Summary
Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .
Abstract
Los vasos sanguíneos suministran oxígeno y nutrientes en todo el cuerpo, y la formación de la red vascular está bajo un estricto control del desarrollo. La visualización in vivo eficaz de los vasos sanguíneos y la cuantificación confiable de su complejidad son fundamentales para comprender la biología y la enfermedad de la red vascular. Aquí, proporcionamos un método detallado para visualizar los vasos sanguíneos con un colorante fluorescente comercialmente disponible, plasma humano acetilado de lipoproteína de baja densidad DiI complejo (DiI-AcLDL), y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden ser etiquetados mediante una simple inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un embrión y los vasos sanguíneos de todo el embrión se pueden visualizar en embriones vivos o fijos. Combinada con la perturbación génica por la microinyección dirigida de ácidos nucleicos y / o la aplicación en el baño de reactivos farmacológicos, las funciones de un gen o de una vía de señalización sobre el desarrollo vascular pueden ser inveEstigmatizados en una semana sin recurrir a sofisticados animales modificados genéticamente. Debido al sistema venoso bien definido de Xenopus y su angiogénesis estereotípica, el brote de vasos preexistentes, la complejidad de los vasos pueden ser cuantificados eficientemente después de experimentos de perturbación. Este protocolo relativamente simple debe servir como una herramienta de fácil acceso en diversos campos de la investigación cardiovascular.
Introduction
La vasculogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos de células endoteliales recién nacidas y la angiogénesis, la formación de nuevos vasos de vasos preexistentes, son dos procesos distintos que configuran la vasculatura embrionaria 1 . Cualquier desregulación en estos procesos da como resultado varias enfermedades del corazón y anomalías estructurales de los vasos. Además, el crecimiento tumoral está asociado con un crecimiento descontrolado de vasos. Como tal, los mecanismos moleculares subyacentes a la vasculogénesis y la angiogénesis son objeto de intensa investigación [ 2] .
Xenopus y pez cebra son modelos de vertebrados atractivos para estudios de vasculogénesis y angiogénesis, por varias razones. Primero, sus embriones son pequeños; Por lo tanto, es relativamente fácil imaginar toda la vasculatura. En segundo lugar, el desarrollo embrionario es rápido; Sólo toma un par de días para que se desarrolle toda la vasculatura, durante cuyo tiempo la vascula en desarrollo Una imagen. En tercer lugar, las intervenciones genéticas y farmacológicas antes y durante la formación de los vasos son fáciles de llevar a cabo, por ejemplo mediante la microinyección de morfolino nucleótidos antisentido (MOs) en el embrión en desarrollo oa través de la aplicación de ba~no de fármacos 3 , 4 , 5 .
La ventaja única de Xenopus sobre el pez cebra es que las manipulaciones embriológicas pueden realizarse porque Xenopus sigue clivajes holoblásticos estereotípicos y el mapa embrionario del destino está bien definido 6 . Por ejemplo, es posible generar un embrión en el que sólo se manipula genéticamente un lado lateral mediante la inyección de un MO antisentido a una célula en la etapa de dos células. También es posible trasplantar el corazón primordio de un embrión a otro para determinar si el gen ejerce su función por una célula intrínseca o mecanismo -extrínsecoAsno = "xref"> 7. Aunque estas técnicas se han desarrollado principalmente en Xenopus laevis , que es alotetraploide y por lo tanto no es ideal para los estudios genéticos , pueden aplicarse directamente a Xenopus tropicalis , una especie diploide estrechamente relacionada 8 .
Una manera de visualizar la vasculatura en un embrión vivo de Xenopus es inyectar un colorante fluorescente para marcar los vasos sanguíneos. La lipoproteína de baja densidad acetilada (AcLDL) marcada con una molécula fluorescente tal como DiI es una sonda muy útil. A diferencia de la LDL no acetilada, la AcLDL no se une al receptor de LDL 9 sino que es endocitados por los macrófagos y las células endoteliales. La inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un animal vivo resulta en el marcaje fluorescente específico de las células endoteliales, y toda la vasculatura puede ser visualizada por microscopía de fluorescencia en embriones vivos o fijos [ 4] .
Aquí prestamosDe protocolos detallados para la visualización y cuantificación de vasos sanguíneos utilizando DiI-AcLDL en Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Proporcionamos puntos prácticos clave, con ejemplos de experimentos exitosos y sin éxito. Además, proporcionamos un método sencillo para el análisis cuantitativo de la complejidad vascular, que podría ser útil para evaluar los efectos de factores genéticos y ambientales en la conformación de la red vascular.
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Protocol
Todos los experimentos cumplieron con los protocolos aprobados por el Colegio Universitario de Medicina de la Universidad de Medicina Institucional Cuidado de Animales y Comités de Uso.
1. Preparación de los embriones de Xenopus tropicalis
NOTA: Los embriones de Xenopus tropicalis se produjeron como se describió anteriormente 10 , con ligeras modificaciones. Xenopus tropicalis embriones se realizaron de acuerdo con las tablas de Nieuwkoop y Faber [ 11] .
- Inducción de la ovulación
- Para inyectar la gonadotropina coriónica humana (hCG) en el saco linfático dorsal de un par de ranas (un macho y una hembra) el día anterior al día de apareamiento. Inyectar 20 unidades por rana hembra y 10 unidades por macho. Casa de un macho y una hembra en el mismo tanque durante la noche (por más de 18 h).
- Para cebar, al día siguiente, se inyectan 200 unidades de hCG a la hembra preimpregnada y 100 unidades de hCG a la preimpregnadamasculino; La hembra preparada comenzará a poner huevos en aproximadamente 3 h y continuará haciéndolo durante todo el día. Mantenga los pares macho y hembra juntos para apareamiento natural o en tanques separados para fertilización in vitro (paso 1.2).
- Fertilización
NOTA: Los huevos pueden ser fertilizados por apareamiento natural o fertilización in vitro . En el apareamiento natural, los huevos son fertilizados a medida que se ponen, y por lo tanto, el momento de la fertilización no puede ser controlado. Alternativamente, una rana hembra cebada puede alojarse en un tanque separado y los huevos no fertilizados pueden ser recolectados para fertilización in vitro , lo que genera cientos de embriones fertilizados al mismo tiempo. Este último enfoque es útil cuando la microinyección dirigida al blastómero se llevará a cabo antes del etiquetado del vaso. En este enfoque, sin embargo, un macho es sacrificado.- Apareamiento natural
- Deje el par cebado macho y hembra en el mismo tanque. El macho se cierra el fEmana, que conduce a la fertilización inmediata de los huevos puestos. Recoger los huevos con una pipeta de vidrio o de plástico y transferirlos a una placa de Petri. Para evitar que los huevos se peguen a la pipeta, cubra la superficie interna de la pipeta con albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA).
- Fertilización in vitro (FIV)
- Separar la hembra cebada del macho después del cebado. La hembra comenzará a poner huevos espontáneamente en aproximadamente 3 h. Transferir algunos huevos puestos con una pipeta revestida con BSA a una placa de Petri y comprobar su calidad bajo un microscopio. Si se ponen huevos sanos (pigmento claro, elástico en forma de bola), prepárese para diseccionar los testículos del macho cebado.
- Hacer 0.4% Tricaine metanosulfonato (MS222) para la eutanasia e inyectar 300 μ l en el saco dorsal linfáticos del macho cebado. En aproximadamente 10 minutos, el macho perderá su sentido del equilibrio y se mantendrá a flote; Confirmar que el macho es eutanasiado pellizcando una pata trasera con unaPar de fórceps romos y observando sin respuesta.
- Disecar los dos testículos, limpiarlos rápidamente tapándolos en papel sin pelusa y transferirlos a un microtubo que contenga 1 mL de L-15 Medium (60%) de Leibovitz suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS); Un procedimiento detallado se describe en otro lugar 10 .
- Picar suavemente los testículos con un mazo para extraer el esperma. A esta concentración ( es decir, 2 testículos en 1 ml de FBS al 10% en 60% de L-15), unas gotas de solución de testículo (0,1 ml) pueden fertilizar aproximadamente trescientos huevos. El esperma restante se puede almacenar a 4 ° C en un tubo bien sellado y se utiliza para la fertilización in vitro al día siguiente.
- Apriete los huevos de la hembra en una pequeña placa de Petri. Sostenga la parte superior de la hembra boca abajo en la palma y coloque el dedo índice entre sus patas traseras. Extender las patas traseras con el dedo índice y la otra mano para exponer la cloaca. Toca la cloaca a la placa de Petri. AbrigoPlato de Petri con 0,5% de BSA para distribuir uniformemente los huevos como monocapa durante la FIV.
- Añadir unas gotas (0,1 ml) de medio L-15 que contiene esperma a los huevos. Para la fertilización sincrónica, agitar suavemente la solución de esperma a través del plato. Después de 4 min a temperatura ambiente, llenar la placa de Petri con 0,01x Modificado Barth's Saline (MBS), incubar durante 10 min, y sustituir la solución con 0.1x MBS. Los huevos fertilizados sufrirán la primera escisión en aproximadamente 1 h a temperatura ambiente. 1x MBS es NaCl 88 mM, KCl 1 mM, NaHCO _ { 3 } 2,5 mM, HEPES 5 mM, MgSO _ { 4 } 1 mM y CaCl _ { 2 } 0,7 mM, pH 7,5.
- Apareamiento natural
- (Opcional) Inyección de oligonucleótidos (MOs) morfolinos antisentido y / o ARNm
- Para investigar el efecto de un gen de interés en la formación de vasos, realizar la microinyección de antisentido MO y / o mRNAs.
- Para tales experimentos, des-gelificar los huevos con 2% de L-cisteína en 1x MBS (pH 7,5-7,8).Reemplazar 0.1x MBS en el plato que contiene los embriones fertilizados con 2% de L-cisteína en 1x MBS. Remueva suavemente el plato para mezclar la solución.
NOTA: Por lo general, se tarda unos 5 min para que los embriones se des-gelifican. Durante este paso, supervise los huevos frecuentemente para asegurarse de que no estén sobreexpuestos a la solución. Si los huevos están excesivamente expuestos, perderán elasticidad y se aplastarán, lo que causará desarrollo aberrante y letalidad. - Lave los huevos de gelatina cinco veces con 0.1x MBS. Realizar la microinyección en Ficoll 4% disuelto en 0.1x MBS. Típicamente, inyectar 4 ng de MO y 600 pg de mRNA por blastómero en la etapa de dos células. Inyectar en una célula para manipular la expresión génica en sólo un lado del embrión. Utilice el lado no inyectado del mismo embrión como control.
- Como otro control para la especificidad de la manipulación de genes, inyectar la misma cantidad de un MO de control (CoMO) o ARNm de control ( por ejemplo, mARN de beta-galactosidasa). CoMO debe tener el mismo mOlecular como MO específico del gen y no debe dirigirse a ningún gen en el genoma de Xenopus . Para facilitar la visualización del lado inyectado, utilice MO marcado con fluoresceína o co-inyecte un trazador ( por ejemplo, EGFP mRNA).
- Dejar los embriones inyectados en 4% de Ficoll durante 2 hy luego transferirlos a una nueva placa de Petri de 60 mm llena de 0.1x MBS.
- Levantamiento
- Levante los embriones a 23 ° C. Aunque la velocidad de desarrollo puede ser ralentizada o acelerada usando temperaturas por debajo o por encima de 23 ° C, respectivamente (rango: 16-26 ° C), se recomienda levantarlas a 23 ° C.
- (Opcional) Tratamiento con reactivos farmacológicos
- Para manipulaciones farmacológicas, administrar fármacos a los embriones en desarrollo por aplicación de baño.
2. Preparación de Inyección de DiI-AcLDL
- Hacer una pipeta de vidrio ahusante con un micr estándarExtractor opipette Coloque un tubo de vidrio de borosilicato en el extractor de micropipeta y utilice los siguientes ajustes: presión, 200; Calor, 30; Pull, 30; Velocidad 120; Tiempo, 200.
- Almacene la solución madre DiI-ACLDL a 4 ° C. Tome la parte clara superior de la solución inyectable, pero no las partículas precipitadas en el fondo del tubo. Cualquier desecho en la pipeta de vidrio perturbar la correcta expulsión de la solución.
- Llenar la pipeta de vidrio preparada con una cantidad adecuada de solución DiI-AcLDL (~ 5 μL) usando un microcargador.
- Corte la punta de la pipeta de vidrio poco a poco usando un par de pinzas finas (número 55). Configure el sistema de inyección controlado por presión de modo que se expulsen aproximadamente 5 nL de solución a la vez; 50-60 nL de solución DiI-ACLDL es suficiente para manchar los vasos de un embrión.
- No deje la pipeta con DiI-ACLDL en el aire durante un período de tiempo prolongado para evitar el secado. Mantenga la punta de la pipeta sumergida en MS al 0,04%222 en una solución de 0.1X MBS. Justo antes de inyectarlo en el embrión (paso 4.2.1), verifique si la misma cantidad de colorante se expulsa.
3. Configuración de la inyección
- Molde de Sylgard
- Para preparar un pequeño molde de Sylgard, mezcle la base de Sylgard y el agente de curado con una relación de peso de 10 a 1. Llene aproximadamente la mitad de una pequeña placa de Petri (plato de 35 mm o 60 mm) con esta solución mezclada y luego deje solidificar durante aproximadamente 48 h a temperatura ambiente.
- Anestesia
- Utilizar MS222 al 0,04% en 1x MBS (pH 7,5-8,0) para la anestesia. Cuando se necesita una anestesia prolongada ( por ejemplo, durante la imagen en vivo), use MS222 al 0.04% en 0.1x MBS para reducir el desequilibrio osmótico. Para ajustar el pH, agregue unas gotas de NaOH (~ 20 μL) y compruebe el pH usando papel de pH.
- Espere hasta que los embriones transferidos dejen de moverse. Toque las aletas dorsales de los embriones e inspeccione si responden a confirmar completar unaNesthesia.
- Posicionamiento de embriones para inyección
- Indent la superficie del molde endurecido de Sylgard con una cuchilla fina y afilada. Hacer una hendidura cóncava en forma de V en la que colocar los embriones (véase la figura 2D ). Coloque un embrión anestesiado, ventral hacia arriba, de forma ligeramente oblicua (aproximadamente 30 °) ( Figura 2D ).
- Llenar el molde con solución MS222 y colocar los embriones en el molde.
4. Inyección DiI-AcLDL
- Incisión de la piel sobre el corazón
- Prepare dos alfileres (Minutiens, 0,10 mm) para cortar la piel sobre el corazón. Fije firmemente cada pasador a un porta-pernos; El corazón debe ser fácilmente identificable a medida que pulsa ( Figura 2A-2C , rosa).
- Perfore la piel de un embrión con un alfiler. Inserte el pasador a través del agujero en el espacio entre el corazón y la piel ( Figura 2C
- Haga una incisión lineal frotando suavemente el otro pasador sostenido fuera de la piel contra el pasador insertado. Amplíe suavemente esta incisión con dos clavijas, exponiendo el corazón ( Figura 2B ' y 2D' , flecha). La pipeta cargada con DiI-AcLDL puede ahora acercarse directamente al corazón ( Figura 2D ' ).
- Inyección
- Inserte la punta de la pipeta de vidrio cargada en el corazón e inyecte 50-60 nL de solución DiI-ACLDL en aproximadamente 10 pulsos de inyección. No inyecte una cantidad excesiva de solución, ya que provoca la ruptura del corazón. Compruebe si el corazón sigue latiendo después de la inyección. Después de cada inyección, compruebe si la misma cantidad de DiI-AcLDL es expulsada; De lo contrario, la punta de la pipeta puede estar bloqueada (ver paso 2.5).
- Transferir los embriones inyectados a una nueva placa de Petri llena de 0.1x MBS para su recuperación. Después de 5-10 min, los renacuajos deben recuperar la conciencia y empezar a moverse. En este momento, los vasos etiquetados pueden ser visualizados. Se recomienda que se visualicen visualmente los embriones marcados con éxito bajo un microscopio de fluorescencia ( Figura 3A y 3B ). Si se inyecta una cantidad insuficiente de DiI-AcLDL en un embrión, se puede inyectar de nuevo ( Figura 3C ).
- Deseche los renacuajos que tienen otros órganos etiquetados ( Figura 3D ). Continúe hasta que se obtenga el número requerido de embriones marcados con éxito.
- Para una imagen más completa de los vasos sanguíneos, utilice microscopía confocal; Podría ser más fácil fijar los embriones marcados para la microscopía confocal. Primero anestesiar los embriones marcados en MS222 al 0,04% en 1x MBS (pH 7,5-8,0) y luego se fijan en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Los embriones fijos se pueden almacenar durante varios días a 4 ° C; Proteger las muestras inyectadas de la luz para evitar el fotoblanqueo de la DiI.
5. Imágenes de DiI-AcLDL
- Imágenes estereoscópicas
- Tomar fotografías bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia ( Figura 3 ) para evaluar la morfología general de la vasculatura.
- Fundir 1% de agarosa en 1x PBS para embriones fijos o en 1x MBS para imágenes en vivo. Vierta la agarosa fundida en una placa de Petri y espere hasta que se solidifique. Hacer una sangría poco profunda en la superficie del gel de agarosa que se ajustará al embrión a la imagen cuando se extiende en su lado lateral. Llenar el plato con tampón (solución MS222 para embriones anestesiados o 1x PBS para embriones fijos).
- Microscopía de fluorescencia (Rhodamine filter seT)
- Como DiI es un colorante verde-excitado y que emite rojo, usando un filtro estándar para rodamina o fluoróforos relacionados espectralmente (excitación máxima a 554 nm y emisión a 571 nm). Colocar los embriones inyectados en las muescas en el molde de agarosa y tomar fotografías ( Figura 3 ).
- Microscopia confocal
NOTA: Para un análisis más detallado de la arquitectura vascular, utilice microscopía confocal.- Si usa un microscopio invertido, coloque los embriones en un plato de fondo de vidrio. Añadir unas gotas de 1x PBS e inmovilizarlos colocando un cobertor en la parte superior. Quitar el exceso de PBS. Si los embriones vivos son imágenes, utilizar embriones anestesiados y utilizar 0,015% MS222 en 0,1x MBS en lugar de PBS.
- Para imágenes de baja ampliación, utilice un objetivo de 4X a 10X para encontrar el área de interés; La parte rostral de la vena cardinal posterior (PCV) es una región útil para investigar la angiogénesis del desarrollo (Figura 4, trazosCajas).
- Utilice un ajuste de adquisición para un fluoróforo de emisión roja (como Rhodamine).
- Haga imágenes apiladas en z mediante la obtención de imágenes de la mitad lateral de un embrión. En primer lugar, se centran en el PCV en el lado lateral cerca del objetivo y luego establecer el límite inferior del foco en la posición donde los buques más cercanos al objetivo están en foco. Establezca el límite superior en la posición en la que se puede enfocar la parte medial del PCV que se está formando una imagen. Imagen de toda esta mitad lateral del embrión. Utilice un software que almacena metadatos en los ajustes de adquisición, como las escalas x, y y z, ya que son necesarios para calcular las longitudes del recipiente.
- Si es necesario, utilice el modo de exploración de azulejos para imitar toda la vasculatura de un embrión. Determinar empíricamente el número de mosaicos horizontales y verticales.
- Para imágenes de alta magnificación, siga los procedimientos anteriores para la imagen de la parte rostral de la PCV y 4 rostral mayoría de las venas intersomíticas (ISV) ( Figura 4 ,Cuadro discontinuo). Ajuste el número de pilas (pila-z) y azulejos (escaneado de baldosas) de manera apropiada.
6. Cuantificación de los buques con etiqueta DiI
NOTA: Los vasos Di-etiquetados pueden rastrearse manualmente o usar software. Usamos "Simple neurite tracer", una libre ImageJ (NIH) plugin, que permite el seguimiento semiautomático de tubos como las estructuras como los vasos sanguíneos y neurites [ 12] . Utilizando este software libre, se pueden calcular los siguientes parámetros. Un procedimiento detallado para el uso de este software se describe en otra parte (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . A continuación, se utilizan ejemplos de la vasculatura de los embriones en los que Tie2 señalización es inhibido o mejorado ( Figura 4A-4C ) [ 5] . Antisentido Tie2MO inyectados embriones exposición reduce la angiogénesis y acorta la ISVs ( Figura 4B ], mientras que la co-inyección de constitutivamente activa Tie2Mutante mRNA (caTie2 mRNA) sobre-rescata este fenotipo, dando lugar a exuberante ISV ramas ( Figura 4C ].
- Longitudes ISV
- Usando el trazador simple de la neurita, calcule la longitud de cada recipiente trazado. Calcular las longitudes de los 4 ISVs rostral más.
- Ramas ISV
NOTA: En embriones de tipo salvaje, sólo unas pocas ramas cortas brotan de la mayoría de los ISV rostrales en la etapa 42.- En el trazador simple de las neuritas, trace estos pequeños vasos después de hacer el ISV del cual originan la rama primaria. Calcular los siguientes parámetros de estas ramas originarias de los ISV.
- Número total de sucursales
- Una vez que todos los ISV y las ramas asociadas se trazan, calcular el número total de ramas ( Figura 5B-5D ).
- Orden de la sucursal
- Como Simple neurite tracer registra el orden de cada rama ( Figura 5A ), calculatE el número de sucursales para cada orden. La mayoría de los vasos en embriones de tipo salvaje deben ser ramas primarias ( es decir, ISVs).
- Índice de complejidad venosa (VCI)
- Como VCI es un parámetro útil para la complejidad de los vasos, lo que da más peso a las ramas de orden superior, calcular la VCI para cada embrión utilizando la fórmula de la Figura 5A . Por ejemplo, los embriones inyectados con Tie2MO tienen una VCI más baja en comparación con el control ( Figura 5B y 5C ), y los embriones inyectados con mRNA caTie2 tienen una VCI más alta ( Figura 5D ).
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Representative Results
Cronología de los experimentos (Figuras 1 y 2)
Poco después de la fecundación, la microinyección dirigida se puede realizar para modular la expresión génica. Por ejemplo, se puede inyectar un MO antisentido que se une específicamente al codón de iniciación del ARNm de Tie2 endógeno, inhibiendo la traducción del mRNA diana de Tie2 por impedimento estérico. Un MO puede conjugarse con fluoresceína para el fácil rastreo visual de embriones inyectados con éxito. Alternativamente, un mRNA trazador ( por ejemplo, ARNm que codifica EGFP) puede co-inyectarse con MO. Además, los fármacos pueden ser tratados mediante aplicación de baño después de la eclosión (fase de la cola corta, alrededor de la etapa 26 de NF). Disolver el medicamento en 0.1x MBS y añadirlo a los embriones. Para el tratamiento anterior, los embriones pueden ser liberados de las membranas con un par de fórceps. DiI-AcLDL puede inyectarse en el corazón alrededor de la etapa 33/34 para investigar la dinámica de la forma del vasoPero típicamente se inyectan en la etapa 37/38 o posterior ( Figura 2 , regiones coloreadas).
Ejemplos típicos de inyecciones exitosas e infructuosas (paso 4.3) (Figura 3)
La imagen estereoscópica es apropiada para el cribado visual. Si se inyecta una cantidad suficiente de DiI-AcLDL en el corazón, el PCV debe ser inmediatamente visible bajo un estereoscopio de fluorescencia ( Figura 3A y 3B ). Los embriones inyectados de forma insuficiente o incorrecta son fáciles de identificar ( Figura 3C y 3D ). Los embriones con una cantidad insuficiente de DiI-AcLDL ( Figura 3C ) se pueden inyectar de nuevo con el mismo colorante hasta que los vasos sean claramente visibles. La imagen inyectó con éxito embriones bajo un microscopio confocal, vivo o después de la fijación.
Desarrollo del posteriO vena cardinal (PCV) y las venas intersomíticas (ISVs)
El PCV se extiende en la dirección rostal a caudal, y esta extensión termina alrededor de la fase 37/38. Los ISVs emergen dorsalmente del PCV en una onda anterior a posterior. Esta ola de formación de ISV comienza en la etapa 36 y termina alrededor de la etapa 40/41; ISVs siguen creciendo y se ligeramente ramificado hasta la etapa 43 ( Figura 3A y 3B ).
La señalización Tie2 controla la ramificación ISV de desarrollo (Figura 4)
El PCV y ISVs crecen en un patrón estereotípico, y su desarrollo está bajo control estricto ( Figura 4A ]. La formación de los ISVs del PCV se puede describir como angiogénesis, y por lo tanto es un modelo útil para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la angiogénesis. Presentamos el resultado de nuestro reciente estudio showiNg que las señales de desarrollo inhibir Tie2 señalización en ISVs para limitar su ramificación 5 . El desmontaje de Tie2 señalización por MO antisense disminuye la longitud y la complejidad de ISVs (Figura 4B], y expresando la forma activa constitutiva de Tie2 (caTie2) provoca excesiva ramificación ISV ( Figura 4C ].
La cuantificación de la complejidad ISV (Figura 5]
Además de las longitudes y números de rama de los ISVs, el "índice de complejidad de la vena" (VCI) se puede calcular para evaluar su complejidad ( Figura 5A ]. Hemos adoptado el "índice de complejidad" desarrollado por Cohen-Cory y colegas, que fue diseñado para cuantificar la complejidad de neuronal axonal o dendríticas arcos [ 13] . En este índice, un embrión con ramas de mayor orden recibe una puntuación más alta que un embrión con el mismo número de salvado totalPero con ramas más bajas. Por lo tanto, un VCI más alto indica que este embrión tiene una red venosa más compleja. El "trazador simple de la neurita" es software útil para no perder de vista el orden y la longitud de ramas individuales. También es posible generar "trayectorias renderizadas", que es una manera útil de visualizar la arquitectura global de la vasculatura ( Figuras 5B-5D , paneles de la derecha).
Figura 1: Cronología de los experimentos. En el día de la fecundación, se pueden inyectar morfolinos (MOs), ADN, ARN o proteína en huevos fertilizados en NF estadio 1 (st1) o 2 (st2). Si se inyecta sólo en el blastómero en st2, el reactivo inyectado afectará sólo un lado lateral. El lado no inyectado puede usarse como control. Co-inyectar un trazador ( por ejemplo, EGFP mRNA) para identificar el lado inyectado. En el segundo día, eaRly tailbud-stage (~ st24) los embriones pueden ser tratados con reactivos farmacológicos por aplicación de baño. El corazón es claramente visible en el tercer día. DiI-AcLDL se puede inyectar en el corazón y los vasos sanguíneos se pueden imaginar poco después de la inyección. Utilice embriones st33-37 para imagen de la dinámica del crecimiento de los vasos o embriones ST42 para imagen de vasos completamente desarrollados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ubicación de la inyección DiI-AcLDL en st42. Lateral ( AB ' ) y ventral ( CD ) de la etapa 42 del embrión. El corazón está coloreado en rosa en AC , en imágenes tomadas de Xenbase (www.xenbase.org). Las imágenes estereoscópicas representativas se muestran en A ' ,
Figura 3: Resultados esperados (imágenes estereoscópicas). Imágenes de fluorescencia representativas de los embriones de las etapas 37/38 ( A ) y 42 ( B ). Se muestran los lados izquierdos de los embriones. La vena cardinal posterior (PCV) se extiende caudalmente, de la cual las venas intersomíticas (ISVs) se ramifican dorsalmente en un wav rostral a caudalmi. Sólo los ISV rostrales son visibles en la etapa 37/38 ( A ), y la mayoría de los ISV se han formado por la etapa 42 ( B ). Si se inyecta una cantidad insuficiente de DiI-AcLDL, el PCV no será claramente visible, incluso después de 30 min ( C ). En este caso, se puede inyectar más DiI-AcLDL. Si DiI-AcLDL se inyecta accidentalmente en otros órganos ( D ), descarte los embriones. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos de la señalización Tie2 en el desarrollo de ISV. La expresión del gen Tie2 fue anulada por la inyección de blastómero de oligonucleótidos morfolino antisentido de traducción-bloqueo (Tie2MO). El morfolino de control (CoMO) tiene el mismo peso molecular, pero nOt objetivo cualquier gen en Xenopus tropicalis . ARNm codificante constitutivamente activa Tie2 mutante (caTie2) fue co-inyectado para rescatar el Tie2 knockdown fenotipo. En contraste con el control ( A ), la inyección de Tie2MO condujo a una disminución dramática en la longitud y número de ISVs ( B ). Este fenotipo fue sobre-rescatado por caTie2, que mostró ISVs con ramas colaterales exuberantes ( C ). La complejidad de los ISVs en las regiones indicadas por cuadros de rayas azules se cuantifica en la Figura 5. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuantificación de la complejidad de las venas. ( A ) La complejidad de ISV puede ser representada por el índice de complejidad de la vena (VCI).( BD ) Las VCI se calcularon a partir de los embriones mostrados en la Figura 4. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado aquí fue desarrollado por Ali H. Brivanlou y sus colegas para investigar eventos de desarrollo durante la formación vascular en Xenopus laevis 4 , pero, como se muestra en este manuscrito, se puede aplicar a otros animales pequeños. La inyección de colorante en el corazón es simple de realizar, y toda la red vascular puede ser visualizada bajo un microscopio de disección de fluorescencia, así como un microscopio confocal. Si el colorante se inyecta en el corazón durante el desarrollo del vaso, la dinámica de crecimiento de los vasos y la ramificación se puede imaginar en tiempo real [ 4] . Usando la red venosa bien definida, particularmente el PCV y el rostral, la mayoría de los ISVs, los efectos de la perturbación genética o ambiental en la angiogénesis pueden ser evaluados cuantitativamente.
El paso más crítico en este protocolo es la inyección de DiI-AcLDL (paso 4). Proporcionamos ejemplos de inyecciones exitosas e infructuosas ( FiGura 3). Los embriones inyectados con éxito deben examinarse bajo un microscopio de fluorescencia, como se describe en el paso 4.3. Si el PCV no es visible 30 min después de la inyección, no se inyectó suficiente DiI-AcLDL ( Figura 3C ). Los embriones inyectados sin éxito pueden ser anestesiados e inyectados de nuevo. En algunos casos, DiI-AcLDL puede ser inyectado en una ubicación incorrecta, en cuyo caso otros órganos serán etiquetados ( Figura 3D ). Deseche los embriones inyectados incorrectamente.
Los vasos sanguíneos de un embrión inyectado con éxito serán visibles poco después de la inyección, y la fluorescencia dura varias horas. Por lo tanto, si la inyección se realiza antes de la formación de ISVs, su desarrollo puede ser visualizado en un embrión vivo, proporcionando una poderosa herramienta para investigar el desarrollo del sistema cardiovascular en tiempo real e in vivo 4 . Como Xenopus ha sido utilizado con éxito como un modelo de pantalla vascular dEl enfoque experimental descrito aquí podría combinarse con experimentos de perturbación farmacológica y utilizarse como plataforma de cribado para encontrar fármacos que aumenten o inhiban la angiogénesis.
Los vasos sanguíneos se pueden visualizar mediante herramientas genéticas, así como por los métodos de etiquetado basados en colorantes descritos aquí. Por ejemplo, Xenopus transgénico 15 o pez cebra 16 que expresan proteínas de fluorescencia bajo el control de los promotores específicos de tipo celular permiten la imagen en vivo de la sangre y los vasos linfáticos, e incluso es posible discriminar las arterias de las venas [ 16] . Aunque los enfoques genéticos son superiores y generan una eficiencia de etiquetado más consistente, los métodos basados en colorantes son fácilmente accesibles a la mayoría de los laboratorios sin acceso a esos animales modificados genéticamente. En Xenopus , la perfusión transcardial de DiI-AcLDL da como resultado laEtiquetado de la mayoría de las células endoteliales 4 , y las arterias y las venas no se distinguen en las imágenes de fluorescencia. Intrigantemente, la lectina-fluoresceína de tomate selectivamente etiquetas arterias en ratones, y cuando co-inyectado con DiI-AcLDL, las arterias y las venas pueden ser discriminados [ 17] . Aunque la aplicación no se probó en otros tejidos o animales, esto proporciona una dirección prometedora para investigar el desarrollo dinámico de arterias y venas en Xenopus .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio se inspiró en el trabajo de Levine et al. , Que describió este método experimental y proporcionó una descripción completa del desarrollo vascular en Xenopus laevis. Damos las gracias a los miembros de nuestro laboratorio por su aporte. Este estudio fue apoyado por la Iniciativa de Investigación Futura de la Universidad de Yonsei de 2015 (2015-22-0095) y el Programa de Desarrollo de Tecnología Biológica y Médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el ministerio de Ciencia, TIC y Planificación del Futuro NRF - 2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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