Summary
Denne protokol beskriver en metode til sensitivt at måle den nukleocytoplasmatiske transportrate inden for motorneuronlignende NSC-34-celler ved at kvantificere den realtidsændring i nuklearimporten af et NLS-NES-GFP-protein.
Abstract
Nukleocytoplasmisk transport henviser til import og eksport af store molekyler fra cellekernen. For nylig har en række undersøgelser vist en forbindelse mellem amyotrofisk lateralsklerose (ALS) og forringelser i den nukleocytoplasmatiske vej. ALS er en neurodegenerativ sygdom, der påvirker motorneuronerne og resulterer i lammelse og i sidste ende i døden inden for 2-5 år i gennemsnit. De fleste tilfælde af ALS er sporadiske og mangler nogen tilsyneladende genetisk binding, men 10% arves på en dominerende måde. For nylig blev hexanukleotid-gentagelsesudvidelser (HRE'er) i den åbne chromosom 9-læseramme 72 (C9orf72) -gen identificeret som en genetisk årsag til ALS og frontotemporal demens (FTD). Vigtigt har forskellige grupper for nylig foreslået, at disse mutanter påvirker nukleocytoplasmatisk transport. Disse undersøgelser har for det meste vist det endelige resultat og manifestationer forårsaget af HRE'er på nukleocytoplasmatisk transport, men de viser ikke nuklear transportdysfunktion irealtid. Som et resultat kan kun alvorlig nukleocytoplasmisk transportmangel bestemmes, hovedsagelig på grund af høj overekspression eller eksogen proteinindsættelse.
Denne protokol beskriver en ny og meget følsom analyse for at evaluere og kvantificere nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importraten for et NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantificeres i realtid under anvendelse af fluorescerende mikroskopi. Dette udføres ved at bruge en eksportinhibitor, hvilket gør det muligt for shuttle GFP kun at komme ind i kernen. For at validere assayet blev C9orf72 HRE-translaterede dipeptid-gentagelser, poly (GR) og poly (PR), som tidligere er blevet vist for at forstyrre nukleocytoplasmatisk transport, anvendt. Ved anvendelse af det beskrevne assay blev der observeret et 50% fald i den nukleare importrate sammenlignet med kontrollen. Ved anvendelse af dette system kan små ændringer i nukleocytoplasmatisk transport undersøges, og evnen hos forskellige faktorer til at redde (selv delvis) en nukleocytoplasmisk trAnsøgningsfejl kan bestemmes.
Introduction
Kernekernekomplekset (NPC) styrer import og eksport af store molekyler ind i og ud af cellekernen. I modsætning til små molekyler, som kan komme ind i kernen uden regulering 1 , styres transporten af større molekyler stærkt af NPC. Disse store molekyler, såsom proteiner og RNA, associerer med transportfaktorer, herunder import og eksport, der skal importeres og eksporteres fra kernen 2 . For at blive importeret skal proteiner indeholde et lille peptidmotiv, der generelt kaldes et nukleært lokaliseringssignal (NLS), som er bundet af importins 2 . Disse sekvenser af aminosyrer virker som et mærke og er forskellige i sammensætning 3 , 4 . Proteiner kan eksporteres fra kernen til cytoplasma på grund af deres tilknytning til exportinS, som binder en signalsekvens, der generelt kaldes et nukleært eksportsignal (NES) 2 . Både importins og exportins er i stand til at transportere deres gods på grund af reguleringen af den lille Ras-relateret nukleær protein GTPase (Ran) 2 . Ran har vist sig at eksistere i forskellige konformationelle tilstande afhængigt af om den er bundet til GTP eller BNP. Når det er bundet til GTP, kan Ran binde til importins eller exportins. Ved binding til RanGTP frigiver importins deres fragt, mens exportinsætninger skal binde RanGTP for at danne et kompleks med deres eksportlast. Den dominerende nukleotidbindende tilstand af Ran afhænger af dens placering i kernen (RanGTP) eller cytoplasmaet (RanGDP).
For nylig har en række undersøgelser vist en forbindelse mellem svækkelser i den nukleocytoplasmatiske vej og både amyotrofisk lateralsklerose (ALS) og frontotemporal demens (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS er en progressiv og dødelig neurodegenerativ sygdom, der påvirker både øvre og nedre motorneuroner (MNs) 13 og resulterer i lammelse og i sidste ende i døden inden for 2-5 år i gennemsnit. De fleste tilfælde af ALS klassificeres som sporadisk (SALS), der mangler nogen tilsyneladende genetisk binding, men 10% arves på en dominerende måde (familie ALS; FALS). For nylig blev hexanukleotid-gentagelsesudvidelser (HRE'er) i den åbne læseramme 72 (C9orf72) -genet for kromosom 9 identificeret 14 , 15 som en genetisk årsag til ALS og FTD. Disse mutanter tegner sig for 30-40% af FALS-sagerne 16 , og forskellige undersøgelser har gjort gældendeAt de forårsager toksicitet ved at påvirke nukleocytoplasmisk transport 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Disse undersøgelser har for det meste vist de endelige resultater og manifestationer af HRE'er på nukleocytoplasmisk transport, men de viser ikke nukleocytoplasmisk forstyrrelse i realtid. Som følge heraf er kun alvorlig nukleocytoplasmisk transportmangel blevet evalueret 11 , 17 , 18 .
Denne protokol beskriver en ny og veRy-sensitiv analyse for at evaluere og kvantificere nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importraten for et NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantificeres i realtid under anvendelse af fluorescerende mikroskopi. Dette gøres ved anvendelse af en eksportinhibitor som beskrevet tidligere 18 , således at shuttle-GFP kun kan komme ind i kernen. Ved hjælp af florescensmikroskopi og en software, der er i stand til at kvantificere fluorescerende ændringer i realtid, er det muligt at kvantificere gradvise ændringer i fluorescensintensiteten af shuttle-GFP, der er placeret i kernen. Som følge heraf kan en Michaelis-Menten-lignende mætningskurve af fluorescens-til-tid-akse, der repræsenterer mængden af nukleær shuttle-GFP på et hvilket som helst tidspunkt, fremstilles. Ved at anvende den oprindelige lineære hastighed for kurverne er det muligt at generere en hældning, som repræsenterer indgangshastigheden i kernen før fluorescensmætning.
For at validere assayet oversættesD C9orf72 dipeptid gentagelser, poly (GR) og poly (PR), som tidligere er blevet rapporteret at forstyrre nukleocytoplasmatisk transport, blev anvendt 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Ved hjælp af dette assay blev der observeret et 50% fald i den nukleare importrate sammenlignet med kontrollen. Ved anvendelse af dette system kan små ændringer i nukleocytoplasmatisk transport undersøges. Endvidere kan evnen af forskellige faktorer til at redde en nukleocytoplasmisk transportfejl bestemmes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Line Preparation
- Optøbe ca. 1.000.000 mus-neuroblastom-rygmarvsceller (NSC-34-celler), som blev opbevaret i en flydende nitrogenbeholder. Brug en 37 ° C vandinkubator, indtil cellerne er helt optøet.
- Tilsæt frisk, varmt medium (DMEM medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin og 1% pen-strep antibiotika).
- Centrifuge optøede celler (SL16R) ved 500 xg i 5 minutter, der danner en cellepellet. Kassér mediet og tilsæt 1 ml nyt medium til cellens resuspension.
- Anbring de resuspenderede celler i en 15 ml kolbe og tilsæt en ekstra 5 ml medium. Inkuber cellerne natten over i en steril inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C.
- Parallelt skal du placere 8 ubelagte dækglas (dækglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm tykt) i en 60 mm kogeplade og sterilisere ved hjælp af 70% ethanol og udsættelse for 30 min UV-lys, indtil det er tørt. Tilsæt medium til hver skål og kassér for at vaske den resterende ethanol.
- Tilføj trypsinpuffer (2,5 g trypsin og 0,2 g EDTA i 1 L Hanks Balanced Salt Solution) til cellerne, når de når ca. 90% sammenflydelse (ca. 6 millioner celler pr. Kolbe) for at tillade adhærente celler at dissociere.
BEMÆRK: NSC-34-celler er følsomme og kræver kun 15 s trypsinbufferinkubering og 1 yderligere min inkubation fri for trypsin inden dissociation under anvendelse af mediet. - Plader cellerne på 60 mm kultivarer, der allerede indeholder dækglas med 3 ml medium, ca. 350 000 pr. Skål. Lad dem i inkubatoren i 24 timer for at tillade cellefastgørelse på dækslerne.
2. Cell Transfektion
BEMÆRK: Efter ca. 24 timer kommer NSC-34 cellerne til at nå 40% konfluens (ca. 800.000 celler) og vil være klar til transfektion.
- Klargør rent DMEM medium (300 μL DMEM medium til hver 60 mm kulturskål) i sterilt mikrocentrifugerbokses.
- Tilsæt 2 μg af hvert plasmid, der kræves til transfektion til hvert DMEM-holdigt mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Shuttle-GFP-plasmidet er obligatorisk i alle celletransfektioner. - Tilsæt transfektionsreagens til alle mikrocentrifugerørene, der indeholder deres krævede plasmider. Her tilsættes 4 μl af det kommercielle transfektionsreagens for hver 2 μg DNA.
- Vortex mikrocentrifugerørene indeholdende DMEM, plasmider og transfektionsreagenset og inkuberer dem ved stuetemperatur i 25 minutter.
- Tilsæt hvert mikrocentrifugerør til en kulturskål og rør forsigtigt op for at danne en homogen opløsning. Placér parabolen tilbage i inkubatoren i 48 timer.
BEMÆRK: Eftersom shuttle-GFP skal udtrykkes i alle celler, kan transport-GFP-transfektionseffektiviteten delvist undersøges og forprøves ved anvendelse af fluorescerende mikroskopi efter transfektion natten over. En fuldstændig undersøgelse af ikke-fluorescerende udtrykte proteiner kan udføres under anvendelse af en immunoblot-analyseer.
3. Mikroskopi
- Fastgør dækslipene, der indeholder transficerede NSC-34-celler, til en afdækningsholder og vask forsigtigt med phosphatpufret saltvand (PBS) for at fjerne de løsne døde celler.
- Identificer en passende cellepatch med et grønt fluorescerende filter med et inverteret mikroskop.
BEMÆRK: En passende cellepatch er defineret som et mikroskopfelt, der viser et stort antal celler (20-30 celler i et felt), og hvor kernerne er klart defineret i cellerne. Cellekerner i cellepatchen identificeres først af øjet og er manuelt markeret af billedprogrammet. - Tilsæt 200 μL af en eksportin-1-hæmmer Leptomycin B (LMB) puffer indeholdende 10 ng / mL LMB i PBS på dækglaset ved at dryppe pufferen på dækglasene under mikroskopet.
BEMÆRK: Dette tidspunkt indstilles som interval nul. - Kvantificer fluorescensintensiteten af de markerede kerner i 3 s intervaller i omkring 400-500 s.
4. Analyse
BEMÆRK: Eftersom forskellige celler udtrykker forskellige niveauer af fluorescerende shuttle-GFP, er det vigtigt at normalisere den nukleare fluorescerende intensitet af hver celle til sin egen indledende fluorescerende intensitet.
- Normaliser fluorescensintensiteten af de markerede kerner ved at dividere 3-s fluorescerende interval for hver kerne med gennemsnittet af de første seks intervaller af den pågældende kerne.
- Efter normaliseringen af hver kerne fremstilles en fluorescerende intensitetskurve, der repræsenterer ændringen i nuklearfluorescens som en funktion af tiden for hver cellepatch. For at gøre dette skal du beregne gennemsnittet af alle cellerne i hver cellepatch (bestående af ca. 20-30 celler i hver patch).
BEMÆRK: Kernefluorescensintensitetskurven ligner en Michaelis-Menten-mætningskurve, hvilket bedre ses i øget tiMig perioder. Dette skyldes et fald i de cytosoliske mængder shuttle-GFP med tiden på grund af nuklear transport. Dette fald reducerer statistisk sandsynligheden for en shuttle-GFP til at transportere ind i kernen og således nå mætning i nuklear fluorescens. Hældningen afledt af den lineære indledende hastighed for kurven giver V max indtastningshastigheden ind i kernen. - Analyser V max- hældningerne af hver cellepatch, afledt af tre til fem uafhængige eksperimenter, ved hjælp af grafingsoftwaren til at producere en hældning, som repræsenterer hver eksperimentelle gruppe. Udfør kvantificering ved hjælp af envejs ANOVA statistisk analyse.
5. Protein Expression Validation
- Anbring 60 mm kulturskåle indeholdende de resterende celler (ikke anvendt i ovennævnte forsøg) fra hver forsøgsgruppe på is.
- Kassér mediet og vask cellerne to gange med PBS for at fortynde og vask det resterende medium.
- Behandl cellerne med 200-400Μl lysis buffer indeholdende PBS, 0,5% Triton og proteaseinhibitor cocktail tablet (PI). Skraber ved hjælp af en celle scraper.
- Saml cellerne i lysisbuffer i et mikrocentrifugerør og homogeniseres med en homogenisator ved 4.000 omdr./min. I 1 minut under is.
- Centrifuger de homogeniserede celler ved 2.500 xg i 10 minutter. Saml supernatanten, kvantificer proteinkoncentrationen ved hjælp af en Bradford-analyse og opbevar indtil anvendelse ved -20 ° C.
- Saml mellem 30 og 70 μg total protein (afhængigt af proteinet) og indlæs det i en SDS-PAGE gel for at teste for proteinekspression ved anvendelse af en immunoblot-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af den her viste fremgangsmåde blev motorneuronlignende NSC-34-celler transficeret med et NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP). Dette protein, som har NLS- og NES-signalsekvenser ( figur 1 ), kan shuttle mellem kernen og cytoplasmaet. Generisk GFP kan indtaste eller forlade kernen i fravær af et lokaliseringssignalmærke kun ved diffusion og fordeles derfor jævnt mellem kernen og cytoplasmaet ( figur 2A ). Til gengæld findes shuttle-GFP-proteinet hovedsageligt i cytoplasmaet på grund af NES- og NLS-signalet s, som påvirker dets dispersion ( Figur 2B ). Således tillader kun tilsætningen af eksportinhibitoren leptomycin B (LMB), som hæmmer proteineksporten, akkumuleringen af shuttle-GFP i kernen og til sidst til måling af shuttle-GFP-importraten ( figur 2C ). Brug af et lysstofmikroskop og så Ftware til at kvantificere fluorescerende ændringer i realtid, kan gradvise ændringer i nuklear fluorescensintensiteten af shuttle-GFP kvantificeres. Som resultat heraf kan en Michaelis-Menten-lignende mætningskurve af fluorescens-til-tid-akse ( figur 3 ), der repræsenterer mængden af nukleær shuttle-GFP på et hvilket som helst tidspunkt, fremstilles. Ved at anvende den oprindelige lineære hastighed af kurverne (som angivet ved cirklen i figur 3 ) kan en hældning, der repræsenterer indgangshastigheden i kernen før fluorescensmætning, genereres.
Flere undersøgelser tyder på, at forskellige C9orf72 proteiner er toksiske i Drosophila melanogaster- modeller og / eller dyrkede celler 6 , 11 . Dippeptidrepetationerne (DPR'er), poly (PR) og poly (GR), produceret fra HRE'er i det muterede C9orf72-gen, viste sig at inducere nukleolspænding 8 ,Lass = "xref"> 19 , 20 og har været impliceret i svækket nukleocytoplasmisk transport, hvilket gør dem til at virke særligt skadelige. For at verificere nytten af det beskrevne assay blev transficerede motorneuronlignende NSC-34-celler transficeret med disse to DPR-plasmider, poly (PR) og poly (GR). Da poly (PR) og poly (GR) DPR'er også er konjugeret til GFP, var det vigtigt at validere, at DPR'erne ikke blev påvirket af leptomycin-B, hvilket ville resultere i et falsk positivt resultat. Poly (PR) -ekspression blev observeret i kernen fuldstændigt som inklusioner; Det kunne således ikke give et falsk positivt nukleært importsignal ( figur 4A ). Poly (GR) -ekspression blev derimod observeret homogent i cytosolen og også som indeslutninger i kernen ( figur 4B ). Ved transfektion af NSC-34-celler med kun poly (GR) og tilsætning af leptomycin-B blev der ikke observeret shuttle-bevægelse af den udtrykte poly (GR) ( Figur 5 ).
Figur 5 ).
Figur 1: Skematisk af NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) konstruktionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Leptomycin B hæmmer eksporten af shuttle-GFP fra kernerne af NSC-34-celler. Repræsentative billeder af NSC-34 celler expGenbruger generisk GFP ( A ) eller shuttle-GFP protein før ( B ) og 20 minutter efter tilsætningen af 10 ng / ml Leptomycin B (LMB) ( C ). Efter LMB-tillæg indføres shuttle-GFP i kernen, men eksporten tilbage til cytoplasma er blokeret. Således akkumulerer shuttle-GFP i kernerne. Målestang = 15 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Michaelis-Menten-lignende plot, der viser en stigning i nuklear fluorescens. Representative Michaelis-Menten-lignende kurver, der udviser en stigning i den nukleare fluorescens af to grupper, berørte og ikke-ramte nukleocytoplasmatiske transportceller inden for 25 minutter. De første 5 min viser en høj forskel i stigningshastigheden, hvilket er deKrøllet over tid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: C9orf72 DPRs poly (PR) og poly (GR) ekspression i NSC-34 celler. Repræsentative billeder af NSC-34 celler transficeret med C9orf72 DPRs, poly (GR) ( A ) og poly (PR) ( B ). Poly (GR) udtrykkes i cellerne, men fordeles også homogent i cytosolen. Poly (PR) udtrykkes hovedsageligt i kernerne. Målestang = 30 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: C9orf72 DPRs, poly (PR) og poly (GR), hæmmer stærkt den nukleare importrate i NSC-34-celler. Motorneuronlignende NSC-34-celler blev co-transficeret med shuttle-GFP sammen med et tomt plasmid, poly (PR) eller poly (GR). Den nukleare importrate blev defineret som hældningen af den oprindelige lineære hastighed for kurven ved Vmax . Transporthastigheden opnået med det tomme plasmid blev defineret som 100%. Samtransfektion med poly (PR) og poly (GR) inhiberede transporthastigheden med ca. 50% sammenlignet med kontrol. Kvantitativ analyse blev udført på tre til fem uafhængige forsøg på en måde ANOVA. **** p <0,0001; *** p <0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol demonstrerer et meget følsomt og kvantitativt nyt assay til evaluering af små ændringer i nukleocytoplasmatisk transport. Ved anvendelse af dette system er det muligt at observere og måle nukleocytoplasmatisk transport og dets dysfunktion i realtid, ikke kun store defekter, som resulterer i dramatiske ændringer i proteinfordeling. Denne analyse har ikke kun en følsom fordel, men det kræver også lidt forberedelse, er billigt og er et meget let og lavt engagement analysen.
For at teste effektiviteten af dette system blev C9orf72 proteiner, poly (GR) og poly (PR) DPR'er, modeller af ALS og FTD, der tidligere blev vist at forårsage en nukleocytoplasmatisk transportmangel, anvendt 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Ved hjælp af dette assay var det muligt at demonstrere i realtid et fald på ca. 50% iNuklear importrate i celler, der udtrykker DPR'erne sammenlignet med celler transficeret med en kontrolvektor. Derfor åbner dette system mulighed for nemt at måle små ændringer i nukleocytoplasmatisk transport, hvilket kan skyldes disse og andre ALS- eller FTD-mutanter eller andre sygdomme, hvor potentielle defekter i nukleocytoplasmatisk transport kan eksistere. Selvom den her beskrevne protokol omhandler motorneuronlignende celler, kan den let tilpasses til andre celletyper. Vigtigst er det ved hjælp af dette system nu muligt at bestemme, hvordan forskellige molekylære faktorer eller lægemidler kan bidrage til at forebygge eller redde (selv delvis) nukleocytoplasmatiske transportmangler i ALS, FTD eller andre lidelser.
En mulig begrænsning ved anvendelse af dette assay er den begrænsede evne til at observere og markere cellekernerne i celler, der ikke har en klar kerne eller som besidder en meget lille en. For at overvinde dette kan en mulig løsning være at simpelthen bruge en større storhed tion. Dette vil dog i sidste ende reducere mængden af celler i hver cellepatch og dermed øge mængden af eksperimenter, der er nødvendige for at nå en betydelig værdi.
En anden overvejelse angår shuttle-GFP-kerne-til-cytoplasmaforholdet før tilsætning af LMB. Dette forhold kan være meget forskelligt i forskellige celletyper og kan derfor være for lille (tæt på et 1: 1 forhold) for at vise en synlig kerne. En mulig løsning er at bruge en nuklear markør på forhånd. Dette vil ikke påvirke den endelige analyse, da hver celle er normaliseret til sin oprindelige nuklearfluorescens. Derudover anbefales det at kalibrere koncentrationen af LMB, der anvendes til eksportinhibering, før dette assay udføres for effektivt at observere den optimale forøgelse af nuklear fluorescens.
Den nukleocytoplasmatiske transportmangel foreslås at spille en hovedrolle i degenerationen af motorneuroner i ALS 5 ,= "Xref"> 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Hvis det er tilfældet, ville lignende nukleocytoplasmatiske transportfejl som dem, der observeres i C9orf72-modellen, forudsiges at spille en rolle i andre ALS-modeller. På grund af den store variation mellem de forskellige modeller kan slutresultatet og molekylære manifestationer som følge af nukleocytoplasmatisk forstyrrelse i hvert tilfælde være ubemærket eller fænotypisk anderledes. På trods af omfattende undersøgelser af forskellige FALS modeller forbliver det en udfordring at forbinde dem med fælles mekanismer. Dette assay kan nu give mulighed for at overvinde, i det mindste delvist, denne udfordring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af AI laboratoriet for deres nyttige kommentarer og forslag. Vi vil gerne takke professor Mark Hipp (Max Planck Institute for Biochemistry) for at give os shuttle-GFP-vektoren. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Israels videnskabsstiftelse (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) og National Institute for Psychobiology in Israel NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 | |
| Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomycin B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
