Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

שיטה לבחינת ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ב Published: July 17, 2017 doi: 10.3791/55690
Automatic Translation
1, 1
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

Summary

אנו מדגימים assay לנתח את רמזים סביבתיים וגנטיים המשפיעים על התנהגות ההזדווגות של זבוב הפירות תסיסנית melanogaster .

Abstract

הדחף המיני של האדם מושפע מגנוטיפ, מניסיון ותנאי סביבה. איך גורמים אלה אינטראקציה כדי לווסת התנהגויות מיניות נשאר מובן. ב תסיסנית melanogaster , רמזים סביבתיים, כגון זמינות מזון, משפיעים על פעילות ההזדווגות המציע מערכת דקדנית לחקור את מנגנונים modulating מינית התנהגות. ב ד melanogaster , רמזים סביבתיים הם חשו לעתים קרובות באמצעות chemosensory gustatory ומערכות חוש הריח. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את ההשפעה של רמזים כימיים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות. Assay מורכב הזירה הזדווגות קטן המכיל בינוני מזון זוג מזדווגים. תדירות ההזדווגות עבור כל זוג הוא פיקוח מתמיד במשך 24 שעות. כאן אנו מציגים את תחולת assay זה כדי לבדוק תרכובות סביבתיות ממקור חיצוני באמצעות מערכת אוויר דחוס כמו גם מניפולציה של רכיבים סביבתיים ישירות בזירה ההזדווגות. USe של מערכת האוויר בלחץ שימושי במיוחד כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נדיפים מאוד, תוך מניפולציה רכיבים ישירות בזירה ההזדווגות יכול להיות בעל ערך כדי לוודא נוכחות של המתחם. Assay זה יכול להיות מותאם לענות על שאלות לגבי ההשפעה של רמזים גנטיים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ואת פוריות, כמו גם אחרים התנהגות הרבייה זכר ונקבה.

Introduction

התנהגויות פוריות בדרך כלל יש עלויות אנרגיה גבוהות, במיוחד עבור הנקבות, אשר מייצרים gametes גדול יותר מאשר גברים חייב בזהירות בחר את התנאים להעלות את צאצאיהם המתפתחים. בגלל עלות האנרגיה, אין זה מפתיע כי רבייה קשורה לתנאים תזונתיים. זה נכון ברוב, אם לא כל, חיות כולל יונקים, התבגרות אשר יכול להתעכב על ידי תת תזונה, ואשר דחף מיני יכול להיות מושפעת לרעה על ידי מזון הגבלה 1.

רפרודוקציה של אורגניזם מודל גנטי תסיסנית melanogaster מושפע גם בתנאים תזונתיים. גברים בבית המשפט ברמה גבוהה יותר בנוכחות מזון נדיפים 2 , ונקבה הם יותר מינית פתוח בנוכחות שמרים, מזין עיקרי לייצור ביצים וצאצאים הישרדות 3 , 4 , 5 . זֶהאבולוציונית משמרת התגובה הרבייה למזון מציעה הזדמנות ללמוד מנגנונים המחברים זמינות מזון סביבתי כדי רבייה מינית באורגניזם גנטית זמן יעיל. ואכן, עבודה ד melanogaster יש מעורבים את מסלול האינסולין כווסת חשוב של הקשר בין מזון התנהגות ההזדווגות 6 . זה הוכיח גם כי מעשה ההזדווגות עצמו משנה את העדפת המזון של הנקבות, כמו גם את הנוירונים chemosensory הקשורים 7 , 8 , 9 .

ברור כי רמזים למזון משפיעים על התנהגויות הרבייה ב מלנוגאסטר . תופעות אלה נראים משפיעים בעיקר נשים, במיוחד לאלה שכבר הזדווגו 5. עם זאת, כדי לבדוק את ההשפעות האלה חריפה של תנאים סביבתיים assay בשימוש קלאסי עבור התנהגות ההזדווגות הנשי עשוילא להיות מתאים מאוד עקב הפרעות ארוכות בין פרקים ההזדווגות. ב assay remating קלאסי, נקבה בתולה הראשון mates עם זכר, והוא מבודד מיד ומוצג עם זכר חדש 24 עד 48 שעות מאוחר יותר. זה assay קלאסי שימש בהצלחה רבה כדי לזהות רכיבים של פליטה זכר לשנות את ההתנהגות הנשית ואת התגובה הנשית 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Assay ההזדווגות מתמשך הוכיח כאן, ולכן, בנוסף מבחני ההזדווגות הקלאסית שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את ההשפעה החריפה של תנאים סביבתיים על התנהגויות הרבייה.

באמצעות assay מתמשך עבור התנהגות ההזדווגות מוסבר כאן, הראינו בעבר כי זוג זבובים חשופים שמרים יהיה remate sאי פעם על פני תקופת תצפית של 24 שעות 5 , 19 , 20 , 21 , בעוד זבובים לא חשופים למזון יהיה רק ​​פעם אחת 5 . ממצא זה יכול להיות תמוהה לאור חלק גדול של הספרות ד melanogaster המציין כי הנקבות לא remate עבור מספר ימים לאחר הזדווגות הראשונית (נסקרו הפניות 10 , 11 ). עם זאת, פער זה יכול בקלות להיות מוסבר על ידי תנאי assay, שבו נקבה מבודדת במשך יום עד כמה ימים לפני הזדמנות ההזדווגות החדשה מסופק. אם הצמד אינו מזדווג במהלך תקופת תצפית זו של שעה, הנקבה מאופיינת כבלתי פתוחה. יתר על כן, תדירות ההזדווגות גבוהה לא צריך להיות מפתיע בהתחשב בנתונים של זבובים נתפס בר להראות כי הנקבות מכילות זרע מ 4 עד 6 זכרים באברי האחסון שלהם; ובכךDicating כי הנקבות באופן טבעי remate מספר פעמים 22 , 23 .

כאן, אנו מדגימים את השימוש זה assay הזדווגות מתמשך כדי לפענח כיצד זבובים לאסוף ולשלב מידע על תנאי הסביבה כדי לווסת את תדירות ההזדווגות. Assay זה מאפשר אחד לבחון מספר גדול יחסית של זוגות ההזדווגות עבור מחקרים גנטיים כדי לבדוק את ההשפעה של רמזים סביבתיים נדיפים ולא תנודתיים. Assay בדרך כלל פועל במשך 24 שעות, אבל יכול להיות המורחבת ל 48 שעות, המאפשר בדיקה של רמזים סביבתיים רכיבה כגון מחזור כהה (LD) אור. אנו מדגימים assay זה על ידי בדיקת ההשפעה של רמזים נדיפים מתרבות שמרים בתוך מערכת אוויר בלחץ בשילוב עם הזמינות של מזין שמרים בלתי נדיף מצע מזון.

מערכת האוויר בלחץ ברציפות משאבות רמזים נדיפים לזירת ההזדווגות המכיליםמזון מצע זוג הבדיקה (אשר התנהגות ההזדווגות שלו מנוטר). כדי לקבוע עוד יותר את הפרטים באמצעותם השמרים משפיע על ההזדווגות, אנו בוחנים תרכובת נדיפה גדולה של שמרים, כלומר חומצה אצטית 24 , בשילוב עם חומצת אמינו תוכן המתאים לזה של שמרים במצע מזון, בצורה של פפטון (אמינו חומצות הנובעות מעיכול אנזימטי של חלבונים מן החי). יחד אלה ניסויים להדגים כיצד ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות של ד melanogaster ניתן לבדוק עם assay זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תיבת הזיווג בשליטת הסביבה

  1. כדי להבטיח אזור בדיקה מבוקר וקל לניקוי, הגדרת ארון מטבח נירוסטה של ​​120 ס"מ x 64 ס"מ x 85 ס"מ כפי שמוצג באיור 1A.
    1. מקדחה חור אחד בחלק האחורי של ארון ממש מתחת לתקרה ארבעה סטים של ארבעה חורים לתוך הצדדים, כל אחד עם קוטר של 2 ס"מ. מקדחה את שתי קבוצות הראשון של ארבעה חורים, על כל צד של הקופסה בגובה של 7 ס"מ מהחלק התחתון של התיבה עם 12.5 ס"מ בין חורים. מקדחה את שתי קבוצות אחרות בכל צד של הקופסה בגובה של 35 ס"מ מלמטה.
      הערה: ארבעת הסטים של ארבעה חורים משמשים כבלי חשמל המצלמה צינורות משאבת אוויר להיכנס ולצאת מהארון. החור בגב משמש עבור כבלי החשמל של לוח אור.
    2. בניית לוח אור עם 18 שורות של 40 לסירוגין לבן ואור אדום פולטות דיודות (LED) עם שטח 2.5 ס"מ בין כל light.Mount לבן ואדום LEDs ב circuiלא עם אספקת החשמל. לחבר כל LED בסדרה עם נגד של 560 Ω, 0.25W ו 5% סובלנות.
      הערה: אורכי הפליטה של ​​האור האדום נמתחו מ -590 עד 661 ננומטר עם שיא חד ב -62 ננומטר. עוצמת האור וכתוצאה מכך באזור ניסיוני הוא כ 900 לוקס עם שני האורות על ו 90 לוקס עם רק את האורות האדומים על; זה נמדד באמצעות מד אור חכם הטלפון App.
    3. צרף את לוח האור לחלק העליון של ארון נירוסטה ולהעביר את כבלי החשמל דרך החור מאחור.
    4. חבר את המתאם של נוריות LED הלבנות לשעון בקרת חשמל כדי לאפשר כיבוי הנורית הלבנה במהלך השלב הכהה של הניסוי. חבר את המתאם של האור האדום, אשר זבובים עיוורים עד 25 , כדי לספק כוח רגיל לשמור אותם על כל משך הניסוי.
    5. תקן אחד 110 ס"מ ושני סוגריים מתכת 54 ס"מ, כל אחד עם רוחב של 0.5 ס"מ, על הצדדים הפנימיים של התיבה בגובה 50ס"מ מהחלק התחתון של התיבה. מניחים צלחת דיפוזיה זכוכית פרוסטד (מידות של 119.0 ס"מ x 54.5 ס"מ x 0.5 ס"מ) על סוגריים אלה.
    6. הוסיפו שלוש שכבות של נייר סינון (120 ס"מ x 50 ס"מ) בין לוח האור לבין צלחת הזכוכית כדי לפזר את האור הזוהר והמבליט על פני השטח של זיווג ההזדווגות (המתואר בסעיף 4). הצמד שני גיליונות נייר סינון יחד על הקצה הארוך שלהם על מוטות עץ 120 ס"מ ארוך באמצעות מגנטים (בצד), כדי לתקוע אותם לתוך הקירות של ארון המתכת; לבצע פעולה זו 3 פעמים.
    7. צרף ארבעה מעריצים בצדדי הקופסה כדי ליצור זרם אוויר ברציפות אוורור תיבת ההזדווגות. צרף את המערכה הראשונה של 8 ס"מ אוהדים בין לוח האור ואת צלחת זכוכית, עם כניסת האוויר בצד שמאל ואת הפליטה בצד ימין של התיבה, כדי למזער את בניית החום שנוצר על ידי לוח האור.
    8. צרף את הסט השני של 12 ס"מ אוהדים 25 ס"מ מעל התחתון של הממשלה כדי ליצור זרימת אוויר החוצה כי פתחי אוNside של ארון ו cools אותו יציב 26 ° C. צרף את המעריצים בצד הפליטה אל צינור היניקה ולהוביל את Airstream מחוץ לחדר כדי למנוע רכיבה מחדש של האוויר בארון.
  2. הגדר שתי עמדות (כ 48 ס"מ גבוה) רכוב עם שני מלחציים, אחד ב 28 ס"מ ואחד ב 30 ס"מ מבסיס הדוכן. תקן מצלמת אינטרנט על כל אחד מהדקים. חבר את 4 המצלמות למחשב המריץ את תוכנת הניטור.
  3. הצב גליונות A4 מתחת לכל מצלמת אינטרנט. השתמש גיליונות לבנים או גיליונות מודפסים עם טרום טבלה ממוספר של 7 על ידי 5 ריבועים עם 4 ס"מ צירים כדי להתאים זיווגים זיווג (המתואר בסעיף 4).
    הערה: מצלמת מצלמת HD עם תצוגת זווית רחבה של 78 מעלות ורזולוציה של 5 מיליון פיקסלים יכולה לכסות שטח של 21 ס"מ x 30 ס"מ המקביל לגיליון A4 ולנטר בין 20 ל -35 זירות זיווג.

2. לטוס אחורה אוסף

  1. מקום 20 זכר ו -20 נקבה wild-type קנטון- Sזבובים לתוך זבובים גידול בקבוקים המכילים 45 מ"ל עשיר לטוס מזון בינוני (ראה סעיף 3) במשך שלושה עד ארבעה ימים. מעבירים את אותם מבוגרים שלוש פעמים על ידי הקשה הראשונה אותם ולאחר מכן לתוך בקבוקים טריים.
    1. מניחים את הבקבוקים באינקובטור ב 25 ° C, ו 12 שעות: 12 שעות אור כהה מחזור עם אורות ב 09:00 (Zeitgeber הזמן (ZT) 0). דור חדש יופיע כעשרה ימים לאחר מכן.
  2. להרדים את הזבובים החדשים eclosed וכתוצאה מכך על רפידות פחמן דו חמצני לא יותר מ 5 דקות לאסוף אותם לתוך בקבוקונים מזון זבוב באמצעות מברשת צבע.
    1. איסוף בתולה (eclosed לאחרונה) נקבות וזכרים בתולה מן wild-type קנטון- S בקבוקי מניות לתוך 2.5 ס"מ x 9.5 ס"מ טוס בקבוקונים גידול עם 6.5 מ"ל של מזון עשיר לטוס מזון.
  3. גיל הזבובים בקבוצות המין זהה של 20 זבובים כל אחד בקבוקונים לגידול טוס במשך 5 עד 8 ימים על 25 מעלות צלזיוס ו 12 שעות: 12 שעות אור כהה מחזור האורות ב 09:00 (ZT 0).
  4. Transfאה זבובים כדי צפרדעים טריים לגדל בקבוקונים ביום שלפני הניסוי.

3. הכנה בינונית למזון

  1. הכן 1 ליטר של עשיר לטוס בינוני כדלקמן.
    1. יוצקים 1 ליטר של מי ברז כוס 2 ליטר זכוכית עם מגש מערבי מגנטי לשים את הכוס על צלחת חמה מגנטית. שמור על ערבוב ולהפוך את החימום עד 300 מעלות צלזיוס עד הטמפרטורה רותחים הוא הגיע.
      הערה: במהלך זמן ההרתחה הארוך בשלבים הבאים חלק של מים יתאדו, אבל יחד עם המרכיבים הוסיף זה פרוטוקול תוצאות 1 L של בינוני זבוב עשיר כאשר הכן בטמפרטורת החדר של כ 22 מעלות צלזיוס.
    2. מוסיפים את המריחה ל -500 סיבובים בדקה (סל"ד) ומוסיפים את המרכיבים הבאים למים הרותחים: 10 גרם אגר, 30 גרם גלוקוז, סוכרוז 15 גרם, 15 גרם תירס, 10 גרם חיטה, 10 גרם קמח סויה, 30 גרם מולסה, 35 גרם שמרים יבשים פעילים. חכה שמרים קצף במרץ, ואז לדחות את הטבלה צלחת חםבוגר עד 120 ° C.
    3. לאחר 10 דקות להפעיל את צלחת חמה עד 30 מעלות צלזיוס ולתת לתערובת לבחוש עד מקורר ל 48 מעלות צלזיוס. צג הטמפרטורה על ידי הוספת מדחום ישירות לתוך האוכל.
    4. ממיסים 2 גרם של p-hydroxy-benzoic חומצה מתיל אסתר (tegosept, 100%) לתוך 10 מ"ל של 96% אתנול. הוסף זה 5 מ"ל של 1 M חומצה propionic לתערובת. מערבבים במשך 3 דקות.
    5. יוצקים את המדיום מזון זבוב לתוך זירות (המתואר בסעיף 4) כדי ליצור שכבה 0.3 ס"מ עובי בתחתית הזירה.
      1. השתמש כוס 200 מ"ל זכוכית לשפוך. כאשר כמויות המדויק הם חשובים, השתמש פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
  2. הכן זבוב בינוני פחות שמרים בדיוק כפי שמתואר בשלב 3.1.1 עד 3.1.5, אבל לעזוב את השמרים בשלב 3.1.2.
  3. הכן בינוני עם אגר עם או בלי פפטון על ידי ערבוב 10 גרם אגר ו 35 גרם peptone ב 1 L של מים רותחים ולבצע צעדים 3.1.4 כדי 3.1.5.

4. מאטיןG ארנה הכנה

  1. פירס חור כ 0.3 ס"מ קוטר בצד העליון של 3.5 ס"מ x 1.0 ס"מ צלחת פטרי פלסטיק באמצעות מחט הכנה מחוממת (מחומם לאדמומיות מבער בונזן). לחלופין, השתמש מלחם.
  2. בעת הכנת בינוני מזון עם תרכובות ריחניות, הראשון פיפטה 30 μL (1% של המדיום הסופי מזון, למשל חומצה אצטית קרחוני 100%) של המתחם הרצוי לתוך המנה למחצית מנות ניסיוני. השאירו את החצי השני של המנות ריקות להשוואה.
    הערה: עם הגדרת המתואר כאן, ניתן לבדוק עד 140 זירות בו זמנית.
  3. באמצעות 10 מ"ל פיפטה סרולוגית, לשפוך 3 מ"ל של מדיום מזון בתחתית המנה על גבי המתחם הרצוי. מכסים אותו בבד גבינה כדי למנוע זיהום, ולהשאיר את המדיום כדי לחזק כ 1 שעות בטמפרטורת החדר.
  4. מניחים מכסה על הכלים וקלטת כל סגור משני צדדים. הכינו קטן פרפין הסרט plugs כדי לכסות את החורים שלאת הכלים על ידי רולינג חתיכות של סרט פרפין לתוך 0.2 ס"מ לחמניות עבות ולאחר מכן לחתוך אותם 0.5 ס"מ.

5. שמרים תרבות ריח

  1. לגדל שמרים פעילים יבשים על שמרים לחלץ פפטון דקסטרוז (YPD) אגר ב 14.0 ס"מ x 2.06 ס"מ צלחת פטרי. ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום בשלב זה.
    1. הכינו צלחות אגר YPD על ידי הוספת 10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם peptone, 22 גרם גלוקוז (0) + - גלוקוז מונוהידראט) ו 15 אגר (טהור) ל 1 ליטר של מים ultrapure רותחים. שכבת התחתון של צלחת פטרי פעם הכל מומס ולאחסן במהופך במקרר ב 4 מעלות צלזיוס, עד 2 חודשים.
    2. מפזרים כמה גרגרי שמרים מיובשים על צלחת בינונית YPD, לתת להם להתמוסס. לאחר מכן פסים את הצלחת בינוני באמצעות לולאה סטרילית. חנות הצלחת 30 ° C חממה לילה. לאחר מכן, לאחסן את התרבות במקרר לא יותר מ 1 בשבוע.
  2. הכן בינוני YPD נוזלי אניN 1 l בקבוקי ידי הוספת 10 גרם שמרים לחלץ, 20 גרם peptone, 22 גרם גלוקוז (0) + - גלוקוז מונוהידראט) ו לערבב ל 1 l ultrapure מים.
    1. החיטוי במשך 25 דקות על 120 מעלות צלזיוס 1 בר הלחץ. לאחר מכן, לאחסן את הבקבוקים על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 חודשים עד לשימוש.
  3. הכניסו את מכסה הבקבוקים הפתוחים (4.5 ס"מ) עם מחיצת סיליקון עבה 0.32 ס"מ.
    1. חותכים שני חורים קטנים מחצה כדי להתאים בחוזקה אביזרי מחיצות תיל. צרף את צינור פוליוויניל כלורי (PVC) קטן (בקוטר: 0.8 ס"מ החיצוני 0.5 ס"מ הפנימי) לשני שקעים היוצאים את הבקבוק ורק אחד הכניסה נכנסים לבקבוק. ראה איור 1 ב 'להמחשה.
    2. לעטוף את כובעי מצויד צינורות רדיד אלומיניום החיטוי במשך 25 דקות על 120 מעלות צלזיוס 1 בר לחץ.
  4. ללבוש כפפות כדי להגן מפני זיהום בשלב זה. טובלים סטרילית 100 פיפטה μL קצה לתוך אחד המושבות שמרים מהצלחת אגר YPD (דEscribed ב 5.1) ושחרר אותו לתוך בקבוק נוזלי YPD autoclaved.
    1. שווי זה שמרים- inoculated YPD בקבוק נוזלי בינוני, כמו גם בקבוק בקרת YPD בינוני (שמרים לא הוסיף) עם כובעים autoclaved רכוב עם ו - מוצא (המתואר בשלב 5.3). שים את שני בקבוקים על צלחות מגנטי נפרד ומערבב 100 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר את התרבות שמרים לגדול.
    2. חבר את פתחי הכניסה של שני בקבוקים משאבות אקווריום נפרד לספק את האוויר לתרבות שמרים. הקפד לחבר את השקע של בקבוק שמרים ניסיוני לצינור אוורור ריח שמרים מתוך חדר ניסיוני כדי למנוע הפרעה עם הניסוי.

6. משאבת אוויר הגדרת

  1. צרף את צינורות PVC גדול (בקוטר: 1.2 ס"מ חיצוני 0.9 ס"מ פנימי) לאוויר דחוס אספקת ולהוביל אותו דרך שתי כוסות L 1 בקבוקי Erlenmeyer מלאים פחם מופעל ל 800 מ"לכדי לטהר את האוויר. השתמש או אוויר דחוס מסופק בדרך כלל במעבדות כמו אספקת אוויר, או לחבר את הצינורות למשאבת אוויר (האוויר בלחץ שימש כאן).
    הערה: חומר הצינור צריך להיות נבחר על בסיס המאפיינים הכימיים של נדיפים, ונבדק כדי למנוע נדיף מלהידבק רירית הצינור (למשל polytetrafluoroethylene, ניילון או נירוסטה).
  2. הפוך שני מפצלי אוויר צינורות 15 מ"ל שלוש עצות פיפטה 1000 μL כל אחד.
    1. לעשות שלושה חורים של ~ 1 ס"מ קוטר. תחילה לשרוף שני חורים, באמצעות מחט הכנה מחומם (אדום מחומם במבער Bunsen), סמוך זה לזה ממש מתחת למכסה של צינור 15 מ"ל. ואז להפוך את החור השלישי על ידי הסרת התחתון של הצינור.
    2. דבק 1,000 טיפים פיפטה μL לתוך החורים עם קצה צר הצבעה החוצה. חותכים את קצה טיפים פיפטה כדי לאפשר זרימת אוויר גבוהה יותר.
  3. חבר את צינורות PVC גדול מן השקע של cפחם מלא בקבוק Erlenmeyer כדי קצה פיפטה בתחתית צינור 15 מ"ל. הוסף שקעים צינורות PVC קטן לשני טיפים פיפטה אופקית להוביל אותם לכיוון שליטה בקבוק ניסיוני.
  4. כדי למנוע זיהום של המדיום YPD עם מיקרואורגניזמים, לצרף את הצינור הקטן מסנן מזרק סטרילי (0.45 מיקרומטר גודל הנקבוביות) עם דחיפה פלסטיק על מחבר צינור צינור הולך לכיוון המסנן, בורג על מחבר כבל פלסטיק לעזוב את המסנן. ואז, לצרף את צינורות הכניסה של בקבוק תרבות YPD (ראה איור 1B ).
  5. כדי למנוע שמרים מוטס מן נסיעה מן הבקבוק תרבות לתוך הזירה הניסויית, לצרף צינור זכוכית (6.5 ס"מ, קוטר חיצוני = 0.5 ס"מ וקוטר פנימי = 0.3 ס"מ) לשקע של כל בקבוק תרבות YPD באמצעות צינורות קטנים. צרף צינורות PVC לצד השני של צינור זכוכית להוביל את זה לעבר החורים התחתון (קדח בכל צד) של תיבת הניסוי.
    1. ממלאים את הצינור עם סיבי זכוכית החיטוי לפני השימוש.
  6. מוסיפים צינור נוסף של 15 מ"ל צינור (המתואר בסעיף 6.2) לצינור ה- PVC הקטן, בכל צד של תיבת הניסוי, כדי לקבל שתי צינורות שפועלות לתוך הקופסה, הן בצד הניסויי (הקרוב ביותר למיצוי זרם האוויר של המאוורר, מימין) ואת הצד הבקרה (הקרוב ביותר כניסתו של זרם האוויר אוהד, משמאל).
  7. הכן 8x 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות כל עם 10 שקעים לבדוק 80 זוגות ההזדווגות באותו זמן, כלומר 40 עבור כל מזגן.
    1. צרוב 10 חורים של ~ 0.8 ס"מ קוטר, 2 ס"מ זה מזה לתוך פיפטה.
    2. חותכים את החלק החיצוני של מזרק 1 מ"ל לתוך שקע קטן (2.5 ס"מ) אחד גדול (5 ס"מ).
    3. דבק אלה שקעים לתוך החורים עם דבק חם.
    4. לעטוף להקה קטנה של סרט פלסטיק פרפין סביב סוף שקעים לצרף פיפטה 1000 μL קצה. קוטר הפתח הוא 0.1 ס"מ. השתמש בעצות נקיות עבור כל ניסוי.
    5. צרף שתי פיפטות סרולוגיות, באמצעות מפצל T עם קוטר חיצוני ≤ 0.5 ס"מ ו חתיכות קצרות של צינורות PVC קטן, לכל אחד משני שקעים משני הצדדים. קלטת את טפטפות שטוח על גיליון נייר לבן (מתחת המצלמות בתיבת פלדה).
    6. באמצעות צג זרימת האוויר, להגדיר את זרימת האוויר, כך מהירות האוויר ביציאה של 1000 פיפטה μL קצה הוא 0.5 מ '/ ש'. זה מתאים זרימת אוויר של 0.0017 L / s לכל קצה.

    7. מעקב אחר התנהגות ההזדווגות

    1. השתמש פיפטה הפה (כמתואר בהתייחסות 26 ) למקום נקבה אחת ניסיוני לתוך צלחת פטרי קטן (המתואר בסעיף 4) בשעה 15:00 (ZT 6) ולתת לה 1 h כדי להסתגל לזירה ההזדווגות.
    2. הגדר את תיבת הניסוי (המתוארת בסעיף 1) באופן הבא:
      1. להדליק את האורות, כלומר נוריות LED לבן על 12 h: 12 שעות כהה מחזור כהה מחובר טיימר שמפעיל אתאור בשעה 09:00 (ZT0) ו אדום אור רציף נוריות כדי לאפשר ניטור של זבובים במהלך השלב האפל של הניסוי. הפעל את האוהדים כדי להגביל את החימום של הממשלה על ידי מקור האור כדי להבטיח ריחות עודפים הם פרקו מחוץ לאזור הבדיקה.
      2. חיבור מצלמות מצלמת אינטרנט למחשב ולהפעיל אותם עם תוכנת ניטור עבור ניטור תמונה.
      3. עבור כל מצלמה, הגדר את המיקוד, בהירות וזום בתוכנת הניטור.
        1. לחץ לחיצה ימנית על מסך המצלמה, פתח את "מאפייני המצלמה", ו unclick "מיקוד אוטומטי". התאם את "המוקד" כדי להבהיר את הרשת או כל מילה כתובה על גיליון הנייר. אם יש צורך, לשנות את "בהירות" ו "זום".
      4. הגדר את התוכנית של תוכנת ניטור ללכוד 1 תמונה כל 2 דקות. לחץ לחיצה ימנית על כל מסך המצלמה ובחר "ערוך מצלמה" ולאחר מכן את "פעולות" אפשרות. לחץ כדי להתחיל את הפעולות "ב רגיל intErvals "ולשנות את הזמן" 2 דקות ". בחר" צלם תמונה "עבור פעולות לבחור לבצע ולבסוף לחץ על" אישור ".
      5. לחץ לחיצה ימנית על כל מסך המצלמה ובחר "התחל ניטור".
    3. לאחר 1 שעה (ב ZT 7), להעביר זכר wildtype לצלחת פטרי באמצעות פיפטה הפה, במקום את הצלחת על גיליונות נייר A4 את מצלמות מצלמת, ולחץ על "התחל ניטור" במשך 24 שעות. עבור הניסוי משאבת אוויר, במקום את המנה בצורה כזו כי שקע פיפטה מחובר חור הכניסה של זיווג ההזדווגות.
    4. כדי לנתח את התנהגות ההזדווגות של בני הזוג, בצע את הפעולות הבאות.
      1. בחר ופתח את כל התמונות בתמונה צפייה בתוכנה ואת הדף דרכם בסדר כרונולוגי.
      2. רשום את התאריך, מספר הניסוי, מספר המנה, וזמן הפתיחה לגיליון אלקטרוני באותה שורה. קח את הזמן ההתחלה של כל זירה מרגע זה ממוקם תחת webcaמצלמה. רשום את חותמת הזמן מהתמונות.
      3. סמן את שעת ההתחלה של כל הזדווגות באותה שורה בגיליון האלקטרוני. ספירת הזדווגות כתקרית כאשר הזכר רכוב על הנקבה והזוג נשאר יציב נייח באותה תנוחה לפחות חמש מסגרות רצופות (10 דקות).
        הערה: קריטריון זה מבוסס על האורך המדווח של הזדווגות, בטווח שבין 12 ל 27 דקות בדאל מלנוגאסטר , וההערכה כי הזיווגים של 10 דקות ומעלה הם פורייה 27 , 28 .
      4. ספירת מספר הזדווגות עבור כל שורה בגיליון האלקטרוני כדי לקבוע את תדירות ההזדווגות. לחלופין, לחסר את זמן ההתחלה של הניסוי מרגע ההזדווגות הראשונה עבור כל שורה כמדד של חביון ההזדווגות, או להפחית את זמן ההזדווגות הראשונה מהזמן של ההזדווגות השנייה כאמצעי של חביון remating.
        1. כדי לחשב את זמן האחזור הנבחר, ודאלהגדיר את התאריכים של הזיווג הראשון והשני כמו ימים רצופים בתוכנה גיליון אלקטרוני.
      5. לנתח את הנתונים במודלים של אפקטים מעורבים, בהנחה של התפלגות נורמלית של הנתונים ולכלול את תאריך הניסוי כגורם אקראי, תוך שימוש בתוכנה סטטיסטית (ראה טבלת החומרים) כדי לקבוע את המשמעות הסטטיסטית של המשתנים הבלתי תלויים - סוג האוויר, ואינטראקציה-כפי שתוארו לעיל 5.
      6. בחר את מודל ההסבר הטוב ביותר על ידי ביצוע ביטול לאחור של משתנים עצמאיים שאינם משמעותיים באמצעות בדיקות יחס הסתברות לוגית ומידע Akaike הקשורים. לאחר הפעלת המודל, בחן ויזואלי את שאריות הנתונים כדי לאשר את הנורמליות. לאשר את ההומוגניות של שונות באמצעות מבחן Levene. במקרה של הומוגניות לא שוויונית, השורש הריבועי הופך את הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש זה assay רציפה, התנהגות ההזדווגות, תדירות ההזדווגות בפרט, ניתן לקבוע בתנאים סביבתיים ניסיוניים. כדי לשלוט בתנאים סביבתיים, שינינו ארון מטבח נירוסטה לתוך אזור הבדיקה, עם מקור האור שלה דיפוזיה, אשר מבטיח שפע גבוה של אור כמות מינימלית של בוהק מלמעלה של זירות ההזדווגות ( איור 1 א ) . אזור הבדיקה הפנימי הוא עטוף לחלוטין על ידי נירוסטה וזכוכית, אשר מאפשר ניקוי עם ממיסים אורגניים, כגון הקסאן או אתנול. בנוסף, הממשלה מצויד חורים לשמש פתחי צינורות, מביא רמזים נדיפים ממערכת האוויר בלחץ (ראה איורים 1A ו 1B ). מערכת האוויר בלחץ, מותאמת ריחות שמרים, מורכב זרימת אוויר מודרך דרך התרבות שמרים נוזליים לפני הזנת זירות הבדיקה באמצעות 4 splitters פיפטה עם10 שקעים כל ( איור 1 ג ). המערכת כולה היא אטומה מצויד מסננים חלקיקים, הן לפני ואחרי הזנת התרבות שמרים, כדי למזער זיהום עם ריחות confounding ( איור 1 ב ).

כדי להדגים את השימוש assay זה, בדקנו אם רמזים נדיפים מתרבות שמרים יכול להשפיע על התנהגות ההזדווגות. האוויר נבע מבעד לתרבות שמרים נוזלית במשך 24 שעות, ושקעי האוויר הונחו בכניסה לכל זירת זיווג (ראה איור 2 א ). מחצית מזירות ההזדווגות הכילו מזון עוף עם שמרים (מזון + שמרים), וחצי השני הכיל מזון זבובים ללא שמרים שנוספו (מזון - שמרים). זן ואישה wildrelpe נחשפו לריחות שמקורם בתרבות השמרים החיצונית, ותדר ההזדווגות שלהם נרשם. כדי לקבוע אילו משתנים נחוצים כדי להסביר את תוצאות גרף, הפעלנו מודלים מעורבים-השפעה, כולל או לא כוללIng המשתנים הבלתי תלויים של מזון בינוני, אוויר שמרים, ואת האינטראקציה של השניים. הנתונים באיור 2B מיוצגים בצורה הטובה ביותר על ידי מודל הכולל את המשתנים הבלתי תלויים של מדיום מזון (p = 0.001) ואוויר שמרים (p = 0.061), אך אין אפקט אינטראקציה מסביר. למרות שמשתנה השמרים אינו משמעותי בנתונים המלאים הללו, יש צורך להסביר את התוצאות. ניתוח של שמרים האוויר מופרדים על מזון בינוני מראה כי זוג ההזדווגות אינו מגיב ריחות שמרים כאשר אין שמרים נוכחים במדיום מזון (אוויר: p = 0.992), אבל הם עושים להגדיל את תדירות ההזדווגות שלהם שמרים כאשר שמרים הוא נוסף על מדיום המזון (אוויר: p = 0.018). יחד, תוצאות אלה מדגימות את הישימות של מערכת האוויר בלחץ כדי לבדוק את ההשפעה של ריחות סביבתיים בשילוב עם תנאי מזון בינוני.

כמו כן, אנו ממחישים כיצד מערכת האוויר בלחץ יכול להיות ביפעל ידי הוספת רמזים כימיים סביבתיים ישירות לזירת הבדיקה. כדי להדגים אילו תרכובות שמרים ספציפיות משפיעות על תדירות ההזדווגות, בדקנו את ההשערה שתכולת חומצת האמינו של השמרים נחוצה להשפעתה על ההזדווגות על ידי הנחת מנה של פפטון (חלבונים בהידרוליים) המתאימים לחומצות האמינו שסופקו על ידי השמרים באגר המצע מצפה את זיווג ההזדווגות. בדקנו גם את הצורך בחומצה אצטית, אחד מתוצרי התסיסה הנדיפים העיקריים של שמרים, כדי להגדיל את תדירות ההזדווגות. זה נעשה על ידי הוספת חומצה אצטית ישירות בינוני מזון. זכר wildtype ונשים נבדקו בזירות המכילות אגר או אגר עם פפטון, עם או בלי חומצה אצטית ישירות במדיום מזון ( איור 3 ב ). זה עושה עבור בינוני מזון פשוט מאוד בסביבה ענייה; לכן, תדירות ההזדווגות הממוצע הוא ירד גם לעומת איור 2 ב. הנתונים באיור 3 ב מיוצגים בצורה הטובה ביותר על ידי מודל כוללמשתנים בלתי תלויים של מדיום מזון (p = 0.002), חומצה אצטית (p = 0.001), ואת האינטראקציה של שני (p = 0.022). הגברת הנשיכות עולה על נוכחות של חומצה אצטית, אך רק במצב שבו נמצא הפפטון במדיום. זה מראה כי זבובים צריכים לחוש בו זמנית חומצות אמינו וחומצה אצטית להגדיל את תדירות ההזדווגות שלהם ( איור 3 ב ). זה מוכיח כי הוספת תרכובות ריחניות ישירות לזירת הבדיקה יכולה להשפיע על התנהגות ההזדווגות וכי השפעות אלה ניתן לזהות בתנאים סביבתיים פשוטים מאוד.

איור 1
איור 1: תרשים של תיבת הניסוי ומערכת אוויר בלחץ עם שמרים. ( א ) איור סכמטי של תיבת ההזדווגות נשלט על ידי הסביבה המתואר בסעיף 1. תיאור של המספרים המספרים החצים: 1. לוח אור עם אל אורות לבנים ואדומים. 2. מאוורר קטן; 3. 3 שכבות של נייר סינון, כל שכבה המורכבת משני גיליונות נייר סינון; 4. צלחת דיפוזיה זכוכית מנוחה על סוגריים המצורפת 3 הצדדים של התיבה; 5. מעריץ גדול; 6. חורים עבור צינורות וכבלים; 7. אזור ניסיוני; חץ גדול, 50 ס"מ על צלחת הזכוכית; חץ בינוני, גובה 35 ס"מ עבור חורי הכבלים; חץ קטן, גובה 7 ס"מ עבור חורים צינורות. ( ב ) איור סכמטי של תרבות השמרים הנוזלים עם זרימת האוויר, כמתואר בסעיפים 5, 6.4 ו -6.5. תיאור המספרים המנויים: 1. יחידת סינון חד פעמית; 2. כובע עם מחיצות הסיליקון החוצה ו - inlets; 3. בינוני נוזלי; ו 4. צינור זכוכית עם סיבי זכוכית. ( ג ) איור סכמטי של שקעי האוויר כמתואר בסעיף 6.7. תיאור המספרים המנויים: 1. פיפטה סרולוגית; 2. צינור לחתוך מזרק 1 מ"ל, ו 3. 1,000 μ פיפטה עצה.יעד = "_ ריק"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ריח שמרים מגביר את הנשיכות בנוכחות שמרים במצע המזון. ( א ) איור סכמטי של זיווג ההזדווגות עם זכר אחד ואחת נקבה טיפ פיפטה משקע האוויר בתרשים 1C להיכנס דרך חור הכניסה. ( B ) מצגת גרפית של התגובה בתדירות ההזדווגות של זוג קנטון- S מזדווגות עם ריח שמרים עם וללא שמרים במדיום מזון זבוב (מזון - שמרים: אוויר בינוני n = 12, שמרים האוויר n = 13, מזון + שמרים : אוויר בינוני n = 24, שמרים אוויר n = 23). גרף קו עם סרגלי שגיאות SEM ופלט סטטיסטי של מודלים מעורבים - השפעה עם האוויר כמשתנה הבלתי תלוי והמועד כמשתנה אקראי לכל מדיום מזון באופן עצמאי. הנתונים הסטטיסטיים העיקרייםL כולל מזון (p = 0.001) ואוויר שמרים (p = 0.061). מעובד מתוך התייחסות 5 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: חומצה אצטית על מצע מזון זבוב מגביר את הנשיחות בנוכחות פפטון. ( א ) איור סכמטי של זיווג ההזדווגות, עם זבוב מזון בינוני המכיל חומצה אצטית ו סרט פלסטיק פרפין תקע סגירת חור הכניסה. ( ב ) מצגת גרפית של תדירות ההזדווגות של זוג קנטון- S מזדווגים בתגובה לחומצה אצטית או על אגר או בינוני פפטון (אגר: חומצה אצטית n = 52, + חומצה אצטית n = 40 ופפטון: N = 28, + חומצה אצטית n = 25). גרף קו עם סורגים שגיאה SEM ו stati(P = 0.001), p = 0.001, ואוכל מזון (p = 0.022) כמשתנים בלתי תלויים והמועד כמשתנה אקראי. מעובד מתוך התייחסות 5 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר assay כדי לבדוק התנהגות ההזדווגות מעל 24 שעות תוך שליטה רציפה על רמזים סביבתיים כי זוג הזדווגות משוער להשתמש כדי לקבוע תדירות ההזדווגות. ניתן להגדיל את תדירות ההזדווגות בתגובה האוויר שמרים נמסר באמצעות מערכת אוויר בלחץ כאשר המדיום מכיל שמרים גם ( איור 2 ב ). בנוסף, תגובה דומה בתדירות ההזדווגות ניתן לראות עם מדיום מזון פשוט המכיל רק אגר, פפטון, ריח חומצה אצטית ישירות במדיום ( איור 3 ב )

עם ניסויים שהוכיחו כאן, ניתן להסיק מסקנות רק על התנהגות ההזדווגות הכללית של בני הזוג, שכן שני המינים חשופים לאותם תנאים סביבתיים. עם זאת, אנו יודעים ממחקרים קודמים כי 47% מהשונות בתדירות ההזדווגות נקבעת על ידי הנקבה, ואילו התרומה הגברית מהווה רק 11% מהשונות20 . לכן, רוב השינויים בתדירות ההזדווגות שנצפו הם ככל הנראה תוצאה של פתיחות מינית הנשית. הגברת הזכרים חיזור עדיין משאיר את הנקבה לקבל או לדחות הזדווגות, כמו מבוגר ד melanogaster נקבות יכול בהצלחה להסיט ניסיונות ההזדווגות 29 . למסקנות מוצקות ולשייך באופן ספציפי את ההבדלים בתדירות ההזדווגות לקבלה המינית הנשית, יש לבחון זוגות הזדווגות נוספים, שבהם הגנוטיפ של הנשי מגוון, אך זו של הזכר נשמרת קבועה.

פרוטוקול זה הוכיח שתי דרכים לספק תרכובות ריחניות לזוג זוגות, או עם מערכת אוויר דחוס או ישירות לתוך המדיום מזון. מערכת האוויר בלחץ יש את היתרון כי כל השפעה ניתן לייחס את התרכובות הנשלחות דרך האוויר, בעוד זה לא ניתן להסיק כאשר תרכובות הם הניחו ישירות לתוך המדיום מזון. לעומת זאת, wלא נמצאה אפקט עם מערכת האוויר בלחץ, זה לא אומר באופן אוטומטי כי הרמז אינו משפיע על ההתנהגות. זה יכול גם אומר כי המתחם אינו מועבר ביעילות דרך מערכת אוויר דחוס. הרכב האוויר בשקע של מערכת אספקת האוויר ניתן לנתח על ידי הצבת מסנן פחמימנים וניתוח תוכן האוויר לכוד עם כרומטוגרפיה גז בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. מערכת האוויר בלחץ הוא assay טוב לבדוק תרכובות שניתן בקלות להפוך מוטס על טווח ארוך יותר. תרכובות פחות נדיפות אולי צריך לשים ישירות לתוך המדיום מזון. חסרון נוסף של מערכת האוויר בלחץ הוא אפקט מהירות האוויר יכול להיות על התנהגות זבוב. זבובים נעצרים כאשר מהירות האוויר גבוהה מדי (מעל 0.7-1.6 מ '/ ש') 30 . בנוסף, מערכת האוויר בלחץ יכול להפוך איכות פשוטה, באיכות נמוכה בלתי נסבלת על ידי ייבוש את המדיום מזון. בשני המקרים, הזבובים אולי לא לשגשגאו טוב באותה מידה, ולכן לא ניתן לייחס מסקנות לתרכובות הספציפיות שנבדקו.

כמה צעדים חיוניים במהלך ההכנה לריצה אופטימלי של מבחני אלה. הצעד הראשון הדורש תשומת לב הוא הכנת המדיום. חשוב כי המדיום, כולל חומרים נדיפים ריחניים כגון חומצה אצטית, מוכן ביום הניסוי ולא במוקדם על מנת למנוע אידוי. כמו כן, המדיום צריך להקשיח על פני השטח ללא זרימת אוויר נוספת (להימנע משימוש ברדסים זה מזה), כי זרימת האוויר יכולה לעורר את ההתנדפות של הריח. הצעד השני הדורש טיפול מיוחד הוא הקמת מערכת אוויר דחוסה. זרימת האוויר צריכה להיות גבוהה מספיק כדי בעדינות בועה את התרבות שמרים מבלי להעביר כל נוזל לזירה.

פרוטוקול זה מדגים assay התנהגותית עם ריחות שמרים בשילוב עם התנהגות ההזדווגות. עם זאת, מערכת זו יכולה להיות מיושמת על כלסוג של ריח, כמו גם סוגים אחרים של התנהגויות. כדי להשתמש במערכת זו ריחות אחרים, יש צורך להתאים את זרימת האוויר ואת המדיח ריח כדי לייעל את העברת תרכובות על המנות. עם זאת, באופן כללי, כל תרכובת שניתן להעביר באמצעות האוויר ניתן לבדוק עם מערכת זו. בנוסף, כל סוג של התנהגות, אצל גברים ונשים כאחד, ניתן לבדוק, או על ידי שימוש באותו סוג של מנות או על ידי התאמת צינורות להגיע ולהתחבר לאזורים מבחן גדול או קטן יותר. בנוסף, כאשר נבחנים התנהגויות מפורטות יותר, יש לבחון מחדש את מסגרת המסגרת ואת ההחלטות של המצלמות. בכל מקרה, אם שני הניסויים עם או בלי ריח הריחון מנוהלים באותו זמן ועם אותו מקור אוויר, כל תגובה לרמז הסביבתי יכולה להתגלות, ללא תלות בשינויים בלחץ או בריכוז מניסוי אחד למשנהו. לבסוף, assay הפגינו כאן ניתן להרחיב לפחות עוד מחזור LD (עד 48 שעות), כל עוד fאספקת האוד אינו מתייבש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למרכז המניות של בלומינגטון תסיסנית עבור המניות זבוב; ג גאהר, ג 'ט Alkema, ו S. ואן Hasselt על הניסיון המוקדם שלהם בפיתוח assay האוויר בלחץ; ג 'ספר בוסמן על העצה על טיפוח שמרים; ואת רזה Athanchi ואת יואל לוין עבור במקור לפתח את זמן לשגות ניטור של תסיסנית הזדווגות התנהגות. JA Gorter נתמך על ידי מעבדה מחקר מדעי המוח BCN / NWO מענק תוכנית. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) (הפניה: 821.02.020) ל- JC Billeter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).

Tags

התנהגות גיליון 125, הנטייה המינית הנשית התנהגות הרבייה רמזים סביבתיים שמרים תזונה התנהגות ההזדווגות הזית
שיטה לבחינת ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gorter, J. A., Billeter, J. C. A… More

Gorter, J. A., Billeter, J. C. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter