebruikt voor intensiteitsrespons en kwantumbumpmetingen.
| pH | 7,15 (pas bij CsOH) |
| Reagens | Concentratie (mM) |
| CsCl | 120 |
| MgCl2 | 2 |
| TES | 10 |
| ATP magnesiumzout (MgATP) | 4 |
| GTP natriumzout (Na2 GTP) | 0.4 |
| Β-Nicotinamide-adenine-dinucleotidehydraat (NAD) | 1 |
| Tetraethyl-ammoniumchloride (TAE) | 15 |
| Bewaren bij -20 ° C. |
Tabel 4: Intracellulaire Oplossing (IS2). Chemische omschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn om intracellulaire oplossing IS2 te produceren, die voornamelijk gebruikt wordt voor omkerende potentiële metingen van de licht geïnduceerde stroom.
Discussion
De toepassing van hele cel opnames op D. melanogaster fotoreceptoren toegestaan voor de ontdekking en de functionele toelichting van nieuwe signalering eiwitten, zoals TRP kanalen 27 , 28 , 29 en INAD 30 , 31 , 32 steiger eiwit. Sinds de initiële introductie van deze techniek heeft het de oplossing van langetermijnvraagstukken over het ionische mechanisme en spanningsafhankelijkheid van het lichtrespons mogelijk gemaakt. Dit gebeurde door het toegewezen vermogen om de membraanspanning en extracellulaire en intracellulaire ionische samenstelling 19 , 28 nauwkeurig te regelen.
Een belangrijk obstakel van de patch klemmethode in D. melanogaster is de fragiliteit van de geïsoleerde ommatidia preparantsoen. Uitgebreide studies hebben aangetoond dat de integriteit van de phototransductiemachines kritisch hangt af van de doorlopende levering van ATP, vooral bij lichtbelichting, wat leidt tot een groot verbruik van ATP. Helaas elimineert de mechanische striping van de pigmenten ( dwz glia) cellen, die nodig zijn om het fotoreceptormembraan met de patchpipet te bereiken, de belangrijkste bron van metabolieten die nodig zijn voor ATP-productie 33 . Toepassing van exogene ATP in de opnamepipet voldoet slechts gedeeltelijk aan de eis voor grote hoeveelheden ATP. Een tekort aan ATP leidt tot spontane activering van de TRP kanalen en naar de dissociatie van de phototransduction machines van de licht geactiveerde kanalen, waardoor een grote toename van cellulaire Ca 2+ en de afschaffing van de normale respons op licht 34 , 35 wordt veroorzaakt. Deze reeks gebeurtenissen is niet te wijten aan schade aan deFotoreceptoren door de dissectieprocedure, maar liever naar de cellulaire depletie van ATP. Om te voorkomen dat deze volgorde van gebeurtenissen optreedt en om normale lichteffecten te handhaven, mogen de fotoreceptoren niet worden blootgesteld aan intense lichten, die grote hoeveelheden ATP verbruiken. Ook moet NAD in de opnamepipet opgenomen worden, vermoedelijk om ATP-productie in de mitochondria 18 , 36 te vergemakkelijken. Voor de metingen van spontane en kwantumstoten is de bovengenoemde moeilijkheid minimaal omdat alleen dimlichten worden gebruikt. In de praktijk kan een stabiele hele-cel opname worden gehandhaafd voor ~ 20-25 minuten, hoewel er een tendens is voor reactiekinetiek om gedurende deze periode te vertragen. Een enkele bereiding van gedisocieerd ommatidia kan tot 2 uur levensvatbaar blijven.
Een bijkomende tekortkoming van de geïsoleerde ommatidiapreparatie is de ontoegankelijkheid van de microvilli, die vertaalt naar de ontoegankelijkheid van de TRP enTRPL kanalen naar de opnamepipet, waardoor opnamen met een kanaal worden voorkomen. Met behulp van een methode die ze ontwikkelden, slaagde Bacigalupo en collega's erin om directe opnamen uit de rhabdomere 37 direct op te nemen . Deze kanaalactiviteit verschilt echter van die van TRPL kanalen die heterologisch tot expressie komen in weefselkweekcellen 38 en van TRP-kanaalactiviteit afgeleid van schotgeluidsanalyse verkregen uit geïsoleerde ommatidia 34 . Vermoedelijk beschadigde de dissectieprocedure de fotoreceptorcellen bij het gebruik van deze methode.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het experimentele deel van dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de VS-Israël Bi National Science Foundation (BM en IL), de Israëlische Science Foundation (ISF), de Deutsch-Israëlische Projektkooperatie (DIP) (naar BM) en de Biotechnologie En Onderzoeksraad Biologische Wetenschappen (BBSRC Grant-nummers: BB / M007006 / 1 en BB / D007585 / 1) naar RCH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | |||
| 5 mL syringe | |||
| 1 mL syringe with elongated tip | |||
| Petri dish | 60 mm | ||
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
| Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
| 2 small beakers | 50 mL or less | ||
| 2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
| Bath chamber | home-made | ||
| Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
| Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
| Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
| Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
| Micro dissecting needle holder | |||
| Vise | |||
| 2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
| Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
| Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
| Osilloscope | GW | GOS-622G | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
| Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
| Suction system | |||
| Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
| Head-stage | Molecular Device | CV - 4 | Gain: x 1/100 |
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
| Clampex | Molecular Device | 10 | software |
| pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
| Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
| Light detector | home made | phototransistor | |
| Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
| Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
| Light guide | Quartz | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
| Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
| Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
| Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
| CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
| NIS Element | Nikon | AR | software |
| Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
| Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 - AT - GFP/FITC Longpass set | |
| Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
| Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |
References
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
- Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
- Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
- Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
- Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
- Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
- Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
- Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
- Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
- Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
- Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
- Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
- Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
- Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
- Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
- Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
- Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
- Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
- Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
- Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
- Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).
