Summary
Vi demonstrerar en analys för att analysera de miljömässiga och genetiska signalerna som påverkar parning beteende i fruktflödet Drosophila melanogaster .
Abstract
En persons sexualitet påverkas av genotyp, erfarenhet och miljöförhållanden. Hur dessa faktorer interagerar för att modulera sexuellt beteende förblir dåligt förstådda. I Drosophila melanogaster påverkar miljöanpassningar, såsom tillgången på mat, parning, som erbjuder ett töjbart system för att undersöka mekanismerna som modulerar sexuellt beteende. I D. melanogaster avkännes miljömärden ofta via kemosensoriska gustatoriska och olfaktoriska system. Här presenterar vi en metod för att testa effekten av miljömässiga kemiska signaler på parningsbeteende. Analysen består av en liten parningsarena som innehåller matmedium och ett parpar. Sammankopplingsfrekvensen för varje par övervakas kontinuerligt under 24 timmar. Här presenterar vi tillämpligheten av denna analys för att testa miljöföreningar från en extern källa genom ett tryckluftssystem samt manipulering av miljökomponenterna direkt i parningsarenan. USiktet på ett trycksatt luftsystem är speciellt användbart för att testa effekten av mycket flyktiga föreningar, medan manipulering av komponenter direkt i parningsarenan kan vara av värde för att fastställa en förenings närvaro. Denna analys kan anpassas för att svara på frågor om påverkan av genetiska och miljömässiga signaler på parningsbeteende och fecundity liksom andra reproduktiva beteenden hos man och kvinna.
Introduction
Reproduktiva beteenden har vanligtvis höga energikostnader, särskilt för kvinnor, som producerar större gameter än män och måste noggrant välja villkoren för att höja sina utvecklingsavkommor. På grund av energikostnaden är det inte förvånande att reproduktionen är kopplad till näringsförhållandena. Detta gäller i de flesta, om inte alla, djur inklusive däggdjur, vars pubertet kan fördröjas av undernäring och vars sexuella körning kan påverkas negativt av livsmedelsbegränsning 1 .
Reproduktionen av den genetiska modellorganismen Drosophila melanogaster påverkas också av näringsbetingelser. Males domstol på högre nivå i närvaro av livsmedel flyktiga 2 , och honor är mer sexuellt mottagliga i närvaro av jäst, ett viktigt näringsämne för äggproduktion och avkomma överlevnad 3 , 4 , 5 . DettaEvolutionärt konserverat reproduktivt svar på mat ger möjlighet att studera mekanismer som förbinder tillgången till livsmedel i livsmedel till sexuell reproduktion i en genetiskt torkbar och tidseffektiv organism. Faktum är att arbetet i D. melanogaster har inneburit insulinväggen som en viktig regulator för sambandet mellan mat och parningsbeteende 6 . Det har också visat att själva parningen av parning ändrar kvinnans matförmåga såväl som de associerade kemosensoriska neuronerna 7 , 8 , 9 .
Det är uppenbart att livsmedelstrådar påverkar reproduktionsbeteenden i D. melanogaster . Dessa effekter verkar huvudsakligen påverka kvinnor, speciellt de som redan har parat 5 . Men för att testa dessa akuta effekter av miljöförhållanden kan analysen som klassiskt används för kvinnlig parning beteendeInte vara mycket lämplig på grund av de långa avbrotten mellan parningspisoderna. I den klassiska remateringsanalysen möts en jungfru med en man och är omedelbart isolerad och presenterad med en ny man 24 till 48 timmar senare. Denna klassiska analys har använts med stor framgång för att identifiera komponenter av manlig ejakulat som modifierar kvinnligt beteende och kvinnligt svar 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerliga parningsanalysen som visas här är därför ett tillägg till klassiska parningsanalyser som kan användas för att studera den akuta effekten av miljöförhållanden på reproduktiva beteenden.
Med hjälp av den kontinuerliga analysen för parning beteende som förklaras här visade vi tidigare att ett par flugor utsatta för jäst kommer att remetera sEveral tider under en 24 timmars observationstid 5 , 19 , 20 , 21 , medan flugor inte exponeras för mat kommer endast att remate en gång 5 . Detta resultat kan vara förbryllande i ljuset av en stor del av D. melanogasterlitteraturen som indikerar att honor inte remitterar flera dagar efter en första parning (ses i referenser 10 , 11 ). Denna skillnad kan emellertid lätt förklaras av analysförhållanden, där en kvinna isoleras i en till flera dagar innan ett nytt parningstillfälle tillhandahålls. Om paret inte klarar sig i denna timmars observationsperiod, kännetecknas kvinnan som inte mottaglig. Dessutom bör den höga parringsfrekvensen inte vara överraskande med tanke på att data från vildfångade flugor visar att honor innehåller spermier från 4 till 6 män i sina lagringsorgan. Därmed iDikterar att kvinnorna naturligt remitterar flera gånger 22 , 23 .
Här demonstrerar vi användningen av denna kontinuerliga parningsanalys för att räkna ut hur flugor samlas och kombinerar information om miljöförhållanden för att modulera parningsfrekvensen. Denna analys gör att man kan testa ett relativt stort antal parande par för genetiska studier och för att testa påverkan av flyktiga och icke-flyktiga miljöanpassningar. Analysen löper typiskt i 24 timmar, men kan förlängas till 48 timmar, vilket möjliggör testning av cykliska miljöanpassningar, såsom den ljusmunna (LD) -cykeln. Vi demonstrerar denna analys genom att testa påverkan av flyktiga signaler från en jästkultur inom ett trycksatt luftsystem i kombination med tillgången på icke-flyktigt jästnäringsämne i livsmedelssubstratet.
Tryckluftssystemet pumpar kontinuerligt flyktiga signaler till en parningsarena som innehållerEtt livsmedelssubstrat och ett testpar (vars parningsbeteende övervakas). För att ytterligare bestämma de särdrag genom vilka jäst påverkar parning testar vi en stor flyktig förening av jäst, nämligen ättiksyra 24 , i kombination med en aminosyrahalt som motsvarar den hos jäst i livsmedelssubstratet, i form av pepton (amino Syror härrörande från enzymatisk uppslutning av animaliska proteiner). Tillsammans visar dessa experiment hur effekten av miljöanpassade signaler på D. melanogasters parringsbeteende kan testas med denna analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Miljöstyrd parningslåda
- För att säkerställa ett kontrollerat och lätt att rengöra testområde, sätt in ett köksskåp av rostfritt stål av 120 cm x 64 cm x 85 cm, vilket visas i figur 1A.
- Borra ett hål på baksidan av skåpet strax under taket och fyra uppsättningar med fyra hål i sidorna, var och en med en diameter av 2 cm. Borra de första två uppsättningarna med fyra hål på varje sida av lådan i en höjd av 7 cm från botten av lådan och med 12,5 cm mellan hålen. Borra de andra två uppsättningarna på varje sida av lådan i en höjd av 35 cm från botten.
OBS! De fyra uppsättningarna med fyra hål används för kamerakraftkablar och luftpumprör för att komma in och ut ur skåpet. Hålet på baksidan används för strömkablarna på ett ljusbord. - Bygg ett ljusbord med 18 rader av 40 alternerande vita och röda lysdioder (LED) med 2,5 cm mellanrum mellan varje ljus. Mätta de vita och röda lysdioderna i en cirkulärT med strömförsörjning. Anslut varje LED i serie med ett motstånd på 560 Ω, 0,25 W och 5% tolerans.
OBS: Utsläppsvåglängden för det röda ljuset sträckte sig från 590-661 nm med en skarp topp vid 627 nm. Den resulterande ljusintensiteten i försöksområdet är cirka 900 lux med båda lamporna på och 90 lux med endast de röda lamporna på; Detta mättes med hjälp av en smartphone light meter app. - Fäst ljuskartan på toppen av rostfritt stålskåp och passera strömkablarna genom hålet på baksidan.
- Anslut adapten från de vita lysdioderna till en strömstyrningstimer för att tillåta att den vita lysdioden slås av under experimentets mörka fas. Anslut adaptern av det röda ljuset, vilka flugor är blinda till 25 , till en vanlig strömförsörjning för att hålla dem på under hela experimentets varaktighet.
- Fixa en 110 cm och två 54 cm långa metallfästen, vardera med en bredd på 0,5 cm, på insidan av lådan i en höjd 50Cm från botten av lådan. Placera en matt glasdiffusionsplatta (dimensioner 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) på dessa fästen.
- Lägg till tre lager av filterpapper (120 cm x 50 cm) mellan ljusbordet och glasplattan för att diffusa ljuset och begränsa bländningen på parningens yta (beskrivet i avsnitt 4). Knappa två filterpappersark tillsammans på sin långsida på 120 cm långa trästavar med magneter (på sidan) för att hålla dem på insidan av metallskåpet; Utför denna åtgärd 3 gånger.
- Fäst fyra fläktar på sidorna av lådan för att skapa en luftflöde som kontinuerligt ventilerar parningslådan. Fäst den första uppsättningen 8 cm fläktar mellan ljusbrädan och glasplattan, med inloppet till luften på vänster sida och avgasen på höger sida av lådan, för att minimera uppbyggnaden av värme som alstras av ljusbrädet.
- Fäst den andra uppsättningen av 12 cm fläktar 25 cm över botten av skåpet för att skapa ett utåtluftflöde som vents iNside av skåpet och kyler den till en stabil 26 ° C. Fäst fläktarna vid avgassidan till en sugslang och led luftströmmen ut ur rummet för att förhindra att luften återvinns i skåpet.
- Borra ett hål på baksidan av skåpet strax under taket och fyra uppsättningar med fyra hål i sidorna, var och en med en diameter av 2 cm. Borra de första två uppsättningarna med fyra hål på varje sida av lådan i en höjd av 7 cm från botten av lådan och med 12,5 cm mellan hålen. Borra de andra två uppsättningarna på varje sida av lådan i en höjd av 35 cm från botten.
- Montera två stativ (ca 48 cm långa) monterade med två klämmor, en på 28 cm och en på 30 cm från stativets botten. Fixa en webbkamera på varje klämma. Anslut de fyra kamerorna till en dator som kör övervakningssoftware.
- Placera A4-lakan under varje webbkamera. Använd otryckta vita lakan eller lakan med förnumrerat rutnät på 7 av 5 rutor med 4 cm axlar för att passa parningspartier (beskrivs i avsnitt 4).
OBS! En HD-kamerakamera med 78 ° vidvinkelvy och 5 miljoner pixlar upplösning kan täcka ett område på 21 cm x 30 cm som motsvarar ett A4-ark och skärm mellan 20 och 35 parningsområden.
2. Flybearbetning och samling
- Placera 20 manliga och 20 kvinnliga vildtyp Canton-SFlyger in i flaskupptagningsflaskor innehållande 45 ml rika flyktmatsmedium (se avsnitt 3) i tre till fyra dagar. Överför samma vuxna tre gånger genom att först trycka ner dem och sedan till färska flaskor.
- Placera flaskorna i en inkubator vid 25 ° C och 12 h: 12 h ljusmyk cykel med lampor klockan 09:00 (Zeitgeber Time (ZT) 0). En ny generation kommer att visas ungefär 10 dagar senare.
- Bedöva de resulterande nyförslutna flugorna på koldioxidkuddar i högst 5 minuter och samla dem i flaskfettflaskor med en pensel.
- Samla jungfruliga (nyförklarade) honor och jungfru män från vildtyp Canton-S- lagerflaskorna i 2,5 cm x 9,5 cm flaskupptagningsflaskor med 6,5 ml rika flodmatsmedium.
- Ålder som flugorna i samma köngrupper av 20 flyger vardera i flygupptagningsflaskor i 5 till 8 dagar vid 25 ° C och 12 timmar: 12 timmars ljus mörk cykel och tänds klockan 09:00 (ZT 0).
- ÖverfÄr flugorna till färska flaskupptagningsflaskor dagen före experimentet.
3. Matmedelsberedning
- Förbered 1 liter rik flygmedium enligt följande.
- Häll 1 liter kranvatten i en 2 liter glasbägare med magnetisk omröringsstång och sätt bägaren på en magnetisk hetplatta. Håll omrörningen av och värm upp till 300 ° C tills kokpunkten är uppnådd.
OBS: Under den långa kokpunkten i följande steg kommer en del vatten att avdunsta, men tillsammans med de tillsatta ingredienserna resulterar detta protokoll i 1 liter rika flygelmedium vid beredning vid rumstemperatur på ungefär 22 ° C. - Slå på omrörningen till 500 rätter per minut (rpm) och tillsätt följande ingredienser till kokande vatten: 10 g agar, 30 g glukos, 15 g sackaros, 15 g majsmjöl, 10 g vetex, 10 g sojamjöl, 30 g Melass, 35 g aktiv torrjäst. Vänta på att jästen skumar kraftigt och vrid sedan ned värmeplattans tempEratur till 120 ° C.
- Efter 10 min vrider värmeplattan till 30 ° C och låt blandningen röra tills den kyls till 48 ° C. Övervak temperaturen genom att placera en termometer direkt i maten.
- Lös 2 g p-hydroxi-bensoesyra-metylester (tegosept, 100%) i 10 ml 96% etanol. Tillsätt detta och 5 ml 1 M propionsyra till blandningen. Rör om i 3 minuter.
- Häll flysmediet i arenorna (beskrivet i avsnitt 4) för att skapa ett 0,3 cm tjockt lager längst ner på arenan.
- Använd en 200 ml glasbägare för att hälla. När exakta kvantiteter är viktiga, använd en 10 ml serologisk pipett.
- Häll 1 liter kranvatten i en 2 liter glasbägare med magnetisk omröringsstång och sätt bägaren på en magnetisk hetplatta. Håll omrörningen av och värm upp till 300 ° C tills kokpunkten är uppnådd.
- Förbered flymedium minus jäst precis som beskrivet i steg 3.1.1 till 3.1.5, men lämna jästen i steg 3.1.2.
- Förbered medium med agar med eller utan pepton genom att blanda 10 g agar och 35 g pepton i 1 liter kokande vatten och utföra steg 3.1.4 till 3.1.5.
4. MatinG Arena Förberedelse
- Pipa ett hål ca 0,3 cm i diameter på översidan av en 3,5 cm x 1,0 cm plast petriskål med hjälp av en uppvärmd beredningsnål (uppvärmd till rodnad i en Bunsen-brännare). Alternativt, använd ett lödstryk.
- När man framställer matmedium med luktföreningar, pipetteras först 30 μl (1% av det slutliga livsmedelsmediet, t.ex. ättiksyra 100%) av önskad förening i skålen för hälften av försöksrätterna. Låt den andra halvan av disken vara tom för jämförelse.
OBS! Med uppställningen som beskrivs här kan maximalt 140 arenor testas samtidigt. - Använd en 10 ml serologisk pipett, häll 3 ml matmedium i botten av skålen ovanpå den önskade föreningen. Täck det med en ostduk för att förhindra kontaminering, och låt mediet solidisera i ca 1 h vid rumstemperatur.
- Placera ett lock på disken och tejpa varje håll på två sidor. Förbered små paraffinfilmpluggar för att täcka hålen påDisken genom att rulla bitar av paraffinfilm i 0,2 cm tjocka rullar och skär dem sedan i 0,5 cm segment.
5. Jästkultur för lukt
- Odla torr aktiv jäst på jäst extraktpepton dextros (YPD) agar i en 14,0 cm x 2,06 cm petriskål. Använd handskar för att förhindra förorening i detta steg.
- Förbered YPD-agarplattor genom att tillsätta 10 g jästextrakt, 20 g pepton, 22 g glukos (0 (+) - glukosmonohydrat) och 15 g agar (ren) till 1 liter kokande, ultralätt vatten. Laga botten på petriskålen när allt är upplöst och lagra upp och ned i kylskåpet vid 4 ° C, i upp till 2 månader.
- Strö några torkade jästkorn på en YPD-mediumplatta, låt dem lösa upp. Stryk sedan medellåten med en steril slinga. Förvara plattan i en 30 ° C inkubator över natten. Därefter lagras kulturen i kylskåpet i högst 1 vecka.
- Förbered YPD flytande medium iN 1 L-flaskor genom att tillsätta 10 g jästextrakt, 20 g pepton, 22 g glukos (0 (+) - glukosmonohydrat) och en omröringsstång till 1 1 ultralätt vatten.
- Autoklav i 25 minuter vid 120 ° C och 1 bar tryck. Därefter förvaras flaskorna vid 4 ° C i upp till 2 månader tills användning.
- Montera öppna flaskhattar (4,5 cm) med en 0,32 cm tjock silikon septum.
- Skär två små hål i septumet för att passa snyggt fästdon. Fäst den lilla tuben av polyvinylklorid (PVC) (diametrar: yttre 0,8 cm och inre 0,5 cm) till båda utloppen som lämnar flaskan och till endast en av insugningarna i flaskan. Se figur 1B för illustration.
- Skruva in de utrustade locken och slangarna i aluminiumfolie och autoklav i 25 minuter vid 120 ° C och 1 bar tryck.
- Använd handskar för att skydda mot förorening i detta steg. Doppa en steril 100 μl pipettspets i en av jästkolonierna från YPD-agarplattan (dEscribed i 5.1) och släpp den i den autoklaverade YPD-vätskeformiga flaskan.
- Kepsa den här jästinokulerade YPD-vätskeformiga flaskan samt en YPD-mediumkontrollflaska (jäst inte tillsatt) med autoklaverade kepsar monterade med in- och utlopp (beskrivet i steg 5.3). Sätt båda flaskorna på separata magnetiska plattor och rör om vid 100 varv per minut vid rumstemperatur i 24 timmar före experimentets början för att tillåta jästkulturen att växa.
- Anslut inloppet på båda flaskorna för att separera akvaripumpar för att tillföra luft till jästkulturen. Var noga med att ansluta utloppet från den experimentella jästflaskan till ett rör som avluftar jästlukten ut ur försöksrummet för att förhindra störning av experimentet.
6. Inställning av luftpump
- Fäst den stora PVC-röret (diametrar: yttre 1,2 cm och inre 0,9 cm) till tryckluft och led det genom två 1 L glas Erlenmeyer-kolvar fyllda med aktivt kol till 800 mlLinje för att rena luften. Använd antingen tryckluft som vanligen levereras i laboratorier som lufttillförsel, eller anslut rören till en luftpump (tryckluft används här).
ANMÄRKNING: Slangmaterialet bör väljas utifrån de flyktiga kemiska egenskaperna och testas för att förhindra att de flyktiga sticker fast i rörets foder (t.ex. polytetrafluoretylen, nylon eller rostfritt stål). - Gör två luftklyvare från 15 ml rör och tre 1000 μL pipettips vardera.
- Gör tre hål med ~ 1 cm diameter. Förbränna först två hål, med en uppvärmd beredningsnål (uppvärmd röd i en Bunsen-brännare), intill varandra strax under locket på 15 ml röret. Gör sedan det tredje hålet genom att ta bort rörets botten.
- Lim 1 000 μL pipettspetsarna i hålen med den smala änden som pekar utåt. Skär änden av pipettspetsarna för att möjliggöra större luftflöde.
- Anslut den stora PVC-tuben från utloppet på cKol-fylld Erlenmeyer-kolv till pipettspetsen längst ner på 15 ml röret. Lägg till små PVC-rörutlopp i de två horisontella pipettespetsarna och led dem mot en kontroll och en experimentflaska.
- För att förhindra föroreningar av YPD-mediet med mikroorganismer, fäst det lilla slangen till ett sterilt sprutfilter (0,45 μm porstorlek) med en plasttryck på slanganslutningsdonet mot filtret och en skruv på plastskottkontakt som lämnar filtret. Fäst sedan röret till inloppet på YPD-kulturflaskan (se figur 1B ).
- För att förhindra att luftburet går från kolkolven till försöksarenan, fäst ett glasrör (6,5 cm lång, ytterdiameter = 0,5 cm och innerdiameter = 0,3 cm) till utloppet på varje YPD-kulturflaska med liten slang. Fäst PVC-röret på andra sidan glasröret och led det mot de nedre hålen (borrade på vardera sidan) i försöksrutan.
- Fyll röret med glasfiber och autoklavera det före användning.
- Lägg till en annan 15 ml rördelare (beskrivet i avsnitt 6.2) till den lilla PVC-tuben, vid vardera sidan av försöksboxen, för att få två rör att springa in i lådan vid båda försökssidorna (närmast avluft av luftflödet till höger) Och kontrollsidan (närmast luftflödesflödet till vänster).
- Förbered 8x 25 ml serologiska pipetter vardera med 10 utlopp för att testa 80 parande par samtidigt, det vill säga 40 för varje luftförhållande.
- Bränn 10 hål med 0,8 cm diameter, 2 cm ihop i pipetten.
- Skär den yttre delen av en 1 ml spruta i ett litet (2,5 cm) och ett stort (5 cm) utlopp.
- Lim dessa utlopp i hålen med varmt lim.
- Vik ett litet band av plastparaffinfilm runt änden av utloppen och fäst en pipettspets på 1000 μL. Spetsöppningens diameter är 0,1 cm. Använd rena tips för varje experiment.
- Fäst två serologiska pipetter, med en T-splitter med ytterdiameter ≥0,5 cm och korta bitar av små PVC-rör, till var och en av de två uttagen på båda sidor. Tape pipetterna platta på vitpappersarket (under kamerorna i stålboxen).
- Med en luftflödesmonitor ställer du in luftflödet så att lufthastigheten vid utgången av 1000 μL pipettspetsen är 0,5 m / s. Detta motsvarar ett luftflöde på 0,0017 L / s per spets.
7. Övervakning av parningsbeteende
- Använd en munpipett (som beskrivs i referens 26 ) för att placera en experimentell kvinna i en liten petriskål (beskrivs i avsnitt 4) klockan 15:00 (ZT 6) och ge henne 1 h för att acklimatisera till parningsarenan.
- Ställ in experimentlådan (beskrivs i avsnitt 1) enligt följande:
- Slå på lamporna, dvs vita ljusdioder på en 12 h: 12 h ljusmyk cykel ansluten till en timer som slår påLjus vid 09:00 (ZT0) och kontinuerliga röda ljusdioder för att möjliggöra övervakning av flugorna under experimentets mörka fas. Slå på fläktarna för att begränsa uppvärmning av skåpet med ljuskällan och för att säkerställa att överflödiga lukt ventileras utanför testområdet.
- Anslut webbkamerakameror till en dator och starta dem med övervakningssoftware för bildövervakning.
- För varje kamera ställer du in fokus, ljusstyrka och zooma in övervakningssoftware.
- Högerklicka på kameraskärmen, öppna "kameraegenskaper" och avmarkera "automatiskt fokus". Justera "fokus" för att klargöra nätet eller några skriftliga ord på pappersarket. Ändra om så önskas "ljusstyrka" och "zoom".
- Ställ in program för övervakningsprogrammet för att fånga 1 bild varannan minut. Högerklicka på varje kameraskärm och välj "redigera kamera" och sedan alternativet "Åtgärder". Klicka för att starta åtgärderna "Vid vanlig intErvals "och ändra tiden till" 2 minuter. "Välj" Ta foto "för att välja åtgärder att utföra och slutligen klicka på" ok ".
- Högerklicka på varje kameraskärm och välj "starta övervakning".
- Efter 1 h (vid ZT 7), överför en vildtypshane till Petri-skålen med munpipetten, placera skålen på A4-pappersarken under kamerakamerorna och klicka på "starta övervakning" i 24 h. För luftpumpexperimentet, placera maträtten på ett sådant sätt att ett pipettuttag är anslutet till ingångshålet på parningsarenan.
- För att analysera parrets parning beteende, gör följande.
- Välj och öppna alla bilder i en bildvisningsprogram och sidan genom dem i kronologisk ordning.
- Skriv ner datum, experimentnummer, skålnummer och starttid i ett kalkylblad inom samma rad. Ta starttiden för varje arena från det ögonblick som den placeras under webcaM kamera. Spela in tidsstämpeln från bilderna.
- Markera starttiden för varje kopiering i samma rad i kalkylbladet. Räkna en parning som en incident när hanen har monterat honan och paret förblir måttligt stillastående och i samma hållning i minst fem på varandra följande ramar (10 min).
ANMÄRKNING: Detta kriterium är baserat på den rapporterade längden av sammansättningen, som sträcker sig från 12 till 27 minuter i D. melanogaster , och observationen att kopiering av 10 min och över är fritt 27 , 28 . - Räkna antalet sampuleringar för varje rad i kalkylbladet för att bestämma sammankopplingsfrekvensen. Alternativt subtrahera experimentets starttid från tiden för första parningen för varje rad som ett mått på parningslatenhet eller subtrahera tiden för den första parningen från tiden för den andra parningen som ett mått på att remittera latens.
- För att beräkna den återgivande latensen, se till attDefiniera datum för den första och den andra parningen som på varandra följande dagar i kalkylbladsprogrammet.
- Analysera data med blandade effekter modeller, med antagande av normal fördelning av data och inklusive experimentets datum som en slumpmässig faktor, med hjälp av en statistisk programvara (se materialtabellen) för att bestämma den statistiska signifikansen hos de oberoende variablerna-matmediet, Luft typ och interaktion-som tidigare beskrivits 5 .
- Välj den bästa förklaringsmodellen genom att utföra bakåt eliminering av icke-signifikanta oberoende variabler med hjälp av log-sannolikhetstesttest och tillhörande Akaike-information. Efter att ha kört modellen, inspektera dataresurserna visuellt för att bekräfta normaliteten. Bekräfta homogeniteten av variationer med Levene test. I händelse av ojämn homogenitet omvandlar kvadratroten data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda denna kontinuerliga analys, parning beteende och parning frekvens i specifika, kan bestämmas under experimentella miljöförhållanden. För att reglera miljöförhållandena förvandlade vi ett köksskåp av rostfritt stål till ett testområde med egen ljuskälla och diffusion, vilket garanterar ett högt överflöd av ljus och en minimal mängd glans från toppen av parningslägena ( Figur 1A ) . Det inre testområdet är helt inneslutet av rostfritt stål och glas, vilket möjliggör rengöring med organiska lösningsmedel, såsom hexan eller etanol. Dessutom är skåpet utrustat med hål som fungerar som inlopp för slangar, vilket ger flyktiga signaler från tryckluftssystemet (se figurerna 1A och 1B ). Trycksluftsystemet, justerat för jästlukt, består av ett luftflöde som styrs genom en flytande jästkultur innan man går in i testarenorna genom 4 pipettsplittrar med10 uttag varje ( figur 1C ). Hela systemet är lufttätt och utrustat med flera partikelfilter, både före och efter in i jästkulturen, för att minimera kontaminering med förvirrande lukt ( Figur 1B ).
För att demonstrera användningen av denna analys testade vi om flyktiga signaler från en jästkultur kan påverka parningsbeteende. Luft bubblades genom en flytande jästkultur under 24 timmar, och luftutloppen placerades i ingången till varje parningsarena (se figur 2A ). Hälften av parningsområdena rymmer mat med jäst (Mat + jäst), och den andra halvan innehöll flyktmat utan jäst tillsatt (Mat - jäst). En vildtypsman och -kvinna utsattes för luktarna som kommer från den yttre jästkulturen, och deras parningsfrekvens registrerades. För att bestämma vilka variabler som behövs för att förklara de grafiska resultaten, sprang vi blandade effekter modeller, antingen inkluderande eller exklusivaIng de oberoende variablerna av matmedium, jästluft och en interaktion av de två. Dataen i Figur 2B representeras bäst av en modell innefattande de oberoende variablerna av matmedium (p = 0,001) och jästluft (p = 0,061), men det finns ingen förklarande interaktionseffekt. Även om jästluftsvariabeln inte är signifikant i denna fullständiga dataset är det nödvändigt att förklara resultaten. Analys av jästluft separerad för matmedium visar att ett parpar svarar inte på jästlukt när det inte finns någon jäst närvarande i livsmedelsmediet (luft: p = 0,992), men de ökar deras parningsfrekvens i jästluft när jäst är Tillsattes också till matmediet (luft: p = 0,018). Tillsammans demonstrerar dessa resultat appliceringen av trycksatt luft för att testa påverkan av miljö lukt i kombination med livsmedelsmediumförhållanden.
Vi illustrerar också hur tryckluftssystemet kan vara bypAssed genom att lägga till miljömässiga kemiska signaler direkt till testarenan. För att visa vilka specifika jästföreningar som påverkar parningsfrekvensen testade vi hypotesen att aminosyrahalten i jäst är nödvändig för dess effekt på parning genom att placera en dos av pepton (hydrolyserade proteiner) som motsvarar aminosyrorna tillförda av jästen i agar Substrat som fodrar parningspanelen. Vi testade också nödvändigheten av ättiksyra, en av de viktigaste flyktiga fermentationsprodukterna av jäst, för att öka parningshastigheten. Detta gjordes genom tillsats av ättiksyra direkt till matmediet. En vildtypshane och -kvinna testades i arenor innehållande agar eller agar med pepton, med eller utan ättiksyra direkt i matmediet ( Figur 3B ). Detta ger ett mycket enkelt livsmedelsmedium och en dålig miljö; Därför minskas den genomsnittliga parringsfrekvensen även i jämförelse med figur 2B. Data i Figur 3B representeras bäst av en modell som inkluderarOberoende variabler av matmedium (p = 0,002), ättiksyra-luft (p = 0,001) och interaktionen mellan de två (p = 0,022). Kvinnlig mottaglighet ökar vid närvaro av ättiksyra, men endast i det tillstånd där pepton är närvarande i mediet. Detta visar att flugor måste samtidigt känna av aminosyror och ättiksyra för att öka deras parningsfrekvens ( Figur 3B ). Detta visar att tillsats av luktföreningar direkt på testarenan kan påverka parningsbeteendet och att dessa influenser kan detekteras under mycket enkla miljöförhållanden.
Figur 1: Diagram över försöksboxen och tryckluftsystemet med jäst. ( A ) Schematisk illustration av den miljöstyrda parningslådan som beskrivs i avsnitt 1. Beskrivning av de antecknade numren och pilarna: 1. Ljusbräda med al Ternating vita och röda lampor; 2. liten fläkt; 3. 3 lager filterpapper, varje lager bestående av två filterpappersark; 4. Glasdiffusionsplatta vilar på parentes fästa på 3 sidor av lådan; 5. stor fan 6. Hål för rör och kablar; 7. experimentområde Stor pil, 50 cm till glasplattan; Mittpil, 35 cm höjd för kabelhålen; Och liten pil, 7 cm höjd för rörhålen. ( B ) Schematisk illustration av den flytande jästkulturen med luftflöde, såsom beskrivs i avsnitt 5, 6.4 och 6.5. Beskrivning av de antecknade numren: 1. Engångsfilterenhet; 2. keps med silikon septum och ut- och inlopp; 3. flytande medium; Och 4. glasrör med glasfiber. ( C ) Schematisk illustration av luftutloppen som beskrivs i avsnitt 6.7. Beskrivning av de antecknade numren: 1. serologisk pipett; 2. Slangskärning från 1 ml spruta och 3. 1000 μL pipettspets.Target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Jästlukt ökar kvinnlig mottaglighet i närvaro av jäst i livsmedelssubstratet. ( A ) Schematisk illustration av en parningsarena med en manlig och en kvinna och en pipettspets från luftutloppet i Figur 1C, som går in genom ingångshålet. ( B ) Grafisk presentation av svaret i parningsfrekvensen hos ett Canton-S parningspar till jästlukt med och utan jäst i flygmatmediet (Mat - jäst: mediumluft n = 12, jästluft n = 13 och mat + jäst : Medium luft n = 24, jästluft n = 23). Linjediagram med SEM-felstänger och statistisk utmatning av blandade effekter modeller med luft som oberoende variabel och datum som en slumpmässig variabel för varje livsmedelsmedium självständigt. HuvudstatistikL-modellen inkluderar mat (p = 0,001) och jästluft (p = 0,061). Anpassad från referens 5 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ättiksyra i fluga mat substrat ökar kvinnlig mottaglighet i närvaro av pepton. ( A ) Schematisk illustration av en parningsarena, med flysmedelsmedium innehållande ättiksyra och en plastparaffinfilmplugg som stänger ingångshålet. ( B ) En grafisk presentation av parningsfrekvensen hos ett Canton-S parningspar som svar på ättiksyra antingen på agar eller peptonmedium (agar: ättiksyra n = 52, + ättiksyra n = 40 och pepton: ättiksyra N = 28, + ättiksyra n = 25). Linjediagram med SEM-felstänger och statiStisk effekt av blandade effekter-modellen med matmedium (p = 0,002), ättiksyra-luft (p = 0,001) och mat * luft (p = 0,022) som oberoende variabler och datumet som en slumpmässig variabel. Anpassad från referens 5 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en analys för att testa parning beteende under 24 timmar medan man kontinuerligt kontrollerar de miljökod som ett parpar är hypoteser att använda för att bestämma parringsfrekvensen. Det är möjligt att öka parningsfrekvensen som svar på jästluft som levereras genom ett tryckluftssystem när mediet innehåller jäst samt ( Figur 2B ). Dessutom kan ett liknande svar i parningsfrekvens observeras med ett förenklat livsmedelsmedium innehållande endast agar, pepton och ättiksyra lukt direkt i mediet ( Figur 3B )
Med experimenten visade sig här kan slutsatser endast dras på parets generella parning beteende, eftersom båda könen utsätts för samma miljöförhållanden. Vi vet emellertid från tidigare forskning att 47% av variationen i parningsfrekvens bestäms av kvinnan, medan det manliga bidraget endast står för 11% av variationen20 . Därför är de flesta av de förändringar som ses i parning frekvens sannolikt ett resultat av kvinnlig sexuell mottaglighet. Ökad manlig förlovning lämnar fortfarande kvinnan för att acceptera eller avvisa parning, eftersom vuxna D. melanogaster- kvinnor framgångsrikt kan avleda parningsprover 29 . För konkreta slutsatser och specifikt att tillskriva skillnader i parningsfrekvens till kvinnlig sexuell mottaglighet är det nödvändigt att testa ytterligare parningspar där kvinnans genotyp varierar men den hos hanen hålls konstant.
Detta protokoll har visat två sätt att leverera luktföreningar till parningspar, antingen med ett tryckluftsystem eller direkt i matmediet. Trycksluftssystemet har fördelen att någon effekt kan hänföras till de föreningar som levereras genom luften, medan detta inte kan avslutas när föreningarna sätts direkt i matmediet. Å andra sidan wHönans ingen effekt hittas med tryckluftssystemet, betyder det inte automatiskt att kön inte påverkar beteendet. Det kan också innebära att förening inte levereras effektivt via trycksatt luft. Luftens sammansättning vid luftleveranssystemets utlopp kan analyseras genom att placera ett kolvätefilter och analysera det fångade luftinnehållet med gaskromatografi kopplad med masspektrometri. Tryckluftssystemet är en bra analys för att testa föreningar som lätt kan göras luftburna över ett längre område. Mindre flyktiga ämnen kan behöva sätta direkt i matmediet. En annan nackdel med trycksatt luftsystem är effektluftshastigheten kan ha på flygbeteende. Fluor slutar röra sig när lufthastigheten är för hög (över 0,7-1,6 m / s) 30 . Dessutom kan tryckluftsystemet göra en enkel miljö av låg kvalitet, oacceptabel genom att torka ut matmediet. I båda fallen kan flugorna inte perfektaOrm lika bra, och inga slutsatser kan då hänföras till de specifika testade föreningarna.
Flera steg är nödvändiga under beredning för optimal körning av dessa analyser. Det första steget som kräver uppmärksamhet är att förbereda mediet. Det är viktigt att mediet, inklusive luktformiga flyktiga föreningar såsom ättiksyra, framställs på experimentens dag och inte tidigare för att undvika förångning. Även mediet måste härda på en yta utan extra luftflöde (undvik att använda avfettar för detta), eftersom luftflödet kan stimulera luktens avdunstning. Det andra steget som kräver särskild vård är inrättandet av trycksatt luft. Luftflödet måste vara tillräckligt högt för att försiktigt bubbla jästkulturen utan att överföra någon vätska till arenan.
Detta protokoll demonstrerar en beteendeanalys med jästlukt i kombination med parningsbeteende. Detta system kan dock tillämpas på allaTyp av lukt, liksom andra typer av beteenden. För att använda detta system för andra luktar är det nödvändigt att justera luftflödet och luktmediet för att optimera överföringen av föreningarna till disken. I allmänhet kan emellertid någon förening som kan överföras med luft testas med detta system. Dessutom kan någon typ av beteende, både hos män och kvinnor, testas, antingen genom att använda samma typ av disk eller genom att justera röret för att nå och ansluta till större eller mindre testområden. Dessutom, när mer detaljerade beteenden testas, måste ramhastigheterna och resolutionerna för de använda kamerorna omprövas. Om båda experimenten med och utan testluften körs samtidigt och med samma luftkälla kan något svar på miljökoden detekteras oberoende av förändringar i tryck eller koncentration från ett experiment till det andra. Slutligen kan analysen som visas här förlängas med åtminstone en annan LD-cykel (upp till 48 timmar), så länge som fOodtillförsel torkar inte ut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Bloomington Drosophila Stock Center för flygbolagen. C. Gahr, JT Alkema och S. van Hasselt för deras tidiga försök att utveckla tryckluftanalysen; Jasper Bosman för råd om odling av jäst Och Rezza Azanchi och Joel Levine för att ursprungligen utveckla tid-lapse övervakning av Drosophila parning beteende. JA Gorter stöddes av ett stipendium för Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program. Detta arbete stöddes delvis av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) (referens: 821.02.020) till JC Billeter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
- Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
- Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
- Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
- Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
- Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
- Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
- Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
- Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
- Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
- Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
- Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
- Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
- Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
- Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
- Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
- Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
- Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
- Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
- Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
