Summary
توفر هذه المقالة الفيديو مظاهرة تفصيلاً الإجراءات اللازمة لإزالة البنكرياس بنجاح من ماوس بتشريح للتحليل النسيجي والتنميط الأيضية.
Abstract
لقد تم التحقيق عامل النسخ المحددة البنكرياس، 1a cre-ريكومبيناسي؛ ساركومه لوكس-توقف-لوكس-كريستين الفئران، جليكاين لحمض الأسبارتيك في كودون 12 (Ptf1acre/+؛ لسلكراسG12D/+) الفأر سلالة كنموذج للبشرية سرطان البنكرياس. لدينا الدراسات الحالية يهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية الأيضية رواية لتطور سرطان البنكرياس. وقد أجرينا التنميط الأيضية للبول، والبراز، والدم، ومقتطفات أنسجة البنكرياس، فضلا عن تحليلات النسيجي لمرحلة تطور سرطان البنكرياس. البنكرياس الماوس ليس جهازا صلبة محددة تحديداً جيدا مثل البشر، ولكن بدلاً من ذلك هو أنسجة ناعمة تصطبغ موزعة التي لم تحدد بسهولة من الأفراد غير مألوف مع الماوس التشريح الداخلي أو عن طريق الأفراد التي لديها القليل أو لا القيام بتجربة تشريح جهاز الماوس. والغرض من هذه الوثيقة تقديم مفصل المجوعات مظاهرة البصرية دليل المبتدئين في إزالة البنكرياس الماوس بالتشريح. ينبغي أن تكون هذه المادة ذات قيمة خاصة للطلاب والباحثين جديدة للبحوث التي يتطلب الحصاد البنكرياس الماوس بتشريح للتنميط الأيضية أو تحليلات النسيجي.
Introduction
وبرز الماوس حيوان نموذجا هاما لسرطان البنكرياس البشرية1،2. في Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ طراز الماوس، كريستين السرطاني كابوزي (ك-Ras) الفئران يتم تنشيط حصرا في البنكرياس، أسفر عن البدء بأورام في البنكرياس، المعروف باسم نيوبلاسياس للسيتولوجيا البنكرياس (بانينس)، أن التقدم للبنكرياس adenocarcinomas الأقنية، يشار إليها باسم بدأكس3. ويتيح هذا النظام النموذجي الماوس واحدة من أفضل النماذج الحيوانية المتاحة لسرطان البنكرياس البشرية4،5، مع ميزة إضافية التي تظهر بانينس خلال الأشهر الخمسة الأولى من الحياة، وكثيراً ما تقدم إلى بدك داخل واحد السنة4،5، في حين أن سرطان البنكرياس يحدث غالباً في البشر 60-70 سنة عمر.
استخراج البنكرياس بالتشريح من Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ الفئران في مختلف الإعمار يسمح لدراسة نسيجية طولية تفصيلية للتنمية سرطان في البنكرياس، بدءاً من أولى مراحل بانين من خلال التقدم إلى بدك3،4 , 5-حصاد البنكرياس في سن تتراوح ما بين خمسة إلى خمسة عشر شهرا يمكن أن تستخدم أيضا لإعداد الأنسجة مقتطفات لتوصيف التغيرات العالمية في البنكرياس4 الأيض التي تحدث أثناء الانتقال من صحية إلى الأنسجة المريضة 6،7.
هذه المقالة يعرض دليل مرئي كاملة للخطوات المطلوبة للقيام استخراج بنكرياس ماوس ويوفر مبادئ توجيهية للتخزين البنكرياس لمزيد من التحليل. هذا الدليل سوف تكون ذات قيمة متساوية للأفراد إجراء بحوث بشأن أمراض البنكرياس الأخرى، بما في ذلك مرض السكري من النوع الأول، وينبغي أن يكون مفيداً بشكل خاص للطلاب والباحثين جديدة للأبحاث المتعلقة بحصاد من البنكرياس الماوس باستخدام تشريح للتنميط الأيضية أو تحليلات النسيجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات التي نفذت في شريط الفيديو وهو موضح أدناه عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ميامي-
1-إعداد واختبار التحفيز
- تأسيس اثنين مجالات متميزة لإجراء العمليات الجراحية وطاولة العمليات والجدول بعد انتهاء العملية. المرحلة كلا المجالين مع جميع المواد والأدوات اللازمة.
الجدول
- المرحلة تعمل تحت غطاء التهوية. ترتيب الجدول بالمعدات بطريقة تسمح بأداء الإجراء مستمر ودون عوائق. إنشاء
- جدول بعد العملية الجراحية في نفس الغرفة والقرب من الجدول الرئيسي للعملية. الحفاظ على كلا الجدولين بيئات معقمة طوال فترة الإجراءات.
- مكان ما يلي اللوازم على طاولة العمليات: جرة زجاج واحد مع غطاء وأنبوب 15 مل واحد وزوج واحد من مقص الجراحة، وضغط واحد زجاجة من الإيثانول 70%، والمجلسين الرغوة، الملقط اثنين، هما محاقن قياس 1 مل 21، أنبوبين 50 مل، أنبوب أحد أجهزة الطرد المركزي ، قنينة المبردة واحدة وأربع منصات الجراحية والدبابيس عشرة، موزع مناديل تعقيم وحاوية الأدوات الحادة-
- وضع الإمدادات التالية على الجدول بعد انتهاء العملية: واحد تحليلية التوازن، أحد ديوار ل 4 من النتروجين السائل، ضحلة واسعة الفم ديوار ورف microtube عائمة وزوج واحد من مقص الجراحة، الملقط اثنين، أربعة قنينات المبردة وموزع ل مناديل معقمة.
- ملء واحدة 50 مل وأنبوب 15 مل واحد بحجم 75% مع الفورمالين.
- استخدام pin في كل زاوية، إلصاق لوحة الجراحية واحد إلى هيئة رغوة تقريبي 30 × 30 سم ليكون بمثابة مجلس تشريح. استخدام دبابيس الأربع المتبقية خلال العملية. إعداد لوحة رغوة أصغر مع لوحة العمليات جراحية لنقل الأجهزة إلى الجدول بعد العملية.
تنبيه: إيسوفلوراني (99.9%) المواد كيميائية سامة، وينبغي أن تستخدم في غطاء تنفيس لضمان أقصى مستوى من الأمان من مسح النفايات غاز مخدر 8. يمكن العثور على معلومات إضافية فيما يتعلق بالمخاطر التي يتعرض لها الباحثون المقترنة باستخدام الأسلوب فتح المنسدلة استخدام إيسوفلوراني في مقال ب تايلور وموك 8- - وضع لوح الجراحية واحد في جرة زجاجية ونقع مع بضع قطرات من إيسوفلوراني (99.9%) ثم ضع منشفة ورقية عبر الجزء العلوي للحيلولة دون الاتصال المباشر للماوس مع إيسوفلوراني. وبالمثل، استخدام لوحة العمليات جراحية لخط الأنبوب المتبقي ونقع مع بضع قطرات من إيسوفلوراني ووضع لوحة إضافية عبر الجزء العلوي للحيلولة دون الاتصال المباشر بين الماوس وإيسوفلوراني.
- صب النتروجين السائل في فم واسعة الضحلة هو التوصل إلى ديوار حتى الحد الأقصى لملء خط-
- مكان الماوس المحدد للتشريح في التخدير للدائرة، أي قطرات جرة زجاج مع لوحة غارقة مع عدد قليل من إيسوفلوراني (99.9%) مغطاة بالغطاء، لدقيقة ~ 1
ملاحظة: يختلف هذا الوقت من الماوس. مرة واحدة الماوس فاقد الوعي، إزالته من الدائرة ووضعه على لوحة التشغيل. - توجيه الماوس حيث أن ذلك هو الكذب الجانب البطني ومع رئيسها وأشار بعيداً عن العالم. وضع الرأس داخل أنبوب مبطنة بوسادة جراحية غارقة مع بضع قطرات من إيسوفلوراني (99.9%)، وإجراء اختبار تحفيز برشة سيرا على أقدام التأكد من أن الماوس لا يستجيب للمنبهات.
- إذا فشل هذا الاختبار والماوس يستجيب لاختبار قرصه سيرا على الأقدام، كرر الخطوة 1.8.
2. الأولى شق وثقب القلب والقتل الرحيم
- دبوس أطرافه الماوس للمجلس رغوة الجراحية والرطب في الجانب البطني من الماوس مع الإيثانول 70%-
- قرصه الفراء/الجلد بالقرب من افتتاح الاحليل مع الملقط وسحب إلى أعلى قليلاً. جعل شق بالمقص الجراحي عن طريق تجويف البطن ابتداء من فتح الاحليل، خط الوسط وتنتهي في الذقن.
- قرب نقطة انطلاق لشق الأولى، الاستيلاء على جانب واحد من الجلد/الفراء مع الملقط وجعل شق آخر مع المقص إلى الأسفل وقطرياً نحو مخلب الظهر.
- كرر هذا بنفس الطريقة على الجانب الآخر-
ملاحظة: قد يكون تمركزها إلى خلق فرصة أوسع الفراء/الجلد، ولكن ليس من الضروري-
- موقع القلب وإزالة تامور، وهو الكيس حول القلب، لتجنب انسداد من إبرة المحقن.
فهم تامور مع الملقط
- وقطع عليه مع المقص. إجراء ثقب القلب بإدخال إبرة حقنه بعناية في قلب ينبض وتبدأ ببطء لسحب المكبس.
- لجمع الدم الأمثل، واستخدام المكبس الإبرة لتقليد عمل الضخ للقلب وتجنب الرسم بسرعة كبيرة جداً-
ملاحظة: عادة حوالي 1 مل دم يمكن جمعها- - بعد الانتهاء من جمع الدم، تبديد الدم في أنبوب جهاز الطرد المركزي والتخلص من المحاقن في حاوية الأدوات الحادة-
- بعد أن يتم إجراء ثقب القلب، القيام بالقتل الرحيم بإزالة المرفقات يربط القلب.
ملاحظة: لم يتم إضافة الهيبارين، تخثر المضادة، لحقنه في هذا الإجراء قبل ثقب القلب للسماح للدم يتجمد لجمع المصل في هذه الدراسة المحددة. ومع ذلك، إذا أراد الباحث أن منع تخثر الدم جمع البلازما، يمكن إضافة الهيبارين للمحاقن قبل ثقب القلب-
- إذا كان ينطوي الدراسة الوراثي للفأرة، قص جزء من الإذن مع المقص ووضع في أنبوب الطرد مركزي لتحقق وراثي.
3-"استخراج البنكرياس"
- تحديد موقع المعدة على الجانب الأيسر للماوس. تبدأ بلطف (لتجنب تمزيق) فصل البنكرياس من المعدة والاثني عشر باستخدام الملقط اثنين.
ملاحظة: عند فصل البنكرياس من المعدة والأمعاء، من المهم جداً أن الملقط تستخدم بلطف دليل نسيج البنكرياس بعيداً عن الأجهزة وعدم سحق أو المسيل للدموع البنكرياس مع الملقط.- الاستمرار في فصل البنكرياس من أقسام الأمعاء صائم والدقاق، وأخيراً من الأعور الأمعاء الغليظة.
- في الأعور، تغيير موضع الملقط ومواصلة الفصل بين البنكرياس على طول القولون المتبقية نحو المستقيم.
ملاحظة: عند هذه النقطة، أنها ملائمة لخفض وإزالة الجزء من المعدة إلى منطقة القولون السابقة مباشرة للمستقيم. - تحديد موقع البنكرياس والطحال. شريحة البنكرياس نحو الجانب الأيمن من الماوس. فصل الاتصالات المتبقية بين البنكرياس وتجويف الصدر بالملقط لفصل كامل البنكرياس والطحال ملاصقة.
- إزالة البنكرياس وانتشرت للفحص. اترك الطحال يعلق على البنكرياس لأغراض تحديد الهوية.
النسيج الضام
- إزالة الكل، والأنسجة والدهون والمساريقي العلوي من البنكرياس.
ملاحظة: هذا النسيج بياضا في اللون وهكذا يمكن تمييزها بسهولة عن أنسجة البنكرياس هو وردي اللون. هذا مهم خاصة إذا كان البنكرياس كله يحتاج إلى إزالة. على سبيل المثال، إذا كان البنكرياس بحاجة إلى موازنة ومقارنة مع وزن الجسم، أو بين مجموعات من الحيوانات. في Ptf1a cre/+؛ LSL-كراس G12D/+ نموذج الماوس، وعلى وجه التحديد في الشهور القديمة، يمكن أن تكون أنسجة البنكرياس الليفي الثابت الحالي. وفي هذه الحالة، يجب أن تتم إزالة حذراً من البنكرياس كما يمكن أن يكون متشابك الأمعاء في أنسجة الورم. في الحالات المتقدمة، الطحال غير طبيعي ونسيج الكبد قد يكون أيضا هذا-
- إزالة الكل، والأنسجة والدهون والمساريقي العلوي من البنكرياس.
- إذا كان مطلوباً، إزالة الأجهزة الأخرى عند هذه النقطة.
4-جمع البيانات وتخزينها
- بعد استخراج الأجهزة، نقل العينات إلى منطقة ما بعد الجراحة للحفاظ على-
- تزن كل جهاز ووضعها في قنينة المبردة كل منهما.
ملاحظة: على طول فيتح الشامل لكل عينة، ينبغي أن تسجل أي مخالفات للرجوع إليها في المستقبل- - حالما يتم وزن الأجهزة، وضعها في النيتروجين السائل لتجميد المفاجئة.
- بعد تجميد المفاجئة، تخزين الأجهزة في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- بوضع عينات الفورمالين المخزنة في أعلى هيئة بين عشية وضحاها، وصباح اليوم التالي بتغيير حل بهم من الفورمالين إلى إيثانول 70%-
ملاحظة: يجب تخزين هذه العينات عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. - للتخزين على المدى الطويل، تجميد لكمه الدم والإذن في-80 درجة مئوية. لجمع المصل من الدم، تسمح للدم أن يتجمد لمدة 30 دقيقة ثم الطرد المركزي أنه. إزالة الجزء المصل باستخدام ماصة ومن ثم تخزين في-80 درجة مئوية.
5. تنظيف
- سانيتيزي جميع تشريح مع مناديل تعقيم أدوات. غطاء أنبوب تصطف isoflurane غارقة في لوحة العمليات الجراحية. استبدال لوحة المفاتيح الجراحية على متن الرغوة مع لوحة جراحة طازجة. التصرف في أجزاء الماوس التي جمعت لا كل المرفق ' سياسة التخلص من الحيوانات s-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 نظرة عامة مجال البيئة التشغيلية، ويبين الشكل 2 في مجال تشغيل وظيفة. وبينما يوفر هذا الإعداد الحد الأدنى من المعدات والتدريج، يجوز اختيار الأفراد لتغيير هذا لتناسب الاحتياجات الفردية. ينبغي أن يكون الأمثل في البروتوكول وفقا للاحتياجات المحددة للتجربة. ويجري هذا الإجراء بطريقة ينهي حياة الفأر، التي تتطلب يوثانيزيشن السليم9. عند الباحث جاهزاً، يتم وضع الماوس في غرفة التخدير مع منصات غارقة في إيسوفلوراني (الشكل 3).
مرة واحدة الماوس فاقد الوعي، إزالة الماوس ووضعه الجانب الظهرية على المجلس. تو-رشة ينبغي إجراء للتأكد من أن الماوس لا يستجيب للألم (الشكل 4). تطبيق الإيثانول 70% لتعقيم منطقة الشق الأولى. يجب أن يتم سحب الدم الطرفي أولاً، قبل إزالة البنكرياس، لضمان استرجاع الدم كافية. قبل إزالة الدم، يجب إزالة تامور لمنع انسداد الإبرة ز 21 فتح. بعد الانتهاء من الدم الطرفي رسم ويتم فصل القلب كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم وثم يتم إزالة البنكرياس.
ابدأ بتحديد موقع المعدة، والذي يوفر نقطة انطلاق جيدة لإزالة البنكرياس (الشكل 5). ملاحظة: ينبغي ممارسة الحذر الشديد أثناء إزالة البنكرياس، وأنسجة الحساسة والهشة، ولذلك ينبغي إجراء جميع العمليات مع قوة لطيف. استخدام الملقط، يبدأ التشريح بالبدء في سحب بلطف البنكرياس بعيداً عن المعدة ولا تزال تفصل أنسجة البنكرياس الخارجي بطانة الجهاز الهضمي (غي) تعمل من المعدة والعفج وصائم والدقاق ( 6 الرقم). حالما يتم التوصل إلى الأعور، يتحقق أسهل إزالة البنكرياس بإعادة تموضع الملقط حتى أن الملقط واحد هو عقد الأعور ويستخدم الملقط الأخرى الاستمرار في فصل البنكرياس من الأمعاء الغليظة (الشكل 7). بعد إزالة من الأمعاء الغليظة، البنكرياس يوضع على الجانب الأيمن من الماوس وأي مرفقات المتبقية هي قطعت(الشكل 8).
ينبغي أن يكون البنكرياس وانتشر للتفتيش، وأي شذوذ ينبغي تسجيلها (الشكل 9). في Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ الماوس السلالة، البنكرياس يمكن أن يحتمل أن تحتوي على ورم تصلب (الشكل 10). وينبغي أيضا دراسة الأجهزة الأخرى لورم خبيث المحتملة. بمجرد إزالة البنكرياس، فإنه ينبغي أن يكون وزنه وسجلت الوزن. ينبغي أن يكون جزء من البنكرياس المجمدة المفاجئة في النتروجين السائل للتحليل الأيضي التنميط في المستقبل أو التجارب الأخرى وجزء من البنكرياس ينبغي أن توضع في فورمالين للتحليل النسيجي في المستقبل. يبين الشكل 11 التخزين الأولية لمختلف أجهزة جمعها من تشريح للاستخدام في تحليلها في وقت لاحق. أجهزة التشريح بجمعها وتخزينها لمزيد من الدراسة سوف تعتمد على أهداف الباحث الفردية.
يمكن استخدام عينات الدم والأنسجة لإجراء تحاليل نسيجية والتنميط الأيضية. ويرد مثال التحليل النسيجي للأنسجة البنكرياس في الشكل 12. التنميط الأيضية يمكن أن تجري على عينات الأنسجة المجمدة المفاجئة وعينه الدم. الممثل الرنين المغناطيسي النووي الطيفي (الرنين المغناطيسي النووي) أطياف مكونات ماء ومسعور من مقتطفات أنسجة البنكرياس تظهر في الشكل 13A و 13B، على التوالي. ويرد في الشكل 14طيف الرنين المغناطيسي النووي ممثل جمعت عينة مصل أعدت من الدم التي جمعت في وقت إجراء سحب الدم الطرفي.
الشكل 1 : انطلاق تشغيل المنطقة. التخطيط العام للأدوات الصحيحة وظروف التشغيل للتشريح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : انطلاق من المنطقة بعد انتهاء العملية. التخطيط العام للأدوات الصحيحة وظروف التشغيل للحصول على إجراءات ما بعد الجراحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : دائرة التخدير. البيئة المناسبة للتخدير عن طريق إيسوفلوراني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : دراسة التحفيز. يجري هو عدم تحمل اختبار التحفيز التي أجريت على الماوس قبل شق الأولية لضمان أي ألم أو إزعاج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تبدأ إزالة البنكرياس. اتجاه الماوس مشيراً إلى استخراج الأولية في البنكرياس، الموقع المشار إليه بالملقط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : استخراج البنكرياس على طول الأمعاء. عملية عزل البنكرياس من الجهاز الهضمي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : إزالة البنكرياس في الأعور. هو التوصل إلى إعادة تموضع الملقط مرة الأعور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : إزالة البنكرياس. مكان البنكرياس على الجانب الأيمن من الماوس. يجب قطع أي مرفقات المتبقية لإزالة البنكرياس تماما. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 9 : فحص البنكرياس. البنكرياس مع الطحال المرفقة التي يجري بحثها بعد إزالة من الماوس. يشار الطحال بواسطة السهم الرأسي، ويشار في البنكرياس بواسطة السهم الأفقي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 10 : فحص البنكرياس. البنكرياس مع الطحال المرفقة عرض ورم البنكرياس يجري بحثها بعد إزالة من الماوس. يشار الطحال بواسطة السهم الرأسي، ويشار في البنكرياس بواسطة السهم الأفقي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 11 : تخزين أجهزة إزالة. التخزين المناسبة للأجهزة والعينات التي تم جمعها، المعدة للتخزين على المدى الطويل والتحليل في المستقبل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 12 : تحليل النسيجي أنسجة البنكرياس. توضع وويوزين الملون الصور من أنسجة البنكرياس. A) أنسجة البنكرياس عادي من Ptf1acre/--؛ LSL-كراسG12D/- التحكم الماوس. ب) بانين أنسجة من البنكرياس من Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ الماوس الدراسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 13 : التنميط التحليل الأيضي. الرنين المغناطيسي النووي الطيفي (الرنين المغناطيسي النووي) بروتون أحادي البعد أطياف مكونات المرحلة A) ماء وب) مسعور من مقتطفات أنسجة البنكرياس بعد تجانس الأنسجة وتعرض لاستخراج كلوروفورم/الميثانول. أطياف الرنين المغناطيسي النووي تم الحصول عليها في 850 ميغاهيرتز، وهي مناسبة للاستخدام في تحليل التنميط الأيضية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 14 : الممثل طيف الرنين المغناطيسي من المصل. يمكن استخدام الدم جمعت بإجراء سحب الدم الطرفي لتحليل التنميط الأيضية. ويبين هذا الطيف نموذجي بروتون أحادي الأبعاد 850 ميغاهرتز الرنين المغناطيسي النووي الطيف التي جمعت في مصل الدم التي تم الحصول عليها من عينة رسم دم طرفي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة
على الرغم من وجود أشرطة فيديو أخرى غير رسمية لتشريح الفأر، توفر هذه المقالة الفيديو الجودة الفنية الأولى، واستعراض النظراء، مظاهرة البصرية لجميع الخطوات التفصيلية المطلوبة للاستخراج وحصاد البنكرياس الماوس بتشريح10 . مع البنكرياس جهاز الرئيسي للنشاط الأيضي والإنسولين ويجري إنتاج وتشريح وحصاد البنكرياس يسمح للحفاظ على الخصائص الفسيولوجية11. بعزل البنكرياس، يمكن إجراء التحليل في المستقبل على العينة. يسمح هذا الإجراء للمقارنة ودراسة التفاعلات بين من الأنسجة الأخرى داخل نفس الكائن الحي داخل نفس الإطار الزمني.
القيود المفروضة على هذه التقنية
الحد أعظم من هذا الإجراء إنهاء الحياة الماوس، مما يحول دون جمع الطولي وأخذ عينات من عينات الأنسجة المتعددة من الماوس نفسه. من أجل تحليل الاتجاهات المتصلة بالعمر، والجنس، أو محددات الكمية الأخرى، يجب أن ينفذ عدد سكانها مستعرضة، كما فعلنا لدراستنا للمؤشرات الحيوية الأيضية لسرطان البنكرياس. قيد آخر من هذا البروتوكول هو عدم القدرة على إيقاف هذا الإجراء. بمجرد بدء يوثانيزيشن، يجب أن تنفذ الإجراء برمته.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
تنفيذ اختبار التحفيز معسر مخلب هند الماوس أمر حاسم لضمان أن يتلقى الماوس معاملة إنسانية. إذا كان الماوس لا تستجيب لهذا الحافز، ثم الإجراء قد تنفذ كما هو مخطط لها. ومع ذلك، يجب عرض الماوس استجابة الأسى نتيجة اختبار التحفيز، الماوس تعاد إلى دائرة التخدير لفترة إضافية من الوقت والاختبار وتتكرر حتى لا يلاحظ رد فعل لاختبار التحفيز12.
وبالمثل، ثقب قلب المحطة الطرفية متبوعاً بإزالة الاتصالات إلى القلب فورا بعد أن يتم جمع عينة الدم الطرفية كما يضمن أسلوب القتل الرحيم ثانوية تضحية إنسانية بالماوس. الكفيلة رسم دم فعالة، ينبغي أن تستخدم العلماء حركة ضخ مع المحاقن مشابهة للقلب النابض للماوس، السماح لجمع الحد الأقصى من الدم للتحليل.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
التبديل بين الأجهزة من الفورمالين إلى حلول الإيثانول 70% تعد أجهزة لعملية الدمج اللازمة للتحليل النسيجي. حلول تخزين مختلفة قد تكون مطلوبة يجب اختيار العلماء لإجراء تجارب أخرى مع الأجهزة. قبل التحليل، من المهم للحد من أي جمود المحتملة الأجهزة مخزنة في الثلاجة-80 درجة مئوية للحفاظ على سلامة الجهاز.
استخدام Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ طراز الماوس يقلل من الحدوث غير البنكرياس الأورام والأمراض الرئيسية13. وبالتالي، من المهم ملاحظة أي مخالفات جلية للبنكرياس أو الأجهزة الأخرى أثناء التشريح وجمع عينات الأنسجة لتحليلها.
التطبيقات المستقبلية
حصاد البنكرياس الماوس بتشريح يسمح لأنواع متعددة من التحليل على نفس العينة. الأكثر شعبية من هذه تشمل، ولكن لا تقتصر على، مجهرية الأسفار وتوضع والأنسجة ويوزين، إيمونوهيستوتشيميستري، الكتلي ومطيافيه الرنين المغناطيسي النووي6،7، 14 , 15-الأمراض مثل مرض السكري والتهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس يمكن دراستها باستخدام التقنيات المذكورة أعلاه16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
MAK تعترف بتقديم الدعم لهذا العمل من "المعاهد الوطنية للصحة"/منح المعهد الوطني للسرطان رقم-1R15CA152985-01A1. كما دعمت هذا المشروع "ميامي جامعة الدراسات الجامعية البحوث جائزة البرنامج"، الفرص الجامعية الدكتوراه جامعة ميامي لبرنامج المنح الدراسية وبرنامج الباحثين الصيف جامعة ميامي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Jar | Corning | 3140-150 | The glass jar used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| Lid of Glass Jar | Corning | 9985-150 | The glass jar lid used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339650 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 9201 | |
| Squeeze bottle | Fisher Scientific | 03-409-10DD | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Foam Boards | Therapak | 562908 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 200205SHN | |
| 1 mL 21G Syringes | BD Biosciences | 309624 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339652 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| Surgical Pads | Fisher Scientific | S67011 | |
| T-Pins Length: 2" | Advance Store Products | X32T-05 | |
| Sterilizing Wipes | Professional Disposables International Inc. | Q85084 | |
| Sharps Container | Fisher Scientific | 14-827-122 | |
| Analytical Balance | Marshall Scientific | ME-AE200 | |
| 4L Dewar | Taylor-Wharton | 4LD | |
| Shallow Wide Mouth Dewar | Fisher Scientific | F3087-V | |
| Floating Microtube Rack | VWR | 60986-100 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile | Fisher Scientific | 10-500-25 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Liquid Nitrogen | Wright Brothers | NIT-60-XX | |
| Mouse Kras Strain | The Jackson Laboratory | OO8179 | |
| Mouse Cre Strain | MMRRC | OOO435-UNC |
References
- Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).
- Jackson-Grusby, L. Modeling cancer in mice. Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).
- Heid, I., et al. Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer. Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).
- Shi, C., et al. KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin. Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).
- LaConti, J. J., et al. Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma. BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).
- Ludwig, M. R., et al. Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer. Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).
- Taylor, D. K., Mook, D. M. Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Auer, H., et al. The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein. Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).
- Ma, J., Leung, L. S. Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics. Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).
- Ijichi, H., et al. Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-β signaling in cooperation with active Kras expression. Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).
- Abiatari, I., et al. Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer. J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).
- Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).
- Yadav, D., et al. Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection. Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).
