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Behavior

मतन व्यवहार पर पर्यावरणीय संकेतों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक विधि Published: July 17, 2017 doi: 10.3791/55690
Automatic Translation
1, 1
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

Summary

हम पर्यावरण और आनुवांशिक संकेतों का विश्लेषण करने के लिए एक परख दिखाते हैं जो फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर में संभोग के व्यवहार को प्रभावित करते हैं।

Abstract

एक व्यक्ति का यौन अभियान जीनोटाइप, अनुभव और पर्यावरणीय परिस्थितियों से प्रभावित होता है। यौन कारकों को व्यवस्थित करने के लिए ये कारक कैसे बातचीत करते हैं, यह बेहद समझा जाता है। ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर में , पर्यावरण संबंधी संकेत, जैसे कि भोजन की उपलब्धता, यौन व्यवहार को मापने वाले तंत्र की जांच करने के लिए एक विनियोग प्रणाली प्रदान करने वाली संभोग गतिविधि को प्रभावित करती है। डी। मेलेनोगास्टर में , पर्यावरण संबंधी संकेत अक्सर कोमोसेंसरी स्नेही और घ्राण प्रणाली के माध्यम से महसूस होता है। यहां, हम संभोग व्यवहार पर पर्यावरण के रासायनिक संकेतों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस परख में एक छोटा संभोग क्षेत्र युक्त भोजन माध्यम और एक संभोग जोड़े शामिल हैं। प्रत्येक जोड़े के संभोग आवृत्ति को लगातार 24 घंटे के लिए मॉनिटर किया जाता है। यहां हम इस परख की प्रयोज्यता को एक बाहरी स्रोत से पर्यावरणीय यौगिकों की जांच करने के लिए दबाव हवा प्रणाली के साथ-साथ संभोग क्षेत्र में सीधे पर्यावरण घटकों के हेरफेर को पेश करते हैं। यूएक दबाव वायु प्रणाली के कुछ बहुत ही अस्थिर यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जबकि संभोग के क्षेत्र में सीधे घटकों को जोड़कर एक यौगिक की उपस्थिति का पता लगाने के लिए मूल्य का हो सकता है। इस परख को संभोग व्यवहार और बुखार और साथ ही अन्य पुरुष और महिला प्रजनन व्यवहार पर आनुवांशिक और पर्यावरण संबंधी संकेतों के प्रभाव के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

प्रजनन संबंधी व्यवहार में आम तौर पर उच्च ऊर्जा लागत होती है, विशेष रूप से महिलाओं के लिए, जो पुरुषों की तुलना में बड़ी संख्या में उत्पादन करते हैं और सावधानीपूर्वक उनके विकासशील वंश को बढ़ाने के लिए शर्तों को चुनना चाहिए। ऊर्जा लागत के कारण, यह आश्चर्यजनक नहीं है कि प्रजनन पोषण संबंधी स्थितियों से जुड़ा हुआ है। यह सबसे ज्यादा सच है, यदि सभी नहीं, स्तनधारियों सहित जानवर, जिनकी यौवन कुपोषण से देरी हो सकती है, और जिनकी यौन अभियान खाद्य प्रतिबंध 1 से नकारात्मक रूप से प्रभावित हो सकता है।

आनुवंशिक मॉडल जीव के प्रजनन ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर भी पोषण संबंधी स्थितियों से प्रभावित है। पुरुष वासियों के भोजन की वाष्पशीलता की उपस्थिति में उच्च स्तर पर 2 , और महिलाएं खमीर की उपस्थिति में अधिक यौन रूप से ग्रहणशील हैं, अंडे के उत्पादन और वंश के अस्तित्व के लिए प्रमुख पोषक तत्व 3 , 4 , 5 । इसभोजन के विकास के प्रति जागरूक प्रजनन संबंधी प्रतिक्रिया, तंत्र का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करती हैं जो कि आनुवंशिक रूप से अनुक्रमित और समय-कुशल जीव में यौन प्रजनन के लिए पर्यावरणीय खाद्य उपलब्धता को जोड़ती हैं। दरअसल, डी। मेलेनोगास्टर में काम करने से इनसुलिन मार्ग को भोजन और संभोग व्यवहार 6 के बीच संबंध के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में फंसाया गया है। इसमें यह भी पता चला है कि संभोग के कार्य में महिलाओं की खाद्य वरीयता के साथ-साथ संबद्ध किमोसेंसरी न्यूरॉन्स 7 , 8 , 9 में बदलाव आया है।

यह स्पष्ट है कि खाद्य संकेतों डी। मेलेनोगास्टर में प्रजनन व्यवहार को प्रभावित करते हैं। इन प्रभावों को मुख्य रूप से महिलाओं को प्रभावित करने लगता है, विशेष रूप से वे जो पहले से ही मिलते हैं 5 । हालांकि, पर्यावरणीय परिस्थितियों के इन तीव्र प्रभावों का परीक्षण करने के लिए क्लासिक तौर पर महिला संभोग व्यवहार के लिए उपयोग की जाने वाली परख भी हो सकती हैसंभोग एपिसोड के बीच लंबे समय तक रुकावट के कारण बहुत उपयुक्त नहीं। शास्त्रीय रीमेटिंग परख में, एक कुंवारी महिला प्रथम पुरुष जो पुरुष के साथ होती है, और तुरंत अलग हो जाती है और 24 से 48 घंटे के बाद एक नया पुरुष प्रस्तुत किया जाता है। इस क्लासिक परख का इस्तेमाल पुरुषों के घटकों की पहचान करने के लिए बड़ी सफलता के साथ किया गया है, जिसमें महिला व्यवहार और महिला प्रतिक्रिया 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 को संशोधित किया गया है। इसलिए, निरंतर संभोग परख दिखाया गया है, इसलिए, क्लासिक संभोग assays के एक अतिरिक्त है कि प्रजनन व्यवहार पर पर्यावरण की स्थिति के तीव्र प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

समझाया गया है कि संभोग व्यवहार के लिए निरंतर परख का उपयोग करके, हमने पहले दिखाया कि खमीर के संपर्क में आने वाली मक्खियों की एक जोड़ी5 घंटे , 1 9 , 20 , 21 के मुकाबले सदाबहार समय, जबकि मक्खियों को भोजन से अवगत नहीं किया जाता है, केवल एक बार 5 बार रिमटेगा। यह खोज डी। मेलेनोगास्टर साहित्य के एक बड़े हिस्से की रोशनी में उलझन में पड़ सकती है, यह दर्शाता है कि प्रारंभिक संभोग के बाद महिलाएं कई दिनों तक नहीं मनाती हैं (संदर्भ 10 , 11 में समीक्षा की गई)। हालांकि, इस विसंगति को आसानी से परख की स्थिति से समझाया जा सकता है, जहां नए संभोग अवसर प्रदान किए जाने से पहले एक महिला को कई दिनों तक अलग किया जाता है। यदि इस घंटे की अवलोकन अवधि में जोड़ी नहीं होती है, तो मादा को ग्रहणशील नहीं माना जाता है। इसके अलावा, उच्च संभोग आवृत्ति को आश्चर्यजनक नहीं होना चाहिए क्योंकि वन्य-पकड़े गए मक्खियों से डेटा दिखाते हैं कि महिलाएं अपने भंडारण अंगों में शुक्राणुओं को 4 से 6 पुरुषों में रखती हैं; इस प्रकार मेंमहिलाओं को स्वाभाविक रूप से कई बार 22 , 23 को रिट्रीट करने के लिए डिकेट करना

यहां, हम इस सतत संभोग परख के प्रयोग को प्रकट करते हैं कि कैसे मक्खियों को इकट्ठा करने और संभोग आवृत्ति को नियंत्रित करने के लिए पर्यावरणीय परिस्थितियों के बारे में जानकारी एकत्रित करने के बारे में जानने के लिए इस परख से आनुवंशिक अध्ययन के लिए अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में संभोग जोड़े और अस्थिर और गैर-वाष्पशील पर्यावरण संकेतों के प्रभाव का परीक्षण करने की अनुमति मिलती है। परख आम तौर पर 24 घंटे के लिए चलती है, लेकिन हल्के-अंधेरे (एलडी) चक्र जैसे साइक्लिंग पर्यावरण संकेतों के परीक्षण की अनुमति देकर 48 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है। हम खाद्य सब्सट्रेट में गैर-वाष्पशील खमीर पोषक तत्व की उपलब्धता के साथ संयोजन क्षेत्र में एक खमीर संस्कृति से अस्थिर संकेतों के प्रभाव का परीक्षण करके इस परख का प्रदर्शन करते हैं।

दबावयुक्त हवा प्रणाली लगातार एक संभोग के क्षेत्र में वाष्पशील संकेतों को पंप करती है जिसमें ये शामिल होते हैंएक खाना सब्सट्रेट और एक टेस्ट द्यू (जिसका संभोग व्यवहार निगरानी रखता है)। खमीर के संवर्धन को प्रभावित करने वाले विशेषताओं को और आगे का निर्धारण करने के लिए, हम खमीर के एक प्रमुख अस्थिर मिश्रित यौगिक का परीक्षण करते हैं, अर्थात् एसिटिक एसिड 24 , जो अमीनो एसिड सामग्री के साथ संयोजन में होता है जो कि खाद्य सब्सट्रेट में खमीर से संबंधित होता है, पेप्टाण (अमीनो पशु प्रोटीन के एंजाइमैटिक पाचन से प्राप्त एसिड)। इन प्रयोगों के साथ यह दर्शाता है कि डी। मेलेनोगास्टर के संभोग व्यवहार पर पर्यावरणीय संकेतों का प्रभाव इस परख के साथ परीक्षण किया जा सकता है।

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Protocol

1. पर्यावरण नियंत्रित संभोग बॉक्स

  1. परीक्षण क्षेत्र को नियंत्रित करने और नियंत्रित करने में आसान सुनिश्चित करने के लिए, चित्र 1 ए में सचित्र के रूप में 120 सेमी x 64 सेमी x 85 सेमी के स्टेनलेस स्टील के रसोई के कैबिनेट को सेटअप करें।
    1. छत के नीचे कैबिनेट के पीछे एक छेद और पक्षों में चार छेद के चार सेट ड्रिल करें, प्रत्येक में 2 सेंटीमीटर व्यास के साथ। बॉक्स के प्रत्येक किनारे पर बॉक्स के नीचे से 7 सेंटीमीटर की ऊंचाई पर और छेद के बीच 12.5 सेमी तक के चार छेद के पहले दो सेटों को ड्रिल करें। नीचे के 35 सेमी की ऊंचाई पर बॉक्स के प्रत्येक तरफ दूसरे दो सेटों को ड्रिल करें।
      नोट: कैबिनेट में प्रवेश करने और बाहर निकलने के लिए चार छेद के चार सेट कैमरे के बिजली के केबल और वायु पंप टयूबिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं। पीठ पर छेद एक प्रकाश बोर्ड के बिजली केबल के लिए प्रयोग किया जाता है।
    2. प्रत्येक प्रकाश के बीच 2.5 सेमी अंतरिक्ष के साथ सफेद और लाल बत्ती-उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के 18 पंक्तियों के साथ एक हल्का बोर्ड बनाएं। एक सर्किट में सफेद और लाल एल ई डी की गणना करेंबिजली की आपूर्ति के साथ टी प्रत्येक एलईडी 560 Ω, 0.25W और 5% सहनशीलता के साथ श्रृंखला में कनेक्ट करें।
      नोट: लाल प्रकाश का उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 5 9 -661 एनएम से 627 एनएम पर एक तेज चोटी के साथ फैला हुआ है। प्रायोगिक क्षेत्र में होने वाली हल्की तीव्रता लगभग 900 लक्स दोनों लाइटों पर और केवल 90 लाइट पर केवल लाल बत्ती के साथ होती है; यह एक स्मार्टफ़ोन प्रकाश मीटर ऐप का उपयोग करके मापा गया था
    3. स्टेनलेस स्टील के कैबिनेट के शीर्ष पर प्रकाश बोर्ड संलग्न करें और पीठ पर छेद के माध्यम से बिजली के केबलों को पास करें।
    4. प्रयोग के अंधेरे चरण के दौरान सफेद एलईडी को बंद करने की अनुमति देने के लिए सफेद एल ई डी के पावर कंट्रोल टाइमर पर एडेप्टर कनेक्ट करें। लाल बत्ती के एडाप्टर से कनेक्ट करें, जो मक्खियों को 25 से अंधे हैं, एक नियमित बिजली की आपूर्ति के लिए उन्हें प्रयोग की संपूर्ण अवधि के लिए रखने के लिए।
    5. एक 110 सेंटीमीटर और दो 54 सेमी लंबे धातु ब्रैकेट्स को ठीक करें, जिनमें से प्रत्येक की चौड़ाई 50 सेंटीमीटर के साथ, एक ऊंचाई 50 पर बॉक्स के भीतर के पक्ष मेंबॉक्स के नीचे से सेमी। इन ब्रैकेट पर एक पाले से बने कांच प्रसार प्लेट (119.0 सेमी x 54.5 सेमी x 0.5 सेमी के आयाम) रखें।
    6. प्रकाश बोर्ड और ग्लास प्लेट के बीच फिल्टर पेपर (120 सेमी x 50 सेमी) की तीन परतों को जोड़ने और संभोग अखाड़ा की सतह पर प्रकाश को सीमित करने के लिए (अनुभाग 4 में वर्णित) जोड़ें। दो फिल्टर पेपर शीटों को अपने लंबे किनारे पर 120 सेमी लंबी लकड़ी की छड़ पर मैग्नेट (साइड पर) का उपयोग करके पिन करें, ताकि उन्हें धातु के कैबिनेट के अंदर ले जाएं; यह क्रिया 3 बार करें
    7. बॉक्स के किनारे चार प्रशंसकों को एक हवा का प्रवाह बनाने के लिए संलग्न करें जो लगातार संभोग बॉक्स को छूटे। प्रकाश बोर्ड द्वारा उत्पन्न गर्मी के भवन निर्माण को कम करने के लिए, बाईं ओर वायु के प्रवेश और बॉक्स के दाईं ओर निकास के साथ, हल्के बोर्ड और ग्लास प्लेट के बीच 8 सेमी प्रशंसकों के पहले समूह को संलग्न करें।
    8. मंत्रिमंडल के नीचे से 25 सेंटीमीटर के 25 सेंटीमीटर के दूसरे सेट को संलग्न करें जिससे बाहरी हवा का प्रवाह बना सके जो कि मैंकैबिनेट के किनारे और इसे स्थिर 26 डिग्री सेल्सियस तक शांत कर देता है प्रशंसकों को निकास पक्ष में एक चूषण नली में संलग्न करें और मंत्रिमंडल में हवा के पुनः साइक्लिंग को रोकने के लिए कमरे से बाहर एक हवाई जहाज का नेतृत्व करें।
  2. दो खड़ा (लगभग 48 सेंटीमीटर लंबा) दो स्टैंप्स के साथ मुहिम की, एक 28 सेंटीमीटर और एक स्टैंड पर स्टेंड के आधार से 30 सेमी। प्रत्येक क्लैम्प पर वेबकैम को ठीक करें 4 कैमरे को मॉनिटरिंग सॉफ़्टवेयर चलाने वाले कंप्यूटर से कनेक्ट करें
  3. हर वेब कैमरा के नीचे ए 4 शीट रखें संगीन अरणियों को समायोजित करने के लिए 4 सेमी कुल्हाड़ियों के साथ 7 से 5 वर्गों के पूर्व-क्रमांकित ग्रिड के साथ छापे रहित श्वेत पत्रक या शीट का उपयोग करें (अनुभाग 4 में वर्णित)।
    नोट: 78 डिग्री चौड़े कोण दृश्य और 5 मिलियन-पिक्सेल रिजॉल्यूशन वाला एक एचडी वेबकैम कैमरा ए 4 शीट के अनुरूप 21 सेंटीमीटर x 30 सेंटीमीटर के क्षेत्र को कवर कर सकता है और 20 और 35 संभोग के बीच मॉनिटर कर सकता है।

2. फ्लाई चालन और संग्रह

  1. प्लेस 20 पुरुष और 20 महिला जंगली प्रकार के कैंटन-एसतीन से चार दिनों के लिए 45 एमएल समृद्ध मछली खाने वाले माध्यम (देखें धारा 3) युक्त मक्खी की बोतल में मक्खियों। पहली बार उन्हें नीचे टैप करके और फिर ताज़ा बोतलों में एक ही वयस्क को तीन बार स्थानांतरित करें।
    1. 25 डिग्री सेल्सियस और 12 घंटे में इनक्यूबेटर में बोतलें रखें: 12:00 बजे रोशनी के साथ 12:00 बजे (Zeitgeber time (ZT) 0)। एक नई पीढ़ी लगभग 10 दिन बाद दिखाई देगी
  2. कार्बन डाइऑक्साइड पैड पर 5 मिनट से अधिक समय के लिए परिणामस्वरूप नवनिर्मित मक्खियों को एनेस्थेटेट करें और उन्हें पेंट ब्रश का उपयोग करके फ्लाई फूड शीशियों में ले लीजिए।
    1. जंगली प्रकार के कैंटन-एस स्टॉक बॉटल से कुंवारी (नवनिर्मित) महिलाएं और कुंवारी पुरुषों को 2.5 सेमी एक्स 9.5 सेमी में उड़ाने वाले शीशियों को इकट्ठा करें और 6.5 मिलीलीटर समृद्ध मछली खाने के माध्यम से।
  3. 25 से 25 डिग्री सेल्सियस और 12 घंटे के लिए उड़ान भरने वाली शीशियों में 20 मक्खियों के समान लिंग समूहों में मक्खियों की आयु: 12 घंटे हल्की-अंधेरे चक्र और रोशनी 09:00 (ZT 0) पर होती है।
  4. transfप्रयोग करने से पहले दिन पर मक्खियों को ताज़ा उड़ाने के लिए शीशियों को उगलने के लिए।

3. खाद्य मध्यम तैयारी

  1. निम्न प्रकार के समृद्ध मक्खी माध्यम के 1 एल तैयार करें।
    1. एक चुंबकीय हलचल बार के साथ 2 एल कांच के बीकर में 1 एल का नल का पानी डालो और एक चुंबकीय हॉट प्लेट पर बीकर डाल दिया। सरगर्मी बंद रखें और ताप को 300 डिग्री सेंटीग्रेड तक बारी करें जब तक उबलते तापमान तक नहीं पहुंच जाता है।
      नोट: निम्नलिखित चरणों में लंबे उबलने वाले समय के दौरान पानी का अनुपात लुप्त हो जाएगा, लेकिन अतिरिक्त सामग्री के साथ-साथ इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप अमीर मक्खी माध्यम के 1 एल का तापमान लगभग 22 डिग्री सेल्सियस के कमरे के तापमान पर तैयार किया जाता है।
    2. 500 ग्राम प्रति मिनट (आरपीएम) के लिए सरगर्मी को चालू करें और उबलते पानी में निम्नलिखित सामग्री जोड़ें: 10 ग्राम अदर, 30 ग्राम ग्लूकोज, 15 ग्राम सोक्रोज, 15 ग्राम मकई, 10 ग्राम गेहूं के बीज, 10 ग्राम सोया आटा, 30 ग्राम गुड़, 35 ग्राम सक्रिय सूखा खमीर। जोर से फोम के लिए खमीर की प्रतीक्षा करें, फिर गर्म प्लेट अस्थायी नीचे बारीतापमान से 120 डिग्री सेल्सियस
    3. 10 मिनट के बाद गरम प्लेट को 30 डिग्री सेल्सियस तक बारी करें और मिश्रण हलचल तक 48 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। एक थर्मामीटर सीधे भोजन में डालने से तापमान मॉनिटर करें
    4. पी-हाइड्रॉक्सी-बेंजोइक एसिड मिथाइल एस्टर (टेगॉसिप्ट, 100%) के 2 ग्राम को 96% इथेनॉल के 10 एमएल में भंग करें। मिश्रण में 5 एमएल और 1 एम प्रोपोनिक एसिड जोड़ें। 3 मिनट के लिए हलचल
    5. क्षेत्र के निचले भाग में 0.3 सेमी मोटी परत बनाने के लिए मक्खी के भोजन के माध्यम को क्षेत्र में (4 अनुभाग में वर्णित) डालें।
      1. डालने का कार्य करने के लिए 200 एमएल ग्लास बीकर का उपयोग करें जब सटीक मात्रा महत्वपूर्ण होती है, तो 10 एमएल सीरियल विंदुक का उपयोग करें।
  2. 3.1.1 तक चरण 3.1.1 में वर्णित अनुसार मध्यम से कम खमीर को तैयार करें, लेकिन चरण 3.1.2 में खमीर छोड़ दें।
  3. उबलते पानी के 1 एल में 10 ग्राम अदर और 35 ग्राम पेप्टाइन को मिलाकर पेप्टोस्ट के साथ या बिना पेपर के साथ मध्यम तैयार करें और 3.1.4 से 3.1.5 के चरणों को पार करें।

4. मैटिनजी एरिना तैयारी

  1. पीस एक छिद्र लगभग 3.5 सेमी व्यास पर एक 3.5 सेमी x 1.0 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश के ऊपरी तरफ गरम तैयारी सुई (एक बन्सन बर्नर में लालिमा के लिए गर्म) का उपयोग करते हुए। वैकल्पिक रूप से, एक सोल्डर आयरन का उपयोग करें
  2. सुगंधित यौगिकों के साथ भोजन के माध्यम तैयार करते समय, पहली पिपेट प्रयोगात्मक व्यंजनों के आधा हिस्से में 30 μL (अंतिम भोजन माध्यम का 1%, जैसे एसिटिक एसिड ग्लैशीय 100%) पकवान में वांछित परिसर में। अन्य आधा व्यंजन को तुलना के लिए खाली छोड़ दें।
    नोट: यहां वर्णित सेट-अप के साथ, अधिकतम 140 एरेनाओं को एक बार में परीक्षण किया जा सकता है।
  3. 10 मिलीलीटर सीरॉलॉजिकल पिपेट का प्रयोग करना, वांछित कंपाउंड के ऊपर पकवान के नीचे 3 एमएल का भोजन माध्यम डालना। प्रदूषण को रोकने के लिए एक पनीर के कपड़े से इसे कवर करें, और कमरे के तापमान पर लगभग 1 घंटे के लिए मज़बूत बनाने के लिए मध्यम छोड़ दें।
  4. व्यंजन पर एक ढक्कन रखें और टेप को दो तरफ बंद करें। छोटे पैराफिन फिल्म तैयार करें, जो छेद को कवर करने के लिए प्लग करता हैपैराफिन फिल्म के टुकड़ों को 0.2 सेमी मोटी रोल में रोल करके डिश और फिर उन्हें 0.5 सेमी सेगमेंट में काटें।

5. गंध के लिए खमीर संस्कृति

  1. एक 14.0 सेमी एक्स 2.06 सेमी पेट्री डिश में खमीर निकालने पेप्टाइन डेक्सट्रोज़ (वाईपीडी) अगर पर शुष्क सक्रिय खमीर बढ़ो। इस चरण में प्रदूषण को रोकने के लिए दस्ताने पहनें
    1. 10 ग्राम खमीर निकालने, 20 ग्राम पेप्टाइन, 22 ग्रास ग्लूकोस (0 (+) - ग्लूकोज मोनोहाइड्रेट) और 15 ग्राम (शुद्ध) उबलते पानी के 1 लीटर तक वाईपीडी अगर प्लेटें तैयार करें। पेट्री डिश के नीचे एक बार जब सब कुछ भंग हो जाता है और फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस तक ऊपर की तरफ रखता है, 2 महीने तक।
    2. एक YPD मध्यम प्लेट पर सूखे खमीर के कुछ अनाज छिड़क, उन्हें भंग करने दें फिर एक बाँझ लूप का उपयोग करते हुए मध्यम प्लेट को लकीरें। प्लेट में 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात स्टोर करें। बाद में, 1 सप्ताह से अधिक समय तक रेफ्रिजरेटर में संस्कृति को संग्रहीत न करें।
  2. वाईपीडी तरल माध्यम तैयार करें I10 ग्राम खमीर निकालने, 20 ग्राम पेप्टाइन, 22 ग्रास ग्लूकोस (0 (+) - ग्लूकोज मोनोहाइड्रेट) और 1 लीटर अतिपरवलर पानी के लिए एक हलचल बार जोड़कर एन 1 एल की बोतलें।
    1. 120 डिग्री सेल्सियस और 1 बार दबाव पर 25 मिनट के लिए आटोक्लेव। बाद में, बोतलों को 4 डिग्री सेल्सियस तक का उपयोग करने तक 2 महीने तक स्टोर करें।
  3. एक 0.32 सेमी मोटी सिलिकॉन पट्टिका के साथ खुली बोतल कैप (4.5 सेमी) फ़िट करें।
    1. कांटेदार बल्कहाफ फिटिंग को फिट करने के लिए पट्टियों के दो छोटे छेदों को काट लें। बोतल से बाहर निकलने वाली बोतल से बाहर निकलने वाली दोनों आउटलेटों के लिए छोटे पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) टयूबिंग (व्यास: बाहरी 0.8 सेमी और आंतरिक 0.5 सेंटीमीटर) को संलग्न करें और बोतल में प्रवेश करने वाले इनलेटों में से केवल एक ही करें। चित्रण 1 बी चित्रण के लिए देखें
    2. एल्यूमीनियम पन्नी में फिट कैप और टयूबिंग को 120 डिग्री सेल्सियस और 1 बार के दबाव पर 25 मिनट के लिए आटोक्लेव लपेटें।
  4. इस चरण में प्रदूषण से बचाने के लिए दस्ताने पहनें YPD अगर प्लेट (डी से खमीर कालोनियों में से एक में एक बाँझ 100 μL विंदुक टिप डुबकी5.1 में लिखित) और इसे आटोक्लेवड YPD तरल माध्यम बोतल में ड्रॉप करें।
    1. इन खमीर-इनोकुएटेड वाईपीडी तरल माध्यम बोतल के साथ-साथ एक वाईपीडी मध्यम नियंत्रण की बोतल (खमीर नहीं जोड़ा गया) जिसमें आटोक्लेव किए गए कैप के साथ इन- और आउटलेट (चरण 5.3 में वर्णित) के साथ रखा गया है। अलग-अलग चुंबकीय प्लेटों पर दोनों बोतल डालें और प्रयोग के प्रारंभ से पहले 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 100 आरपीएम पर हलचल करें ताकि खमीर संस्कृति को बढ़ने की अनुमति मिल सके।
    2. खमीर संस्कृति को हवा की आपूर्ति करने के लिए एक्वैरियम पंप को अलग करने के लिए दोनों की बोतलों से जुड़ें। प्रायोगिक खमीर की बोतल के आउटलेट को प्रयोग के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए प्रयोगात्मक कमरे से खमीर की गंध को निकालते हुए एक ट्यूब में जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।

6. एयर पम्प सेट-अप

  1. बड़ी पीवीसी टयूबिंग (व्यास: बाहरी 1.2 सेमी और आंतरिक 0.9 सेंटीमीटर) को एक दबावयुक्त हवा की आपूर्ति में संलग्न करें और इसे 800 एमएल तक सक्रिय चारकोल से भरे दो 1 एल ग्लास एरलेमेयर फ्लास्क के माध्यम से लेंहवा शुद्ध करने के लिए रेखा प्रयोगशालाओं में हवा की आपूर्ति के रूप में सामान्यतः आपूर्ति की जाने वाली दबाव हवा का उपयोग करें, या ट्यूबों को एक हवाई पंप (दबाव वायु का उपयोग किया गया था) में जोड़ें।
    नोट: ट्यूबिंग सामग्री को वाष्पशील के रासायनिक गुणों के आधार पर चुना जाना चाहिए और टयूबिंग (जैसे पॉलीटेटफ्लूरोएथीलीन, नायलॉन या स्टेनलेस स्टील) के अस्तर से चिपकने से अस्थिरता को रोकने के लिए परीक्षण किया गया।
  2. 15 एमएल ट्यूबों से दो एयरप्लेटर्स और तीन 1,000 μL विंदुक युक्तियाँ बनाएं।
    1. ~ 1 सेमी व्यास के तीन छेद बनाएं पहले 15 मिलीलीटर ट्यूब के ढक्कन के ठीक नीचे एक दूसरे के आस-पास, एक गर्म तैयारी सुई (बुनसेन बर्नर में गर्म लाल) का उपयोग करके, दो छिद्र जलाएं। फिर ट्यूब के निचले हिस्से को निकालकर तीसरा छेद बनाओ।
    2. छोर में 1000 μL विंदुक युक्तियों को गोंद बाहर की ओर इशारा संकीर्ण अंत के साथ। अधिक हवा के प्रवाह को अनुमति देने के लिए विंदुक युक्तियों के अंत काट लें।
  3. सी के आउटलेट से बड़ी पीवीसी टयूबिंग कनेक्ट करें15 मिलीलीटर ट्यूब के निचले भाग में पिपेट टिप के लिए हार्कोल से भरे एर्लेनमेयर फ्लास्क छोटे पीवीसी टयूबिंग आउटलेट दो क्षैतिज विंदुक युक्तियों में जोड़ें और उन्हें एक नियंत्रण और एक प्रायोगिक बोतल की ओर ले जाएं।
  4. सूक्ष्मजीवों के साथ वाईपीडी माध्यम के संदूषण को रोकने के लिए, फिल्टर की ओर जा रहे बल्कहाइड टयूबिंग कनेक्टर पर एक प्लास्टिक धक्का के साथ एक बाँझ सिरिंज फिल्टर (0.45 माइक्रोन आकार का आकार) के लिए छोटे टयूबिंग को संलग्न करें, और फिल्टर छोड़ने वाले प्लास्टिक के बल्कहायर कनेक्टर पर पेंच। फिर, टयूबिंग को वाईपीडी संस्कृति की बोतल के प्रवेश में संलग्न करें ( चित्रा 1 बी देखें)।
  5. प्रायोगिक क्षेत्र में संस्कृति फ्लास्क से यात्रा करने से हवाई खमीर को रोकने के लिए, छोटे ट्यूबिंग का उपयोग करके प्रत्येक YPD संस्कृति की बोतल के आउटलेट में एक गिलास ट्यूब (6.5 सेमी लंबे, बाहरी व्यास = 0.5 सेमी और आंतरिक व्यास = 0.3 सेमी) संलग्न करें। ग्लास ट्यूब के दूसरी तरफ पीवीसी टयूबिंग संलग्न करें और प्रयोग बॉक्स के निचले छेद (हर तरफ ड्रिल) की ओर ले जाएं।
    1. ग्लास फाइबर के साथ ट्यूब भरें और उपयोग करने से पहले इसे आटोक्लेव करें।
  6. प्रायोगिक बक्से के प्रत्येक पक्ष में छोटे पीवीसी टयूबिंग के लिए एक और 15 मिलीलीटर ट्यूब फालीटर (एक्सचेंज 6.2 में वर्णित) जोड़ें, दोनों प्रयोगात्मक पक्ष पर बॉक्स में चलने वाली ट्यूबों पाने के लिए (प्रशंसक वायु प्रवाह के निकास के निकटतम, दाएं) और नियंत्रण पक्ष (प्रशंसक वायु प्रवाह के प्रवेश के निकटतम, बाएं)।
  7. 8 घंटों के 25 मिलीलीटर सीरॉलॉजिकल पिपेट्स को प्रत्येक आउटलेट के लिए 10 आउटलेट के साथ एक साथ 880 मिलिंग जोड़े का परीक्षण करने के लिए तैयार करें, अर्थात 40।
    1. ~ 0.8 सेमी व्यास के 10 छेद जलाएं, पिपेट में 2 सेमी अतिरिक्त।
    2. 1 एमएल सिरिंज का एक छोटा (2.5 सेमी) और एक बड़ा (5 सेंटीमीटर) आउटलेट में बाहरी भाग को काटें।
    3. इन दुकानों को गर्म गोंद के साथ छेद में गोंद करें।
    4. आउटलेट के अंत में प्लास्टिक पैराफिन फिल्म का एक छोटा सा बैंड लपेटें और 1,000 μL विंदुक टिप संलग्न करें। टिप खोलने का व्यास 0.1 सेमी है प्रत्येक प्रयोग के लिए साफ युक्तियों का उपयोग करें
    5. दो सीरॉलॉजिकल पिपेट्स संलग्न करें, बाहरी व्यास ≥0.5 सेमी और छोटे पीवीसी टयूबिंग के छोटे टुकड़े के साथ टी-स्प्लिटर का उपयोग करें, दोनों तरफ से दो आउटलेटों में से प्रत्येक के लिए। सफेद पेपर शीट (स्टील बॉक्स में कैमरे के नीचे) पर पिपेटों को टेप करें।
    6. वायु प्रवाह मॉनिटर का इस्तेमाल करना, हवा के प्रवाह को सेट करें ताकि 1000 μL विंदुक टिप के बाहर निकलने पर हवा के वेग 0.5 एम / एस हो। यह 0.0017 एलएएस प्रति टिप के हवा के प्रवाह से मेल खाती है।

    7. संभोग व्यवहार की निगरानी

    1. एक प्रायोगिक महिला को पेट्री डिश (अनुभाग 4 में वर्णित) में 15:00 बजे (जेडटी 6) में एक मुंह विंदुक (जैसा कि संदर्भ 26 में वर्णित किया गया है) का प्रयोग करें और संभोग के क्षेत्र में अनुकूलन करने के लिए उसे 1 घंटा दें।
    2. प्रायोगिक बॉक्स (अनुभाग 1 में वर्णित) निम्नानुसार सेट करें:
      1. रोशनी चालू करें, अर्थात् एक 12 घंटे पर सफेद प्रकाश एलईडी: 12 घंटे हल्का-अंधेरा चक्र जो टाइमर से कनेक्ट होता है जो उस पर स्विच करता हैप्रयोग के अंधेरे चरण के दौरान मक्खियों की निगरानी की अनुमति देने के लिए 09:00 (ZT0) पर प्रकाश और लगातार लाल बत्ती एलईडी। प्रशंसकों को प्रकाश स्रोत से कैबिनेट को ऊपर उठाने की सीमा को चालू करने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कि परीक्षण क्षेत्र के बाहर अतिरिक्त गंध का इस्तेमाल किया जाता है।
      2. एक कंप्यूटर पर वेब कैमरा कैमरे कनेक्ट करें और उन्हें चित्र निगरानी के लिए मॉनिटरिंग सॉफ्टवेयर से प्रारंभ करें।
      3. प्रत्येक कैमरे के लिए, मॉनिटरिंग सॉफ़्टवेयर में फ़ोकस, चमक और ज़ूम सेट करें।
        1. कैमरा स्क्रीन पर राइट-क्लिक करें, "कैमरा गुणों को खोलें" और "स्वचालित फोकस" को अनक्लिक करें। पेपर शीट पर ग्रिड या किसी लिखित शब्दों को स्पष्ट करने के लिए "फ़ोकस" समायोजित करें। यदि आवश्यक हो, तो "चमक" और "ज़ूम" को बदलें।
      4. मॉनिटरिंग सॉफ्टवेयर के कार्यक्रम को 1 पिक्चर हर 2 मिनट पर कैप्चर करने के लिए सेट करें प्रत्येक कैमरा स्क्रीन पर राइट-क्लिक करें और "एडिट करें" विकल्प चुनें और फिर "एक्शन" विकल्प चुनें। कार्रवाई शुरू करने के लिए क्लिक करें "नियमित int परErvals "और" 2 मिनट "के लिए समय बदलें। चुनने के लिए कार्य करने के लिए" आखें फोटो "चुनें और आखिरकार" ठीक है "पर क्लिक करें।
      5. प्रत्येक कैमरा स्क्रीन पर राइट-क्लिक करें और "मॉनिटरिंग प्रारंभ करें" चुनें।
    3. 1 घंटे के बाद (जेडटी 7 पर), मुंह विंदुक का उपयोग करते हुए एक पेटी डिश में एक जंगली सूक्ष्म अंतरण करना, वेब कैमरा कैमरों के ए 4 पेपर शीट्स पर डिश रखें और 24 घंटे के लिए "मॉनिटरिंग शुरू करें" पर क्लिक करें। वायु पंप प्रयोग के लिए, इस तरह डिश रखें कि पिपेट आउटलेट संभोग क्षेत्र के प्रवेश द्वार से जुड़ा हुआ है।
    4. जोड़े के संभोग व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए, निम्नलिखित करें
      1. कालानुक्रमिक क्रम में उनके माध्यम से एक छवि देखने वाले सॉफ्टवेयर और पृष्ठ में सभी चित्रों को चुनें और खोलें
      2. दिनांक, प्रयोग संख्या, डिश नंबर, और एक ही पंक्ति के भीतर एक स्प्रेडशीट में प्रारंभ समय लिखें। उस समय से प्रत्येक क्षेत्र के प्रारंभ समय को लें, जो इसे वेबकाई के तहत रखा गया हैमी कैमरा चित्रों से समय टिकट रिकॉर्ड करें
      3. स्प्रेडशीट में एक ही पंक्ति में प्रत्येक संभोग के शुरुआती समय को चिह्नित करें। किसी संभोग को एक घटना के रूप में गिनाओ, जब पुरुष ने महिला को माउंटेन किया है और जोड़ी कम से कम पांच लगातार फ्रेम (10 मिनट) के लिए एकदम स्थिर और उसी आसन में रहता है।
        नोट: यह मानदंड डी। मेलानोगास्टर में 12 से 27 मिनट तक की संगतता की रिपोर्ट की लंबाई पर आधारित है, और यह अवलोकन है कि 10 मिनट और उससे अधिक उम्र के लोग उपजाऊ 27 , 28 हैं ।
      4. संभोग आवृत्ति निर्धारित करने के लिए स्प्रैडशीट में प्रत्येक पंक्ति के लिए मोज़ों की संख्या की गणना करें। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक पंक्ति के लिए प्रजनन विलंबता के रूप में प्रत्येक पंक्ति के प्रयोग से प्रयोग के प्रारंभ समय को घटाना, या दूसरे विवाह के समय से पहले संभोग के समय को घटाकर विलंब के समय के रूप में घटा देना।
        1. Rematting विलंबता की गणना करने के लिए, सुनिश्चित करें किस्प्रैडशीट सॉफ्टवेयर में लगातार दिन के रूप में पहली और दूसरी संभोग की तारीखों को परिभाषित करें।
      5. स्वतंत्र चर-भोजन माध्यम के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए डेटा के सामान्य वितरण को संभालने वाले डेटा का विश्लेषण और प्रयोग की तारीख को यादृच्छिक कारक के रूप में शामिल करना, सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करना (सामग्रियों की तालिका देखें) हवा प्रकार, और बातचीत-जैसा कि पहले वर्णित 5
      6. लॉग-संभावना अनुपात परीक्षणों और संबद्ध उकेक की जानकारी का उपयोग करते हुए गैर-महत्वपूर्ण स्वतंत्र चर के पीछे के उन्मूलन को निष्पादित करके सबसे अच्छा समझाते मॉडल का चयन करें। मॉडल चलाने के बाद, सामान्य अवस्था की पुष्टि के लिए आंकड़ों के अवशेषों की नेत्रहीन जांच करें। लेवेन के परीक्षण का उपयोग करते हुए भिन्नता की एकरूपता की पुष्टि करें। असमान एकरूपता के मामले में, वर्ग-रूट डेटा को बदलता है।

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Representative Results

इस निरंतर परख, संभोग व्यवहार, और विशेष में संभोग आवृत्ति का प्रयोग, प्रयोगात्मक पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत निर्धारित किया जा सकता है। पर्यावरणीय परिस्थितियों को नियंत्रित करने के लिए, हमने एक स्टेनलेस स्टील के रसोई के कैबिनेट को एक परीक्षण क्षेत्र में बदल दिया, अपने स्वयं के प्रकाश स्रोत और प्रसार के साथ, जो प्रकाश के उच्च बहुतायत सुनिश्चित करता है और संभोग अखाड़ा ( चित्रा 1 ए ) के शीर्ष से एक न्यूनतम चमक को सुनिश्चित करता है । आंतरिक परीक्षण क्षेत्र पूरी तरह से स्टेनलेस स्टील और कांच द्वारा घिरा हुआ है, जो हेक्सेन या इथेनॉल जैसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ सफाई के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, कैबिनेट छेद से लैस है जो टयूबिंग के लिए इनलेट के रूप में कार्य करता है, दबाव वायु प्रणाली से वाष्पशील संकेत लाता है ( आंकड़े 1 ए और 1 बी देखें )। खमीर की गंध के लिए समायोजित दबाव वाली हवा प्रणाली में, 4 विंदुक स्प्लिटर के माध्यम से टेस्ट एरेनास में प्रवेश करने से पहले एक तरल खमीर संस्कृति के माध्यम से निर्देशित एक वायु प्रवाह होता है।10 आउटलेट प्रत्येक ( चित्रा 1 सी )। पूरी प्रणाली वायुरोधी है और कई कण फिल्टरों के साथ फिट है, जो खमीर संस्कृति में प्रवेश करने से पहले और बाद में, गंदे odors ( चित्रा 1 बी ) के साथ प्रदूषण को कम करने के लिए।

इस परख के प्रयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हमने परीक्षण किया कि क्या खमीर संस्कृति से वाष्पशील संकेतों से संभोग व्यवहार प्रभावित हो सकता है। 24 घंटे के लिए एक तरल खमीर संस्कृति के माध्यम से हवा को बुदबुदाते हुए किया गया था, और हवा के आउटलेट प्रत्येक संभोग क्षेत्र के प्रवेश द्वार ( चित्रा 2 ए देखें) में रखा गया था। संभोग के अर्धों में से आधा खमीर (खाद्य + खमीर) के साथ फ्लाई खाना होता है, और दूसरे भाग में खमीर के बिना फ्लाई खाना होता है (खाद्य - खमीर)। एक जंगली पुरुष और महिला बाहरी खमीर संस्कृति से आने वाली सुगंधों के संपर्क में थी, और उनकी संभोग आवृत्ति दर्ज की गई थी। गैलेफेड परिणामों को समझाने के लिए कौन-से वेरिएबल आवश्यक हैं, यह निर्धारित करने के लिए, हम मिश्रित-प्रभाव वाले मॉडल चलाते थे, या तो इसमें शामिल या छोड़े गए थेखाद्य माध्यम के स्वतंत्र चर, खमीर हवा, और दो की बातचीत। चित्रा 2 बी में डेटा सबसे अच्छा भोजन माध्यम (पी = 0.001) और खमीर हवा (पी = 0.061) के स्वतंत्र चर सहित एक मॉडल द्वारा प्रस्तुत किया गया है, लेकिन कोई अंतरफलक प्रभाव समझा नहीं है। यद्यपि खमीर हवा चर इस संपूर्ण डेटा सेट में महत्वपूर्ण नहीं है, फिर भी परिणामों की व्याख्या करना आवश्यक है। भोजन माध्यम के लिए अलग खमीर हवा का विश्लेषण दिखाता है कि भोजन माध्यम (वायु: पी = 0.9 9) में खमीर मौजूद नहीं है, जब एक संभोग जोड़े खमीर की गंध का जवाब नहीं देता, लेकिन खमीर होने पर वे अपने संभोग आवृत्ति में खमीर हवा में वृद्धि करते हैं भोजन के माध्यम से भी जोड़ा (हवा: पी = 0.018)। इन परिणामों से खाद्य माध्यम की स्थितियों के साथ संयोजन में पर्यावरणीय गंधों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए दबावयुक्त हवा प्रणाली की प्रयोज्यता प्रदर्शित होती है।

हम यह भी स्पष्ट करते हैं कि कैसे दबाव हवा प्रणाली बीएपी हो सकती हैपरीक्षण के क्षेत्र में सीधे पर्यावरण रासायनिक संकेतों को जोड़कर गड़बड़ी किस विशिष्ट खमीर यौगिकों को संभोग आवृत्ति पर असर डालने के लिए, हमने इस परिकल्पना का परीक्षण किया है कि अमीनो एसिड सामग्री को पीटोन (हाइडोलाइज्ड प्रोटीन) की एक खुराक को अमीनो अम्ल के मुकाबले संगत पर इसके प्रभाव के लिए जरूरी है ताकि अमीर खमीर द्वारा आपूर्ति की जाती है। सब्सट्रेट संभोग क्षेत्र अस्तर हम संभोग आवृत्ति को बढ़ाने के लिए, खमीर के प्रमुख वाष्पशील किण्वन उत्पादों में से एक एसिटिक एसिड की आवश्यकता का परीक्षण भी किया। यह सीधे एसिटिक एसिड को खाद्य माध्यम से जोड़कर किया गया था। खाद्य माध्यम ( चित्रा 3 बी ) में सीधे या एसिटिक एसिड के बिना पेप्टाफोन युक्त अगर या एगर युक्त पेड़ों में एक जंगली पुरुष और महिला का परीक्षण किया गया था। यह एक बहुत ही साधारण भोजन माध्यम और एक खराब वातावरण बनाता है; इसलिए, औसत संभोग आवृत्ति भी 2 बी की तुलना में कमी आई है। चित्रा 3 बी में डेटा, मॉडल सहित सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता हैखाद्य माध्यम के स्वतंत्र चर (पी = 0.002), एसिटिक एसिड एयर (पी = 0.001), और दो (पी = 0.022) की बातचीत। एसीटिक एसिड की उपस्थिति पर महिला ग्रहणशीलता बढ़ जाती है, लेकिन केवल ऐसी स्थिति में जहां पीपेटोन मध्यम में मौजूद है। इससे पता चलता है कि मक्खियों को एक साथ अपने संभोग आवृत्ति ( चित्रा 3 बी ) को बढ़ाने के लिए अमीनो एसिड और एसिटिक एसिड को समझने की जरूरत है। यह दर्शाता है कि गंध संयुग्मों को सीधे टेस्ट एना से जोड़ना संभोग व्यवहार को प्रभावित कर सकता है और ये प्रभाव बहुत ही साधारण पर्यावरणीय परिस्थितियों में पाया जा सकता है

आकृति 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक बॉक्स का आरेख और खमीर के साथ दबाव प्रणाली। ( ए ) अनुभाग 1 में वर्णित पर्यावरण के साथ संगत संभोग बॉक्स के योजनाबद्ध उदाहरण। एनोटेट संख्या और तीरों का विवरण: 1. अल बोर्ड के साथ अल सफेद और लाल बत्ती टर्निंग; 2. छोटे प्रशंसक; 3. फिल्टर पेपर की 3 परतें, प्रत्येक परत जिसमें दो फिल्टर-पेपर शीट होते हैं; 4. ग्लास प्रसार प्लेट बॉक्स के 3 पक्षों से जुड़ी कोष्ठक पर आराम; 5. बड़ा प्रशंसक; 6. टयूबिंग और तारों के लिए छेद; 7. प्रायोगिक क्षेत्र; बड़े तीर, कांच प्लेट में 50 सेमी; मध्यम तीर, केबल छेद के लिए 35 सेमी की ऊंचाई; और छोटे तीर, ट्यूबिंग छेद के लिए 7 सेमी ऊंचाई। ( बी ) धारा 5, 6.4 और 6.5 में बताए अनुसार वायु प्रवाह के साथ तरल खमीर संस्कृति के योजनाबद्ध उदाहरण। एनोटेट संख्या का विवरण: 1. डिस्पोजेबल फिल्टर इकाई; 2. सिलिकॉन सेप्टम और आउट- और इनलेट के साथ टोपी; 3. तरल माध्यम; और 4. गिलास फाइबर के साथ गिलास ट्यूब। ( सी ) धारा 6.7 में वर्णित हवा के आउटलेट के योजनाबद्ध उदाहरण। एनोटेट संख्याओं का विवरण: 1. सीरमिकल पिपेट; 2. टयूबिंग 1 एमएल सिरिंज से कटौती, और 3. 1,000 μL विंदुक टिपलक्ष्य = "_ रिक्त"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2: खमीर गंध खाद्य सब्सट्रेट में खमीर की उपस्थिति में महिला ग्रहणशीलता बढ़ जाती है। ( ए ) प्रवेश द्वार के माध्यम से प्रवेश 1C में एयर आउटलेट से एक पुरुष और एक महिला और विंदुक टिप के साथ एक संभोग के मैदान के योजनाबद्ध उदाहरण। ( बी ) कैंटन-एस संभोग की संभोग की आवृत्ति में प्रतिक्रिया के ग्राफिकल प्रस्तुति के साथ और फ्लाई भोजन माध्यम में खमीर के बिना खमीर गंध (खाद्य - खमीर: मध्यम हवा एन = 12, खमीर हवा एन = 13 और खाद्य + खमीर : मध्यम हवा एन = 24, खमीर हवा एन = 23)। एसईएम त्रुटि सलाखों के साथ लाइन ग्राफ और स्वतंत्र चर के रूप में हवा के साथ मिश्रित प्रभाव मॉडल के सांख्यिकीय उत्पादन और प्रत्येक खाद्य माध्यम के लिए स्वतंत्र रूप से एक यादृच्छिक चर के रूप में तिथि स्वतंत्र रूप से मुख्य सांख्यिकीविदएल मॉडल में भोजन (पी = 0.001) और खमीर हवा (पी = 0.061) शामिल है। संदर्भ 5 से अनुकूलित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: फ्लाई खाना सब्सट्रेट में एसिटिक एसिड पेप्टाफोन की उपस्थिति में महिला ग्रहणशीलता को बढ़ाता है। ( ए ) एक संभोग के मैदान के योजनाबद्ध चित्रण, एटेटिक एसिड युक्त मछली खाने वाले भोजन के माध्यम से और एक प्लास्टिक पैराफिन फिल्म प्लग को प्रवेश द्वार को बंद करना। ( बी ) अगर या पेप्टाफोन माध्यम पर एसिटिक एसिड की प्रतिक्रिया में एक कैंटन-एस संभोग जोड़े की संभोग आवृत्ति की एक ग्राफिकल प्रस्तुति (अगर: -एसीटीक एसिड एन = 52, एसिटिक एसिड एन = 40 और पेप्टोोन: -सिनेटिक एसिड एन = 28, + एसिटिक एसिड एन = 25)। SEM त्रुटि सलाखों और स्टेटी के साथ लाइन ग्राफ़भोजन माध्यम (पी = 0.002), एसिटिक एसिड वायु (पी = 0.001), और भोजन * हवा (पी = 0.022) के साथ मिश्रित-प्रभाव मॉडल के निर्णायक उत्पादन स्वतंत्र चर और एक यादृच्छिक चर के रूप में दिनांक। संदर्भ 5 से अनुकूलित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यह प्रोटोकॉल 24 घंटों से संभोग व्यवहार का परीक्षण करने के लिए एक परख का वर्णन करता है, जबकि पर्यावरण के संकेतों को लगातार नियंत्रित करते हुए कि एक संभोग जोड़े को संभोग आवृत्ति निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। मध्यम में खमीर ( चित्रा 2 बी ) भी शामिल है जब दबाव हवा प्रणाली के माध्यम से खमीर हवा के जवाब में संभोग आवृत्ति में वृद्धि संभव है। इसके अतिरिक्त, संभोग की आवृत्ति में एक समान प्रतिक्रिया सीधे सरलीकृत खाद्य माध्यम के साथ मनाई जा सकती है जिसमें केवल अगर, पेप्टाफोन और एसिटिक एसिड गंध सीधे माध्यम में होती है ( चित्रा 3 बी )

यहां प्रदर्शित प्रयोगों के साथ, निष्कर्ष जोड़े के सामान्य संभोग व्यवहार पर ही तैयार किए जा सकते हैं, क्योंकि दोनों लिंगों को एक ही पर्यावरण परिस्थितियों से अवगत कराया गया है। हालांकि, हम पिछले अनुसंधान से जानते हैं कि संभोग आवृत्ति में बदलाव का 47% महिला द्वारा निर्धारित होता है, जबकि पुरुष योगदान केवल 11% भिन्नता के लिए होता है20 इसलिए, देखा गया संभोग आवृत्ति में अधिकांश परिवर्तन संभवतः महिला यौन ग्रहणशीलता का परिणाम है। बढ़ी हुई पुरुषों अभी भी, महिला को स्वीकार करने या अस्वीकार करने के लिए संभोग छोड़ देता है वयस्क मेलानोगास्टर के रूप में महिलाओं को सफलतापूर्वक हटाने कर सकते हैं संभोग का प्रयास 29 प्रेमालाप। फर्म के निष्कर्षों के लिए और विशेष रूप से महिला यौन ग्रहणशीलता के संभोग आवृत्ति में अंतर को स्पष्ट करने के लिए, अतिरिक्त संभोग जोड़ों का परीक्षण करना आवश्यक है जहां महिला का जीनोटाइप विविध होता है लेकिन पुरुष का निरंतर रखा जाता है

इस प्रोटोकॉल ने एक संभोग वायु प्रणाली के साथ या सीधे भोजन माध्यम में, संभोग जोड़े को सुगंधित यौगिकों को देने के दो तरीके दिखाए हैं। दबावयुक्त हवा प्रणाली का लाभ यह है कि किसी भी प्रभाव को यौगिकों को हवा के जरिये वितरित किया जा सकता है, जबकि यह यौगिकों को सीधे भोजन माध्यम में रखा जाता है जब यह निष्कर्ष निकाला नहीं जा सकता है दूसरी तरफ, wहेन दबाव प्रणाली के साथ कोई प्रभाव नहीं पाया जाता है, इसका स्वतः मतलब यह नहीं है कि क्यू व्यवहार को प्रभावित नहीं करता है इसका अर्थ यह भी हो सकता है कि दबाव हवा प्रणाली के माध्यम से यौगिक कुशलतापूर्वक वितरित नहीं किया जाता है। एयर डिलीवरी सिस्टम के आउटलेट पर हवा की संरचना का विश्लेषण एक हाइड्रोकार्बन फिल्टर लगाकर किया जा सकता है और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर गैस क्रोमैटोग्राफी के साथ फंस गए वायु सामग्री का विश्लेषण कर सकता है। दबावयुक्त हवा प्रणाली एक यौगिकों का परीक्षण करने के लिए एक अच्छा परख है जो आसानी से एक लंबी दूरी पर एयरबोर्न बना सकते हैं। कम वाष्पशील यौगिकों को सीधे भोजन माध्यम में डालना होगा दबावयुक्त हवा प्रणाली का एक और नुकसान यह है कि प्रभाव वायु वेग उड़ान के व्यवहार पर हो सकता है। मक्खियों के चलते चलते रहें जब वायु वेग बहुत अधिक है (0.7-1.6 मी / एस से ऊपर) 30 इसके अतिरिक्त, दबावयुक्त हवा प्रणाली भोजन के माध्यम से सुखाने से एक सरल, निम्न-गुणवत्ता वाले वातावरण को असहनीय बना सकती है। दोनों मामलों में, मक्खियों perf नहीं हो सकता हैOrm समान रूप से अच्छी तरह से, और कोई निष्कर्ष तो परीक्षण किया विशिष्ट यौगिकों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है

इन assays के इष्टतम चलने की तैयारी के दौरान कई कदम महत्वपूर्ण हैं। पहला कदम जिस पर ध्यान देने की आवश्यकता है, वह माध्यम की तैयारी है। यह जरूरी है कि माध्यम से, गंधयुक्त वाष्पशील यौगिकों जैसे एसिटिक एसिड, प्रयोग के दिन तैयार किया जाता है और न ही जल्दी से वाष्पीकरण से बचने के लिए। इसके अलावा, मध्यम को बिना किसी अतिरिक्त वायु प्रवाह (इस के लिए धूआं हुड का उपयोग करने से बचने) के साथ सतह पर कड़ा होना चाहिए क्योंकि एयरफ्लो गंध के वाष्पीकरण को उत्तेजित कर सकता है। दूसरे चरण के लिए विशेष देखभाल की आवश्यकता है दबाव हवा प्रणाली की स्थापना। क्षेत्र में किसी भी द्रव को स्थानांतरित किए बिना खमीर संस्कृति को धीरे-धीरे बुलबुला करने के लिए वायु प्रवाह को उच्च होना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में संभोग व्यवहार के साथ संयोजन में खमीर गंध के साथ एक व्यवहार परख दर्शाया गया है। हालांकि, इस प्रणाली को किसी भी पर लागू किया जा सकता हैगंध का प्रकार, साथ ही अन्य प्रकार के व्यवहार भी अन्य गंधों के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए, व्यंजनों के लिए यौगिकों के हस्तांतरण को अनुकूलित करने के लिए एयरफ्लो और गंध माध्यम को समायोजित करना आवश्यक है। हालांकि, सामान्य तौर पर, किसी भी परिसर को हवा से स्थानांतरित किया जा सकता है, इस प्रणाली के साथ परीक्षण किया जा सकता है। इसके अलावा, किसी भी प्रकार का व्यवहार, दोनों पुरुषों और महिलाओं में, का परीक्षण किया जा सकता है, या तो एक ही प्रकार के बर्तन का उपयोग करके या टयूबिंग को समायोजित करके या बड़े या छोटे परीक्षण क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए। इसके अतिरिक्त, जब अधिक विस्तृत व्यवहार का परीक्षण किया जाता है, फ्रेम दर और इस्तेमाल किए गए कैमरों के प्रस्तावों पर पुनर्विचार करने की आवश्यकता होती है। किसी भी मामले में, यदि टेस्ट गंध के साथ और बिना प्रयोग दोनों प्रयोगों को एक ही समय में और एक ही वायु स्रोत के साथ चलाया जाता है, तो पर्यावरण क्यू के लिए कोई भी प्रतिक्रिया पता लगा सकती है, चाहे एक प्रयोग से दूसरे में दबाव या एकाग्रता में परिवर्तन की परवाह किए बिना। अन्त में, यहां परख के प्रदर्शन को कम से कम एक और एलडी चक्र (48 घंटे तक) के लिए बढ़ाया जा सकता है, जब तक कि एफओड की आपूर्ति सूख नहीं है

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धात्मक हित नहीं है

Acknowledgments

हम उड़ने वाले स्टॉक के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर का धन्यवाद करते हैं; सी। गहर, जेटी अल्कामा, और एस। वैन हेस्टेल ने दबाव हवा के परख के विकास के अपने शुरुआती प्रयास के लिए; खमीर की खेती पर सलाह के लिए जैस्पर बॉसमैन; और रज़ा अज़ांचि और जोएल लेविन को मूल रूप से ड्रोसोफिला संभोग व्यवहार की समय-अवधि की निगरानी का विकास करने के लिए। जेए गॉर्टर को न्यूरोसाइंस रिसर्च स्कूल बीसीएन / एनडब्ल्यूओ ग्रेजुएट प्रोग्राम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। यह काम, जे.सी. बिल्टर के वैज्ञानिक सहयोग के लिए डच संगठन (एनडब्ल्यूओ) (संदर्भ: 821.02.020) द्वारा भाग में समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

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References

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
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Gorter, J. A., Billeter, J. C. A… More

Gorter, J. A., Billeter, J. C. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

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