Summary
Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.
Abstract
Kan damarları vücuda oksijen ve besin sağlarlar ve vasküler ağ oluşumu sıkı gelişim kontrolü altındadır. Kan damarlarının etkili in vivo görselleştirilmesi ve karmaşıklığının güvenilir bir şekilde ölçülmesi, damar şebekesinin biyolojisi ve hastalığını anlamanın anahtarıdır. Burada, piyasada bulunan bir flüoresan boya, insan plazması asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein DiI kompleksi (DiI-AcLDL) ile kan damarlarını görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını ölçmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz . Kan damarları, bir embriyonun atan kalbine basit bir DiI-AcLDL enjeksiyonuyla etiketlenebilir ve tüm embriyo içindeki kan damarları canlı veya sabit embriyolarda görüntülenebilir. Nükleik asitlerin hedeflenen mikroenjeksiyonu ve / veya farmakolojik reaktiflerin banyo uygulaması ile gen pertürbasyonuyla kombine edildiğinde, bir genin veya sinyal yolunun vasküler gelişim üzerindeki rolleri inve edilebilirSofistike genetik mühendisliğe tabi tutulmuş hayvanlara başvurmadan bir hafta içinde denendi. Xenopus'un iyi tanımlanmış venöz sistemi ve stereotipik anjiyojenezinden dolayı, var olan damarların filizlenmesi, karmaşıklık, pertürbasyon deneylerinden sonra verimli bir şekilde nicelleştirilebilir. Bu nispeten basit protokol, çeşitli kardiyovasküler araştırmalarda kolay erişilebilir bir araç olarak kullanılmalıdır.
Introduction
Vaskülojenez, yeni doğan endotel hücrelerinden yeni kan damarlarının oluşumu ve önceden var olan damarlardan yeni damarların oluşumu olan anjiyogenez, embriyonik vaskülatürü şekillendiren iki ayrı süreçtir 1 . Bu işlemlerdeki herhangi bir düzensizlik, çeşitli kalp hastalıklarına ve damarların yapısal anormalliklerine neden olur. Dahası, tümör büyümesi, kontrolsüz damar büyümesi ile ilişkilidir. Bu nedenle, vaskülojenezin ve anjiyogenezinin altında yatan moleküler mekanizmalar yoğun araştırma konusudır 2 .
Xenopus ve zebra balığı çeşitli nedenlerle vaskülogenez ve anjiyogenez çalışmaları için cazip omurgalı modelleridir. Birincisi, embriyoları küçüktür; Bu nedenle, tüm vaskülatürün görüntüsünü görmek nispeten kolaydır. İkincisi, embriyonik gelişme hızlıdır; Tüm vaskülatürün gelişmesi yalnızca birkaç gün alır, bu süre boyunca gelişmekte olan vaskül Resimlenebilir. Üçüncü olarak, gelişmekte olan embriyoya antisens morfolino nükleotidlerinin (MO'lar) mikroenjeksiyon veya ilaçlar 3 , 4 , 5'in banyo uygulaması yoluyla uygulanması gibi, damar oluşumu öncesi ve sırasında genetik ve farmakolojik müdahalelerin gerçekleştirilmesi kolaydır.
Xenopus'un zebra balığı üzerindeki benzersiz avantajı, Xenopus'un stereotipik holoblastik bölünmeleri izlemesi ve embriyonik kader haritasının iyi tanımlanmış olması nedeniyle 6 embriyolojik manipülasyonların gerçekleştirilebilmesidir. Örneğin, iki hücreli evredeki bir hücrede bir antisense MO enjekte edilerek yalnızca bir yanal bölgenin genetik olarak manipüle edildiği bir embriyo üretmek mümkündür. Kalbin primordiumun bir embriyodan diğerine nakledilmesi, genin işlevini hücre içi veya ekstrensek mekanizma ile uygulayıp uygulamadığını belirlemek de mümkündürAss = "xref"> 7. Bu teknikler çoğunlukla allotetraploid olan ve bu nedenle genetik araştırmalar için ideal olmayan Xenopus laevis'de geliştirilmiş olmakla birlikte , yakından ilişkili bir diploid tür olan Xenopus tropikalis'e doğrudan uygulanabilirler8 .
Canlı bir Xenopus embriyosunda vaskülatürün görselleştirilmesinin bir yolu, kan damarlarını etiketlemek için bir flüoresan boya enjekte etmektir. DiI gibi bir floresan molekülü ile etiketlenmiş asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (AcLDL) çok yararlı bir probdur. Asetilasid LDL'nin aksine, AcLDL LDL reseptörüne 9 bağlamaz, ancak makrofajlar ve endotel hücreleri tarafından endositize edilir. Canlı bir hayvanın kalbine DiI-AcLDL enjeksiyonu, endotel hücrelerinin spesifik flüoresan etiketlenişiyle sonuçlanır ve tüm vaskülatür, canlı veya sabit embriyoların flüoresan mikroskopisi ile görüntülenebilir.
İşte biz presXenopus tropikalis'teki DiI -AcLDL'yi kullanarak kan damarlarının görüntülenmesi ve nicelenmesi için ayrıntılı protokoller ( Şekil 1 ). Başarılı ve başarısız deney örnekleri ile önemli pratik noktalar sağlarız. Buna ek olarak, vasküler ağın şekillendirilmesinde genetik ve çevresel faktörlerin etkilerini değerlendirmede yararlı olabilecek, vasküler kompleksitenin kantitatif analizi için basit bir yöntem sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan protokollerle uyumludur.
1. Xenopus tropicalis Embriyolarının Hazırlanması
NOT: Xenopus tropicalis embriyoları daha önce tarif edildiği gibi 10 hafif bir değişiklikle üretilmiştir. Xenopus tropicalis embriyoları , Nieuwkoop ve Faber 11'in tablolarına göre sahnelendi.
- Yumurtlamayı indüksiyon
- Eşleştirme gününden önceki gün bir çift kurbağanın (bir erkek ve bir bayan) dorsal lenf kesesine insan koryonik gonadotropin (hCG) enjekte etmek için pre-prime uygulayın. Dişi kurbağa başına 20 birim ve erkek başına 10 birim enjekte edin. Evde bir erkek ve bir kadın aynı tankta gece boyunca (18 saatten fazla süreyle) evde bırakın.
- Ertesi gün, ön-astarlanmış dişi 200 ünite hCG ve ön-astarlanmış 100 ünite hCG enjekte edinerkek; Astarlanan kadın yaklaşık 3 saat içinde yumurta bırakmaya başlayacak ve gün boyunca bunu yapmaya devam edecektir. Erkek ve dişi çiftleri doğal çiftleşme için veya in vitro fertilizasyon için ayrı tanklarda (adım 1.2) tutun.
- dölleme
NOT: Yumurtalar doğal çiftleşme veya in vitro fertilizasyon ile döllenir. Doğal çiftleşmede, yumurtalar serildikçe döllenir ve bu nedenle döllenme zamanlaması kontrol edilemez. Alternatif olarak, astarlanmış bir dişi kurbağa ayrı bir depoda barındırabilir ve aynı zamanda döllenmiş yüzlerce embriyo üreten in vitro fertilizasyon için verimsiz yumurta toplanabilir. Bu yaklaşım, blastomer hedefli mikroenjeksiyon damar etiketlemeden önce gerçekleştirildiğinde yararlıdır. Ancak bu yaklaşımda bir erkek kurban edilir.- Doğal çiftleşme
- Astarlanmış dişi ve erkek çifti aynı tankta bırakın. Erkek fEmale, bırakılan yumurtaların derhal döllenmesine yol açar. Yumurtaları bir cam veya plastik pipetle toplayın ve bir Petri kabına aktarın. Yumurtaların pipete yapışmasını önlemek için, pipetin iç yüzeyini% 0.5 sığır serumu albumin (BSA) ile kaplayın.
- In vitro fertilizasyon (IVF)
- Astarlandıktan sonra astarlanmış dişi erkeğinden ayrılmalıdır. Kadın yaklaşık 3 saat içinde kendiliğinden yumurta bırakmaya başlar. BSA kaplı bir pipet kullanarak birer tane koyulmuş yumurtayı bir Petri kabına aktarın ve mikroskop altında kalitelerini kontrol edin. Sağlıklı yumurtalar (berrak pigment, elastik top şeklinde) atılırsa, astarlı erkekten testisleri ayırmaya hazır olun.
- Ötenazi için% 0.4 Tricaine metansülfonat (MS222) yapın ve astarlı erkek dorsal lenf bezi içine 300 μL enjekte edin. Yaklaşık 10 dakika sonra erkek denge duygusunu kaybedecek ve ayakta kalacaktır; Erkeklerin bir arka bacağını bir tutarak euthanize olduklarını onaylayınKünt forseps çifti ve yanıt gözlemlemek.
- İki testisin parçalarını temizleyin, tüysüz kağıda hızlı bir şekilde dokundurarak temizleyin ve 1 mL% 60 Leibovitz'in L-15 Medium (% 60) içeren% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte bir mikro tüp içine aktarın; Ayrıntılı bir prosedür, başka yerde 10'da anlatılmıştır.
- Testisleri sperm elde etmek için yavaş yavaş bir havanla kestirin. Bu konsantrasyonda ( yani, % 60 L-15'de 1 mL% 10 FBS'de 2 testis) birkaç damla testis solüsyonu (0.1 mL) yaklaşık üç yüz yumurta dölleyebilmektedir. Kalan sperm sıkıca kapatılmış bir tüp içerisinde 4 ° C'de saklanabilir ve ertesi gün IVF için kullanılabilir.
- Dişi yumurtaları küçük bir Petri kabına sıkıştırın. Dişi üst kısmını avuç içine ters olarak tutun ve işaret parmağını arka ayakları arasına koyun. Arka bacaklarını işaret parmağı ile, diğer elinizle yayarak ortaya çıkın. Petri kabına girmek için dokunun. Coat tO IVF sırasında yumurta tek bir kat olarak eşit dağıtmak için% 0.5 BSA ile Petri tabağı.
- Yumurtalara birkaç damla (0.1 mL) sperm içeren L-15 ortam ekleyin. Eşzamanlı dölleme için, sperm solüsyonunu çanakta hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 4 dakika sonra, Petri kabını 0.01x Modifiye Barth's Saline (MBS) ile doldurun, 10 dakika inkübe edin ve çözeltiyi 0.1x MBS ile değiştirin. Döllenmiş yumurtalar oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat içinde ilk bölünmeye uğrayacaklardır. 1x MBS, 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 2.5 mM NaHC03, 5 mM HEPES, 1 mM MgS04 ve 0.7 mM CaCl2, pH 7.5'tir.
- Doğal çiftleşme
- (İsteğe bağlı) Antisens morfolino oligonükleotidleri (MO'lar) ve / veya mRNA'ların enjeksiyonu
- İlgili bir genin damar oluşumu üzerine etkisini araştırmak için antisense MO ve / veya mRNA'ların mikroenjeksiyonunu gerçekleştirin.
- Bu tür deneyler için, yumurtaları 1x MBS'de (pH 7.5-7.8)% 2 L-sistein ile de jölleyin.1x MBS'de% 2 L-sistein ile döllenmiş embriyoları içeren çanakta 0.1x MBS'yi değiştirin. Çözümü karıştırmak için çanağı yavaşça döndürün.
NOT: Embriyoların jel haline getirilmesi genellikle yaklaşık 5 dakika alır. Bu adım esnasında, yumurtaları çözeltiye aşırı maruz kalmamalarını sağlamak için sık sık izleyin. Yumurtalara aşırı maruz kaldıklarında elastikiyetlerini kaybederler ve yassılaşırlar ve bu da anormal gelişim ve ölümcüllük yaratır. - Jöle silinmiş yumurtaları 0.1x MBS ile beş kez yıkayın. 0.1x MBS'de çözünmüş% 4 Ficoll içinde mikroenjeksiyon uygulayın. Tipik olarak, iki hücreli evrede blastom başına 4 ng MO ve 600 pg mRNA enjekte edin. Embriyonun sadece bir tarafında gen ekspresyonunu manipüle etmek için bir hücreye enjekte edin. Kontrol olarak aynı embriyonun enjekte edilmemiş tarafını kullanın.
- Gen manipülasyonunun özgüllüğü için bir başka kontrol olarak, aynı miktarda bir kontrol MO (CoMO) veya kontrol mRNA'yı ( örneğin, beta-galaktosidaz mRNA) enjekte edin. CoMO aynı m'ye sahip olmalıdırOleole ağırlık olarak gen-spesifik MO'dır ve Xenopus genomundaki herhangi bir geni hedef almamalıdır. Enjekte edilen tarafın kolay görselleştirilmesi için floresan etiketli MO kullanın veya bir izleyici birlikte uygulayın ( ör. EGFP mRNA).
- Enjekte edilen embriyoları 2 saat boyunca% 4 Ficoll'a bırakın ve sonra bunları 0.1x MBS ile dolu yeni bir 60 mm Petri kabına aktarın.
- Yükselen
- Embriyoları 23 ° C'de kaldırın. Gelişme hızı sırasıyla 23 ° C'nin (aralık: 16-26 ° C) altındaki sıcaklıklarda veya yavaşlatıldığında hızlanabilirken, 23 ° C sıcaklıkta yükseltilmesi önerilir.
- (İsteğe bağlı) Farmakolojik reaktiflerle işleme
- Farmakolojik manipülasyonlar için, gelişen embriyolara banyo uygulamasıyla ilaçlar verin.
2. DiI-AcLDL Enjeksiyonunun Hazırlanması
- Standart mikr kullanarak inceltici bir cam pipet yapınOpipet çektirme makinesi. Mikro pipet çekiciye bir borosilikat cam tüp yerleştirin ve aşağıdaki ayarları kullanın: basınç, 200; Isı, 30; Çekin, 30; Hız, 120; Zaman, 200.
- DiI-AcLDL stok solüsyonunu 4 ° C'de saklayın. Enjeksiyon çözeltisinin üst kısmını temizleyin, ancak tüpün altındaki çökelmiş partikülleri atmayın. Cam pipet içindeki herhangi bir pislik çözeltinin doğru bir şekilde boşaltılmasına engel olacaktır.
- Hazırlanan cam pipeti, bir mikro yükleyici kullanarak uygun miktarda DiI-AcLDL çözeltisi (~ 5 μL) ile doldurun.
- İnce bir forseps çifti (numara 55) kullanarak cam pipetin ucundan kük çıkartın. Basınç kontrollü enjeksiyon sistemini bir seferde yaklaşık 5 nL solüsyonun atılması için ayarlayın; 50-60 nL DiI-AcLDL çözeltisi bir embriyo damarlarını lekelemek için yeterlidir.
- Kurumayı önlemek için DiI-AcLDL yüklü pipetini havaya uzun süre bırakmayınız. Pipetin ucunu% 0,04'lük MS'ye batırın222 0.1X MBS çözümü. Embriyonun içine enjekte etmeden önce (adım 4.2.1), aynı miktarda boya çıkıp çıkmadığını kontrol edin.
3. Enjeksiyon Ayarı
- Sylgard kalıp
- Küçük bir Sylgard kalıbı hazırlamak için, Sylgard tabanı ve sertleştirici ajanı 10 ila 1 ağırlık oranında karıştırın. Karışık çözeltiyle küçük bir Petri kabının (35 mm veya 60 mm bulaşıklık) yaklaşık yarısını doldurun ve yaklaşık olarak katılaşması için bırakın 48 saat oda sıcaklığında.
- Anestezi
- Anestezi için 1x MBS'de (pH 7.5-8.0) 0.04% MS222 kullanın. Uzun anestezi gerektiğinde ( örneğin canlı görüntüleme sırasında), ozmotik dengesizliği azaltmak için 0.1x MBS'de% 0.04 MS222 kullanın. PH'ı ayarlamak için birkaç damla NaOH (~ 20 μL) ilave edin ve pH kağıdını kullanarak pH değerini kontrol edin.
- Aktarılan embriyoların hareketi durana kadar bekleyin. Embriyoların dorsal yüzgeçlerine dokunun ve bunların tamamlandığını onaylamak için yanıt verip vermediğini kontrol edinnesthesia.
- Enjeksiyonluk embriyoların konumlandırılması
- Sertleştirilmiş Sylgard kalıbın yüzeyini ince ve keskin bir bıçakla girinti yapın. Embriyoların yerleştirileceği V-şeklinde içbükey girinti yapın (bkz. Şekil 2D ). Anestezi uygulanmış bir embriyo, ventral yüz yukarı eğik olarak (yaklaşık 30 °) yerleştirin ( Şekil 2D ).
- Kalıbı MS222 solüsyonuyla doldurun ve embriyoları kalıba yerleştirin.
4. DiI-ACLDL Enjeksiyonu
- Kalbin üstünde cilt insizyonu
- Kalbi çevreleyen cildi kesmek için iki iğne hazırlayın (Minutiens, 0.10 mm). Her iğneyi bir iğ tutucuya sıkıca sabitleyin; Titreşirken kalp kolayca tanınabilir olmalıdır ( Şekil 2A-2C , pembe).
- Bir iğne ile bir embriyo cildi delin. İğneyi, kalp ve cilt arasındaki boşluğun deliğinden geçirin ( Şekil 2C
- Deri dışına tutulan diğer pimi, sokulan pime nazikçe ovarak doğrusal bir kesik açın. Bu kesiyi iki pimle hafifçe genişletin, kalbi ortaya çıkarın ( Şekil 2B ' ve 2D' , ok). DiI-AcLDL ile yüklenen pipet doğrudan kalbe yaklaşabilir ( Şekil 2D ' ).
- Enjeksiyon
- Yüklenen cam pipetin ucunu kalbe yerleştirin ve yaklaşık 10 emisyon atımında 50-60 nL DiI-AcLDL solüsyonu enjekte edin. Aşırı miktarda solüsyonu enjekte etmeyin, çünkü kalp rüptürüne neden olur. Enjeksiyondan sonra kalbin atmaya devam edip etmediğini kontrol edin. Her enjeksiyondan sonra, aynı miktarda DiI-AcLDL'nin atılıp çıkarılmadığını kontrol edin; Aksi halde, pipetin ucu bloke olabilir (bkz. Adım 2.5).
- Enjekte edilen embriyoları toparlanma için 0.1x MBS ile dolu yeni bir Petri kabına aktarın. 5-10 dakika sonra tadpoles bilinç kazanmalı ve hareket etmeye başlamalıdır. Şu anda, etiketli gemiler görüntülenebilir. Embriyoların floresan mikroskop altında başarıyla etiketlendiği görsel olarak taranması önerilir ( Şekil 3A ve 3B ). Bir embriyoya yeterli miktarda DiI-AcLDL enjekte edilmezse tekrar enjekte edilebilir ( Şekil 3C ).
- Etiketli diğer organları olan tadpoles'u atın ( Şekil 3D ). Gereken sayıda embriyo elde edilene kadar devam edin.
- Kan damarlarının daha ayrıntılı olarak görüntülenmesi için, konfokal mikroskopi kullanın; Konfokal mikroskopi için işaretlenmiş embriyoları düzeltmek daha kolay olabilir. İlk önce 1x MB'de% 0.04'lük MS222'de işaretlenmiş embriyoları anestezi edinS (pH 7.5-8.0) ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde% 4 paraformaldehid içinde sabitleyin. Sabit embriyolar birkaç gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir; Enjekte edilen numuneleri, DiI'in ışığa maruz kalmamak için ışığa karşı koruyun.
5. DiI-AcLDL'nin görüntülenmesi
- Stereoskopik görüntüleme
- Vasculature genel morfolojisini değerlendirmek için bir fluoresans stereoskopik mikroskop ( Şekil 3 ) altında fotoğraf çekin.
- Sabit embriyolar için 1x PBS'de% 1 agaroz eritin veya canlı görüntüleme için 1x MBS'de eritin. Bir Petri kabına eritilmiş agaroz dökün ve katılaşıncaya kadar bekleyin. Agaroz jelinin yan tarafında yatarken imgelenecek embriyonun sığacağı sığ bir girinti yapın. Çanağı tamponla doldurun (anestezi uygulanmış embriyolar için MS222 çözeltisi veya sabit embriyolar için 1x PBS).
- Floresan mikroskobu (Rhodamine filtresit);
- DiI, rodamin veya spektral ilgili fluoroforlar için standart bir filtre seti kullanarak (maksimum 554 nm'de uyarma ve 571 nm'de emisyon) yeşil-uyarılan ve kırmızı yayan bir boya görüntüsüdür. Enjekte edilen embriyoları agaroz kalıbındaki girintilere yerleştirin ve fotoğraf çekin ( Şekil 3 ).
- Konfokal mikroskobi
NOT: Vasküler mimariyi daha yakından incelemek için konfokal mikroskopi kullanın.- Ters bir mikroskop kullanılıyorsa, embriyoları cam altı bir tabağa yerleştirin. Birkaç damla 1x PBS ekleyin ve üstüne bir kapak kayışı yerleştirerek onları hareketsiz hale getirin. Fazla PBS'yi çıkarın. Canlı embriyolar görüntülenecekse, anestezi uygulanmış embriyolar kullanın ve PBS yerine 0.1x MBS'de% 0.015 MS222 kullanın.
- Düşük büyütmeli görüntüleme için ilgi alanını bulmak için 4X - 10X arasında bir hedef kullanın; Posterior Kardinal Ven'in (PCV) rostral kısmı, gelişimsel anjiyogenezi araştırmak için yararlı bir bölge (Şekil 4, kesiklikutular).
- Kırmızı bir emisyon floroforu (Rhodamine gibi) için edinme ayarı kullanın.
- Bir embriyonun yanal yarısını görüntüleyerek z-yığılmış görüntüler yapın. Önce, objektifin yan tarafındaki PCV'ye odaklanın ve objektifin en yakınındaki kapların odaklandığı konumdaki odakın alt sınırını ayarlayın. Üst sınırı, PCV'nin görüntüleneceği medial bölümünün odaklanabileceği konuma ayarlayın. Embriyonun tüm yan yarısını görüntüleyin. Gemi uzunluklarını hesaplamak için gerekli olduğu gibi x, y ve z ölçekleri gibi satın alma ayarlarındaki meta verilerini depolayan yazılımları kullanın.
- Gerekirse, bir embriyonun tüm damar yapısını görüntülemek için karo tarama modunu kullanın. Ampirik olarak yatay ve dikey döşeme sayısını belirler.
- Yüksek büyütmeli görüntüleme için, PCV'nin rostral bölümünü ve 4 rostral en intersomitik venleri (ISV'ler) imge için yukarıdaki prosedürleri izleyin ( Şekil 4 ,Kesikli kutu). İstiflerin sayısını (z yığını) ve fayansları (fayans tarama) uygun şekilde ayarlayın.
6. DiI-etiketli gemilerin miktarının tespiti
NOT: DiI etiketli kaplar el ile veya yazılım kullanılarak izlenebilir. Kan damarları ve nevritler gibi tüp benzeri yapıların yarı otomatik olarak izlenmesine izin veren ücretsiz bir ImageJ (NIH) eklentisi olan "Basit nevrit tracer" kullanıyoruz 12 . Bu özgür yazılım kullanılarak aşağıdaki parametreler hesaplanabilir. Bu yazılımın kullanımı için ayrıntılı bir prosedür, başka yerlerde (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) açıklanmıştır 12 . Aşağıda, Tie2 sinyalinin inhibe edildiği veya çoğaltıldığı embriyoların vaskülatür örneklerini kullanıyoruz ( Şekil 4A-4C ). Antisens Tie2MO enjekte edilen embriyolar, anjiyogenezi düşürür ve ISV'leri kısaltır ( Şekil 4B ), oysa yapısal olarak aktif Tie2'nin birlikte enjeksiyonuMutant mRNA (caTie2 mRNA), bu fenotipi kurtararak aşırı derecede ISV dalları oluşturur ( Şekil 4C ).
- ISV uzunlukları
- Basit nevrit tracer'ı kullanarak, izlenen her gemi uzunluğunu hesaplayın. 4 rostral en ISV'lerin uzunluklarını hesaplayın.
- ISV şubeleri
NOT: Vahşi embriyolarda, sahnede 42 rostral en ISV'lerden sadece birkaç kısa dallar filizlenir.- Basit nevrit tracer'da, bu küçük damarları, birincil dalı oluşturduğu ISV'yi yaptıktan sonra izleyin. Bu dalların ISV'lerden kaynaklanan aşağıdaki parametrelerini hesaplayın.
- Toplam şube sayısı
- Tüm ISV'ler ve ilişkili dallar izlandıktan sonra toplam dal sayısını hesaplayın ( Şekil 5B-5D ).
- Şube siparişi
- Simple neurite tracer, her dalın sırasını kaydettiğinden ( Şekil 5A ), calculatE her sipariş için şube sayısı. Vahşi tipli embriyolardaki damarların çoğunluğu birincil dallar olmalıdır ( yani ISV'ler).
- Damar kompleksite indeksi (VCI)
- VCI, yüksek dereceli dallara daha fazla ağırlık veren, karmaşıklık için yararlı bir parametredir, Şekil 5A'daki formülü kullanarak her embriyo için VCI'yi hesaplayın. Örneğin, Tie2MO enjekte edilen embriyolar, kontrol ( Şekil 5B ve 5C ) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir VCI'ye sahiptir ve caTie2 mRNA enjekte edilen embriyoların daha yüksek bir VCI'ye sahiptir ( Şekil 5D ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneylerin zaman çizelgesi (Şekiller 1 ve 2)
Döllenmeden kısa bir süre sonra, gen ekspresyonunu modüle etmek için hedeflenmiş mikroenjeksiyon yapılabilir. Örneğin, endojen Tie2 mRNA'nın başlatma kodonuna spesifik olarak bağlanan bir antisense MO, enjekte edilebilmekte ve Tie2 hedef mRNA'sının translasyonunu sterik engelleyerek inhibe edebilmektedir. Bir MO, başarıyla enjekte edilen embriyoların kolay görsel taramaları için fluoresceine konjuge edilebilir. Alternatif olarak, bir izleyici mRNA ( örn., EGFP'yi kodlayan mRNA) MO ile birlikte enjekte edilebilir. Ek olarak, uyuşturucular kuluçka yapıldıktan sonra banyo uygulaması ile tedavi edilebilir (erken tailbud evresi, NF evre 26 civarında). İlaç 0.1x MBS'de eritilir ve embriyonlara eklenir. Daha önceki tedaviler için, embriyolar bir çift forsepsle zarlardan kurtarılabilir. Damar şekli dinamiğini araştırmak için 33/34 evre etrafındaki kalbe Di-AcLDL enjekte edilebilirAncak, tipik olarak evre 37/38 veya sonrasında enjekte edilir ( Şekil 2 , renkli bölgeler).
Başarılı ve başarısız enjeksiyonların tipik örnekleri (adım 4.3) (Şekil 3)
Stereoskopik görüntüleme görsel tarama için uygundur. Yeterli miktarda DiI-AcLDL kalbe enjekte edilirse, PCV, flüoresan stereoskop altında hemen görülmelidir ( Şekil 3A ve 3B ). Yetersiz veya yanlış enjekte edilmiş embriyoların belirlenmesi kolaydır ( Şekil 3C ve 3D ). Yetersiz miktarda DiI-AcLDL'ye sahip embriyo ( Şekil 3C ), damarlar açıkça görünene kadar aynı boya enjekte edilebilir. Görüntü, embriyoları konfokal mikroskop altında, canlı veya sabitlemeden başarıyla enjekte etti.
Posteri geliştirmeVeya kardinal ven (PCV) ve intersomitik damarlar (ISV'ler)
PCV, rostalden kaudal yönde uzanır ve bu uzantı evre 37/38 civarında sona erer. ISV'ler PCV'den ön-arka dalgada dorsal olarak ortaya çıkar. Bu ISV oluşumu 36. evrede başlar ve 40/41 evre civarında sona erer; ISV'ler büyümeye devam eder ve evre 43'e kadar hafif dallara dönüşür ( Şekil 3A ve 3B ).
Tie2 sinyallemesi gelişimsel ISV dallanmasını kontrol eder (Şekil 4)
PCV ve ISV kalıplaşmış bir biçimde büyüyor ve gelişimi sıkı kontrol altındadır ( Şekil 4A ). PCV'den ISV'lerin oluşumu anjiyogenez olarak tanımlanabilir ve bu nedenle anjiyogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için yararlı bir modeldir. Son çalışma şovumuzun sonucunu sunmaktayızBu gelişme sinyalleri ISV'lerdeki Tie2 sinyallemesini engelleyerek dallanmalarını sınırlar 5 . Antisense MO ile Tie2 sinyalinin indirilmesi, ISV'lerin uzunluğunu ve karmaşıklığını azaltır (Şekil 4B) ve Tie2'nin (caTie2) yapıcı aktif formunu ifade etmek, aşırı ISV dallanmasına neden olur ( Şekil 4C ).
ISV karmaşıklığının niceleştirilmesi (Şekil 5)
ISV'lerin uzunluklarına ve kol numaralarına ek olarak, "karın kompleksitesi endeksi" (VCI) karmaşıklığını değerlendirmek için hesaplanabilir ( Şekil 5A ). Koher-Cory ve meslektaşları tarafından geliştirilen ve nöronal aksonal veya dendritik birliklerin karmaşıklığını ölçmek için tasarlanan "karmaşıklık indeksini" 13 kabul ettik. Bu endekste, daha yüksek dereceli dallara sahip bir embriyo, aynı sayıda toplam kepek içeren bir embriyoya kıyasla daha yüksek bir puan almaktadırSatranç ama daha alçak dereceli dallarla. Bu nedenle, daha yüksek bir VCI, bu embriyonun daha karmaşık bir venöz ağı olduğunu gösterir. "Simple neurite tracer", şubelerin sırasını ve uzunluğunu takip etmek için kullanışlı bir yazılımdır. Vaskülatürün genel mimarisini görselleştirmek için yararlı bir yol olan "işlenmiş yollar" oluşturmak da mümkündür ( Şekil 5B-5D , sağ paneller).
Şekil 1: Deneylerin zaman çizelgesi. Döllenme gününde, morpholinos (MO), DNA, RNA veya protein, NF evre 1 (st1) veya 2 (st2) döllenmiş yumurtalara enjekte edilebilir. St2 de sadece bir blastoma enjekte edilirse, enjekte edilen reaktif sadece bir yanal yan etkiler. Enjeksiyon yapılmamış taraf bir kontrol olarak kullanılabilir. Enjekte edilen tarafı belirlemek için bir izleyici ( örn., EGFP mRNA) birlikte uygulayın. İkinci gün, ea(~ St24) embriyolar, banyo uygulamayla farmakolojik reaktiflerle muamele edilebilir. Kalp, üçüncü günde açıkça görülür. DiI-AcLDL kalbe enjekte edilebilir ve enjeksiyondan kısa bir süre sonra kan damarları görüntülenebilir. Geminin büyümesini veya st42 embriyolarının dinamiklerini, tamamen gelişmiş damarları imgelemek için st33-37 embriyolar kullanın. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: St42'deki DiI-AcLDL enjeksiyonunun yeri. Evre 42 embriyonun lateral ( AB ' ) ve ventral ( CD ) görüntüleri. Kalp, Xenbase'den çekilen görüntülerde (www.xenbase.org) AC renkte pembeye boyanmıştır. Temsilci stereoskopik görüntüler A ' ,
Şekil 3: Beklenen sonuçlar (stereoskopik görüntüler). Evre 37/38 ( A ) ve evre 42 ( B ) embriyolarından temsilci floresans görüntüleri. Embriyoların sol tarafları gösterilir. Posterior Kardinal Ven (PCV), intersomitik venlerin (ISV) dorsal olarak bir rostral-kaudal dalga dalgalanmasından kaudal olarak uzanıre. Sadece rostral ISV'ler evre 37/38 ( A ) 'da görülebilir ve çoğu İSV evre 42 ( B ) tarafından oluşturulmuştur. Yeterli miktarda DiI-AcLDL enjekte edilmezse, 30 dakika sonra bile PCV net olarak görünmez ( C ). Bu durumda, daha fazla DiI-AcLDL enjekte edilebilir. DiI-AcLDL yanlışlıkla diğer organlara ( D ) enjekte edilirse, embriyoları atın. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: ISV gelişimi üzerine Tie2 sinyalizasyonunun etkileri. Tie2 geni ifadesi, blastomere translasyon engelleyici antisens morfolino oligonükleotidlerin (Tie2MO) enjeksiyonu ile yok edildi. Kontrol morfolino (CoMO) aynı molekül ağırlığına sahiptir, ancak nXenopus tropicalis'teki herhangi bir geni hedefleyin . MRNA kodlayan yapısal olarak aktif Tie2 mutantı (caTie2), Tie2 knockdown fenotipinin kurtarılması için birlikte enjekte edildi. Kontrol ( A ) 'nın aksine, Tie2MO enjeksiyonu, ISV'lerin uzunluğunu ve sayısını ( B ) dramatik bir şekilde düşürdü. Bu fenotip, kabarık kollateral dalları olan ISV'leri gösteren (2) caTie2 ile aşırı kurtarıldı. Mavi kesikli kutularla gösterilen bölgelerdeki ISV'lerin karmaşıklığı Şekil 5'de nicelenmiştir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Damar karmaşıklığının nicelleştirilmesi. ( A ) ISV'nin karmaşıklığı damar karmaşıklığı indeksi (VCI) ile gösterilebilir.( BD ) VCI'ler, Şekil 4'te gösterilen embriyolar arasından hesaplandı. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol ilk olarak Xenopus laevis 4'te vasküler oluşum sırasında gelişme olaylarını araştırmak için Ali H. Brivanlou ve arkadaşları tarafından geliştirildi, ancak bu el yazmasında gösterildiği gibi diğer küçük hayvanlara uygulanabilir. Kalbe boya enjeksiyonu gerçekleştirmek kolaydır ve tüm vasküler ağ, bir floresan diseksiyon mikroskopu altında bir konfokal mikroskop altında görüntülenebilir. Boya damar gelişiminde kalbe enjekte edilirse, damar büyümesinin ve dallanmanın dinamikleri gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir 4 . İyi tanımlanmış venöz ağı, özellikle de PCV ve rostral-en ISV'leri kullanarak genetik veya çevresel pertürbasyonun anjiyogenez üzerindeki etkileri nicel olarak değerlendirilebilir.
Bu protokolde en kritik adım DiI-AcLDL enjeksiyonudur (4. adım). Başarılı ve başarısız enjeksiyon örneklerini sunuyoruz ( FiGure 3). Başarıyla enjekte edilen embriyolar, adım 4.3'te açıklandığı gibi bir flüoresans mikroskopu altında taranmalıdır. Enjeksiyondan 30 dakika sonra PCV görünür değilse, yeterli DiI-AcLDL enjekte edilmez ( Şekil 3C ). Başarısız bir şekilde enjekte edilen embriyolar anestezi altına alınabilir ve tekrar enjekte edilebilir. Bazı durumlarda, DiI-AcLDL yanlış organlara enjekte edilebilir ve bu durumda diğer organlar etiketlenecektir ( Şekil 3D ). Yanlışlıkla enjekte edilen embriyoları atın.
Başarıyla enjekte edilen embriyo kan damarları, enjeksiyondan kısa bir süre sonra görülecektir ve floresan birkaç saat sürer. Bu nedenle, enjeksiyon ISV'lerin oluşumundan önce gerçekleştirilirse, gelişimleri canlı bir embriyo içinde görüntülenebilir ve böylece kardiyovasküler sistemin gerçek zamanlı ve canlı olarak gelişimini araştıran güçlü bir araç sağlanır 4 . Xenopus , vasküler dokuları taramak için bir model olarak başarıyla kullanıldığındanMemelilerde 14 bozucu ajanlar, burada açıklanan deneysel yaklaşım farmakolojik pertürbasyon deneyleri ile birleştirilebilir ve anjiyogenezi arttıran veya inhibe eden ilaçları bulmak için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.
Kan damarları, burada açıklanan boya tabanlı etiketleme yöntemlerinin yanı sıra genetik aletlerle de görselleştirilebilir. Örneğin, transjenik Xenopus 15 veya zebra balığı 16 , hücre tipine özgü hızlandırıcıların kontrolü altında flüoresan proteinlerini ifade eder, kan ve lenfatik damarların canlı görüntülemesini sağlar ve damarları damarlardan ayırt etmek 16 mümkündür. Genetik yaklaşımlar daha üstün olmasına ve daha tutarlı etiketleme etkinliği üretmesine rağmen, boya temelli yöntemlere, bu tür genetik olarak tasarlanmış hayvanlara erişmeksizin çoğu laboratuvarlar kolayca erişilebilir. Xenopus'ta, DiI-AcLDL'nin transkardiyal perfüzyonu,En endotel hücre 4'ün etiketlenmesi ve arterler ve damarlar, floresans görüntülerinde ayırt edilemez. İlginç olarak, domates lektin-floresein farelerde atardamarları seçici olarak farelerde etiketliyor ve DiI-AcLDL ile birlikte uygulandığında, arterler ve damarlar ayırdedilebilir 17 . Uygulama diğer dokularda veya hayvanlarda test edilmemesine rağmen, Xenopus'daki arter ve damarların dinamik gelişimini araştırmak için umut verici bir yön vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Levine ve ark.'nın eserlerinden esinlenmiştir. , Bu deneysel yöntemi açıkladı ve Xenopus laevis'teki vasküler gelişimin kapsamlı bir tanımını sağladı . Girişleri için laboratuvarımızın üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, 2015 Yonsei Üniversitesi'nin Geleceğin Öncü Araştırma Girişimi (2015-22- 0095) ve Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) Biyo ve Tıbbi Teknoloji Geliştirme Programı tarafından desteklenmektedir ( NMK-2013M3A9D5072551)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60 mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
