Summary
Denne protokol demonstrerer en fluorescensbaseret metode til visualisering af vaskulaturen og kvantificering af dets kompleksitet i Xenopus tropicalis . Blodkar kan billedbehandles minutter efter injektion af et fluorescerende farvestof i et embryos slaghalve efter genetisk og / eller farmakologisk manipulation for at studere kardiovaskulær udvikling in vivo .
Abstract
Blodkar leverer ilt og næringsstoffer i hele kroppen, og dannelsen af det vaskulære netværk er under tæt udviklingskontrol. Den effektive in vivo visualisering af blodkar og den pålidelige kvantificering af deres kompleksitet er nøglen til forståelsen af biologi og sygdom i det vaskulære netværk. Her giver vi en detaljeret metode til visualisering af blodkar med et kommercielt tilgængeligt fluorescerende farvestof, humanplasmaacetyleret lavdensitetslipoprotein DiI-kompleks (DiI-AcLDL) og kvantificering af deres kompleksitet i Xenopus tropicalis . Blodkar kan mærkes ved en simpel injektion af DiI-AcLDL ind i et embryos slagende hjerte, og blodkar i hele embryoet kan afbildes i levende eller faste embryoner. Kombineret med genforstyrrelse ved målrettet mikroinjektion af nukleinsyrer og / eller badapplikationen af farmakologiske reagenser kan et gens eller en signalvejsstats rolle på vaskulær udvikling være invektetSteget inden for en uge uden at ty til sofistikerede genetisk manipulerede dyr. På grund af det veldefinerede venesystem af Xenopus og dets stereotype angiogenese kan spiring af allerede eksisterende skibe, fartøjskompleksitet kvantificeres effektivt efter perturbationsforsøg. Denne relativt enkle protokol skal fungere som et let tilgængeligt værktøj inden for forskellige områder inden for kardiovaskulær forskning.
Introduction
Vasculogenese, dannelsen af nye blodkar fra nyfødte endotelceller og angiogenese, dannelsen af nye fartøjer fra eksisterende skibe, er to forskellige processer, der former embryonisk vaskulatur 1 . Enhver dysregulering i disse processer resulterer i forskellige hjertesygdomme og strukturelle abnormiteter af fartøjer. Endvidere er tumorvækst forbundet med ukontrolleret karvestigning. Som sådan er molekylære mekanismer, der ligger til grund for vaskulogenese og angiogenese, genstand for intens undersøgelse 2 .
Xenopus og zebrafisk er attraktive hvirveldyrsmodeller til vaskulogenese og angiogeneseundersøgelser af flere årsager. For det første er deres embryoner små; Derfor er det relativt nemt at se hele vaskulaturen. For det andet er embryonal udvikling hurtig; Det tager kun et par dage for hele vaskulaturen at udvikle, i hvilket tidsrum den udviklende vaskul Ature kan afbildes. For det tredje er genetiske og farmakologiske interventioner før og under karretdannelse nemme at udføre, såsom gennem mikroinjektion af antisense morpholino nukleotider (MOs) i det udviklende embryo eller gennem badapplikationen af lægemidler 3 , 4 , 5 .
Den unikke fordel ved Xenopus over zebrafisk er, at embryologiske manipulationer kan udføres, fordi Xenopus følger stereotypiske holoblastiske spaltninger, og det embryonske skæbnekort er veldefineret 6 . For eksempel er det muligt at generere et embryo, hvor kun en lateral side er genetisk manipuleret ved at indsprøjte en antisense MO til en celle i tocellefasen. Det er også muligt at transplantere hjertet primordium fra ét embryo til et andet for at bestemme, om genet udøver sin funktion ved hjælp af en celle-iboende eller -ekstruktiv mekanismeAss = "xref"> 7. Selvom disse teknikker hovedsagelig er blevet udviklet i Xenopus laevis , som er allotetraploid og derfor ikke er ideel til genetiske undersøgelser, kan de anvendes direkte til Xenopus tropicalis , en nært beslægtet diploid art 8 .
En måde at visualisere vaskulaturet på i et levende Xenopus embryo er at injicere et fluorescerende farvestof til at mærke blodkarrene. Acetyleret lavdensitetslipoprotein (AcLDL) mærket med et fluorescerende molekyle, såsom DiI, er en meget nyttig probe. I modsætning til ikke-acetyleret LDL binder AcLDL ikke til LDL-receptoren 9, men endocytteres af makrofager og endotelceller. Injektionen af DiI-AcLDL i hjertet af et levende dyr resulterer i den specifikke fluorescerende mærkning af endotelceller, og hele vaskulaturen kan afbildes ved fluorescensmikroskopi i levende eller faste embryoner 4 .
Her præsiderer viEnt detaljerede protokoller til visualisering og kvantificering af blodkar ved anvendelse af DiI-AcLDL i Xenopus tropicalis ( Figur 1 ). Vi giver nøgle praktiske punkter, med eksempler på succesfulde og mislykkede forsøg. Derudover giver vi en retfærdig metode til kvantitativ analyse af vaskulær kompleksitet, hvilket kan være nyttigt ved vurdering af virkningerne af genetiske og miljømæssige faktorer ved udformningen af det vaskulære netværk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter overholdt protokoller godkendt af Yonsei University College of Medicine Institutionelle Dyrepleje og Brugskomitéer.
1. Fremstilling af xenopus tropicalis embryoer
BEMÆRK: Xenopus tropicalis-embryoner blev fremstillet som tidligere beskrevet 10 med let modifikation. Xenopus tropicalis-embryoner blev iscenesat ifølge tabellerne i Nieuwkoop og Faber 11 .
- Induktion af ægløsning
- For at pre-prime, injicere human chorionic gonadotropin (hCG) i dorsal lymfe sagen af et par frøer (en mand og en kvinde) dagen før parring dagen. Injicer 20 enheder pr. Kvindelige frø og 10 enheder pr. Mand. Hus en mand og en kvinde i samme tank natten over (i mere end 18 timer).
- For at prime på den følgende dag injicere 200 enheder hCG til den præprimerede hun og 100 enheder hCG til den præ-primedhan; Den primede kvindelige vil begynde at lægge æg på ca. 3 timer og vil fortsætte med at gøre det hele dagen. Hold han- og hunparret sammen til naturlig parring eller i separate tanke til in vitro befrugtning (trin 1.2).
- Befrugtning
BEMÆRK: Æg kan befrugtes ved naturlig parring eller in vitro befrugtning. Ved naturlig parring befrugtes æg, som de er lagt, og derfor kan timing af befrugtning ikke styres. Alternativt kan en primet kvindelige frø huses i en separat tank, og ufrugtede æg kan opsamles til in vitro befrugtning, hvilket genererer hundredvis af embryoner befrugtet på samme tid. Sidstnævnte tilgang er nyttig, når blastomerer-målrettet mikroinjektion vil blive udført forud for mærkning af karret. I denne tilgang bliver en mand aflivet.- Naturlig parring
- Forlad primet kvindelige og mandlige par i samme tank. Hanen vil låse fEmale, hvilket fører til øjeblikkelig befrugtning af de lagt æg. Saml æggene med en glas- eller plastpipette og overfør dem til en petriskål. For at forhindre, at æggene holder sig fast i pipetten, belægge pipetterens indre overflade med 0,5% bovint serumalbumin (BSA).
- In vitro befrugtning (IVF)
- Adskil den primede kvindelige fra hanen efter priming. Kvinden begynder at lægge æg spontant på ca. 3 timer. Overfør et par lagt æg ved hjælp af en BSA-belagt pipette til en petriskål og kontroller deres kvalitet under et mikroskop. Hvis sunde æg (klart pigment, elastisk kugleformet) blev lagt, forberede sig på at dissekere testiklerne fra den primede mand.
- Lav 0,4% Tricaine methansulfonat (MS222) til eutanasi og injicer 300 μL i dorsal lymfe sac af den primede han. Omkring 10 min vil manden miste sin sans for balancen og forblive omladet; Bekræft at hanen er euthaniseret ved at klemme et bagben med aPar blunt tang og observerer intet svar.
- Dissect de to testikler, rengør dem ved hurtigt at trykke dem på lintfri papir og overfør dem til en mikrotube indeholdende 1 ml 60% Leibovitz L-15 Medium (60%) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS); En detaljeret procedure er beskrevet andetsteds 10 .
- Forsigtigt hakket testiklerne med en pistle for at udtrække sædcellerne. Ved denne koncentration ( dvs. 2 testikler i 1 ml 10% FBS i 60% L-15) kan nogle få dråber af testisopløsningen (0,1 ml) befrugte ca. tre hundrede æg. Den resterende sæd kan opbevares ved 4 ° C i et tæt forseglet rør og anvendes til IVF den næste dag.
- Klem æggene fra kvinden ind i en lille petriskål. Hold den øverste del af kvinden op og ned på håndfladen og læg pegefingeren mellem bagbenene. Spred sine bagben med pegefingeren og den anden hånd for at udsætte cloacaen. Rør cloacaen til Petri-skålen. Frakke tHan Petri skål med 0,5% BSA til jævnt fordelt æg som et monolag under IVF.
- Tilsæt et par dråber (0,1 ml) sædholdigt L-15 medium til æggene. Til synkron befrugtning rør forsigtigt sædopløsningen over skålen. Efter 4 minutter ved stuetemperatur skal du fylde Petriskålen med 0,01x Modificeret Barths Saline (MBS), inkuberes i 10 minutter og erstatte opløsningen med 0,1x MBS. De befrugtede æg vil gennemgå den første spaltning i ca. 1 time ved stuetemperatur. 1x MBS er 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 2,5 mM NaHC03, 5 mM HEPES, 1 mM MgS04 og 0,7 mM CaCl2, pH 7,5.
- Naturlig parring
- (Valgfri) Injektion af antisense morpholino oligonukleotider (MOs) og / eller mRNA'er
- For at undersøge effekten af et gen af interesse ved fartøjsdannelse, udfør mikroinjektionen af antisense MO og / eller mRNA'er.
- Til sådanne forsøg aflejrer æggene med 2% L-cystein i 1x MBS (pH 7,5-7,8).Udskift 0,1x MBS i skålen, der indeholder de befrugtede embryoner med 2% L-cystein i 1x MBS. Skær forsigtigt op for at blande opløsningen.
BEMÆRK: Det tager normalt ca. 5 min., At embryoerne bliver afledt. I løbet af dette trin overvåges ægene ofte for at sikre, at de ikke er overeksponeret for løsningen. Hvis æggene er overeksponerede, vil de miste elasticitet og blive fladt, hvilket vil medføre afvigende udvikling og dødelighed. - Vask de-jellied æg fem gange med 0.1x MBS. Udfør mikroinjektionen i 4% Ficoll opløst i 0,1x MBS. Injicer typisk 4 ng MO og 600 pg mRNA pr. Blastomere i tocellefasen. Injicer i en celle for at manipulere genekspression på kun den ene side af embryoet. Brug den uinjicerede side af det samme embryo som en kontrol.
- Som en anden kontrol for specificiteten af genmanipulationen injiceres den samme mængde af en kontrol MO (CoMO) eller kontrol mRNA ( fx beta-galactosidase mRNA). CoMO skal have samme mOlecular vægt som den genspecifikke MO og må ikke målrette mod noget gen i Xenopus genomet. For nem visualisering af den injicerede side skal du bruge fluorescein-mærket MO eller co-injicere en sporstof ( f.eks. EGFP mRNA).
- Lad de indsprøjtede embryoner i 4% Ficoll i 2 timer og overfør dem derefter til en ny 60 mm petriskål fyldt med 0,1x MBS.
- hævning
- Hæv embryonerne ved 23 ° C. Selv om udviklingshastigheden kan sænkes eller accelereres ved anvendelse af temperaturer under henholdsvis 23 ° C (område: 16-26 ° C), anbefales det at hæve dem ved 23 ° C.
- (Valgfri) Behandling med farmakologiske reagenser
- Til farmakologisk manipulation administrerer lægemidler til de udviklende embryoner ved badapplikation.
2. Fremstilling af DiI-AcLDL Injection
- Lav en aftagende glaspipette med en standard mikrOpipette puller. Placér et borosilicatglasrør i mikropipettetrækkeren og brug følgende indstillinger: tryk, 200; Varme, 30; Pull, 30; Hastighed, 120; Tid, 200.
- Opbevar DiI-AcLDL stamopløsning ved 4 ° C. Tag den øvre klare del af injektionsvæsken, men ikke de udfældede partikler på bunden af røret. Eventuelle affald i glaspipetten vil forstyrre korrekt udkastning af opløsningen.
- Fyld den fremstillede glaspipette med en passende mængde DiI-AcLDL-opløsning (~ 5 μl) ved anvendelse af en mikrolaster.
- Klip glaspipets spids lidt efter lidt ved hjælp af et fint par tang (nummer 55). Indstil det trykstyrede injektionssystem, så ca. 5 nL opløsning udsprøjtes ad gangen; 50-60 nL DiI-AcLDL-opløsning er tilstrækkelig til at plette karrene i et embryo.
- Lad ikke den DiI-AcLDL-ladede pipette komme i luft i længere tid for at undgå tørring. Hold toppen af pipetten nedsænket i 0,04% MS222 i 0,1 x MBS-opløsning. Lige før du injicerer det i embryoet (trin 4.2.1), skal du kontrollere, om det samme antal farvestoffer udstødes.
3. Injektionsopsætning
- Sylgard skimmelsvamp
- For at forberede en lille Sylgard-skimmel blandes Sylgard base og hærdemiddel med et vægtforhold på 10 til 1. Fyld ca. halvdelen af en lille petriskål (35 mm eller 60 mm fad) med denne blandede opløsning og lad den derefter størkne i ca. 48 timer ved stuetemperatur.
- Anæstesi
- Brug 0,04% MS222 i 1x MBS (pH 7,5-8,0) til anæstesi. Når der kræves en lang anæstesi ( f.eks. Under levende billeddannelse), skal du bruge 0,04% MS222 i 0,1x MBS for at reducere den osmotiske ubalance. For at justere pH, tilsæt et par dråber NaOH (~ 20 μL) og kontroller pH ved hjælp af pH-papir.
- Vent indtil de overførte embryoner holder op med at flytte. Berør embryonernes dorsefinner og undersøge, om de svarer for at bekræfte komplette anesthesia.
- Placering af embryoner til injektion
- Indsæt overfladen af den hærde Sylgard-form med et tyndt og skarpt blad. Lav en V-formet konkav indrykning, hvor embryterne skal placeres (se figur 2D ). Placer et bedøvet embryo, ventral-side op, på en lidt skrå måde (ca. 30 °) ( Figur 2D ).
- Fyld støbeformen med MS222-opløsningen og læg embryoerne i formen.
4. DiI-AcLDL Injection
- Indsnit af hud over hjertet
- Klargør to pins (Minutiens, 0,10 mm) for at skære huden over hjertet. Stram hver stift fast til en stiftholder; Hjertet bør let identificeres som det pulserer ( figur 2A-2C , lyserød).
- Punkter huden af et embryo med en pin. Sæt stiften gennem hullet i rummet mellem hjertet og huden ( figur 2C
- Lav et lineært snit ved forsigtigt at gnide den anden stifter, der holdes uden for huden mod den indsatte stift. Forsæt forsigtigt dette snit med to ben, hvor hjertet udsættes ( figur 2B ' og 2D' , pil). Den pipette, der er fyldt med DiI-AcLDL, kan nu nærme sig hjertet ( Figur 2D ' ).
- Indsprøjtning
- Indsæt spidsen af den indlæste glaspipette i hjertet og injicer 50-60 nL DiI-AcLDL opløsning i ca. 10 udstødningsimpulser. Sprøjt ikke en for stor mængde opløsning, da det får hjertet til at briste. Kontroller, om hjertet fortsætter med at slå efter injektionen. Efter hver injektion skal du kontrollere, om det samme antal DiI-AcLDL udkastes. Ellers kan spidsen af pipetten være blokeret (se trin 2.5).
- Overfør de indsprøjtede embryoner til en ny petriskål fyldt med 0,1x MBS til genopretning. Efter 5-10 minutter skal tadpoles genvinde bevidstheden og begynde at bevæge sig. På dette tidspunkt kan de mærkede fartøjer afbildes. Det anbefales at visuelt skærm med succes mærket embryoner under et fluorescensmikroskop ( figur 3A og 3B ). Hvis en utilstrækkelig mængde DiI-AcLDL injiceres i et embryo, kan det injiceres igen ( figur 3C ).
- Kassér tadpoles, der har andre organer mærket ( Figur 3D ). Fortsæt indtil det ønskede antal vellykkede mærket embryoner er opnået.
- For mere grundig billeddannelse af blodkar, brug konfokal mikroskopi; Det kan være lettere at fastsætte de mærkede embryoner til konfokal mikroskopi. Først bedøves de mærkede embryoner i 0,04% MS222 i 1x MBS (pH 7,5-8,0) og derefter fikse dem i 4% paraformaldehyd i 1X phosphatpufret saltvand (PBS) i 1 time ved stuetemperatur. Faste embryoner kan opbevares i flere dage ved 4 ° C; Beskyt de indsprøjtede prøver fra lys for at undgå fotobildning af DiI.
5. Billeddannelse af DiI-AcLDL
- Stereoskopisk billeddannelse
- Tag fotografier under et fluorescens stereoskopisk mikroskop ( Figur 3 ) for at vurdere vasculaturens generelle morfologi.
- Smelte 1% agarose i 1x PBS til faste embryoner eller i 1x MBS til levende billeddannelse. Hæld smeltet agarose i en petriskål og vent til det størkner. Lav et lavt indryk på overfladen af agarosegel, der passer til embryoet, der skal billedvis, når det ligger på sin side. Fyld fadet med buffer (MS222-opløsning til bedøvede embryoner eller 1x PBS til faste embryoner).
- Fluorescensmikroskopi (Rhodamin filter set)
- Da DiI er et grøn-exciteret og rødemitterende farvestof, billed ved anvendelse af et standardfilter sæt til rhodamin eller spektralrelaterede fluoroforer (maksimal excitation ved 554 nm og emission ved 571 nm). Placer de indsprøjtede embryoner i indrykkningerne på agaroseskimmelsen og tag fotografier ( figur 3 ).
- Konfokal mikroskopi
BEMÆRK: For en nærmere analyse af vaskulær arkitektur, brug konfokal mikroskopi.- Hvis du bruger et inverteret mikroskop, skal du placere embryonerne på en glasbundet skål. Tilføj et par dråber 1x PBS og immobiliser dem ved at placere et dækslip på toppen. Fjern overskydende PBS. Hvis levende embryoner skal afbildes, brug bedøvede embryoner og brug 0,015% MS222 i 0,1x MBS i stedet for PBS.
- For lav forstørrelse billeddannelse, brug en 4X til 10X objektiv for at finde interessepunktet; Den rostrale del af den bageste kardinal ven (PCV) er en nyttig region til undersøgelse af udviklingsangiogenese (figur 4, stipledekasser).
- Brug en opkøbsindstilling for en rød emission fluorofor (som f.eks. Rhodamine).
- Lav z-stablede billeder ved at billedere den laterale halvdel af et embryo. Først skal du fokusere på PCV'en på den laterale side nær målet og derefter indstille den nedre grænse for fokuset på den position, hvor skibene nærmest målet er i fokus. Indstil den øvre grænse i den position, hvor den mediale del af PCV'en, der afbildes, kan fokuseres. Billede hele denne halvdel af embryoet. Brug software, der gemmer metadata på opkøbsindstillingerne, f.eks. X, y og z-skalaer, da de skal beregne fartøjets længder.
- Hvis det er nødvendigt, skal du bruge fliseskanningstilstanden til at se hele embryonets vasculatur. Bestem empirisk antallet af vandrette og lodrette fliser.
- For høj forstørrelse billeddannelse, følg procedurerne ovenfor for at se den rostrale del af PCV og 4 rostral-mest intersomitiske vener (ISV'er) ( Figur 4 ,Punkteret boks). Juster antallet af stakke (z-stack) og fliser (flise scan) på passende måde.
6. Kvantificering af DiI-mærkede fartøjer
BEMÆRK: DiI-mærkede fartøjer kan spores manuelt eller ved hjælp af software. Vi bruger "Simple neurite tracer", et gratis ImageJ (NIH) plugin, som muliggør halvautomatisk sporing af rørlignende strukturer som blodkar og neuritter 12 . Ved hjælp af denne gratis software kan følgende parametre beregnes. En detaljeret procedure til brug af denne software er beskrevet andetsteds (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Nedenfor bruger vi eksempler på vaskulaturen af embryoner, hvor Tie2-signalering er hæmmet eller forbedret ( Figur 4A-4C ) 5 . Antisense Tie2MO-injicerede embryoner udviser reducerer angiogenese og forkorter ISV'er ( figur 4B ), hvorimod co-injektionen af konstitutivt aktiv Tie2Mutant mRNA (caTie2 mRNA) redigerer denne fænotype, hvilket resulterer i sprudlende ISV-grene ( figur 4C ).
- ISV længder
- Ved hjælp af Simple neurite sporer beregnes længden af hvert sporet fartøj. Beregn længden af de 4 rostral-mest ISV'er.
- ISV filialer
BEMÆRK: I vildtypeembryoner spire kun nogle få korte grene fra de mest rostral-mest udbredte ISV'er i fase 42.- I Simple Simple Tracer sporer disse små fartøjer efter at have lavet den ISV, hvorfra de stammer fra den primære gren. Beregn følgende parametre for disse grene, der stammer fra ISV'erne.
- Samlet gren nummer
- Når alle ISV'erne og de tilhørende grene er sporet, beregnes det samlede antal grene ( Figur 5B-5D ).
- Branchordre
- Som Simple neurite sporer registrerer rækkefølgen af hver gren ( Figur 5A ), calculatE antallet af grene for hver ordre. De fleste skibe i vildtypeembryoner bør være primære grene ( dvs. ISV'er).
- Vein kompleksitetsindeks (VCI)
- Da VCI er en nyttig parameter til fartøjskompleksitet, som giver større vægt til højere ordensgrene, beregnes VCI for hvert embryo ved hjælp af formlen i figur 5A . For eksempel har Tie2MO-injicerede embryoner en lavere VCI sammenlignet med kontrol ( Figur 5B og 5C ), og cTie2 mRNA-indsprøjtede embryoner har en højere VCI ( Figur 5D ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidslinje for eksperimenter (figur 1 og 2)
Kort efter befrugtning kan målrettet mikroinjektion udføres for at modulere genekspression. For eksempel kan en antisense MO, der specifikt binder til initieringskodonet af det endogene Tie2-mRNA, injiceres, hæmme oversættelsen af Tie2-målmRNA ved sterisk hindring. En MO kan konjugeres til fluorescein til den nemme visuelle screening af vellykkede injicerede embryoner. Alternativt kan et spor-mRNA ( fx mRNA kodende for EGFP) co-injiceres med MO. Derudover kan lægemidler behandles ved badapplikation efter udklækning (tidlige haleudbudsstadium, omkring NF-fase 26). Opløs lægemidlet i 0,1x MBS og læg det til embryoerne. Til tidligere behandling kan embryoner frigøres fra membranerne med et par tang. DiI-AcLDL kan injiceres i hjertet omkring fase 33/34 for at undersøge dynamikken i fartøjsformAtion, men typisk injicerer vi ved trin 37/38 eller senere ( figur 2 , farvede områder).
Typiske eksempler på vellykkede og mislykkede injektioner (trin 4.3) (figur 3)
Stereoskopisk billedbehandling er egnet til visuel screening. Hvis en tilstrækkelig mængde DiI-AcLDL injiceres i hjertet, skal PCV umiddelbart ses under et fluorescens-stereoskop ( figur 3A og 3B ). Utilstrækkeligt eller ukorrekt injicerede embryoner er lette at identificere ( Figur 3C og 3D ). Embryoer med utilstrækkelig mængde DiI-AcLDL ( Figur 3C ) kan injiceres igen med samme farvestof, indtil karrene er tydeligt synlige. Billede med succes injiceret embryoner under et konfokalt mikroskop, levende eller efter fiksering.
Udvikling af posteriEller kardinal ven (PCV) og de intersomitiske vener (ISV'er)
PCV'en strækker sig i rostal-til-caudal retning, og denne forlængelse slutter omkring fase 37/38. ISV'er opstår dorsalt fra PCV'en i en anterior-to-posterior bølge. Denne bølge af ISV-dannelse begynder på stadium 36 og slutter omkring fase 40/41; ISV'er fortsætter med at vokse og bliver let forgrenede indtil fase 43 ( figur 3A og 3B ).
Tie2-signalstyring styrer udviklingsmæssig ISV-forgrening (figur 4)
PCV og ISV'erne vokser i et stereotypisk mønster, og deres udvikling er under tæt kontrol ( figur 4A ). Dannelsen af ISV'erne fra PCV'en kan beskrives som angiogenese, og derfor er det en nyttig model til at undersøge molekylære mekanismer, der ligger til grund for angiogenese. Vi introducerer resultatet af vores seneste studie showiNg, at udviklingssignaler hæmmer Tie2-signalering i ISV'er for at begrænse deres forgrening 5 . Nedbrydningen af Tie2-signalering ved antisense MO reducerer ISVs længde og kompleksitet (figur 4B), og ekspression af den konstitutive aktive form af Tie2 (caTie2) forårsager for stor ISV-forgrening ( figur 4C ).
Kvantificering af ISV-kompleksitet (figur 5)
Udover ISV'ernes længder og gren numre kan "venekompleksitetsindekset" (VCI) beregnes for at vurdere deres kompleksitet ( Figur 5A ). Vi vedtog "kompleksitetsindeks" udviklet af Cohen-Cory og kolleger, der var designet til at kvantificere kompleksiteten af neuronale axonale eller dendritiske arbors 13 . I dette indeks modtager et embryo med flere højtordnede grene en højere score end et embryo med samme antal totale klidChes men med flere lavordre grene. Derfor betyder et højere VCI, at dette embryo har et mere komplekst venetisk netværk. "Simple neurite tracer" er nyttig software til at holde styr på rækkefølgen og længden af de enkelte filialer. Det er også muligt at generere "renderede stier", som er en nyttig måde at visualisere den samlede arkitektur af vaskulaturen på ( fig. 5B-5D , højre paneler).
Figur 1: Tidslinje for forsøgene. På befrugtningsdagen kan morfolinos (MOs), DNA, RNA eller protein injiceres i befrugtede æg på NF stadium 1 (st1) eller 2 (st2). Hvis det kun injiceres i den ene blastomere ved st2, vil det injicerede reagens kun påvirke en side på siden. Den uinjicerede side kan bruges som kontrol. Co-indsprøjt en sporer ( f.eks. EGFP mRNA) for at identificere den injicerede side. På den anden dag, eaRly-tail-stage (~ st24) embryoner kan behandles med farmakologiske reagenser ved badapplikation. Hjertet er tydeligt synligt på den tredje dag. DiI-AcLDL kan injiceres i hjertet og blodkar kan afbildes kort efter injektionen. Brug st33-37 embryoner til at billedet dynamikken af fartøjsvækst eller st42 embryoner til billede fuldt udviklede fartøjer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Placering af DiI-AcLDL injektionen ved st42. Lateral ( AB ' ) og ventrale ( CD ) synspunkter af fase 42 embryoen. Hjertet er farvet i pink i AC , i billeder taget fra Xenbase (www.xenbase.org). Repræsentative stereoskopiske billeder er vist i A ' ,
Figur 3: Forventede resultater (stereoskopiske billeder). Repræsentative fluorescensbilleder fra fase 37/38 ( A ) og fase 42 ( B ) embryoner. Embryos venstre side er vist. Den bageste kardinale ven (PCV) strækker sig kaudalt, hvorfra intersomitiske vener (ISV'er) forgrenes dorsalt i en rostral-til-caudal wave. Kun rostral ISV'er er synlige i fase 37/38 ( A ), og de fleste ISV'er er dannet af fase 42 ( B ). Hvis en insufficient mængde DiI-AcLDL injiceres, vil PCV'en ikke være tydelig synlig, selv efter 30 minutter ( C ). I dette tilfælde kan mere DiI-AcLDL injiceres. Hvis DiI-AcLDL ved et uheld injiceres i andre organer ( D ), kassere embryoerne. Målestang = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekter af Tie2-signalering på ISV-udvikling. Tie2-genekspression blev slået ned ved blastomereinjektionen af translation-blokerende antisense-morpholino-oligonukleotider (Tie2MO). Kontrolmorpholino (CoMO) har samme molekylvægt, men gør nOt mål ethvert gen i xenopus tropicalis . MRNA-kodende konstitutivt aktiv Tie2-mutant (caTie2) blev injiceret for at redde Tie2-knockdown-fænotypen. I modsætning til kontrollen ( A ) førte theTie2MO-injektionen til et dramatisk fald i længden og antallet af ISV'er ( B ). Denne fænotype blev overoprøret af caTie2, som viste ISV'er med sprudlende sikkerhedsafdelinger ( C ). Kompleksiteten af ISV'er i regioner angivet med blå stiplede kasser er kvantificeret i Figur 5. Skalestang = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantificering af venekompleksitet. ( A ) Kompleksiteten af ISV kan repræsenteres af veinkompleksitetsindekset (VCI).( BD ) VCI'er blev beregnet ud fra de embryoner, der er vist i figur 4. Skalestang = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, blev først udviklet af Ali H. Brivanlou og kolleger til at undersøge udviklingshændelser under vaskulær dannelse i Xenopus laevis 4 , men som det fremgår af dette manuskript, kan det anvendes til andre små dyr. Farveinjektion i hjertet er let at udføre, og hele det vaskulære netværk kan afbildes under et fluorescensdissektionsmikroskop, såvel som et konfokalt mikroskop. Hvis farvestoffet injiceres i hjertet under skibets udvikling, kan dynamikken i fartøjets vækst og forgrening afbildes i realtid 4 . Ved anvendelse af det veldefinerede venøse netværk, især PCV- og rostral-mest ISV'er, kan virkningerne af genetisk eller miljømæssig perturbation på angiogenese vurderes kvantitativt.
Det mest kritiske trin i denne protokol er injektionen af DiI-AcLDL (trin 4). Vi giver eksempler på succesfulde og mislykkede injektioner ( FiGure 3). Succesfulde injicerede embryoner skal screenes under et fluorescensmikroskop som beskrevet i trin 4.3. Hvis PCV'en ikke er synlig 30 min efter injektion, blev ikke nok DiI-AcLDL injiceret ( figur 3C ). Uforsøgt injicerede embryoner kan bedøves og injiceres igen. I nogle tilfælde kan DiI-AcLDL injiceres på en forkert placering, i hvilket tilfælde andre organer vil blive mærket ( Figur 3D ). Kassér forkert injicerede embryoner.
Blodkarrene i et vellykket injiceret embryo vil være synlige kort efter injektionen, og fluorescens varer i flere timer. Hvis injektionen udføres før dannelsen af ISV'er, kan deres udvikling derfor afbildes i et levende embryo, hvilket giver et stærkt værktøj til at undersøge udviklingen af det kardiovaskulære system i realtid og in vivo 4 . Da Xenopus med succes er blevet brugt som en model til at screene vaskulær dForstyrrende midler i pattedyr 14 , kan den eksperimentelle fremgangsmåde, der er beskrevet her, kombineres med farmakologiske forstyrrelsesforsøg og anvendes som en screeningsplatform for at finde lægemidler, der forstærker eller hæmmer angiogenese.
Blodkar kan visualiseres ved hjælp af genetiske værktøjer, såvel som ved de farvestofbaserede mærkningsmetoder, der beskrives her. For eksempel muliggør transgen Xenopus 15 eller zebrafisk 16, der udtrykker fluorescensproteiner under kontrol af celletypespecifikke promotorer, levende billeddannelse af blod og lymfekar, og det er endda muligt at diskriminere arterier fra vener 16 . Selvom genetiske metoder er overlegne og giver mere konsistent mærkningseffektivitet, er farvestofbaserede metoder let tilgængelige for de fleste laboratorier uden adgang til sådanne genetisk manipulerede dyr. I Xenopus resulterer den transcardielle perfusion af DiI-AcLDL iMærkning af de fleste endotelceller 4 , og arterier og vener kan ikke skelnes i fluorescensbilleder. Indtrigende mærker tomatlesin-fluorescein selektivt arterier i mus, og når de injiceres med DiI-AcLDL, kan arterier og vener diskrimineres 17 . Selv om applikationen ikke blev testet i andre væv eller dyr, giver dette en lovende retning for at undersøge den dynamiske udvikling af arterier og vener i Xenopus .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev inspireret af Levine et al. , Som beskrev denne eksperimentelle metode og gav en omfattende beskrivelse af vaskulær udvikling i Xenopus laevis. Vi takker medlemmerne af vores laboratorium for deres input. Denne undersøgelse blev støttet af Yonsei Universitets Fremtidsforskningsinitiativ fra 2015 (2015-22- 0095) og Biofysisk Udviklingsprogram for National Research Foundation (NRF) finansieret af ministeriet for videnskab, IKT og fremtidig planlægning ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
