Summary
Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.
Abstract
Bloedvaten leveren zuurstof en voedingsstoffen door het hele lichaam, en de vorming van het vaatnetwerk is onder strakke ontwikkelingsregeling. De efficiënte in vivo visualisatie van bloedvaten en de betrouwbare kwantificering van hun complexiteit zijn essentieel voor het begrijpen van de biologie en ziekte van het vaatnetwerk. Hier geven we een gedetailleerde methode om bloedvaten te visualiseren met een in de handel verkrijgbare fluorescerende kleurstof, menselijk plasma geacetyleerd laagdichtheid lipoproteïne DiI complex (DiI-AcLDL) en om hun complexiteit te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen worden gemerkt door een eenvoudige injectie van DiI-AcLDL in het kloppende hart van een embryo, en bloedvaten in het hele embryo kunnen worden afgebeeld in levende of vaste embryo's. Gecombineerd met genstoornis door de gerichte microinjectie van nucleïnezuren en / of de badtoepassing van farmacologische reagentia, kunnen de rollen van een gen of van een signaalweg op vasculaire ontwikkeling in vivo zijnBinnen een week gestegen zonder aan te vullen tot geavanceerde genetisch gemanipuleerde dieren. Vanwege het goed gedefinieerde veneuze systeem van Xenopus en zijn stereotiepe angiogenese kan het spruiten van bestaande vaten, vatencomplexiteit efficiënt worden gekwantificeerd na verstoringsexperimenten. Dit relatief eenvoudige protocol dient als een gemakkelijk toegankelijk instrument op diverse gebieden van cardiovasculair onderzoek.
Introduction
Vasculogenese, de vorming van nieuwe bloedvaten uit pasgeboren endotheelcellen, en angiogenese, de vorming van nieuwe vaten uit bestaande vaten, zijn twee verschillende processen die de embryonale vasculatuur vormen 1 . Elke dysregulatie bij deze processen resulteert in verschillende hartziekten en structurele abnormaliteiten van vaten. Bovendien is tumorgroei geassocieerd met onbeheerde vatengroei. Als zodanig zijn moleculaire mechanismen die onderliggend zijn aan vasculogenese en angiogenese het onderwerp van intensief onderzoek 2 .
Xenopus en zebravis zijn aantrekkelijke gewervelde modellen voor vasculogenese en angiogenese studies, om verschillende redenen. Ten eerste zijn hun embryo's klein; Daarom is het relatief eenvoudig om de hele vasculatuur te bekijken. Ten tweede is embryonale ontwikkeling snel; Het duurt slechts een paar dagen voor de gehele vasculatuur om te ontwikkelen, gedurende welke periode het ontwikkelende vaatje ontwikkelt Ature kan worden afgebeeld. Ten derde zijn genetische en farmacologische interventies voor en tijdens het vatenvorming makkelijk te verrichten, zoals door middel van microinjectie van antisense morfolino nucleotiden (MO's) in het ontwikkelende embryo of door de badtoepassing van drugs 3 , 4 , 5 .
Het unieke voordeel van Xenopus over zebravis is dat embryologische manipulaties kunnen worden uitgevoerd omdat Xenopus stereotiepe holoblastische splitsingen volgt en de embryonale lotkaart is goed gedefinieerd 6 . Bijvoorbeeld, het is mogelijk om een embryo te genereren waarin slechts één zijdelingse zijde genetisch gemanipuleerd wordt door een antisense MO te injecteren naar een cel in het twee-cel stadium. Het is ook mogelijk om het hartprimordium van een embryo naar een ander te transplanteren om te bepalen of het gen zijn functie uitoefent door een cel-intrinsiek of -xtrinsiek mechanismeAss = "xref"> 7. Hoewel deze technieken meestal zijn ontwikkeld in Xenopus laevis , die allotetraploïde is en daarom niet ideaal is voor genetische studies, kunnen ze direct toegepast worden op Xenopus tropicalis , een nauw verwante diploïde soort 8 .
Een manier om de vasculatuur in een levend Xenopus embryo te visualiseren, is om een fluorescerende kleurstof te injecteren om de bloedvaten te labelen. Geacetyleerde laagdichtheidslipoproteïne (AcLDL) gemerkt met een fluorescerend molecuul zoals DiI is een zeer bruikbare sonde. In tegenstelling tot niet-geacetylleerde LDL bindt AcLDL niet aan de LDL-receptor 9 maar wordt endocytose door macrofagen en endothelcellen. De injectie van DiI-AcLDL in het hart van een levend dier resulteert in de specifieke fluorescerende etikettering van endotheelcellen, en de gehele vasculatuur kan worden afgebeeld door fluorescentiemicroscopie in levende of vaste embryo's 4 .
Hier preseren weGedetailleerde protocollen voor het visualiseren en kwantificeren van bloedvaten met behulp van DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Figuur 1 ). Wij leveren belangrijke praktische punten, met voorbeelden van succesvolle en mislukte experimenten. Daarnaast bieden we een eenvoudige methode voor de kwantitatieve analyse van vasculaire complexiteit, die nuttig kan zijn bij de beoordeling van de effecten van genetische en omgevingsfactoren op het vormen van het vaatnetwerk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten voldoen aan protocollen die zijn goedgekeurd door de Yonsei University College of Medicine Institutionele Diervoeder- en Gebruikscommissies.
1. Bereiding van xenopus tropicalis embryo's
OPMERKING : Xenopus tropicalis embryo's werden geproduceerd zoals eerder beschreven 10 , met lichte wijziging. Xenopus tropicalis embryo's werden georganiseerd volgens de tabellen van Nieuwkoop en Faber 11 .
- Inductie van ovulatie
- Voor pre-prime injecteer menselijke chorionische gonadotropine (hCG) in de dorsale lymfezak van een paar kikkers (een man en een vrouw) op de dag voor de dag van paring. Spuit 20 eenheden per vrouwelijke kikker en 10 eenheden per mannetje. Huis een man en een vrouw in dezelfde tank overnacht (voor meer dan 18 uur).
- Om de volgende dag te injecteren, injecteer 200 eenheden hCG aan de voorgevulde vrouwelijke en 100 eenheden hCG aan de pre-primedmannetje; Het gepresteerde vrouw zal ongeveer 3 uur eieren leggen en de hele dag doorgaan. Houd het mannelijke en vrouwelijke paar samen voor natuurlijke paring of in aparte tanks voor in vitro bevruchting (stap 1.2).
- Bevruchting
OPMERKING: Eieren kunnen bevrucht worden door natuurlijke paring of in vitro bevruchting. Bij natuurlijke paring worden eieren bevrucht zoals ze gelegd zijn, en daarom kan de timing van bevruchting niet worden gecontroleerd. Als alternatief kan een geperste vrouwelijke kikker in een aparte tank worden gehuisvest, en onbevruchte eieren kunnen worden verzameld voor in vitro bevruchting, waardoor tegelijkertijd honderden embryo's worden bevrucht. Deze laatste benadering is handig wanneer blastomere-gerichte microinjectie wordt uitgevoerd voorafgaand aan het etiketteren van vaten. In deze aanpak wordt echter een man geofferd.- Natuurlijke paring
- Laat primed vrouwelijk en mannelijk paar in dezelfde tank. De man zal de f knijpenEmale, wat leidt tot onmiddellijke bevruchting van de gelegde eieren. Verzamel de eieren met een glas- of plasticpipet en breng ze naar een Petri-schotel. Om te voorkomen dat de eieren aan het pipet vallen, bedek het binnenoppervlak van de pipet met 0,5% runder serumalbumine (BSA).
- In vitro bevruchting (IVF)
- Na het priming scheiden de geperste vrouw uit het mannetje. Het vrouwtje begint eieren ongeveer 3 uur spontaan te leggen. Breng een paar gelegde eieren over met een BSA-gecoate pipette naar een Petri-schotel en controleer hun kwaliteit onder een microscoop. Als gezonde eieren (duidelijk pigment, elastisch kogelvormig) werden gelegd, bereiden zich voor om de testes uit het primed man te ontleden.
- Maak 0,4% Tricaine methaansulfonaat (MS222) voor euthanasie en injecteer 300 μL in de dorsale lymfezak van de primed man. In ongeveer 10 minuten zal de man zijn gevoel van evenwicht verliezen en zal hij blijven staan; Bevestig dat het mannetje geëuthaniseerd wordt door een achterbeen te knijpen met eenEen paar stompe tang en waarnemen geen reactie.
- Dissect de twee testes uit, maak ze schoon door ze snel op lintvrij papier te tikken en ze over te brengen in een microtube die 1 ml 60% Leibovitz L-15 Medium (60%) bevat, aangevuld met 10% foetaal runder serum (FBS); Een gedetailleerde procedure is elders beschreven 10 .
- Zachtjes de proefjes voorzichtig met een stamper verwijderen om het sperma te extraheren. Bij deze concentratie (2 testes in 1 ml 10% FBS in 60% L-15) kunnen enkele druppels testisoplossing (0,1 ml) ongeveer driehonderd eieren bevruchten. Het overgebleven sperma kan bij 4 ° C in een strak afgesloten buis worden opgeslagen en de volgende dag voor IVF worden gebruikt.
- Knijp de eieren van het vrouwtje in een kleine Petri-schotel. Houd het bovenste gedeelte van het vrouwelijk ondersteboven op de handpalm en leg de wijsvinger tussen zijn achterpoten. Verspreid de achterpoten met het voorvinger en de andere kant om de cloaca bloot te stellen. Raak de cloaca aan op de Petri-schotel. Coat tHij Petri schotel met 0,5% BSA om de eieren gelijkmatig te verdelen tijdens een IVF.
- Voeg een paar druppels (0,1 ml) spermahoudend L-15-medium toe aan de eieren. Voor de synchrone bevruchting, roer de sperma-oplossing voorzichtig over de schotel. Na 4 minuten bij kamertemperatuur, vul de Petri schotel met 0,01x Modified Barth's Saline (MBS), incubeer 10 minuten en vervang de oplossing met 0.1x MBS. De bevruchte eieren ondergaan de eerste splitsing in ongeveer 1 uur bij kamertemperatuur. 1x MBS is 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHC03, 5 mM HEPES, 1 mM MgS04 en 0,7 mM CaCl2, pH 7,5.
- Natuurlijke paring
- (Optioneel) Injectie van antisense morfolino oligonucleotiden (MOs) en / of mRNAs
- Om het effect van een gen van belang op het vormen van vaten te onderzoeken, voer de microinjectie van antisense MO en / of mRNAs uit.
- Voor dergelijke experimenten, deeg de eieren met 2% L-cysteïne in 1x MBS (pH 7,5-7,8).Vervang 0.1x MBS in het gerecht dat bevruchte embryo's bevat met 2% L-cysteïne in 1x MBS. Zet de schotel voorzichtig om de oplossing te mengen.
OPMERKING: Het duurt meestal ongeveer 5 minuten om de embryo's te vervallen. Tijdens deze stap, controleer de eieren regelmatig om ervoor te zorgen dat ze niet overbelicht zijn aan de oplossing. Als de eieren overbelicht zijn, zullen ze elasticiteit verliezen en plat worden, wat afwijkende ontwikkeling en dodelijkheid zal veroorzaken. - Was de afgekoelde eieren vijf keer met 0.1x MBS. Voer de microinjectie uit in 4% Ficoll opgelost in 0.1x MBS. Typ in het algemeen 4 ng MO en 600 pg mRNA per blastomere in het twee-cel stadium. Spuit in één cel om genuitdrukking op slechts één kant van het embryo te manipuleren. Gebruik de ongeïnjecteerde kant van hetzelfde embryo als een controle.
- Als een andere controle voor de specificiteit van genmanipulatie, injecteer dezelfde hoeveelheid van een controle MO (CoMO) of controle mRNA ( bv. Bèta-galactosidase mRNA). CoMO moet hetzelfde m hebbenOleculair gewicht als de genspecifieke MO en mag geen gen op het Xenopus- genoom richten. Voor een makkelijke visualisatie van de geïnjecteerde kant, gebruik fluoresceine-gemarkeerde MO of co-injecteer een tracer ( bijv. EGFP mRNA).
- Laat de geïnjecteerde embryo's gedurende 4 uur in 4% Ficoll achterlaten en overbrengen naar een nieuwe 60 mm Petri-schaal, gevuld met 0.1x MBS.
- verheffing
- Verhoog de embryo's bij 23 ° C. Hoewel de ontwikkelingssnelheid kan worden vertraagd of versneld door gebruik te maken van temperaturen onder of hoger dan 23 ° C (bereik: 16-26 ° C), wordt het aanbevolen om ze te verhogen bij 23 ° C.
- (Optioneel) Behandeling met farmacologische reagentia
- Voor farmacologische manipulaties, geef medicijnen aan de ontwikkelende embryo's door middel van een badtoepassing.
2. Bereiding van DiI-AcLDL Injectie
- Maak een tapijtglas met een standaard micrOpipette puller. Plaats een borosilicaatglasbuis in de micropipettractor en gebruik de volgende instellingen: druk, 200; Hitte, 30; Trek, 30; Snelheid, 120; Tijd, 200.
- Bewaar DiI-AcLDL voorraadoplossing bij 4 ° C. Neem het bovenste heldere gedeelte van de oplossing voor injectie, maar niet de geprecipiteerde deeltjes op de bodem van de buis. Iedere puin in de glazen pipet zal de juiste uitwerping van de oplossing verstoren.
- Vul de bereide glazen pipet met een geschikte hoeveelheid DiI-AcLDL oplossing (~ 5 μL) met een microlader.
- Knip het uiteinde van de glazen pipet beetje bij beetje uit met een fijne paar tang (nummer 55). Stel het drukgestuurde injectiesysteem in, zodat ongeveer 5 nL oplossing tegelijk wordt uitgeworpen; 50-60 nL DiI-AcLDL oplossing is genoeg om de vaten van één embryo te vleken.
- Laat de DiI-AcLDL-geladen pipette niet langer in de lucht liggen om te voorkomen dat u droogt. Houd de punt van de pipet ondergedompeld in 0,04% MS222 in 0,1 x MBS oplossing. Voordat u het injecteert in het embryo (stap 4.2.1), controleer of u dezelfde hoeveelheid kleurstof uitstoot.
3. Injectie Setup
- Sylgard schimmel
- Voor het bereiden van een kleine Sylgard-schimmel, meng Sylgard base en verhardingsmiddel met een gewichtsverhouding van 10 tot 1. Vul ongeveer ongeveer de helft van een kleine Petri-schotel (35 mm of 60 mm schotel) met deze gemengde oplossing en laat het vervolgens om ongeveer 48 uur bij kamertemperatuur.
- Anesthesie
- Gebruik 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) voor anesthesie. Wanneer lang verdoving nodig is (bijvoorbeeld tijdens live imaging), gebruik 0,04% MS222 in 0.1x MBS om de osmotische onbalans te verminderen. Om de pH aan te passen, voeg een paar druppels NaOH (~ 20 μL) toe en controleer de pH met behulp van pH-papier.
- Wacht tot de overgebrachte embryo's stoppen met verhuizen. Raak de dorsale vinnen van de embryo's aan en controleer of ze reageren op complete anesthesia.
- Positie embryo's voor injectie
- Zet het oppervlak van de geharde Sylgard-vorm in een dun en scherp mes. Maak een V-vormige concave indentatie om de embryo's te plaatsen (zie figuur 2D ). Plaats een verdoofd embryo, ventraal omhoog, op een licht schuine manier (ongeveer 30 °) ( Figuur 2D ).
- Vul de vorm met MS222 oplossing en plaats de embryo's in de vorm.
4. DiI-AcLDL Injectie
- Incisie van huid die over het hart ligt
- Bereid twee pinnen (Minutiens, 0,10 mm) om de huid over het hart te snijden. Steek elke pen stevig vast aan een pinhouder; Het hart moet gemakkelijk herkenbaar zijn aangezien het pulseert ( Figuur 2A-2C , roze).
- Stuk de huid van een embryo met een pen. Steek de pen door het gat in de ruimte tussen het hart en de huid ( Figuur 2C
- Maak een lineaire insnijding door voorzichtig de andere pen die buiten de huid wordt gehouden tegen de ingebouwde pin te wrijven. Vergroot deze snede voorzichtig met twee pennen, ontbloot het hart ( Figuur 2B ' en 2D' , pijl). De pipet die geladen is met DiI-AcLDL kan nu direct naar het hart komen ( Figuur 2D ' ).
- Injectie
- Steek de tip van de geladen glazen pipet in het hart en injecteer 50-60 nL DiI-AcLDL oplossing in ongeveer 10 uitwerppulsen. Spuit geen overmatige hoeveelheid oplossing in, omdat het het hart breekt. Controleer of het hart na de injectie blijft verslaan. Controleer na elke injectie of dezelfde hoeveelheid DiI-AcLDL uitgeworpen wordt; Anders kan de tip van de pipet geblokkeerd zijn (zie stap 2.5).
- Breng de geïnjecteerde embryo's over naar een nieuwe Petri-schotel, gevuld met 0.1x MBS voor herstel. Na 5-10 minuten moeten de paddestoelen het bewustzijn herwinnen en beginnen te bewegen. Op dit moment kunnen de gelabelde vaten worden afgebeeld. Het is aan te bevelen om succesvol geëtiketteerde embryo's visueel te screenen onder een fluorescentiemicroscoop ( Figuur 3A en 3B ). Als een onvoldoende hoeveelheid DiI-AcLDL in een embryo wordt geïnjecteerd, kan het opnieuw worden ingespoten ( Figuur 3C ).
- Verwijder de paddestoelen die andere organen hebben gemarkeerd ( Figuur 3D ). Ga door tot het gewenste aantal succesvol gemarkeerde embryo's is verkregen.
- Voor meer grondige beeldvorming van bloedvaten gebruik confocal microscopie; Het kan makkelijker zijn om de gelabelde embryo's voor confocale microscopie op te lossen. Eerst anesthetiseren de gelabelde embryo's in 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) en zet ze dan in 4% paraformaldehyde in 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Vaste embryo's kunnen meerdere dagen bij 4 ° C worden opgeslagen; Bescherm de geïnjecteerde monsters uit het licht om te voorkomen dat de DiI wordt geblazen.
5. Imaging van DiI-AcLDL
- Stereoscopische beeldvorming
- Neem foto's onder een fluorescentie stereoscopische microscoop ( Figuur 3 ) om de algemene morfologie van de vaatwasser te beoordelen.
- Smelt 1% agarose in 1x PBS voor vaste embryo's of in 1x MBS voor livebeelden. Giet gesmolten agarose in een Petri-schotel en wacht tot het stevig is. Maak een ondiep indentatie op het oppervlak van de agarosegel die het embryo past dat bij het aan de zijde liggend wordt afgebeeld. Vul de schotel met buffer (MS222 oplossing voor verdoofde embryo's of 1x PBS voor vaste embryo's).
- Fluorescentiemicroscopie (Rhodamine filter set)
- Aangezien DiI een groengezette en rode emitterende kleurstof is, wordt gebruik gemaakt van een standaard filterset voor rhodamine of spectraal verwante fluoroforen (maximale excitatie bij 554 nm en emissie bij 571 nm). Plaats de geïnjecteerde embryo's in de inkepingen op de agarosevorm en neem foto's ( figuur 3 ).
- Confocale microscopie
OPMERKING: Voor een nauwere analyse van de vasculaire architectuur, gebruik confocale microscopie.- Als u een omgekeerde microscoop gebruikt, plaatst u de embryo's op een glasbodemschotel. Voeg een paar druppels 1x PBS toe en laat ze immobiliseren door een deklaag bovenaan te plaatsen. Verwijder overtollige PBS. Als levende embryo's worden afgebeeld, gebruik dan verdoofde embryo's en gebruik 0,015% MS222 in 0.1x MBS in plaats van PBS.
- Gebruik voor het vergroten van het beeldscherm een 4X tot 10X objectief om het gebied van belang te vinden; Het rostrale deel van de achterste kardinale ader (PCV) is een nuttig gebied om ontwikkelingsangiogenese te onderzoeken (figuur 4, gestippeldboxes).
- Gebruik een acquisitie instelling voor een rode emissie fluorofoor (zoals Rhodamine).
- Maak z-stapelde beelden door de laterale helft van een embryo af te beelden. Eerst, focus op de PCV aan de zijkant in de buurt van het objectief en stel dan de onderste limiet van de focus in op de positie waar de vaartuigen die het dichtst bij de doelstelling liggen in focus. Stel de bovenste limiet in op de positie waar het mediale deel van de PCV die wordt afgebeeld, geconcentreerd kan worden. Afbeelding deze hele laterale helft van het embryo. Gebruik software die metagegevens op de acquisitie-instellingen opslaat, zoals x, y en z-schalen, omdat ze de lengte van de schepen moeten berekenen.
- Gebruik indien nodig de tegelscanmodus om de volledige vasculatuur van een embryo te maken. Bepaal empirisch het aantal horizontale en verticale tegels.
- Voor hoge vergroting beeldvorming, volg de bovenstaande procedures om het rostrale deel van de PCV en 4 rostral-meeste intersomitische venen (ISV's) te zien ( Figuur 4 ,Gestippelde doos). Pas het aantal stapels (z-stack) en tegels (tegelschandering) op.
6. Kwantificering van DiI-gemarkeerde schepen
OPMERKING: DiI-gemarkeerde schepen kunnen handmatig worden opgespoord of software gebruiken. We gebruiken "Simple neurite tracer", een gratis ImageJ (NIH) plugin, die semi-automatische tracing van buisvormige structuren zoals bloedvaten en neurieten mogelijk maakt 12 . Met behulp van deze gratis software kunnen de volgende parameters worden berekend. Een gedetailleerde procedure voor het gebruik van deze software is elders beschreven (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Hieronder gebruiken we voorbeelden van de vasculatuur van embryo's waarin Tie2-signalering wordt geremd of verbeterd ( Figuur 4A-4C ) 5 . Antisense Tie2MO-geïnjecteerde embryo's vertonen vermindert angiogenese en verkorten ISV's ( Figuur 4B ), terwijl de co-injectie van constitutief actieve Tie2Mutant mRNA (caTie2 mRNA) redt dit fenotype, wat resulteert in exuberante ISV-takken ( Figuur 4C ).
- ISV lengtes
- Gebruik een eenvoudige neurietracer, bereken de lengte van elk traceervat. Bereken de lengtes van de 4 rostral-meeste ISV's.
- ISV-takken
OPMERKING: bij wildtype embryo's ontplooien er slechts enkele korte takken uit de rostral-meeste ISV's in stadium 42.- In Simple Simple Tracer traceer deze kleine vaten na het maken van de ISV, waaruit zij de primaire tak afkomstig zijn. Bereken de volgende parameters van deze takken afkomstig van de ISV's.
- Totaal taknummer
- Nadat alle ISV's en de bijbehorende takken zijn opgespoord, bereken dan het totale aantal takken ( Figuur 5B-5D ).
- Branch order
- Als Simple neurite tracer registreert de volgorde van elke tak ( Figuur 5A ), calculatE het aantal takken voor elke bestelling De meeste vaten in wildtype embryo's zouden primaire takken moeten zijn ( dwz ISV's).
- Vein complexiteit index (VCI)
- Aangezien VCI een nuttige parameter is voor de complexiteit van het vaartuig, wat meer gewicht geeft aan hogere ordertakken, bereken de VCI voor elk embryo met behulp van de formule in Figuur 5A . Bijvoorbeeld, Tie2MO-geïnjecteerde embryo's hebben een lagere VCI in vergelijking met de controle ( Figuur 5B en 5C ) en cTie2 mRNA-geïnjecteerde embryo's hebben een hogere VCI ( Figuur 5D ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdlijn van experimenten (figuren 1 en 2)
Kort na bevruchting kan gerichte microinjectie worden uitgevoerd om genuitdrukking te moduleren. Bijvoorbeeld kan een antisense MO die specifiek bindt aan het initiatiecodon van het endogene Tie2-mRNA geïnjecteerd worden, waardoor de translatie van Tie2-target-mRNA door sterische belemmering wordt geremd. Een MO kan worden geconjugeerd met fluoresceïne voor het makkelijk visuele screenen van succesvol geïnjecteerde embryo's. Als alternatief kan een tracer-mRNA (bijvoorbeeld mRNA dat voor EGFP codeert) met MO geïnjecteerd worden. Daarnaast kunnen geneesmiddelen worden behandeld door een badtoepassing na het uitbroeden (vroegtijdig stadium, rond NF-stadium 26). Los het geneesmiddel op in 0,1x MBS en voeg het toe aan de embryo's. Voor eerdere behandeling kunnen embryo's worden vrijgemaakt van de membranen met een paar tang. DiI-AcLDL kan geïnjecteerd worden in het hart rond stadium 33/34 om de dynamiek van het vaartuig te onderzoekenAtie, maar typisch injecteren we in stadium 37/38 of later ( Figuur 2 , gekleurde gebieden).
Typische voorbeelden van succesvolle en mislukte injecties (stap 4.3) (Figuur 3)
Stereoscopische beeldvorming is geschikt voor visuele screening. Als een voldoende hoeveelheid DiI-AcLDL in het hart wordt geïnjecteerd, moet de PCV onmiddellijk zichtbaar zijn onder een fluorescentie stereoscoop ( Figuur 3A en 3B ). Onvoldoende of onjuist geïnjecteerde embryo's zijn gemakkelijk te identificeren ( Figuur 3C en 3D ). Embryo's met een onvoldoende hoeveelheid DiI-AcLDL ( Figuur 3C ) kunnen opnieuw met dezelfde kleurstof worden ingespoten totdat de vaten duidelijk zichtbaar zijn. Afbeelding met succes geïnjecteerde embryo's onder een confocale microscoop, live of na fixatie.
Ontwikkeling van de posteriOf kardinale ader (PCV) en de intersomitische aderen (ISV's)
De PCV strekt zich uit in de rostal-naar-caudale richting, en deze uitbreiding eindigt rond fase 37/38. ISV's verschijnen dorsaal van de PCV in een anterior-to-posterior wave. Deze golf van ISV-vorming begint in stadium 36 en eindigt rond stadium 40/41; ISV's blijven groeien en worden licht vertakt tot fase 43 ( Figuur 3A en 3B ).
Tie2 signalering controleert ontwikkelings-ISV vertakking (Figuur 4)
De PCV en ISV's groeien in een stereotypisch patroon, en hun ontwikkeling is onder streng beheer ( Figuur 4A ). De vorming van de ISV's uit de PCV kan worden beschreven als angiogenese, en daarom is het een nuttig model om moleculaire mechanismen onderliggende angiogenese te onderzoeken. We introduceren het resultaat van onze recente studie showiNg die ontwikkelingssignalen belemmeren Tie2 signalering in ISVs om hun vertakkingen te beperken 5 . De afname van Tie2-signalering door antisense MO vermindert de lengte en complexiteit van ISV's (Figuur 4B) en het uitdrukken van de constitutieve actieve vorm van Tie2 (caTie2) veroorzaakt buitensporige ISV-vertakking ( Figuur 4C ).
Kwantificering van ISV-complexiteit (Figuur 5)
Naast de lengte- en vertakkingsnummers van de ISV's kan de "complex complexiteit index" (VCI) worden berekend om hun complexiteit te beoordelen ( Figuur 5A ). We hebben de "complexiteit index" ontwikkeld die door Cohen-Cory en collega's werd ontwikkeld, die werd ontworpen om de complexiteit van neuronale axonale of dendritische arbors 13 te kwantificeren. In deze index krijgt een embryo met meer hoogwaardige takken een hogere score dan een embryo met hetzelfde aantal totale zemelenChes maar met meer low-order takken. Daarom geeft een hogere VCI aan dat dit embryo een complexer veneus netwerk heeft. "Simple neurite tracer" is handige software om de volgorde en lengte van individuele takken bij te houden. Het is ook mogelijk om "gesmolten paden" te genereren, wat een nuttige manier is om de algemene architectuur van de vaatwasser te visualiseren ( figuren 5B-5D , rechterpanelen).
Figuur 1: Tijdlijn van de experimenten. Op de dag van bevruchting kunnen morfolinos (MOs), DNA, RNA of eiwit worden geïnjecteerd in bevruchte eieren in NF stadium 1 (st1) of 2 (st2). Indien alleen ingespoten in de ene blastomere bij st2, zal het geïnjecteerde reagens slechts een zijdelingse kant beïnvloeden. De niet-geïnjecteerde kant kan als controle gebruikt worden. Co-injecteer een tracer (bijvoorbeeld EGFP mRNA) om de geïnjecteerde kant te identificeren. Op de tweede dag, oaDe embryo's van de tailbud-stadium (~ st24) kunnen met farmacologische reagentia worden behandeld met een badtoepassing. Het hart is op de derde dag duidelijk zichtbaar. DiI-AcLDL kan in het hart worden ingespoten en de bloedvaten kunnen kort na de injectie worden afgebeeld. Gebruik st33-37 embryo's om de dynamiek van vaartuiggroei of st42 embryo's aan te geven op volledig ontwikkelde vaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plaatsing van de DiI-AcLDL injectie bij st42. Laterale ( AB ' ) en ventrale ( CD ) aanzichten van het stadium 42 embryo. Het hart is gekleurd in roze in AC , in afbeeldingen uit Xenbase (www.xenbase.org). Representatieve stereoscopische afbeeldingen worden getoond in A ' ,
Figuur 3: Verwachte resultaten (stereoscopische beelden). Representatieve fluorescentiebeelden van fase 37/38 ( A ) en stadium 42 ( B ) embryo's. De linker zijden van de embryo's worden getoond. De achterste kardinale ader (PCV) strekt zich uit in de wortel, waaruit intersomitische aderen (ISV's) dorsaal vertakken in een rostral-naar-caudale wave. Alleen rostral ISV's zijn zichtbaar in stadium 37/38 ( A ), en de meeste ISV's zijn gevormd door fase 42 ( B ). Als een onvoldoende hoeveelheid DiI-AcLDL wordt geïnjecteerd, zal de PCV niet duidelijk zichtbaar zijn, zelfs na 30 minuten ( C ). In dit geval kan meer DiI-AcLDL geïnjecteerd worden. Als DiI-AcLDL per ongeluk in andere organen ( D ) wordt geïnjecteerd, gooi de embryo's weg. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van Tie2 signalering op ISV ontwikkeling. Tie2-genuitdrukking werd door de blastomere-injectie van translatie-blokkerende antisense morfolino-oligonucleotiden (Tie2MO) afgebroken. De controle morfolino (CoMO) heeft hetzelfde molecuulgewicht, maar doet nGeen doelwit voor elk gen in Xenopus tropicalis . MRNA-coderende constitutief actieve Tie2 mutant (caTie2) werd gecojecteerd om het Tie2 knockdown fenotype te redden. In tegenstelling tot de controle ( A ) leidde deTie2MO injectie tot een dramatische afname van de lengte en het aantal ISV's ( B ). Dit fenotype werd overgered door caTie2, die ISV's met uitbundige onderpandstakken ( C ) liet zien. De complexiteit van ISV's in gebieden aangeduid met blauwe streepjesdoosjes wordt in figuur 5 gekwantificeerd. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van adercomplexiteit. ( A ) De complexiteit van ISV kan worden vertegenwoordigd door de ader complexiteit index (VCI).( BD ) VCI's werden berekend uit de embryo's die in Figuur 4 zijn getoond. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol werd eerst ontwikkeld door Ali H. Brivanlou en collega's om ontwikkelingsgebeurtenissen tijdens vasculaire vorming in Xenopus laevis 4 te onderzoeken, maar zoals getoond in dit manuscript, kan deze toegepast worden op andere kleine dieren. Dye injectie in het hart is eenvoudig uit te voeren, en het gehele vasculaire netwerk kan worden afgebeeld onder een fluorescentiedissectiemicroscoop, evenals een confocale microscoop. Als de kleurstof in het hart wordt geïnjecteerd tijdens de ontwikkeling van vaten, kan de dynamiek van vaartgroei en vertakking in real time 4 worden weergegeven. Met behulp van het goed gedefinieerde veneuze netwerk, met name de meeste PCV- en rostral-ISV's, kunnen de effecten van genetische of milieuverstoring op angiogenese kwantitatief worden beoordeeld.
De meest kritische stap in dit protocol is de injectie van DiI-AcLDL (stap 4). Wij bieden voorbeelden van succesvolle en mislukte injecties ( FiGure 3). Succesvol geïnjecteerde embryo's moeten onder een fluorescentiemicroscoop worden gescreend, zoals beschreven in stap 4.3. Als de PCV niet zichtbaar is 30 minuten na injectie, is niet genoeg DiI-AcLDL geïnjecteerd ( Figuur 3C ). Niet-geïmplementeerde embryo's kunnen verdoofd worden en opnieuw geïnjecteerd worden. In sommige gevallen kan DiI-AcLDL geïnjecteerd worden op een onjuiste plaats, in welk geval andere organen worden gemarkeerd ( Figuur 3D ). Onjuist geïnjecteerde embryo's weggooien.
De bloedvaten van een succesvol geïnjecteerd embryo zullen kort na injectie zichtbaar zijn en de fluorescentie duurt enkele uren. Daarom, als de injectie wordt uitgevoerd voor de vorming van ISV's, kan hun ontwikkeling worden afgebeeld in een levend embryo, dat een krachtig instrument biedt om de ontwikkeling van het cardiovasculaire systeem in realtime en in vivo 4 te onderzoeken. Aangezien Xenopus succesvol is gebruikt als model om vasculaire d te screenenVerstorende middelen in zoogdieren 14 , kan de hier beschreven experimentele benadering gecombineerd worden met farmacologische verstoringsexperimenten en gebruikt worden als screeningsplatform om medicijnen te vinden die angiogenese versterken of remmen.
Bloedvaten kunnen worden gedetecteerd door genetische hulpmiddelen, evenals door de op kleurstof gebaseerde etiketteringsmethoden die hier worden beschreven. Bijvoorbeeld, transgene Xenopus 15 of zebravis 16 die fluorescentieproteïnen uitdrukken onder de controle van celltypespecifieke promotors, maken het mogelijk dat de bloed- en lymfatische vaten levende beelden worden weergegeven en het is zelfs mogelijk om arteriën van aderen 16 te onderscheiden. Hoewel genetische benaderingen superieur zijn en een consistente etiketteringsefficiëntie genereren, zijn op kleurstof gebaseerde methoden gemakkelijk toegankelijk voor de meeste laboratoria zonder toegang tot dergelijke genetisch gemanipuleerde dieren. In Xenopus resulteert de transcardiale perfusie van DiI-AcLDL in deEtikettering van de meeste endotheelcellen 4 , en arteriën en aderen zijn niet onderscheiden in fluorescentiebeelden. Intriguingly, tomaten lectin-fluoresceïne selectief label arteriën in muizen, en wanneer gecombineerd met DiI-AcLDL, kunnen arteriën en aderen worden gediscrimineerd 17 . Hoewel de applicatie niet in andere weefsels of dieren is getest, biedt dit een veelbelovende richting om de dynamische ontwikkeling van slagaders en aderen in Xenopus te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd geïnspireerd door het werk van Levine et al. , Die deze experimentele methode beschreven en een uitgebreide beschrijving van de vaatontwikkeling in Xenopus laevis gaf . Wij danken de leden van ons laboratorium voor hun input. Deze studie werd ondersteund door het Yonsei University Future-Leading Research Initiative van 2015 (2015-22- 0095) en het Bio & Medical Technology Development Program van de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomstige planning ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
