Summary
Este artigo de vídeo fornece uma demonstração detalhada das formalidades necessárias para remover com êxito o pâncreas de um rato por dissecação para análise histológica e perfis metabólicos.
Abstract
Nós temos investigado o fator de transcrição específico do pâncreas, 1a cre-recombinase; sarcoma de rato LOX-paragem-lox-Kristen, glicina, ácido aspártico no codão 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) cepa de rato como modelo de câncer no pâncreas humano. O objetivo dos nossos estudos atuais é identificar biomarcadores metabólicos romance de progressão do câncer pancreático. Efetuamos a criação de perfil metabólico de urina, fezes, sangue e extratos de tecido do pâncreas, bem como a análise histológica do pâncreas para encenar a progressão do câncer. O pâncreas de rato não é um órgão sólido bem definido como nos seres humanos, mas pelo contrário, é um tecido mole difusamente distribuído que não é facilmente identificado por indivíduos que não estão familiarizados com a anatomia interna do mouse ou por indivíduos que têm pouca ou nenhuma experiência realizando dissecções de órgão do rato. O objetivo deste artigo é fornecer uma detalhada step-wise demonstração visual para orientar noviços na remoção do pâncreas rato por dissecação. Este artigo deve ser especialmente valioso para estudantes e investigadores de novo à investigação que requer a colheita do pâncreas de rato por dissecação para criação de perfil metabólico ou análise histológica.
Introduction
O mouse tem emergido como um importante modelo animal de câncer no pâncreas humano1,2. No Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modelo do rato, a Kristen oncogene de sarcoma (K-Ras) de rato é ativado exclusivamente no pâncreas, resultando em iniciação de lesões pré-cancerosas no pâncreas, conhecido como neoplasias intra-epitelial pancreáticas (PanINs), que o progresso para adenocarcinoma ductal do pâncreas, comumente referido como PDACs3. Este sistema de modelo do mouse fornece dentre os melhores modelos animais disponíveis para4,câncer de pâncreas humano5, com a vantagem adicional dos PanINs emergem dentro os primeiros cinco meses de vida e, frequentemente, progresso a PDAC dentro um único ano4,5, Considerando que o câncer de pâncreas ocorre mais frequentemente em humanos 60-70 anos de idade.
Extração do pâncreas por dissecação do Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + ratos em várias idades permite detalhado exame histológico longitudinal do desenvolvimento de câncer no pâncreas, desde os primeiros estágios de PanIN através da progressão PDAC3,4 , 5. colheita do pâncreas em idades que variam de cinco a quinze meses também pode ser usada para preparar o tecido extratos para caracterizar mudanças globais no metabolismo de4 pâncreas que ocorrem durante a transição de saudável para o tecido doente 6,7.
Este artigo apresenta um guia visual completo das etapas necessárias para realizar uma extração de pâncreas de rato e fornece diretrizes para o armazenamento de um pâncreas para posterior análise. Este guia será igualmente valioso para indivíduos realizando pesquisa sobre outras doenças do pâncreas, incluindo diabetes tipo e devem ser especialmente útil para estudantes e investigadores novos para pesquisas envolvendo a colheita do pâncreas de rato usando dissecação para criação de perfil metabólico ou análise histológica.
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Protocol
os procedimentos realizados no vídeo e descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de Miami e institucional Cuidado Animal.
1. preparação e estímulo teste
- estabelecer duas áreas distintas para o procedimento cirúrgico, mesa de operações e a tabela de pós operação. Estágio de ambas as áreas com todos os materiais e utensílios necessários.
Tabela de
- fase a operar sob uma capa exalada. Organizar a mesa com o equipamento de uma forma que permite o desempenho contínuo e sem entraves do processo.
- Estabelecer uma tabela pós-operatória na mesma sala e perto da mesa principal da operação. Manter ambas as tabelas como ambientes estéreis durante o procedimento.
- Lugar o seguinte fornece na mesa de operações: um frasco com tampa, um tubo de 15 mL, um par de tesouras cirúrgicas, uma garrafa de etanol a 70%, duas placas de espuma, duas pinças, duas seringas de calibre 1 mL 21, dois tubos de 50 mL, tubo de centrifugação de uma , um frasco criogênico, quatro almofadas cirúrgicas, dez pinos, um distribuidor de toalhetes esterilizantes e um recipiente de objectos cortantes.
- Coloque o seguinte material na mesa de pós operação: uma balança analítica, um 4 L dewar de nitrogênio líquido, uma rasa grande boca dewar, um rack de microtubo flutuante, um par de tesouras cirúrgicas, pinças de dois, quatro frascos criogênicos e um dispensador de Toalhetes esterilizados.
- Preencher um de 50 mL e um tubo de 15 mL, volume 75% com formalina.
- Usando um alfinete em cada esquina, apor um bloco cirúrgico para uma placa de espuma de aproximadamente 30 cm x 30 cm para servir como o tabuleiro de dissecação. Use os restantes quatro pinos durante a operação. Preparar uma placa de espuma menor com um bloco cirúrgico para transferir os órgãos à tabela pós-operatório.
Cuidado: Isoflurano (99,9%) é um químico do tóxico e deve ser usado em uma capa do respiradouro para garantir o máximo nível de segurança da eliminação de resíduos de gás anestésico 8. Informações adicionais sobre os riscos para os pesquisadores associados com o uso do método aberto-gota utilizando isoflurano podem ser encontradas em um artigo por Taylor e Mook 8. - Colocar um bloco cirúrgico, o frasco de vidro e embeba com algumas gotas de isoflurano (99,9%) e coloque um papel toalha por cima para evitar o contato direto do mouse com o isoflurano. Da mesma forma, use um bloco cirúrgico para o restante do tubo de linha e mergulhe com algumas gotas de isoflurano e coloque uma almofada adicional por cima para evitar o contato direto entre o rato e o isoflurano.
- Pour nitrogênio líquido na boca larga superficial dewar até o máximo preencher linha é alcançado.
- Lugar o mouse selecionado para dissecção para a anestesia de câmara, ou seja, o frasco de vidro com um pad embebido com algumas gotas de isoflurano (99,9%) coberto com a tampa, para ~ 1 min.
Nota: Esse tempo varia de rato de rato. Uma vez que o mouse é inconsciente, removê-lo da câmara e colocá-lo no quadro de funcionamento. - Oriente do mouse para que o lado ventral é uma mentira e com sua cabeça apontada longe o cientista. Coloque a cabeça dentro do tubo alinhado com um bloco cirúrgico embebido com algumas gotas de isoflurano (99,9%) e executar um teste de estímulo uma pitada de pé para garantir que o mouse não responde a estímulos.
- Se este teste falha e o mouse responde para o teste do beliscão de pé, repita o passo 1.8.
2. Inicial de incisão, punção de coração e eutanásia
- Pin dos membros do rato para a placa de espuma cirúrgica e molhado do lado ventral do mouse com etanol a 70%.
- Aperte a pele/pele perto da abertura uretral com pinça e puxe ligeiramente para cima. Fazer uma incisão com a tesoura cirúrgica através da cavidade abdominal a partir da linha mediana, a abertura uretral e terminando no queixo.
- Perto de ponto de partida da incisão inicial, pegue um dos lados da pele/pele com a pinça e fazer outra incisão com a tesoura para baixo e na diagonal em direção a pata traseira.
- Repetir isto da mesma maneira do lado oposto.
Nota: A pele/pele pode ser fixada para baixo para criar uma abertura mais larga, mas não é necessária.
- Localizar o coração e remover o pericárdio, que é o saco em torno do coração, para evitar entupimento da agulha da seringa.
- Segure o pericárdio com a pinça e cortar com a tesoura. Realizar a punção do coração inserindo cuidadosamente a agulha da seringa o coração e comece a retrair o êmbolo lentamente.
- Para coleta de sangue ideal, utilize o êmbolo da agulha para imitar a ação de bombeamento do coração e evitar desenhar rapidamente.
Nota: Normalmente cerca de 1 mL de sangue pode ser coletado. - Depois de concluir a coleta de sangue, dissipar o sangue no tubo de centrífuga e descarte a seringa no recipiente de objectos cortantes.
- Depois que é feita a punção do coração, realizar eutanásia removendo os anexos conectando o coração.
Nota: Heparina, um anticoagulante, não foi adicionada à seringa neste procedimento antes da punção do coração para permitir que o sangue a coagular para coleta de soro neste estudo específico. No entanto, se o pesquisador quis evitar a coagulação de sangue para coleta de plasma, heparina pôde ser adicionada à seringa antes da punção do coração.
- Se o estudo envolve a determinação do genótipo do rato, cortar uma parte da orelha com a tesoura e coloque em um tubo de centrífuga para uma verificação de genótipo.
3. extração do pâncreas
- localizar o estômago do lado esquerdo do mouse. Comece suavemente (a fim de evitar rasgar) Separe o pâncreas do estômago e duodeno, utilizando duas pinças.
Nota: Quando desconectar o pâncreas do estômago e intestinos, é muito importante que a pinça é usada suavemente para guiar o tecido do pâncreas longe os órgãos e para não esmagar ou rasgar o pâncreas com a pinça.- Continuar a separar o pâncreas das seções intestino delgado jejuno e íleo e por último do ceco do intestino grosso.
- Para o ceco, reposicionar o fórceps e continuar a separação do pâncreas ao longo do cólon restante no sentido reto.
Nota: Neste ponto, é conveniente cortar e remover a parte do estômago para a região do cólon imediatamente anterior do reto. - Localizar o pâncreas e baço em anexo. Deslize o pâncreas para o lado direito do mouse. Separe as restantes ligações entre o pâncreas e a cavidade torácica com a pinça para retirar totalmente o pâncreas e o baço conjugado.
- Remover o pâncreas e espalhá-lo para exame. Deixe o baço anexado ao pâncreas para fins de identificação.
- Remover todos do tecido conjuntivo, tecido gordo e mesentérico do pâncreas.
Nota: Este tecido é mais branco na cor e, portanto, pode ser facilmente distinguido do tecido do pâncreas é mais rosado na cor. Isto é particularmente importante se o pâncreas inteiro precisa ser removido. Por exemplo, se o pâncreas precisa ser pesado e em relação ao peso corporal, ou entre grupos de animais. No Ptf1a cre / +; LSL-Kras G12D / + modelo do rato, especificamente nos meses mais velhos, difícil fibroso tecido pancreático poderia estar presente. Neste caso, a remoção cuidadosa do pâncreas deve ser conduzida como os intestinos podem ser entrelaçados no tecido do tumor. Em casos avançados, baço anormal e tecido do fígado podem também estar presentes.
- Remover todos do tecido conjuntivo, tecido gordo e mesentérico do pâncreas.
- Se desejado, remover outros órgãos neste ponto.
4. coleta de dados e armazenamento
- após a extração dos órgãos, mover as amostras para a área de pós-operatório para preservação.
- Pesar cada órgão e colocá-los em seus respectivos frascos criogênicos.
Nota: ao longo de sagacidadeh a massa de cada amostra, as irregularidades devem ser registadas para referência futura. - Uma vez que os órgãos são pesados, colocá-los para o nitrogênio líquido para congelamento de snap.
- Após snap congelando, armazenar os órgãos a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Colocar as amostras de formalina armazenada na parte superior do banco durante a noite, e na manhã seguinte alterar sua solução de formalina para etanol a 70%.
Nota: Estas amostras devem ser armazenadas a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. - Para o armazenamento de longo prazo, congelar o ponche de sangue e orelha a-80 ° c... Para coleta de soro do sangue, permitir que o sangue a coagular por 30 min, em seguida, centrifugá-lo. Remover a porção de soro com uma pipeta e armazene-o em seguida a -80 ° C.
5. Clean Up
- Sanitize a dissecação todas as ferramentas com as toalhitas esterilizantes. Tampa do tubo alinhado com o isoflurano embebido bloco cirúrgico. Substitua o bloco cirúrgico sobre a placa de espuma com um bloco cirúrgico novo. Elimine as porções do mouse que não foram coletadas pela facilidade ' política de eliminação de animais de s.
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Representative Results
A Figura 1 mostra uma visão geral da área de ambiente operacional e a Figura 2 mostra a área de operação do post. Enquanto essa configuração fornece a quantidade mínima de equipamentos e preparo, os indivíduos podem optar por alterar isto para melhor atender as necessidades individuais. O protocolo deve ser otimizado de acordo com as necessidades específicas da experiência. Este procedimento é realizado de uma forma que termina a vida de um rato, exigindo adequada eutanásia9. Quando o pesquisador está pronto, o mouse é colocado na câmara de anestesia com as almofadas encharcada de isoflurano (Figura 3).
Uma vez que o mouse é inconsciente, remover o mouse e colocá-lo lado dorsal na placa. Um procedimento de dedo-pinch deve ser realizado para garantir que o mouse não responde à dor (Figura 4). Aplica álcool 70% para esterilizar a área da incisão inicial. O terminal de sangue deve ser realizado em primeiro lugar, antes da remoção do pâncreas, para garantir a recuperação de sangue adequada. Antes da remoção do sangue, o pericárdio deve ser removido para evitar o entupimento da agulha 21G de abertura. Depois de completar o sangue terminal desenhar, o coração é destacado como um método secundário de eutanásia e o pâncreas é removido.
Comece localizando o estômago, o que fornece um bom ponto de partida para a remoção do pâncreas (Figura 5). Nota: Extremo cuidado deve ser exercido durante a remoção do pâncreas, que é um tecido delicado e frágil, e, portanto, todas as operações devem ser executadas com uma força suave. Usando fórceps, começar a dissecação por começar a puxar suavemente o pâncreas longe o estômago e continuar a separar o tecido pancreático do forro exterior do trato gastrintestinal (GI) trabalhando a partir do estômago para o duodeno, o jejuno e o íleo ( Figura 6). Uma vez atingido o ceco, mais fácil remoção do pâncreas é conseguida pelo reposicionamento do fórceps para que um fórceps está segurando o ceco e a outra pinça é usada para continuar a separar o pâncreas do intestino grosso (Figura 7). Após a remoção do intestino grosso, o pâncreas é colocado no lado direito do mouse e os restantes anexos são cortadas(Figura 8).
O pâncreas devem ser espalhado para inspeção e qualquer anormalidade deve ser gravado (Figura 9). No Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + mouse estirpe, o pâncreas potencialmente poderia conter um tumor endurecido (Figura 10). Outros órgãos também devem ser examinados para potencial metástase. Uma vez que o pâncreas foi removido, isso deve ser pesado e o peso verificado. Uma parte do pâncreas deve ser snap-congelado em nitrogênio líquido para futuro análise de perfil metabólico ou outros testes e uma porção do pâncreas devem ser colocados em formol para futura análise histológica. A Figura 11 mostra o armazenamento inicial de vários órgãos coletados a partir da dissecação para uso em análise posterior. Os objetivos do pesquisador individual dependerá os órgãos colhidos por dissecação e armazenados para um estudo mais aprofundado.
Amostras de tecido e o sangue podem ser usadas para análise histológica e para criação de perfil metabólico. Um exemplo da análise histológica do tecido do pâncreas é mostrado na Figura 12. De perfil metabólico pode ser realizado na amostra de sangue e amostras de tecido congelado snap. Espectros de espectroscopia (NMR) representante da ressonância magnética nuclear dos componentes de extratos de pâncreas tecido hidrofílicos e hidrofóbicos são mostrados na Figura 13A e 13B, respectivamente. Um espectro de NMR representante coletado em uma amostra de soro preparada a partir de sangue coletado no momento do procedimento de desenhar sangue terminal é mostrado na Figura 14.
Figura 1 : Preparo da área de funcionamento. Layout geral de ferramentas corretas e condições de funcionamento para a dissecação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Preparo da área de pós operação. Layout geral de ferramentas corretas e condições de funcionamento para os procedimentos pós-operatórios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Câmara anestesia. Ambiente adequado para a anestesia através do isoflurano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Exame de estímulo. O teste de estímulo realizado no mouse antes da incisão inicial para garantir qualquer dor ou desconforto não é ser suportado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Começando a remoção do pâncreas. A orientação do mouse indicando a extração inicial do pâncreas, local indicado pelo fórceps. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Extração de pâncreas ao longo do intestino. Processo de isolar o pâncreas do tracto gastrointestinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Remoção do pâncreas para o ceco. Reposicionamento da pinça uma vez o ceco é alcançado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Remoção do pâncreas. Coloque o pâncreas no lado direito do mouse. Os restantes anexos devem ser cortados para remover totalmente o pâncreas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Pâncreas exame. O pâncreas baço anexado a ser examinados após a remoção do mouse. O baço é indicado pela seta vertical, e o pâncreas é indicado pela seta horizontal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 : Pâncreas exame. O pâncreas baço anexado exibindo um tumor pancreático sendo examinado após a remoção do mouse. O baço é indicado pela seta vertical, e o pâncreas é indicado pela seta horizontal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11 : Armazenamento de órgãos removidos. Armazenamento adequado dos órgãos e amostras coletadas, preparado para armazenamento a longo prazo e análise futura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12 : Análise histológica do tecido do pâncreas. Hematoxilina e eosina manchado imagens do tecido do pâncreas. A) tecido do pâncreas normal de um Ptf1acre /-; LSL-KrasG12D /- rato de controle. B) PanIN tecido do pâncreas de um Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + rato de estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13 : Metabólica Análise de criação de perfil. Próton unidimensional ressonância magnética nuclear (NMR) de espectroscopia espectros de componentes de fase A) hidrofílico e B) hidrofóbico de extratos de tecido do pâncreas após homogeneização do tecido e submetido a extração de clorofórmio/metanol. O espectro de RMN foram adquirido em 850 MHz e é adequado para uso em análises de perfil metabólicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14 : Espectro de NMR representante de soro. O sangue coletado pelo procedimento de sorteio de sangue terminal pode ser usado para análise de perfil metabólico. Este espectro mostra um típico espectro de 850 MHz NMR próton unidimensional coletadas sobre o soro obtido a partir de uma amostra de sorteio de sangue terminal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Importância no que diz respeito a métodos existentes
Enquanto existem outros vídeos informais de dissecções de rato, este artigo de vídeo fornece a primeira qualidade profissional, par-revistos, demonstração visual de todas as etapas detalhadas necessárias para extração e colheita do pâncreas rato por dissecação10 . Com o pâncreas é um órgão principal para a atividade metabólica e insulina produção, dissecção e colheita do pâncreas permite a preservação das características fisiológicas11. Isolando o pâncreas, análises futuras podem ser realizadas na amostra. Este procedimento permite a comparação e o estudo das interações de outros tecidos dentro do organismo mesmo dentro do mesmo prazo.
Limitações da técnica
A maior limitação deste procedimento é a cessação da vida do rato, evitando assim que a coleção longitudinal e amostragem de múltiplas amostras de tecido do mouse mesmo. A fim de analisar as tendências relacionadas à idade, sexo ou outros quantificadores, uma população transversal deve ser implementada, como fizemos para nosso estudo de biomarcadores metabólicos de câncer pancreático. Outra limitação deste protocolo é a incapacidade para pausar o processo. Uma vez que a eutanásia é iniciada, o procedimento deve efectuar na sua totalidade.
Passos críticos dentro do protocolo
Execução do teste de estímulo beliscando a pata traseira do mouse é fundamental para garantir que o rato recebe tratamento humano. Se o mouse não reage a este estímulo, então o procedimento se efectuar como planejado. No entanto, deve o mouse exibir uma resposta angustiada como resultado do teste de estímulo, o rato deve ser retornado para a câmara de anestesia para um período adicional de tempo e o teste repetido até uma reação ao teste de estímulo não é observada a12.
Da mesma forma, a punção do coração terminal seguida da remoção das conexões para o coração, imediatamente após a amostra de sangue terminal é recolhida como um método secundário de eutanásia garante o sacrifício humano do mouse. Para garantir uma eficaz recolha de sangue, o cientista deve usar um movimento de bombeamento com a seringa que é parecida com o batimento cardíaco do mouse, permitindo a máxima coleta de sangue para análise.
Modificações e solução de problemas
Os órgãos de formalina para soluções de etanol 70% de comutação prepara os órgãos para o processo de incorporação necessário para análise histológica. Soluções de armazenamento diferente podem ser necessárias caso o cientista opte por realizar outros experimentos com os órgãos. Antes da análise, é importante limitar qualquer potencial descongelamento dos órgãos armazenados no freezer-80 ° C para preservar a integridade do órgão.
Uso da Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modelo do rato minimiza a ocorrência de não-pancreática primária tumores e doenças13. Assim, é importante observar as irregularidades que são aparentes para o pâncreas ou outros órgãos durante a dissecção e coleta das amostras de tecido para análise.
Aplicações futuras
Colheita do pâncreas rato por dissecação permite vários tipos de análise para ser realizado na mesma amostra. O mais popular destes incluem, mas não está limitados a, microscopia de fluorescência, hematoxilina e histologia eosina, imuno-histoquímica, espectrometria de massa e de6,de espectroscopia de ressonância magnética nuclear7, 14 , 15. doenças como diabetes, câncer de pâncreas e pancreatite podem ser estudadas usando as técnicas mencionadas acima de16.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
MAK reconhece apoio para este trabalho a partir do National Institutes of Health / número - 1R15CA152985-01A1 de concessão do National Cancer Institute. Este projeto também foi apoiado pela Miami University graduação prêmio programa de pesquisa, as oportunidades de doutorado-graduação de Universidade de Miami para programa de bolsas e o programa de estudiosos de Verão de Universidade de Miami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Jar | Corning | 3140-150 | The glass jar used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| Lid of Glass Jar | Corning | 9985-150 | The glass jar lid used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339650 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 9201 | |
| Squeeze bottle | Fisher Scientific | 03-409-10DD | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Foam Boards | Therapak | 562908 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 200205SHN | |
| 1 mL 21G Syringes | BD Biosciences | 309624 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339652 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| Surgical Pads | Fisher Scientific | S67011 | |
| T-Pins Length: 2" | Advance Store Products | X32T-05 | |
| Sterilizing Wipes | Professional Disposables International Inc. | Q85084 | |
| Sharps Container | Fisher Scientific | 14-827-122 | |
| Analytical Balance | Marshall Scientific | ME-AE200 | |
| 4L Dewar | Taylor-Wharton | 4LD | |
| Shallow Wide Mouth Dewar | Fisher Scientific | F3087-V | |
| Floating Microtube Rack | VWR | 60986-100 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile | Fisher Scientific | 10-500-25 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Liquid Nitrogen | Wright Brothers | NIT-60-XX | |
| Mouse Kras Strain | The Jackson Laboratory | OO8179 | |
| Mouse Cre Strain | MMRRC | OOO435-UNC |
References
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