Rodent मलेरिया परजीवी अलैंगिक और यौन रक्त चरणों और मच्छर चरणों का फेनोटाइपिक विश्लेषण
Summary
मानव मलेरिया परजीवी के लिए जीवन चक्र और कृंतक मलेरिया परजीवी के जीव विज्ञान की हड़ताली समानताके कारण, कृंतक मलेरिया मॉडल मलेरिया अनुसंधान के लिए अपरिहार्य हो गए हैं। इसमें, हमने जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक कृंतक मलेरिया प्रजातियों के फीनोटाइपिक विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली कुछ सबसे महत्वपूर्ण तकनीकों को मानकीकृत किया है।
Abstract
आनुवंशिकी और प्रणाली जीव विज्ञान प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति आणविक स्तर पर मलेरिया परजीवी के जीव विज्ञान की हमारी समझ को बढ़ावा दिया है. तथापि, वैक्सीन और कीमोथेरेपी विकास के लिए प्रभावी मलेरिया परजीवी लक्ष्य अभी भी सीमित हैं। यह मुख्य रूप से मानव प्लाज्मोडियम प्रजातियों के लिए विवो संक्रमण मॉडल में प्रासंगिक और व्यावहारिक की अनुपलब्धता के कारण है, सबसे विशेष रूप से पी फाल्सीपेरम और पी वाइवैक्सके लिए . इसलिए, कृंतक मलेरिया प्रजातियों बड़े पैमाने पर मलेरिया टीका के लिए vivo मॉडल में व्यावहारिक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया गया है, दवा लक्ष्यीकरण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और संरक्षित Plasmodiumspp. जीन के कार्यात्मक लक्षण अध्ययन. दरअसल, कृंतक मलेरिया मॉडल अमूल्य साबित हो गया है, विशेष रूप से मच्छर संचरण और जिगर चरण जीव विज्ञान की खोज के लिए, और प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए अपरिहार्य थे. हालांकि, ट्रांसजेनिक और जंगली प्रकार अलैंगिक और यौन रक्त अवस्था परजीवी के phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों में विसंगतियां हैं। इन विसंगतियों के उदाहरण रक्त-चरण परजीवी के साथ कृन्तकों के अंतःशिरा बनाम इंट्रापेरिटोनल संक्रमण और पुरुष युग्मक के मूल्यांकन का विकल्प हैं। इसमें, हम रिपोर्टर-जीन या जंगली प्रकार कृंतक मलेरिया परजीवी प्रजातियों को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक परजीवी में अलैंगिक और यौन रक्त चरणों के फीनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए मानकीकृत प्रयोगात्मक विधियों का विस्तार करते हैं। हम एनोफील्स मच्छर के वैक्टर के अंदर मलेरिया परजीवी मच्छर चरणों (गेमेट, ओकिनेट्स, ओसिस्ट, और स्पोरोजोइट्स) के फीनोटाइपकाज का मूल्यांकन करने के तरीकों का भी विस्तार से विस्तार करते हैं। इन तरीकों का विस्तृत और सरलीकृत कर रहे हैं यहाँ पी berghei और पी yoelii के घातक और गैर घातक उपभेदों के लिए, लेकिन यह भी पी Chabaudi और पी vinckei कृंतक मलेरिया प्रजातियों के लिए कुछ समायोजन के साथ लागू किया जा सकता है.
Introduction
मलेरिया परजीवी दुनिया भर में मनुष्यों में मलेरिया के संक्रमण के लाखों लोगों के कारण, 600,000 से अधिक हर साल1मृत्यु के साथ . मानव संक्रमण पांच मलेरिया परजीवी प्रजातियों के कारण होते हैं, जैसे पी फाल्सीपेरम, पी वाइवैक्स, पी ओवले, पी मलेरिया,और पी. अधिकांश नैदानिक मलेरिया नश्वरता उप-सहारा अफ्रीका1में पी फाल्सीपेरम के कारण होती है। एक अन्य मानव मलेरिया परजीवी प्रजाति है कि उप सहारा अफ्रीका के बाहर व्यापक दुनिया भर में रुग्णता का कारण बनता है पी vivax2है. अन्य तीन प्रजातियां सभी अधिक भौगोलिक रूप से प्रतिबंधित हैं और घातक पी नोल्सी3को छोड़कर सौम्य मलेरिया संक्रमण का कारण बनती हैं। संक्रमण के विवो मॉडल में प्रासंगिक और व्यावहारिक गैर मानव की अनुपलब्धता हमेशा से रही है और अभी भी मलेरिया वैक्सीन और दवा के विकास के लिए एक बाधा है। इससे पहले मलेरिया दवा लक्ष्यीकरण और चयापचय अध्ययन ों ने क्रमशः4मुर्गियों और बतखों को संक्रमित करने वाले पी गैलिनोसेसम और पी लोफोरेजैसे एवियन मलेरिया मॉडलों पर व्यापक रूप से भरोसा किया है . इसके बाद, विवो मॉडलों के रूप में विभिन्न टीकों और औषध लक्ष्यीकरण अध्ययनों में कृंतक मलेरिया प्रजातियों को धीरे-धीरे शुरू किया गया। इन वर्षों में, जीव विज्ञान और मानव मलेरिया प्रजातियों के लिए कृंतक मलेरिया मॉडल के जीवन चक्र चरणों के मेजबान परजीवी बातचीत की समानता के सबूत जमा हो गया है.
विशेष रूप से, कृंतक मलेरिया मॉडल का पता लगाने और मच्छर और पूर्व एरिथ्रोसाइटिक चरणों5के जीव विज्ञान की विशेषता के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण थे। तथापि, चार कृंतक मलेरिया प्रजातियां हैं (पी. बरघेई, पी. रक्त की प्रजातियों में रक्त चरणों के तुल्यकालन में अंतर है, जहां पी Chabaudi और पी vinckei उपभेदों के रक्त चरणों ज्यादातर तुल्यकालिक हैं, जबकि पी berghei और पी yoelii के रक्त चरणों6 नहीं कर रहे हैं , 7. एक और उल्लेखनीय अंतर रक्त चरणों है कि कुछ उपभेदों में होता है की आत्म मंजूरी है(उदा. पी yoelii 17X-NL , पी berghei NK65 , और पी vinckei lentum), जबकि अन्य के रक्त संक्रमण एक ही प्रजाति के उपभेदों घातक हो सकता है अगर अनुपचारित छोड़ दिया (पीyoelii 17X-L, पी berghei ANKA, और पी Chabaudi AS). इसके अलावा, पी yoelii 17X-NL तनाव और पी berghei ANKA तनाव अधिमानी रूप से reticulocytesआक्रमण 8,9,10,11, हालांकि पी की इन सुविधाओं. योलाई और पी बर्गेई उपभेदों एक सख्त विकास की आवश्यकता नहीं हैं12,13,14. इसलिए, चूहों उन परजीवी के रक्त चरणों के साथ एक संक्रमण से पहले फेनिलहाइड्रेज़ीन के साथ इलाज कर रहे हैं परजीवी और gametocytemia पी berghei ANKA तनाव के लिए एक मच्छर संक्रमण के लिए आवश्यक बढ़ाने के लिए और पी yoelii के लिए 17X-NL15,16,17,18,19.
मच्छर चरणों के विकास में अंतर भी विभिन्न कृंतक मलेरिया प्रजातियों के बीच मौजूद हैं, सबसे उल्लेखनीय तापमान और इष्टतम मच्छर चरणों के विकास के लिए आवश्यक समय जा रहा है और sporozoite लंबाई5,6, 20| कृंतक मलेरिया प्रजातियों के पूर्व एरिथ्रोसाइटिक चरणों में, मतभेदों में कृंतक प्रजातियां और तनाव शामिल हैं जो संक्रामक स्पोरोज़ोइट टीका के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं, अतिसंवेदनशील कृंतक तनाव में टीका लगाने के लिए आवश्यक स्पोरोजोइट्स की संख्या, इन विट्रो यकृत अवस्था विकास परख के लिए आवश्यक स्तनधारी कोशिका प्रकार , और जिगर चरण विकासकोपूरा करने के लिए समय 5 ,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
इन विभिन्नक्षमताओं के बावजूद, कृंतक मलेरिया परजीवी रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण के आवेदन के लिए जल्दी अनुकूल मॉडल थे, क्योंकि वे कम समय और संसाधन की सफलता की एक उच्च संभावना के साथ लेने वालीथी 31. वास्तव में, कृंतक मलेरिया मॉडल सबसे अच्छा मॉडल थे, और कई मामलों में केवल मॉडल, कई वर्षों के लिए उपलब्ध कार्यात्मक मच्छर और जिगर के चरणों में व्यक्त जीन की विशेषता.
लोकप्रियता और कृंतक मलेरिया मॉडल में रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण की सुविधा के प्रकाश में, विभिन्न तरीकों की एक संख्या transgenic परजीवी जीवन चक्र चरणों, विशेष रूप से रक्त चरणों के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है. हालांकि, इन तरीकों में से कुछ असंगत हैं; उदाहरण के लिए, एक आईपी इंजेक्शन के बाद रक्त-चरण परजीवी के संक्रमण की तुलना (जो संभवतः peritoneal लिम्फ नोड्स के लिए सूखा रहे हैं और, वहाँ से, खून में प्रवेश कर सकते हैं; इसलिए, इंजेक्शन परजीवी खून में समान रूप से अंत नहीं है) , सीरियल रक्त चरण स्थानान्तरण या जी संख्या की एक अलग संख्या के साथ क्लोन के मच्छर संचरण की तुलना (जो gametocytogenesis को प्रभावित कर सकता है32,33), या ट्रांसजेनिक परजीवी की तुलना सीधे भोले जंगली प्रकार (WT) के लिए परजीवी है कि इलेक्ट्रोपोरेशन और सकारात्मक दवा चयन और पुरुष gamete exflagellation के विभिन्न अमानकीकृत मूल्यांकन के अधीन कभी नहीं थे. इसलिए, यह प्रोटोकॉल है कि रक्त में ट्रांसजेनिक या WT कृंतक मलेरिया परजीवी के किसी भी प्रकार के phenotypic विश्लेषण के लिए पालन करने के लिए सरल कर रहे हैं मानकीकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है और मच्छर में कृंतक मलेरिया की जैविक variabilities के लिए समायोजित करने के लिए परजीवी प्रजातियों.
इसमें, हम ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार के रक्त और मच्छर जीवन चक्र चरणों के phenotypic विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत, विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर रिपोर्ट पी yoelii और पी berghei परजीवी. ये प्रोटोकॉल पी चबौडी और पी विन्केई परजीवी पर भी लागू होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव मलेरिया परजीवी के लिए अपने जीवन चक्र के सामान्य जीव विज्ञान में समानता के बावजूद, माउस मलेरिया मॉडल भी मानव प्लाज्मोडियम प्रजातियों है कि vivo मॉडल में विश्वसनीय के रूप में उनके उपयोग की सीमा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अहमद आली विकास अनुदान 2015BSV036 से Bezmialem Vakif विश्वविद्यालय के लिए धन द्वारा समर्थित है, और सार्वजनिक स्वास्थ्य और उष्णकटिबंधीय चिकित्सा के Tulane विश्वविद्यालय स्कूल द्वारा प्रदान की धन द्वारा, और R21Grant के लिए NIH-NIAID से धन द्वारा 1R21AI11058-01A1.
Materials
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/ Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi–zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B., Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here?. Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel ‘gene insertion/marker out’ (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
