Summary

Rodent मलेरिया परजीवी अलैंगिक और यौन रक्त चरणों और मच्छर चरणों का फेनोटाइपिक विश्लेषण

Published: May 30, 2019
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Summary

मानव मलेरिया परजीवी के लिए जीवन चक्र और कृंतक मलेरिया परजीवी के जीव विज्ञान की हड़ताली समानताके कारण, कृंतक मलेरिया मॉडल मलेरिया अनुसंधान के लिए अपरिहार्य हो गए हैं। इसमें, हमने जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक कृंतक मलेरिया प्रजातियों के फीनोटाइपिक विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली कुछ सबसे महत्वपूर्ण तकनीकों को मानकीकृत किया है।

Abstract

आनुवंशिकी और प्रणाली जीव विज्ञान प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति आणविक स्तर पर मलेरिया परजीवी के जीव विज्ञान की हमारी समझ को बढ़ावा दिया है. तथापि, वैक्सीन और कीमोथेरेपी विकास के लिए प्रभावी मलेरिया परजीवी लक्ष्य अभी भी सीमित हैं। यह मुख्य रूप से मानव प्लाज्मोडियम प्रजातियों के लिए विवो संक्रमण मॉडल में प्रासंगिक और व्यावहारिक की अनुपलब्धता के कारण है, सबसे विशेष रूप से पी फाल्सीपेरम और पी वाइवैक्सके लिए . इसलिए, कृंतक मलेरिया प्रजातियों बड़े पैमाने पर मलेरिया टीका के लिए vivo मॉडल में व्यावहारिक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया गया है, दवा लक्ष्यीकरण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और संरक्षित Plasmodiumspp. जीन के कार्यात्मक लक्षण अध्ययन. दरअसल, कृंतक मलेरिया मॉडल अमूल्य साबित हो गया है, विशेष रूप से मच्छर संचरण और जिगर चरण जीव विज्ञान की खोज के लिए, और प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए अपरिहार्य थे. हालांकि, ट्रांसजेनिक और जंगली प्रकार अलैंगिक और यौन रक्त अवस्था परजीवी के phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों में विसंगतियां हैं। इन विसंगतियों के उदाहरण रक्त-चरण परजीवी के साथ कृन्तकों के अंतःशिरा बनाम इंट्रापेरिटोनल संक्रमण और पुरुष युग्मक के मूल्यांकन का विकल्प हैं। इसमें, हम रिपोर्टर-जीन या जंगली प्रकार कृंतक मलेरिया परजीवी प्रजातियों को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक परजीवी में अलैंगिक और यौन रक्त चरणों के फीनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए मानकीकृत प्रयोगात्मक विधियों का विस्तार करते हैं। हम एनोफील्स मच्छर के वैक्टर के अंदर मलेरिया परजीवी मच्छर चरणों (गेमेट, ओकिनेट्स, ओसिस्ट, और स्पोरोजोइट्स) के फीनोटाइपकाज का मूल्यांकन करने के तरीकों का भी विस्तार से विस्तार करते हैं। इन तरीकों का विस्तृत और सरलीकृत कर रहे हैं यहाँ पी berghei और पी yoelii के घातक और गैर घातक उपभेदों के लिए, लेकिन यह भी पी Chabaudi और पी vinckei कृंतक मलेरिया प्रजातियों के लिए कुछ समायोजन के साथ लागू किया जा सकता है.

Introduction

मलेरिया परजीवी दुनिया भर में मनुष्यों में मलेरिया के संक्रमण के लाखों लोगों के कारण, 600,000 से अधिक हर साल1मृत्यु के साथ . मानव संक्रमण पांच मलेरिया परजीवी प्रजातियों के कारण होते हैं, जैसे पी फाल्सीपेरम, पी वाइवैक्स, पी ओवले, पी मलेरिया,और पी. अधिकांश नैदानिक मलेरिया नश्वरता उप-सहारा अफ्रीका1में पी फाल्सीपेरम के कारण होती है। एक अन्य मानव मलेरिया परजीवी प्रजाति है कि उप सहारा अफ्रीका के बाहर व्यापक दुनिया भर में रुग्णता का कारण बनता है पी vivax2है. अन्य तीन प्रजातियां सभी अधिक भौगोलिक रूप से प्रतिबंधित हैं और घातक पी नोल्सी3को छोड़कर सौम्य मलेरिया संक्रमण का कारण बनती हैं। संक्रमण के विवो मॉडल में प्रासंगिक और व्यावहारिक गैर मानव की अनुपलब्धता हमेशा से रही है और अभी भी मलेरिया वैक्सीन और दवा के विकास के लिए एक बाधा है। इससे पहले मलेरिया दवा लक्ष्यीकरण और चयापचय अध्ययन ों ने क्रमशः4मुर्गियों और बतखों को संक्रमित करने वाले पी गैलिनोसेसम और पी लोफोरेजैसे एवियन मलेरिया मॉडलों पर व्यापक रूप से भरोसा किया है . इसके बाद, विवो मॉडलों के रूप में विभिन्न टीकों और औषध लक्ष्यीकरण अध्ययनों में कृंतक मलेरिया प्रजातियों को धीरे-धीरे शुरू किया गया। इन वर्षों में, जीव विज्ञान और मानव मलेरिया प्रजातियों के लिए कृंतक मलेरिया मॉडल के जीवन चक्र चरणों के मेजबान परजीवी बातचीत की समानता के सबूत जमा हो गया है.

विशेष रूप से, कृंतक मलेरिया मॉडल का पता लगाने और मच्छर और पूर्व एरिथ्रोसाइटिक चरणों5के जीव विज्ञान की विशेषता के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण थे। तथापि, चार कृंतक मलेरिया प्रजातियां हैं (पी. बरघेई, पी. रक्त की प्रजातियों में रक्त चरणों के तुल्यकालन में अंतर है, जहां पी Chabaudi और पी vinckei उपभेदों के रक्त चरणों ज्यादातर तुल्यकालिक हैं, जबकि पी berghei और पी yoelii के रक्त चरणों6 नहीं कर रहे हैं , 7. एक और उल्लेखनीय अंतर रक्त चरणों है कि कुछ उपभेदों में होता है की आत्म मंजूरी है(उदा. पी yoelii 17X-NL , पी berghei NK65 , और पी vinckei lentum), जबकि अन्य के रक्त संक्रमण एक ही प्रजाति के उपभेदों घातक हो सकता है अगर अनुपचारित छोड़ दिया (पीyoelii 17X-L, पी berghei ANKA, और पी Chabaudi AS). इसके अलावा, पी yoelii 17X-NL तनाव और पी berghei ANKA तनाव अधिमानी रूप से reticulocytesआक्रमण 8,9,10,11, हालांकि पी की इन सुविधाओं. योलाई और पी बर्गेई उपभेदों एक सख्त विकास की आवश्यकता नहीं हैं12,13,14. इसलिए, चूहों उन परजीवी के रक्त चरणों के साथ एक संक्रमण से पहले फेनिलहाइड्रेज़ीन के साथ इलाज कर रहे हैं परजीवी और gametocytemia पी berghei ANKA तनाव के लिए एक मच्छर संक्रमण के लिए आवश्यक बढ़ाने के लिए और पी yoelii के लिए 17X-NL15,16,17,18,19.

मच्छर चरणों के विकास में अंतर भी विभिन्न कृंतक मलेरिया प्रजातियों के बीच मौजूद हैं, सबसे उल्लेखनीय तापमान और इष्टतम मच्छर चरणों के विकास के लिए आवश्यक समय जा रहा है और sporozoite लंबाई5,6, 20| कृंतक मलेरिया प्रजातियों के पूर्व एरिथ्रोसाइटिक चरणों में, मतभेदों में कृंतक प्रजातियां और तनाव शामिल हैं जो संक्रामक स्पोरोज़ोइट टीका के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं, अतिसंवेदनशील कृंतक तनाव में टीका लगाने के लिए आवश्यक स्पोरोजोइट्स की संख्या, इन विट्रो यकृत अवस्था विकास परख के लिए आवश्यक स्तनधारी कोशिका प्रकार , और जिगर चरण विकासकोपूरा करने के लिए समय 5 ,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

इन विभिन्नक्षमताओं के बावजूद, कृंतक मलेरिया परजीवी रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण के आवेदन के लिए जल्दी अनुकूल मॉडल थे, क्योंकि वे कम समय और संसाधन की सफलता की एक उच्च संभावना के साथ लेने वालीथी 31. वास्तव में, कृंतक मलेरिया मॉडल सबसे अच्छा मॉडल थे, और कई मामलों में केवल मॉडल, कई वर्षों के लिए उपलब्ध कार्यात्मक मच्छर और जिगर के चरणों में व्यक्त जीन की विशेषता.

लोकप्रियता और कृंतक मलेरिया मॉडल में रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण की सुविधा के प्रकाश में, विभिन्न तरीकों की एक संख्या transgenic परजीवी जीवन चक्र चरणों, विशेष रूप से रक्त चरणों के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है. हालांकि, इन तरीकों में से कुछ असंगत हैं; उदाहरण के लिए, एक आईपी इंजेक्शन के बाद रक्त-चरण परजीवी के संक्रमण की तुलना (जो संभवतः peritoneal लिम्फ नोड्स के लिए सूखा रहे हैं और, वहाँ से, खून में प्रवेश कर सकते हैं; इसलिए, इंजेक्शन परजीवी खून में समान रूप से अंत नहीं है) , सीरियल रक्त चरण स्थानान्तरण या जी संख्या की एक अलग संख्या के साथ क्लोन के मच्छर संचरण की तुलना (जो gametocytogenesis को प्रभावित कर सकता है32,33), या ट्रांसजेनिक परजीवी की तुलना सीधे भोले जंगली प्रकार (WT) के लिए परजीवी है कि इलेक्ट्रोपोरेशन और सकारात्मक दवा चयन और पुरुष gamete exflagellation के विभिन्न अमानकीकृत मूल्यांकन के अधीन कभी नहीं थे. इसलिए, यह प्रोटोकॉल है कि रक्त में ट्रांसजेनिक या WT कृंतक मलेरिया परजीवी के किसी भी प्रकार के phenotypic विश्लेषण के लिए पालन करने के लिए सरल कर रहे हैं मानकीकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है और मच्छर में कृंतक मलेरिया की जैविक variabilities के लिए समायोजित करने के लिए परजीवी प्रजातियों.

इसमें, हम ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार के रक्त और मच्छर जीवन चक्र चरणों के phenotypic विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत, विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर रिपोर्ट पी yoelii और पी berghei परजीवी. ये प्रोटोकॉल पी चबौडी और पी विन्केई परजीवी पर भी लागू होते हैं।

Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रयोगों को टूलेन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और बेज़ियालम वाकिफ विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति के अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया। ?…

Representative Results

मलेरिया परजीवी के लिए रिवर्स आनुवंशिक उपकरण और तकनीक लागू करने की सफलता ने मलेरिया अनुसंधान के क्षेत्र में क्रांति ला दी है, जिसमें कई प्लाज्मोडियम प्रजातियों39के विशिष्ट जीन…

Discussion

मानव मलेरिया परजीवी के लिए अपने जीवन चक्र के सामान्य जीव विज्ञान में समानता के बावजूद, माउस मलेरिया मॉडल भी मानव प्लाज्मोडियम प्रजातियों है कि vivo मॉडल में विश्वसनीय के रूप में उनके उपयोग की सीमा…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

अहमद आली विकास अनुदान 2015BSV036 से Bezmialem Vakif विश्वविद्यालय के लिए धन द्वारा समर्थित है, और सार्वजनिक स्वास्थ्य और उष्णकटिबंधीय चिकित्सा के Tulane विश्वविद्यालय स्कूल द्वारा प्रदान की धन द्वारा, और R21Grant के लिए NIH-NIAID से धन द्वारा 1R21AI11058-01A1.

Materials

Heparin Sigma 375095-100KU
Xanthurenic acid Sigma D120804-5G
Hypoxanthine Sigma H9377-25G
Alsever's solution Sigma A3551-500ML
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Phenylhydrazine Sigma P26252-5G
Glycerol Sigma G5516-500ML
Giemsa Sigma GS1L-1L
26G x 3/8 Precision Glide Needle,  Becton Dickinson 305110
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 Becton Dickinson 309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G Becton Dickinson 329412
Isoflurane, USB Piramal 2667- 46- 7
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
RPMI Gibco 22400105
DMEM Gibco 11995065
Pencillin/ Streptomycin Gibco 10378016
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Fiber Glass Wool Corning 3950

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Aly, A. S., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).

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