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Developmental Biology

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in doi: 10.3791/55652 Published: May 25, 2017

Summary

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Abstract

Blutgefäße liefern Sauerstoff und Nährstoffe im ganzen Körper, und die Bildung des Gefäßnetzes ist unter engen Entwicklungskontrolle. Die effiziente In-vivo- Visualisierung von Blutgefäßen und die zuverlässige Quantifizierung ihrer Komplexität sind der Schlüssel zum Verständnis der Biologie und der Erkrankung des Gefäßnetzes. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Verfügung, um Blutgefäße mit einem handelsüblichen Fluoreszenzfarbstoff, einem humanen Plasma acetylierten Diiplex (DiI-AcLDL) mit niedriger Dichte zu identifizieren und ihre Komplexität in Xenopus tropicalis zu quantifizieren . Blutgefäße können durch eine einfache Injektion von DiI-AcLDL in das schlagende Herz eines Embryos markiert werden, und Blutgefäße im gesamten Embryo können in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden. Kombiniert mit der Genstörung durch die gezielte Mikroinjektion von Nukleinsäuren und / oder die Badanwendung von pharmakologischen Reagenzien können die Rollen eines Gens oder eines Signalweges auf der Gefäßentwicklung auftretenStammte innerhalb einer Woche ohne Rückgriff auf anspruchsvolle gentechnisch veränderte Tiere. Wegen des wohldefinierten venösen Systems von Xenopus und seiner stereotypen Angiogenese kann das Keimen von bereits vorhandenen Gefäßen die Gefäßkomplexität nach Störungsexperimenten effizient quantifiziert werden. Dieses relativ einfache Protokoll sollte als ein leicht zugängliches Werkzeug in verschiedenen Bereichen der Herz-Kreislauf-Forschung dienen.

Introduction

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Die Vaskulogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus neugeborenen Endothelzellen und die Angiogenese, die Bildung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Gefäßen, sind zwei verschiedene Prozesse, die das embryonale Gefäßbild verändern. Jede Dysregulation in diesen Prozessen führt zu verschiedenen Herzerkrankungen und strukturellen Anomalien der Gefäße. Darüber hinaus ist das Tumorwachstum mit dem unkontrollierten Gefäßwachstum verbunden. Als solche sind molekulare Mechanismen, die der Vaskulogenese und der Angiogenese zugrunde liegen, Gegenstand intensiver Untersuchungen 2 .

Xenopus und Zebrafisch sind aus verschiedenen Gründen attraktive Wirbeltiermodelle für Vaskulogenese- und Angiogenese-Studien. Zuerst sind ihre Embryos klein; Daher ist es relativ einfach, die gesamte vaskulatur zu bildlich zu machen. Zweitens ist die embryonale Entwicklung schnell; Es dauert nur ein paar tage für das gesamte vasculature zu entwickeln, während welcher zeit das entwickelnde vaskul Ature kann abgebildet werden. Drittens sind genetische und pharmakologische Interventionen vor und während der Gefäßbildung leicht durchzuführen, wie durch die Mikroinjektion von Antisense-Morpholino-Nukleotiden (MOs) in den sich entwickelnden Embryo oder durch die Badanwendung der Medikamente 3 , 4 , 5 .

Der einmalige Vorteil von Xenopus über Zebrafisch ist, dass embryologische Manipulationen durchgeführt werden können, weil Xenopus stereotypen holoblastischen Spaltungen folgt und die embryonale Schicksalskarte gut definiert ist 6 . Beispielsweise ist es möglich, einen Embryo zu erzeugen, bei dem nur eine laterale Seite genetisch manipuliert wird, indem man ein Antisense-MO zu einer Zelle im Zweizellenstadium injiziert. Es ist auch möglich, das Herz-Primordium von einem Embryo zu einem anderen zu transplantieren, um zu bestimmen, ob das Gen seine Funktion durch einen zell-intrinsischen oder -extrinsischen Mechanismus ausübtAss = "xref"> 7 Obwohl diese Techniken meist in Xenopus laevis entwickelt wurden, das allotetraploid ist und daher nicht ideal für genetische Studien ist, können sie direkt auf Xenopus tropicalis angewendet werden , eine eng verwandte diploide Spezies 8 .

Eine Möglichkeit, die Vaskulatur in einem lebenden Xenopus- Embryo zu visualisieren, besteht darin, einen Fluoreszenzfarbstoff zu injizieren, um die Blutgefäße zu etikettieren. Acetyliertes Lipoprotein mit niedriger Dichte (AcLDL), das mit einem fluoreszierenden Molekül wie DiI markiert ist, ist eine sehr nützliche Sonde. Im Gegensatz zu nichtacetyliertem LDL bindet AcLDL nicht an den LDL-Rezeptor 9, sondern wird durch Makrophagen und Endothelzellen endozytiert. Die Injektion von DiI-AcLDL in das Herz eines lebenden Tieres führt zu einer spezifischen fluoreszierenden Markierung von Endothelzellen, und das gesamte Gefäßsystem kann durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden 4 .

Hier haben wir vorDetaillierte Protokolle für die Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßen mit DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Abbildung 1 ). Wir bieten wichtige praktische Punkte, mit Beispielen für erfolgreiche und erfolglose Experimente. Darüber hinaus bieten wir eine einfache Methode zur quantitativen Analyse der vaskulären Komplexität, die bei der Beurteilung der Auswirkungen von genetischen und umweltbedingten Faktoren auf die Formgebung des Gefäßnetzes nützlich sein könnte.

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Protocol

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Alle Experimente erfüllten die Protokolle, die von der Yonsei University College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt wurden.

1. Vorbereitung von Xenopus tropicalis Embryos

ANMERKUNG : Xenopus tropicalis Embryos wurden wie zuvor beschrieben 10 mit leichter Modifikation hergestellt. Xenopus tropicalis Embryos wurden nach den Tabellen von Nieuwkoop und Faber 11 inszeniert.

  1. Induktion des Eisprungs
    1. Zur Vorprime, injizieren menschliches Choriongonadotropin (hCG) in den dorsalen Lymphbeutel eines Paares von Fröschen (ein Mann und ein Weibchen) am Tag vor dem Tag der Paarung. Spritzen Sie 20 Einheiten pro weiblichen Frosch und 10 Einheiten pro Mann. Haus ein Mann und ein Weibchen im selben Tank über Nacht (für mehr als 18 Stunden).
    2. Zum Prime, am folgenden Tag, injizieren 200 Einheiten von hCG auf die vor-grundierte weibliche und 100 Einheiten von hCG auf die vor-grundiertmännlich; Die grundierte Frau wird beginnen, Eier in ca. 3 Stunden zu legen und wird auch weiterhin den ganzen Tag tun. Halten Sie das männliche und weibliche Paar zusammen für natürliche Paarung oder in separaten Tanks für In-vitro- Fertilisation (Schritt 1.2).
  2. Düngung
    HINWEIS: Eier können durch natürliche Paarung oder In-vitro- Fertilisation befruchtet werden. In der natürlichen Paarung werden die Eier befruchtet, während sie gelegt werden, und daher kann der Zeitpunkt der Befruchtung nicht kontrolliert werden. Alternativ kann ein grundierter weiblicher Frosch in einem separaten Tank untergebracht werden und unbefruchtete Eier können für die In-vitro- Fertilisation gesammelt werden, die Hunderte von gleichzeitig befruchteten Embryonen erzeugt. Der letztere Ansatz ist nützlich, wenn eine Blastomere-zielgerichtete Mikroinjektion vor der Gefäßkennzeichnung durchgeführt wird. Bei diesem Ansatz wird jedoch ein Mann geopfert.
    1. Natürliche Paarung
      1. Lassen Sie grundierte weibliche und männliche Paar in den gleichen Tank. Der Mann wird die fEmale, was zur sofortigen Befruchtung der gelegten Eier führt. Die Eier mit einer Glas- oder Plastikpipette sammeln und in eine Petrischale überführen. Um zu verhindern, dass die Eier an der Pipette haften, beschichten Sie die innere Oberfläche der Pipette mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA).
    2. In-vitro- Fertilisation (IVF)
      1. Trennen Sie das grundierte Weibchen vom Männchen nach dem Grundieren. Das Weibchen fängt an, Eier spontan in ca. 3 h zu legen. Übertragen Sie einige gelegte Eier mit einer BSA-beschichteten Pipette zu einer Petrischale und überprüfen Sie ihre Qualität unter einem Mikroskop. Wenn gesunde Eier (klares Pigment, elastisch kugelförmig) gelegt wurden, bereiten Sie sich vor, um die Hoden aus dem grundierten Männchen zu sezieren.
      2. Machen Sie 0,4% Tricainmethansulfonat (MS222) für die Euthanasie und injizieren Sie 300 μl in den dorsalen Lymphsack des grundierten Mannes. In etwa 10 min wird der Mann sein Gleichgewicht verlieren und wird über Wasser bleiben; Bestätigen Sie, dass das Männchen durch das Einklemmen eines Hinterbeins mit einemPaar stumpfe Zangen und beobachtete keine Antwort.
      3. Ziehen Sie die beiden Hoden heraus, reinigen Sie sie, indem Sie sie schnell auf fusselfreies Papier klopfen und in ein Mikroröhrchen mit 1 ml 60% Leibovitz L-15 Medium (60%), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), überführen. Ein detailliertes Verfahren ist an anderer Stelle beschrieben 10 .
      4. Die Hoden vorsichtig mit einer Pistille zerkleinern, um das Sperma zu extrahieren. Bei dieser Konzentration ( dh 2 Hoden in 1 ml 10% FBS in 60% L-15) können einige Tropfen der Hodenlösung (0,1 ml) etwa dreihundert Eier befruchten. Das verbleibende Sperma kann bei 4 ° C in einem dicht verschlossenen Rohr gelagert und für IVF am nächsten Tag verwendet werden.
      5. Squeeze die Eier von der Frau in eine kleine Petrischale. Halten Sie den oberen Teil des Weibchens umgedreht auf die Handfläche und setzen Sie den Zeigefinger zwischen die Hinterbeine. Verbreiten Sie seine Hinterbeine mit dem Zeigefinger und die andere Hand, um die Kloake zu entlarven. Berühre die Kloake zur Petrischale. Mantel tEr Petrischale mit 0,5% BSA, um die Eier gleichmäßig als Monoschicht während der IVF zu verteilen.
      6. Fügen Sie ein paar Tropfen (0,1 ml) des Spermien enthaltenden L-15-Mediums zu den Eiern hinzu. Für die synchrone Befruchtung rühren Sie die Spermien-Lösung vorsichtig über die Schale. Nach 4 min bei Raumtemperatur füllen Sie die Petrischale mit 0,01x modifizierter Barth's Saline (MBS), inkubieren für 10 min und ersetzen Sie die Lösung mit 0.1x MBS. Die befruchteten Eier werden die erste Spaltung in ca. 1 h bei Raumtemperatur durchlaufen. 1x MBS beträgt 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHCO 3 , 5 mM HEPES, 1 mM MgSO 4 und 0,7 mM CaCl 2 , pH 7,5.
  3. (Optional) Injektion von Antisense-Morpholino-Oligonukleotiden (MOs) und / oder mRNAs
    1. Um die Wirkung eines Gens von Interesse auf die Gefäßbildung zu untersuchen, führen Sie die Mikroinjektion von Antisense MO und / oder mRNAs durch.
    2. Für solche Experimente entgleisen die Eier mit 2% L-Cystein in 1x MBS (pH 7,5-7,8).Ersetzen Sie 0,1x MBS in der Schale mit den befruchteten Embryonen mit 2% L-Cystein in 1x MBS. Die Schale vorsichtig umdrehen, um die Lösung zu mischen.
      ANMERKUNG: Es dauert normalerweise ungefähr 5 min, damit die Embryonen entblößt werden. Während dieses Schrittes, überwachen Sie die Eier häufig, um sicherzustellen, dass sie nicht überbelichtet werden, um die Lösung. Wenn die Eier überbelichtet sind, verlieren sie die Elastizität und werden abgeflacht, was zu einer abweichenden Entwicklung und Letalität führen wird.
    3. Waschen Sie die de-jellied Eier fünfmal mit 0.1x MBS. Führen Sie die Mikroinjektion in 4% Ficoll aufgelöst in 0.1x MBS. Typischerweise injizieren Sie 4 ng MO und 600 pg mRNA pro Blastomere im Zweizellenstadium. In eine Zelle injizieren, um die Genexpression nur auf einer Seite des Embryos zu manipulieren. Benutze die uninjizierte Seite des gleichen Embryos als Kontrolle.
    4. Als weitere Kontrolle für die Spezifität der Genmanipulation injizieren Sie die gleiche Menge einer Kontrolle MO (CoMO) oder Kontrolle mRNA ( zB Beta-Galactosidase mRNA). CoMO muss das gleiche haben mOleculargewicht als Gen-spezifisches MO und darf keinem Gen im Xenopus- Genom ansprechen. Zur leichten Visualisierung der injizierten Seite verwenden Sie Fluorescein-markiertes MO oder co-injizieren einen Tracer ( zB EGFP mRNA).
    5. Lassen Sie die injizierten Embryonen in 4% Ficoll für 2 h und überweisen sie dann auf eine neue 60 mm Petrischale mit 0.1x MBS gefüllt.
  4. Anheben
    1. Heben Sie die Embryonen bei 23 ° C an. Obwohl die Entwicklungsgeschwindigkeit durch Verwendung von Temperaturen unter oder über 23 ° C (Bereich: 16-26 ° C) verlangsamt oder beschleunigt werden kann, empfiehlt es sich, diese bei 23 ° C anzuheben.
  5. (Optional) Behandlung mit pharmakologischen Reagenzien
    1. Für pharmakologische Manipulationen, verabreichen Medikamente an die sich entwickelnden Embryonen durch Badanwendung.

2. Vorbereitung der DiI-AcLDL-Injektion

  1. Machen Sie eine verjüngende Glaspipette mit einem Standard-MikrOpipettenabzieher Legen Sie eine Borosilikatglasröhre in den Mikropipettenabzieher und verwenden Sie folgende Einstellungen: Druck, 200; Hitze, 30; Ziehen, 30; Geschwindigkeit, 120; Zeit, 200.
  2. Die DiI-AcLDL-Stammlösung bei 4 ° C aufbewahren. Nehmen Sie den oberen klaren Teil der Lösung für die Injektion, aber nicht die ausgefällten Partikel auf der Unterseite des Tubus. Alle Schutt in der Glaspipette stört den richtigen Ausstoß der Lösung.
  3. Füllen Sie die vorbereitete Glaspipette mit einer geeigneten Menge an DiI-AcLDL-Lösung (~ 5 μL) mit einem Mikroloader.
  4. Clip aus der Spitze der Glaspipette nach und nach mit einer feinen Pinzette (Nummer 55). Stellen Sie das druckgesteuerte Einspritzsystem so ein, dass ca. 5 nL Lösung zu einem Zeitpunkt ausgeworfen wird. 50-60 nL DiI-AcLDL-Lösung reicht aus, um die Gefäße eines Embryos zu färben.
  5. Lassen Sie die DiI-AcLDL-beladene Pipette längere Zeit nicht an der Luft ab, um ein Trocknen zu vermeiden. Halten Sie die Spitze der Pipette in 0,04% MS versenkt222 in 0.1X MBS-Lösung. Kurz vor dem Einspritzen in den Embryo (Schritt 4.2.1), um zu sehen, ob die gleiche Menge an Farbstoff ausstößt.

3. Einspritzung

  1. Sylgard-Schimmel
    1. Um eine kleine Sylgard-Form herzustellen, mischen Sie Sylgard-Base und Härtungsmittel mit einem Gewichtsverhältnis von 10 bis 1. Füllen Sie etwa die Hälfte einer kleinen Petrischale (35 mm oder 60 mm Schale) mit dieser gemischten Lösung und lassen Sie sie dann etwa verfestigen 48 h bei Raumtemperatur.
  2. Anästhesie
    1. Verwenden Sie 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) für Anästhesie. Wenn lange Anästhesie benötigt wird ( zB während der Live-Bildgebung), verwenden Sie 0,04% MS222 in 0.1x MBS, um das osmotische Ungleichgewicht zu reduzieren. Um den pH-Wert einzustellen, fügen Sie einige Tropfen NaOH (~ 20 μL) hinzu und überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Papier.
    2. Warten Sie, bis die übertragenen Embryos aufhören zu bewegen. Berühre die Rückenflossen der Embryonen und kontrolliere, ob sie darauf antworten, dass sie vollständig bestätigenNesthesie
  3. Embryonen zur Injektion positionieren
    1. Einzug der Oberfläche der gehärteten Sylgard-Form mit einer dünnen und scharfen Klinge. Machen Sie eine V-förmige konkave Einbuchtung, in der die Embryonen platziert werden können (siehe Abbildung 2D ). Legen Sie einen anästhesierten Embryo, ventral-Seite nach oben, in einer etwas schrägen Art (ca. 30 °) (Abbildung 2D ).
    2. Füllen Sie die Form mit MS222-Lösung und legen Sie die Embryonen in die Form.

4. DiI-AcLDL-Injektion

  1. Inzision der Haut über dem Herzen
    1. Bereiten Sie zwei Stifte (Minutiens, 0,10 mm) vor, um die Haut über dem Herzen zu schneiden. Fixieren Sie jeden Stift fest an einen Stifthalter; Das Herz sollte leicht identifizierbar sein, wie es pulsiert (Abbildung 2A-2C , rosa).
    2. Punktion der Haut eines Embryos mit einem Stift. Setzen Sie den Stift durch das Loch in den Raum zwischen dem Herzen und der Haut ( Abbildung 2C
    3. Machen Sie einen linearen Einschnitt durch sanftes Reiben der anderen Pin außerhalb der Haut gegen den eingelegten Stift gehalten. Diese Inzision mit zwei Stiften vorsichtig erweitern und das Herz aussetzen ( Abbildung 2B ' und 2D' , Pfeil). Die mit DiI-AcLDL geladene Pipette kann sich nun direkt dem Herzen nähern (Abbildung 2D ' ).
  2. Injektion
    1. Setzen Sie die Spitze der beladenen Glaspipette in das Herz ein und injizieren Sie 50-60 nL DiI-AcLDL-Lösung in ca. 10 Ausstoßimpulsen. Spritzen Sie nicht eine übermäßige Menge an Lösung, da es das Herz zu brechen verursacht. Prüfen Sie, ob das Herz nach der Injektion weiter schlägt. Nach jeder Injektion prüfen, ob die gleiche Menge an DiI-AcLDL ausgeworfen wird. Andernfalls kann die Spitze der Pipette blockiert werden (siehe Schritt 2.5).
  3. Übertragen Sie die injizierten Embryos auf eine neue Petrischale, die mit 0.1x MBS zur Verwertung gefüllt ist. Nach 5-10 min sollten die Kaulquappen das Bewusstsein wiedererlangen und beginnen sich zu bewegen. Zu diesem Zeitpunkt können die markierten Gefäße abgebildet werden. Es empfiehlt sich, erfolgreich markierte Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop zu visualisieren (Abbildung 3A und 3B ). Wenn eine unzureichende Menge an DiI-AcLDL in einen Embryo injiziert wird, kann er wieder injiziert werden (Abbildung 3C ).
  4. Verwerfe die Kaulquappen, die andere Organe haben ( Abbildung 3D ). Weiter, bis die erforderliche Anzahl erfolgreich markierter Embryonen erreicht ist.
  • (Optional) Fixierung der Embryonen
    1. Für eine gründlichere Bildgebung von Blutgefäßen, verwenden Sie konfokale Mikroskopie; Es könnte einfacher sein, die markierten Embryonen für konfokale Mikroskopie zu fixieren. Zuerst betonen die markierten Embryonen in 0,04% MS222 in 1x MBS (pH 7,5-8,0) und fixieren sie dann in 4% Paraformaldehyd in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 h bei Raumtemperatur. Feste Embryos können für mehrere Tage bei 4 ° C gelagert werden; Schützen die eingespritzten Proben vor Licht, um das Photobleichen des DiI zu vermeiden.
  • 5. Bildgebung von DiI-AcLDL

    1. Stereoskopische Bildgebung
      1. Nehmen Sie Fotos unter einem fluoreszierenden stereoskopischen Mikroskop (Abbildung 3 ), um die Gesamtmorphologie des Gefäßsystems zu beurteilen.
      2. 1% Agarose in 1x PBS für feste Embryonen oder in 1x MBS für lebende Bildgebung schmelzen. Gießen Sie geschmolzene Agarose in eine Petrischale und warten Sie, bis sie erstarrt. Machen Sie eine flache Einbuchtung auf der Oberfläche des Agarosegels, die den Embryo passieren wird, um abgebildet zu werden, wenn er auf seiner lateralen Seite liegt. Füllen Sie die Schale mit Puffer (MS222-Lösung für anästhesierte Embryonen oder 1x PBS für feste Embryonen).
    2. Fluoreszenzmikroskopie (Rhodaminfilter seT)
      1. Als DiI ist ein grün-angeregter und rot emittierender Farbstoff, Bild unter Verwendung eines Standardfiltersatzes für Rhodamin oder spektral verwandte Fluorophore (maximale Anregung bei 554 nm und Emission bei 571 nm). Lege die injizierten Embryos in die Vertiefungen auf die Agaroseform und fotografiere (Abbildung 3 ).
    3. Konfokale mikroskopie
      HINWEIS: Für eine genauere Analyse der Gefäßarchitektur verwenden Sie konfokale Mikroskopie.
      1. Wenn Sie ein invertiertes Mikroskop verwenden, positionieren Sie die Embryonen auf einer Glasbodenschale. Fügen Sie ein paar Tropfen von 1x PBS hinzu und immobilisieren Sie sie, indem Sie einen Deckzettel auf die Oberseite legen. Entfernen Sie überschüssiges PBS. Wenn lebende Embryonen abgebildet werden sollen, verwenden Sie anästhesierte Embryonen und verwenden Sie 0,015% MS222 in 0,1x MBS anstelle von PBS.
      2. Für die Vergrößerung Bildgebung, verwenden Sie ein 4X bis 10X Ziel, um den Bereich von Interesse zu finden; Der rostrale Teil der hinteren Kardinalvene (PCV) ist eine nützliche Region, um die Entwicklungsangiogenese zu untersuchen (Abbildung 4, gestricheltBoxen).
        1. Verwenden Sie eine Erfassungseinstellung für einen roten Emissions-Fluorophor (wie Rhodamin).
        2. Machen Sie z-gestapelte Bilder durch die Abbildung der lateralen Hälfte eines Embryos. Zuerst konzentriere ich mich auf den PCV auf der lateralen Seite in der Nähe des Objektivs und setze dann die untere Grenze des Fokus an die Stelle, wo die Schiffe, die dem Ziel am nächsten liegen, im Fokus sind. Setzen Sie die obere Grenze an die Stelle, an der der mediale Teil des abgebildeten PCV fokussiert werden kann. Bild diese ganze laterale Hälfte des Embryos. Verwenden Sie Software, die Metadaten auf den Erfassungseinstellungen speichert, wie z. B. x-, y- und z-Skalen, da sie die Gefäßlängen berechnen müssen.
        3. Wenn nötig, verwenden Sie den Fliesen-Scan-Modus, um das gesamte Gefäßsystem eines Embryos abzubilden. Empirisch bestimmen die Anzahl der horizontalen und vertikalen Fliesen.
      3. Für die Bildverarbeitung mit hoher Vergrößerung folgen Sie den oben beschriebenen Vorgehensweisen, um den rostralen Teil des PCV und 4 rostral-am meisten intersomitischen Venen (ISVs) abzubilden (Abbildung 4 ,Gestrichelte Kiste). Passen Sie die Anzahl der Stapel (z-Stack) und Fliesen (Fliesen-Scan) entsprechend an.

    6. Quantifizierung von DiI-markierten Gefäßen

    HINWEIS: DiI-markierte Schiffe können manuell oder mit Software verfolgt werden. Wir verwenden "Simple Neurite Tracer", ein freies ImageJ (NIH) Plugin, das eine halbautomatische Verfolgung von röhrenartigen Strukturen wie Blutgefäßen und Neuriten ermöglicht. Mit dieser freien Software können folgende Parameter berechnet werden. Eine detaillierte Vorgehensweise für die Verwendung dieser Software ist an anderer Stelle beschrieben (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Im Folgenden verwenden wir Beispiele für die Gefäße von Embryonen, in denen Tie2-Signalisierung gehemmt oder verstärkt wird (Abbildung 4A-4C ) 5 . Antisense Tie2MO-injizierte Embryonen zeigen die Angiogenese und verkürzt die ISVs (Abbildung 4B ), während die Co-Injektion von konstitutiv aktivem Tie2Mutante mRNA (caTie2 mRNA) überholt diesen Phänotyp, was zu üppigen ISV-Verzweigungen führt (Abbildung 4C ).

    1. ISV-Längen
      1. Mit einfachem Neuriten-Tracer, berechnen Sie die Länge jedes verfolgten Schiffes. Berechnen Sie die Längen der 4 rostral-meisten ISVs.
    2. ISV Niederlassungen
      ANMERKUNG: In Wildtyp-Embryonen sprießen nur wenige kurze Zweige von den rostral-meisten ISVs in Stufe 42.
      1. In Simple Neuriten Tracer, verfolgen diese kleinen Schiffe nach der ISV, aus denen sie den Primärzweig stammen. Berechnen Sie die folgenden Parameter dieser Zweige, die aus den ISVs stammen.
      2. Gesamtzahl der Filialen
        1. Sobald alle ISVs und die zugehörigen Zweige verfolgt sind, berechnen Sie die Gesamtzahl der Zweige (Abbildung 5B-5D ).
      3. Zweigbestellung
        1. Als einfacher Neuriten-Tracer die Reihenfolge jedes Zweigs aufzeichnet ( Abbildung 5A ), kalkulierenE die Anzahl der Zweige für jede Bestellung. Die Mehrheit der Schiffe in Wildtyp Embryonen sollten primäre Zweige ( dh ISVs) sein.
      4. Vene-Komplexitätsindex (VCI)
        1. Da VCI ein nützlicher Parameter für die Gefäßkomplexität ist, der mehr Ätzungen höherer Ordnung ergibt, berechnen Sie die VCI für jeden Embryo unter Verwendung der Formel in 5A . Zum Beispiel haben Tie2MO-injizierte Embryos eine niedrigere VCI im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 5B und 5C ), und CaTie2 mRNA-injizierte Embryos haben eine höhere VCI (Abbildung 5D ).

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    Representative Results

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    Zeitplan der Experimente (Abb. 1 und 2)

    Kurz nach der Befruchtung kann eine gezielte Mikroinjektion durchgeführt werden, um die Genexpression zu modulieren. Beispielsweise kann ein Antisense-MO, das spezifisch an das Initiationscodon der endogenen Tie2-mRNA bindet, injiziert werden, was die Translation von Tie2-Ziel-mRNA durch sterische Hinderung hemmt. Ein MO kann mit Fluorescein für die einfache visuelle Screening von erfolgreich injizierten Embryonen konjugiert werden. Alternativ kann eine tracer-mRNA ( z. B. mRNA, die für EGFP kodiert) mit MO co-injiziert werden. Darüber hinaus können Medikamente durch Badanwendung nach dem Schlüpfen behandelt werden (frühe Endstücksphase, um NF Stufe 26). Löse das Medikament in 0,1x MBS und füge es den Embryonen hinzu. Für eine frühere Behandlung können Embryos mit einer Pinzette von den Membranen befreit werden. DiI-AcLDL kann in das Herz um die Stufe 33/34 injiziert werden, um die Dynamik der Gefäßform zu untersuchenAber typischerweise injizieren wir in Stufe 37/38 oder später (Abbildung 2 , farbige Regionen).

    Typische Beispiele für erfolgreiche und erfolglose Injektionen (Schritt 4.3) (Abbildung 3)

    Die stereoskopische Bildgebung eignet sich für das visuelle Screening. Wenn eine ausreichende Menge an DiI-AcLDL in das Herz injiziert wird, sollte der PCV sofort unter einem Fluoreszenz-Stereoskop sichtbar sein (Abbildung 3A und 3B ). Unzureichend oder falsch injizierte Embryonen sind leicht zu identifizieren (Abbildung 3C und 3D ). Embryonen mit einer unzureichenden Menge an DiI-AcLDL (Abbildung 3C ) können wieder mit dem gleichen Farbstoff injiziert werden, bis die Gefäße deutlich sichtbar sind. Bild erfolgreich injiziert Embryonen unter einem konfokalen Mikroskop, leben oder nach Fixierung.

    Entwicklung der posteriOder Kardinalvene (PCV) und die intersomitischen Venen (ISVs)

    Der PCV erstreckt sich in der rostal-to-caudal-Richtung, und diese Erweiterung endet um Stufe 37/38. ISVs tauchen dorsal aus dem PCV in einer anterior-to-posterior Welle auf. Diese Welle der ISV-Bildung beginnt in Stufe 36 und endet um Stufe 40/41; Die ISVs wachsen weiter und werden bis zur Stufe 43 leicht verzweigt ( Fig. 3A und 3B ).

    Tie2-Signalisierungssteuerung Entwicklungs-ISV-Verzweigung (Abbildung 4)

    Die PCV und ISVs wachsen in einem stereotypen Muster, und ihre Entwicklung ist unter strenger Kontrolle (Abbildung 4A ). Die Bildung der ISVs aus dem PCV kann als Angiogenese beschrieben werden und ist daher ein nützliches Modell zur Untersuchung molekularer Mechanismen, die der Angiogenese zugrunde liegen. Wir stellen das Ergebnis unserer aktuellen Studie vorDiese Entwicklungssignale hemmen die Tie2-Signalisierung in ISVs, um ihre Verzweigung zu begrenzen 5 . Der Knockdown der Tie2-Signalisierung durch Antisense MO verringert die Länge und Komplexität der ISVs (Abbildung 4B) und die exprimierende aktive Form von Tie2 (caTie2) verursacht eine übermäßige ISV-Verzweigung (Abbildung 4C ).

    Quantifizierung der ISV-Komplexität (Abbildung 5)

    Zusätzlich zu den Längen und Verzweigungsnummern der ISVs kann der "Vene Komplexitätsindex" (VCI) berechnet werden, um deren Komplexität zu beurteilen (Abbildung 5A ). Wir haben den von Cohen-Cory und den Kollegen entwickelten "Komplexitätsindex" übernommen, der die Komplexität der neononalen axonalen oder dendritischen Dornungen quantifizieren sollte. In diesem Index erhält ein Embryo mit höherwertigen Zweigen eine höhere Punktzahl als ein Embryo mit der gleichen Anzahl der gesamten KleieAber mit mehr niederwertigen Filialen. Daher zeigt ein höherer VCI an, dass dieser Embryo ein komplexeres venöses Netzwerk hat. "Einfache Neuriten-Tracer" ist nützliche Software, um die Reihenfolge und Länge der einzelnen Zweige zu verfolgen. Es ist auch möglich, "gerenderte Wege" zu erzeugen, was eine nützliche Möglichkeit ist, die Gesamtarchitektur des Gefäßsystems zu visualisieren ( Fig. 5B-5D , rechte Tafeln).

    Abbildung 1
    Abbildung 1: Zeitplan der Experimente Am Tag der Befruchtung können Morpholinos (MOs), DNA, RNA oder Protein in befruchtete Eier in NF-Stadium 1 (st1) oder 2 (st2) injiziert werden. Wenn nur in die eine Blastomere bei st2 injiziert wird, wird das injizierte Reagenz nur eine laterale Seite beeinflussen. Die uninjizierte Seite kann als Kontrolle verwendet werden. Co-Inject eines Tracers ( zB EGFP mRNA) zur Identifizierung der injizierten Seite. Am zweiten tag, eaRly tailbud-stage (~ st24) Embryos können mit pharmakologischen Reagenzien durch Badanwendung behandelt werden. Das Herz ist am dritten Tag deutlich sichtbar. DiI-AcLDL kann in das Herz injiziert werden und Blutgefäße können kurz nach der Injektion abgebildet werden. Verwenden Sie St33-37 Embryonen, um die Dynamik des Gefäßwachstums oder der St42-Embryonen aufzubauen, um voll entwickelte Gefäße zu bildlich zu machen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2: Lage der DiI-AcLDL-Injektion bei st42. Lateral ( AB ' ) und ventral ( CD ) Ansichten des Embryos der Stufe 42. Das Herz ist in rosa in der Farbe gefärbt, in Bildern aus Xenbase (www.xenbase.org). Repräsentative stereoskopische Bilder sind in A ' , D. Für die Injektion, punktieren Sie die Haut über dem Herzen ( C , solide Pfeil), machen einen linearen Schnitt, und öffnen Sie die Haut seitlich, um das Herz (rote Pfeile). Nach dem Einschnitt wird das Herz für die Injektion ( D ' ) deutlich unterscheidbar sein. Maßstäbe = 200 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 3
    Abbildung 3: Erwartete Ergebnisse (stereoskopische Bilder). Repräsentative Fluoreszenzbilder aus Stufe 37/38 ( A ) und Stufe 42 ( B ) Embryonen. Die linken Seiten der Embryonen sind gezeigt. Die hintere Kardinalvene (PCV) erstreckt sich kaudal, von denen intersomitische Venen (ISVs) Zweig dorsal in einem rostral-to-caudal wavE. Nur rostrale ISVs sind in Stufe 37/38 ( A ) sichtbar, und die meisten ISVs haben sich nach Stufe 42 ( B ) gebildet. Wenn eine unzureichende Menge an DiI-AcLDL injiziert wird, ist die PCV auch nach 30 min ( C ) nicht deutlich sichtbar. In diesem Fall kann mehr DiI-AcLDL injiziert werden. Wenn DiI-AcLDL versehentlich in andere Organe ( D ) injiziert wird, verwerfe die Embryonen. Maßstab = 500 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Auswirkungen der Tie2-Signalisierung auf die ISV-Entwicklung Die Tie2-Genexpression wurde durch die Blastomere-Injektion von Translationsblockierungs-Antisense-Morpholino-Oligonukleotiden (Tie2MO) niedergeschlagen. Die Kontrolle Morpholino (CoMO) hat das gleiche Molekulargewicht, aber nOt Ziel jedes Gen in Xenopus tropicalis . MRNA-kodierende konstitutiv aktive Tie2-Mutante (CaTie2) wurde co-injiziert, um den Tie2-Knockdown-Phänotyp zu retten. Im Gegensatz zur Kontrolle ( A ) führte die TY2MO-Injektion zu einer dramatischen Abnahme der Länge und der Anzahl der ISVs ( B ). Dieser Phänotyp wurde von caTie2 überreizt, der ISVs mit überschwänglichen Kollateralzweigen ( C ) zeigte. Die Komplexität der ISVs in den Regionen, die durch blaue gestrichelte Kästen angegeben sind, wird in Fig. 5 quantifiziert. Maßstab = 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 5
    Abbildung 5: Quantifizierung der Venenkomplexität. ( A ) Die Komplexität von ISV kann durch den Vene-Komplexitätsindex (VCI) repräsentiert werden.( BD ) VCIs wurden aus den in Abbildung 4 dargestellten Embryonen berechnet. Maßstab bar = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

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    Das hier vorgestellte Protokoll wurde zuerst von Ali H. Brivanlou und Kollegen entwickelt, um Entwicklungsereignisse während der Gefäßbildung in Xenopus laevis 4 zu untersuchen, aber wie in diesem Manuskript gezeigt, kann es auf andere kleine Tiere angewendet werden. Die Farbinjektion in das Herz ist einfach durchzuführen, und das gesamte Gefäßnetzwerk kann unter einem Fluoreszenzdissektionsmikroskop sowie ein konfokales Mikroskop abgebildet werden. Wenn der Farbstoff während der Gefäßentwicklung in das Herz injiziert wird, kann die Dynamik des Gefäßwachstums und der Verzweigung in Echtzeit abgebildet werden 4 . Mit dem wohldefinierten venösen Netzwerk, insbesondere den PCV- und rostral-meisten ISVs, können die Effekte von genetischen oder umweltbedingten Störungen auf die Angiogenese quantitativ beurteilt werden.

    Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Injektion von DiI-AcLDL (Schritt 4). Wir bieten Beispiele für erfolgreiche und erfolglose Injektionen ( Fi3). Erfolgreich injizierte Embryonen sollten unter einem Fluoreszenzmikroskop abgeschirmt werden, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Wenn der PCV 30 min nach der Injektion nicht sichtbar ist, wurde nicht genug DiI-AcLDL injiziert (Abbildung 3C ). Unvereinbar injizierte Embryonen können wieder betäubt und wieder eingespritzt werden. In einigen Fällen kann DiI-AcLDL an einen falschen Ort injiziert werden, in welchem ​​Fall andere Organe beschriftet werden (Abbildung 3D ). Verwerfung von falsch injizierten Embryonen.

    Die Blutgefäße eines erfolgreich injizierten Embryos werden kurz nach der Injektion sichtbar sein und die Fluoreszenz dauert mehrere Stunden. Deshalb, wenn die Injektion vor der Bildung von ISVs durchgeführt wird, kann ihre Entwicklung in einem Live-Embryo abgebildet werden, was ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Entwicklung des Herz-Kreislauf-Systems in Echtzeit und in vivo 4 bietet . Da Xenopus erfolgreich als Modell zum Screening des Gefäßes d verwendet wurdeBei den Säugetieren 14 kann der hier beschriebene experimentelle Ansatz mit pharmakologischen Störungen kombiniert und als Screening-Plattform verwendet werden, um Medikamente zu finden, die die Angiogenese verstärken oder hemmen.

    Blutgefäße können durch genetische Werkzeuge sowie durch die hier beschriebenen farbstoffbasierten Markierungsmethoden sichtbar gemacht werden. Zum Beispiel ermöglichen transgene Xenopus 15 oder Zebrafisch 16 , die Fluoreszenzproteine ​​unter der Kontrolle von zelltypspezifischen Promotoren exprimieren, die lebende Bildgebung von Blut und lymphatischen Gefäßen, und es ist sogar möglich, Arterien aus Venen zu unterscheiden 16 . Obwohl genetische Ansätze überlegen sind und eine gleichmäßigere Etikettierungseffizienz erzeugen, sind Farbstoff-basierte Methoden für die meisten Laboratorien ohne Zugang zu solchen gentechnisch veränderten Tieren leicht zugänglich. Bei Xenopus ergibt sich die transkardiale Perfusion von DiI-AcLDLMarkierung der meisten Endothelzellen 4 , und Arterien und Venen sind in Fluoreszenzbildern nicht zu unterscheiden. Faszinierend markiert Tomate Lektin-Fluorescein selektiv Arterien bei Mäusen und bei der Co-Injektion mit DiI-AcLDL können Arterien und Venen diskriminiert werden 17 . Obwohl die Anwendung nicht in anderen Geweben oder Tieren getestet wurde, bietet dies eine vielversprechende Richtung, um die dynamische Entwicklung von Arterien und Venen in Xenopus zu untersuchen.

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    Disclosures

    Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

    Acknowledgments

    Diese Studie wurde von der Arbeit von Levine et al. , Die diese experimentelle Methode beschrieben und eine umfassende Beschreibung der vaskulären Entwicklung in Xenopus laevis zur Verfügung stellte . Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre Inputs. Diese Studie wurde von der Yonsei University Future-führenden Forschungsinitiative von 2015 (2015-22-0095) und dem Bio & Medical Technology Development Program der Nationalen Forschungsstiftung (NRF) unterstützt, die vom Ministerium für Wissenschaft, IKT & Zukunftsplanung ( NRF-2013M3A9D5072551)

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    35 mm Petri dish SPL 10035 Sylgard mold frame
    60 mm Petri dish SPL 10060 Embryo raising tray
    Borosilicate Glass Sutter instrument B100-50-10 Needle for injection
    BSA Sigma A3059-10G Coating reagent
    CaCl2 D.S.P.GR Reagent 0.1x MBS component
    Coverslip Superior HSU-0111520 For confocal imaging
    DiI-AcLDL Thermo Fisher Scientific L3484 Vessel staining solution
    FBS Hyclone SH.30919.02 For storage of testis
    Fiber Optical Illuminator World Precision Instruments Z-LITE-Z Light
    Ficoll Sigma F4375 Injection buffer
    Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter instrument P-97 Injection needle puller
    Forcep Fine Science Tool 11255-20 For embryo hatching and
    needle tip cutting
    Glass Bottom dish SPL 100350 For confocal imaging
    hCG MNS Korea For priming of frogs
    HEPES Sigma H3375 Buffering agent
    Incubator Lab. Companion ILP-02 For raising embryos
    KCl DAEJUNG 6566-4400 MBS component
    L15 medium Gibco 11415-114 For storage of testis
    L-cysteine Sigma 168149-100G De-jellying reagent
    MgSO4 Sigma M7506 MBS component
    Microtube Axygen MCT-175-C-S For storage of testis
    MS222 Sigma E10521 Anesthetic powder
    NaCl DAEJUNG 7647-14-5 MBS component
    NaOH Sigma S-0899 pH adjusting reagent
    Paraformaldehyde Sigma P6148 Fixatives
    PBS BIOSESANG P2007 Buffer for imaging
    pH paper Sigma P4536-100EA For confirming pH
    PICO-LITER INJECTOR Waner instruments PLI-100A For injection
    Pin Pinservice 26002-10 For incision
    Pinholder Scitech Korea 26016-12 For incision
    Precision Stereo Zoom Binocular Microscope World Precision Instruments PZMIII For visual screening
    Standard Manual Control Micromanipulator  Waner instruments W4 64-0056 For microinjection
    SYLGARD 184 Kit Dow Corning For DiI injection
    Transfer pipette Korea Ace Scientific Co. YM.B78-400 For eggs and
    embryo collection

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    References

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    Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).More

    Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).

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