Summary
Wir zeigen einen Assay, um die ökologischen und genetischen Cues zu analysieren, die das Paarungsverhalten in der Fruchtfliege beeinflussen Drosophila melanogaster .
Abstract
Der sexuelle Antrieb eines Individuums wird durch Genotyp, Erfahrung und Umweltbedingungen beeinflusst. Wie diese Faktoren interagieren, um sexuelle Verhaltensweisen zu modulieren, bleibt schlecht verstanden. In Drosophila Melanogaster , Umwelt-Cues, wie die Verfügbarkeit der Lebensmittel, beeinflussen Paarung Aktivität bietet ein traktierbares System, um die Mechanismen zu modulieren sexuelles Verhalten zu untersuchen. In D. melanogaster werden ökologische Hinweise oft über die chemosensorischen Geschmacks- und Geruchsstoffe erkannt. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Wirkung von umweltchemischen Stichworten auf das Paarungsverhalten zu testen. Der Assay besteht aus einer kleinen Paarungsarena mit Nahrungsmedium und einem Paarungspaar. Die Paarungsfrequenz für jedes Paar wird kontinuierlich für 24 Stunden überwacht. Hier stellen wir die Anwendbarkeit dieses Assays dar, um Umgebungsverbindungen aus einer externen Quelle durch ein Druckluftsystem zu testen und die Umweltkomponenten direkt in der Paarungsarena zu manipulieren. Das UEin Druckluftsystem ist besonders nützlich, um die Wirkung von sehr flüchtigen Verbindungen zu testen, während die Manipulation von Komponenten direkt in der Paarungsarena von Wert sein kann, um die Anwesenheit einer Verbindung zu ermitteln. Dieser Assay kann angepasst werden, um Fragen über den Einfluss von genetischen und ökologischen Cues auf Paarungsverhalten und Fruchtbarkeit sowie andere männliche und weibliche Fortpflanzungsverhalten zu beantworten.
Introduction
Fortpflanzungsverhalten haben typischerweise hohe Energiekosten, vor allem für Frauen, die größere Gameten produzieren als Männer und müssen sorgfältig die Bedingungen wählen, um ihre sich entwickelnden Nachkommen zu erhöhen. Wegen der Energiekosten ist es nicht verwunderlich, dass die Reproduktion mit den Ernährungsbedingungen verbunden ist. Dies gilt in den meisten, wenn nicht alle Tiere , einschließlich Säugetiere, deren Pubertät durch Unterernährung verzögert werden kann und Sexualtrieb , dessen kann sich negativ durch Nahrungsbeschränkung 1 betroffen sein.
Die Reproduktion des genetischen Modellorganismus Drosophila melanogaster wird auch durch Ernährungsbedingungen beeinflusst. Males Gericht auf höherem Niveau in Gegenwart von Lebensmitteln flüchtige 2 , und Frauen sind mehr sexuell empfänglich in Gegenwart von Hefe, ein wichtiger Nährstoff für die Eiproduktion und Nachkommen Überleben 3 , 4 , 5 . DiesEvolutionäre konservierte Reproduktionsreaktion auf Nahrung bietet die Möglichkeit, Mechanismen zu untersuchen, die die Umweltnahrungsmittelverfügbarkeit mit der sexuellen Reproduktion in einem genetisch tragbaren und zeitsparenden Organismus verbinden. In der Tat hat die Arbeit in D. melanogaster den Insulinweg als wichtigen Regulator des Zusammenhangs zwischen Nahrung und Paarungsverhalten verwickelt 6 . Es hat auch gezeigt, dass der Akt der Paarung selbst die Nahrungspräferenz von Weibchen sowie die damit verbundenen chemosensorischen Neuronen 7 , 8 , 9 ändert.
Es ist klar, dass Lebensmittel-Cues Reproduktionsverhalten in D. melanogaster beeinflussen . Diese Effekte scheinen vor allem Frauen zu behandeln, speziell diejenigen, die bereits gepaart haben 5 . Um jedoch diese akuten Effekte von Umgebungsbedingungen zu testen, kann der Assay, der klassisch für weibliches Paarungsverhalten verwendet wird,Nicht sehr geeignet wegen der langen Unterbrechungen zwischen Paarung Episoden. In der klassischen Remoting-Assay, eine Jungfrau weiblich erste Kumpel mit einem Mann, und ist sofort isoliert und präsentiert mit einem neuen Mann 24 bis 48 Stunden später. Dieser klassische Assay wurde mit großem Erfolg verwendet, um Komponenten des männlichen Ejakulats zu identifizieren, die das weibliche Verhalten und die weibliche Antwort 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 modifizieren. Der hier vorgestellte kontinuierliche Paarungsassay ist daher eine Ergänzung zu klassischen Paarungsassays, mit denen die akute Wirkung von Umgebungsbedingungen auf das Fortpflanzungsverhalten untersucht werden kann.
Mit dem kontinuierlichen Assay für das Paarungsverhalten, das hier erklärt wird, haben wir vorher gezeigt, dass ein Paar Fliegen, die Hefe ausgesetzt sind, sAlltägliche Zeiten über einen 24-Stunden-Beobachtungszeitraum 5 , 19 , 20 , 21 , während Fliegen, die nicht der Nahrung ausgesetzt sind, nur einmal 5 Dieser Befund kann im Lichte eines großen Teils der D. melanogaster- Literatur rätselhaft sein, was darauf hinweist, dass Frauen sich nach einer anfänglichen Paarung (einige in den Ziffern 10 , 11 ) nicht wiederholen. Allerdings kann diese Diskrepanz leicht durch Assay-Bedingungen erklärt werden, wo eine Frau für ein bis mehrere Tage isoliert ist, bevor eine neue Paarungsmöglichkeit zur Verfügung gestellt wird. Wenn das Paar in dieser stundenlangen Beobachtungsperiode nicht passt, wird das Weibchen als nicht empfänglich charakterisiert. Darüber hinaus sollte die hohe Paarungsfrequenz nicht überraschen, da die Daten von wild gefangenen Fliegen zeigen, dass Frauen Spermien von 4 bis 6 Männchen in ihren Speicherorganen enthalten; Also inDass Frauen selbstverständlich mehrmals 22 , 23 .
Hier zeigen wir die Verwendung dieses kontinuierlichen zusammenpassenden Assays, um zu enträtseln, wie Fliegen sammeln und kombinieren Informationen über Umgebungsbedingungen, um Paarungsfrequenz zu modulieren. Dieser Assay erlaubt es, eine relativ große Anzahl von Paarungspaaren für genetische Studien zu testen und den Einfluss von flüchtigen und nicht-flüchtigen Umwelt-Cues zu testen. Der Assay läuft typischerweise für 24 h, kann aber auf 48 h verlängert werden, was die Prüfung von Zyklus-Umgebungs-Cues wie dem Hell-Dunkel-Zyklus ermöglicht. Wir zeigen diesen Assay, indem wir den Einfluss von flüchtigen Cues aus einer Hefekultur innerhalb eines Druckluftsystems in Kombination mit der Verfügbarkeit von nicht-flüchtigen Hefe-Nährstoffen in dem Nahrungsmittelsubstrat untersuchen.
Das Druckluftsystem pumpt kontinuierlich flüchtige Cues in eine passende Arena, die enthaltenSa-Food-Substrat und ein Test-Paar (dessen Paarungsverhalten überwacht wird). Um die Besonderheiten, durch die die Hefe beeinflusst, zu bestimmen, testen wir eine große flüchtige Verbindung von Hefe, nämlich Essigsäure 24 , in Kombination mit einem Aminosäuregehalt, der dem von Hefe im Nahrungsmittelsubstrat entspricht, in Form von Pepton (Amino Säuren, die aus der enzymatischen Verdauung von tierischen Proteinen gewonnen wurden). Gemeinsam zeigen diese Experimente, wie die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten von D. melanogaster mit diesem Assay getestet werden kann.
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Protocol
1. Umweltgesteuerte Paarungsbox
- Um eine kontrollierte und leicht zu reinigende Testfläche zu gewährleisten, richten Sie einen Edelstahl-Küchenschrank von 120 cm x 64 cm x 85 cm ein, wie in Abbildung 1A dargestellt.
- Bohren Sie ein Loch an der Rückseite des Schrankes knapp unter der Decke und vier Sätze von vier Löcher in die Seiten, jeweils mit einem Durchmesser von 2 cm. Bohren Sie die ersten beiden Sätze von vier Löchern, auf jeder Seite des Kastens in einer Höhe von 7 cm von der Unterseite des Kastens und mit 12.5 cm zwischen den Löchern. Bohren Sie die beiden anderen Sätze auf jeder Seite der Schachtel in einer Höhe von 35 cm von unten.
HINWEIS: Die vier Sätze von vier Löchern werden für Kamerastromkabel und Luftpumpschlauch verwendet, um das Gehäuse zu betreten und zu verlassen. Das Loch auf der Rückseite wird für die Stromkabel einer Leuchttafel verwendet. - Bilden Sie eine Leuchttafel mit 18 Reihen von 40 wechselnden weißen und roten Leuchtdioden (LED) mit 2,5 cm Abstand zwischen jedem Licht. Stellen Sie die weißen und roten LEDs in einem Kreislauf einT mit Stromversorgung. Verbinden Sie jede LED in Serie mit einem Widerstand von 560 Ω, 0,25W und 5% Toleranz.
HINWEIS: Die Emissionswellenlängen des roten Lichts von 590-661 nm mit einem scharfen Peak bei 627 nm. Die daraus resultierende Lichtintensität im Experimentierbereich beträgt ca. 900 Lux bei beiden Lampen und 90 Lux mit nur den roten Lampen an; Dies wurde mit einem smartphone light meter app gemessen. - Befestigen Sie die Lichtplatte an der Oberseite des Edelstahl-Schrankes und führen Sie die Stromkabel durch das Loch auf der Rückseite.
- Verbinden Sie den Adapter der weißen LEDs mit einem Power Control Timer, um das Wechseln der weißen LED während der Dunkelphase des Experiments zu ermöglichen. Verbinden Sie den Adapter des roten Lichts, das fliegt blind bis 25 , zu einer regelmäßigen Stromversorgung, um sie für die gesamte Dauer des Experiments zu halten.
- Fixieren Sie eine 110 cm und zwei 54 cm lange Metallhalterungen, jeweils mit einer Breite von 0,5 cm, bis zu den Innenseiten der Box auf einer Höhe 50Cm von der Unterseite der Box. Legen Sie eine Glasdiffusionsplatte (Maße von 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) auf diese Klammern.
- Fügen Sie drei Schichten Filterpapier (120 cm x 50 cm) zwischen der Lichtplatte und der Glasplatte hinzu, um das Licht zu diffundieren und die Blendung auf der Oberfläche der zusammenpassenden Arenen zu begrenzen (siehe Abschnitt 4). Pin zwei Filter Papierblätter zusammen auf ihre lange Kante auf 120 cm lange Holzstangen mit Magneten (auf der Seite), um sie an den Innenseiten des Metall-Schrank zu kleben; Diese Aktion 3 mal durchführen.
- Befestigen Sie vier Lüfter an den Seiten der Box, um einen Luftstrom zu erzeugen, der ständig die passende Box entlüftet. Befestigen Sie den ersten Satz von 8 cm-Ventilatoren zwischen der Lichtplatte und der Glasplatte, mit dem Lufteinlass auf der linken Seite und dem Auspuff an der rechten Seite der Box, um den Aufbau der von der Leuchttafel erzeugten Wärme zu minimieren.
- Befestigen Sie den zweiten Satz von 12 cm Ventilatoren 25 cm über dem Boden des Schrankes, um einen äußeren Luftstrom zu erzeugen, der das i entlüftetNside des Schrankes und kühlt es zu einem stabilen 26 ° C. Bringen Sie die Lüfter an der Auspuffseite an einen Saugschlauch an und führen Sie den Luftstrom aus dem Raum, um ein erneutes Radfahren der Luft im Schrank zu verhindern.
- Bohren Sie ein Loch an der Rückseite des Schrankes knapp unter der Decke und vier Sätze von vier Löcher in die Seiten, jeweils mit einem Durchmesser von 2 cm. Bohren Sie die ersten beiden Sätze von vier Löchern, auf jeder Seite des Kastens in einer Höhe von 7 cm von der Unterseite des Kastens und mit 12.5 cm zwischen den Löchern. Bohren Sie die beiden anderen Sätze auf jeder Seite der Schachtel in einer Höhe von 35 cm von unten.
- Stellen Sie zwei Ständer (ca. 48 cm hoch) mit zwei Klemmen auf, eine bei 28 cm und eine mit 30 cm von der Unterseite des Ständers. Fix eine Webcam auf jede der Klemmen. Verbinden Sie die 4 Kameras mit einem Computer, auf dem die Überwachungssoftware läuft.
- Platzieren Sie A4 Blätter unter jeder Webcam. Benutzen Sie unbedruckte weiße Blätter oder Blätter mit vornumeriertem Gitter von 7 von 5 Quadraten mit 4 cm-Achsen, um passende Arenen (siehe Abschnitt 4) aufzunehmen.
HINWEIS: Eine HD-Webcam mit 78 ° Weitwinkel-Ansicht und 5-Millionen-Pixel-Auflösung kann eine Fläche von 21 cm x 30 cm entsprechend einem A4-Blatt und Monitor zwischen 20 und 35 Paarungs-Arenen abdecken.
2. Fliegen Aufzucht und Sammlung
- Platz 20 männlichen und 20 weiblichen Wild-Typ Canton-SFliegt in Fliegenaufzuchtflaschen, die 45 mL reiche Fliegenfuttermedium (siehe Abschnitt 3) für drei bis vier Tage enthalten. Übertragen Sie die gleichen Erwachsenen dreimal, indem Sie sie zuerst und dann in frische Flaschen klopfen.
- Legen Sie die Flaschen in einen Inkubator bei 25 ° C und 12 h: 12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit Lichter an um 09:00 (Zeitgeber Zeit (ZT) 0). Eine neue Generation wird etwa 10 Tage später erscheinen.
- Anästhesieren Sie die daraus entstandenen neu entdeckten Fliegen auf Kohlendioxid-Pads für nicht länger als 5 Minuten und sammeln Sie sie in fliegen Lebensmittel Fläschchen mit einem Pinsel.
- Sammeln Sie jungfräuliche (neu erschlossene) Weibchen und Jungfrauen aus den Wildtyp- Canton-S- Lagerflaschen in 2,5 cm x 9,5 cm Fliegenaufzuchtfläschchen mit 6,5 ms reichhaltigem Futterfuttermedium.
- Alter der Fliegen in den gleichen Geschlechtsgruppen von 20 Fliegen jeweils in Fliegenaufzucht Fläschchen für 5 bis 8 Tage bei 25 ° C und 12 h: 12 h hell-dunkler Zyklus und Lichter an um 09:00 (ZT 0).
- TransfDie Fliegen zu frischen Fliegenaufzucht Fläschchen am Tag vor dem Experiment.
3. Lebensmittel Mittel Vorbereitung
- Bereiten Sie 1 L des reichen Fliegenmediums wie folgt vor.
- 1 l Leitungswasser in ein 2-l-Glasbecher mit einem Magnetrührer geben und den Becher auf eine Magnetplatte stellen. Halten Sie das Rühren aus und drehen Sie die Heizung auf 300 ° C, bis die Siedetemperatur erreicht ist.
HINWEIS: Während der langen Siedezeit in den folgenden Schritten wird ein Wasseranteil verdampfen, aber zusammen mit den zugesetzten Zutaten führt dieses Protokoll zu 1 l reichem Fliegenmedium, wenn es bei Raumtemperatur von etwa 22 ° C hergestellt wird. - Schalten Sie das Rühren auf 500 Runden pro Minute (U / min) ein und fügen Sie dem kochenden Wasser folgende Zutaten hinzu: 10 g Agar, 30 g Glukose, 15 g Saccharose, 15 g Maismehl, 10 g Weizenkeim, 10 g Sojamehl, 30 g Melasse, 35 g aktive Trockenhefe. Warten Sie auf die Hefe, um kräftig zu schäumen, dann drehen Sie die heiße PlattentempErature bis 120 ° C.
- Nach 10 min die heiße Platte auf 30 ° C abkühlen lassen und die Mischung rühren lassen, bis sie auf 48 ° C abgekühlt ist. Überwachen Sie die Temperatur, indem Sie ein Thermometer direkt in das Lebensmittel einführen.
- 2 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester (tegosept, 100%) in 10 ml 96% iges Ethanol auflösen. Fügen Sie diese und 5 ml 1 M Propionsäure der Mischung hinzu. Rühre für 3 min.
- Gießen Sie das Fliegenfuttermedium in die Arenen (beschrieben in Abschnitt 4), um eine 0,3 cm dicke Schicht an der Unterseite der Arena zu schaffen.
- Verwenden Sie zum Ausgießen ein 200 ml Glasbecher. Wenn genaue Mengen wichtig sind, verwenden Sie eine 10 mL serologische Pipette.
- 1 l Leitungswasser in ein 2-l-Glasbecher mit einem Magnetrührer geben und den Becher auf eine Magnetplatte stellen. Halten Sie das Rühren aus und drehen Sie die Heizung auf 300 ° C, bis die Siedetemperatur erreicht ist.
- Bereiten Sie Fliegenmedien minus Hefe genau wie in Schritt 3.1.1 bis 3.1.5 beschrieben, aber lassen Sie die Hefe in Schritt 3.1.2.
- Medium mit Agar mit oder ohne Pepton durch Mischen von 10 g Agar und 35 g Pepton in 1 l kochendem Wasser zubereiten und die Schritte 3.1.4 bis 3.1.5 durchführen.
4. MatinG Arena Vorbereitung
- Durchbohren Sie ein Loch von ca. 0,3 cm Durchmesser auf der Oberseite einer 3,5 cm x 1,0 cm breiten Plastik-Petrischale mit einer beheizten Präparationsnadel (erhitzt auf Rötung in einem Bunsenbrenner). Alternativ verwenden Sie auch einen Lötkolben.
- Bei der Zubereitung von Nahrungsmittelmedium mit geruchlosen Verbindungen wird die erste Pipette 30 μl (1% des endgültigen Nahrungsmittelmediums, z. B. Essigsäure Glazial 100%) der gewünschten Verbindung in die Schale für die Hälfte der Versuchsschalen pipettiert. Lassen Sie die andere Hälfte des Geschirrs zum Vergleich leer.
HINWEIS: Mit dem hier beschriebenen Aufbau können maximal 140 Arenen sofort getestet werden. - Unter Verwendung einer 10 mL serologischen Pipette gießen Sie 3 ml Lebensmittelmedium an der Unterseite der Schale auf die gewünschte Verbindung. Mit einem Käsetuch abdecken, um eine Kontamination zu vermeiden und das Medium ca. 1 h bei Raumtemperatur zu verfestigen.
- Legen Sie einen Deckel auf die Teller und Klebeband jeweils auf zwei Seiten zu schließen. Bereiten Sie kleine Paraffin-Filmstopfen vor, um die Löcher zu bedeckenDie Gerichte durch Walzen von Paraffin-Folien in 0,2 cm dicke Walzen und schneiden sie dann in 0,5 cm-Segmente.
5. Hefe-Kultur für Geruch
- Wachsen Sie trockene aktive Hefe auf Hefeextrakt Pepton Dextrose (YPD) Agar in einer 14,0 cm x 2,06 cm Petrischale. Tragen Sie Handschuhe, um Kontamination in diesem Schritt zu verhindern.
- YPD-Agarplatten durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 22 g Glucose (0 (+) - Glucose-Monohydrat) und 15 g Agar (rein) zu 1 l kochendem Reinstwasser zubereiten. Legen Sie den Boden der Petrischale, sobald alles aufgelöst ist und lagern Sie sich im Kühlschrank bei 4 ° C, für bis zu 2 Monate.
- Streuen Sie ein paar Körner getrocknete Hefe auf eine YPD-Mediumplatte, lassen Sie sie auflösen. Dann strecke die mittlere Platte mit einer sterilen Schleife. Die Platte in einem 30 ° C Inkubator über Nacht aufbewahren. Danach die Kultur im Kühlschrank für nicht länger als 1 Woche aufbewahren.
- YPD flüssiges Medium vorbereiten iN 1 L-Flaschen durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 22 g Glucose (0 (+) - Glucose-Monohydrat) und einem Rührstab zu 1 l Reinstwasser.
- Autoklav für 25 min bei 120 ° C und 1 bar Druck. Danach die Flaschen bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahren.
- Die offenen Flaschendeckel (4,5 cm) mit einem 0,32 cm dicken Silikonseptum anbringen.
- Schneiden Sie zwei kleine Löcher im Septum, um eng an Stacheldraht-Armaturen anzupassen. Befestigen Sie die kleinen Polyvinylchlorid (PVC) Schläuche (Durchmesser: außen 0,8 cm und innere 0,5 cm) an beiden Ausgängen, die die Flasche verlassen und nur einen der Einlässe in die Flasche eindringen. Siehe Abbildung 1B zur Veranschaulichung.
- Wickeln Sie die mitgelieferten Kappen und Schläuche in Aluminiumfolie und Autoklav für 25 min bei 120 ° C und 1 bar Druck.
- Tragen Sie Handschuhe zum Schutz vor Kontamination in diesem Schritt. Tauchen Sie eine sterile 100 μl Pipettenspitze in eine der Hefekolonien aus der YPD-Agarplatte (dIn 5.1 beschrieben) und in die autoklavierte Flüssigmediumflasche YPD fallen lassen.
- Diese Hefe-inokulierte YPD-Flüssigmedium-Flasche sowie eine YPD-Medium-Kontrollflasche (Hefe nicht zugegeben) mit autoklavierten Kappen, die mit Ein- und Auslauf montiert sind (beschrieben in Schritt 5.3). Setzen Sie beide Flaschen auf getrennte magnetische Platten und rühren bei 100 U / min bei Raumtemperatur für 24 Stunden vor Beginn des Experiments, um die Hefekultur zu wachsen.
- Verbinden Sie die Einlässe beider Flaschen, um Aquariumpumpen zu trennen, um der Hefekultur Luft zuzuführen. Vergewissern Sie sich, den Auslass der experimentellen Hefeflasche mit einem Schlauch zu verbinden, der den Hefegeruch aus dem Versuchsraum entlüftet, um eine Störung des Experiments zu vermeiden.
6. Luftpumpenaufbau
- Bringen Sie den großen PVC-Schlauch (Durchmesser: ca. 1,2 cm und innen 0,9 cm) an eine Druckluftzufuhr an und führen Sie ihn durch zwei 1-l-Glas-Erlenmeyerkolben, die mit Aktivkohle bis zu 800 ml gefüllt sindUm die Luft zu reinigen. Verwenden Sie entweder Druckluft, die üblicherweise in Labors als Luftzufuhr geliefert wird, oder verbinden Sie die Rohre mit einer Luftpumpe (hier wurde Druckluft verwendet).
HINWEIS: Schlauchmaterial sollte auf der Grundlage der chemischen Eigenschaften des flüchtigen Materials ausgewählt und getestet werden, um zu verhindern, dass das flüchtige Material an der Auskleidung des Schlauches anhaftet (z. B. Polytetrafluorethylen, Nylon oder Edelstahl). - Machen Sie zwei Luftteiler aus 15 ml Röhren und jeweils drei 1.000 μl Pipettenspitzen.
- Machen Sie drei Löcher von ~ 1 cm Durchmesser. Zuerst zwei Löcher verbrennen, mit einer beheizten Präparationsnadel (beheizt rot in einem Bunsenbrenner), nebeneinander direkt unterhalb des Deckels des 15 mL Röhrchens. Dann machen Sie das dritte Loch, indem Sie den Boden des Tubus entfernen.
- Kleben Sie die 1.000 μl Pipettenspitzen in die Löcher mit dem schmalen Ende nach außen. Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitzen, um einen größeren Luftstrom zu ermöglichen.
- Verbinden Sie den großen PVC-Schlauch vom Ausgang des cHarcoal-gefüllter Erlenmeyerkolben zur Pipettenspitze am Boden des 15-ml-Röhrchens. Fügen Sie kleine PVC-Schlauch-Auslässe zu den beiden horizontalen Pipettenspitzen hinzu und führen Sie sie zu einer Kontrolle und einer experimentellen Flasche.
- Um eine Verunreinigung des YPD-Mediums mit Mikroorganismen zu vermeiden, befestigen Sie den kleinen Schlauch an einem sterilen Spritzenfilter (0,45 μm Porengröße) mit einem plastischen Druck auf Schottschlauchverbinder, der in Richtung des Filters geht, und eine Schraube auf den Kunststoffschottverbinder, der den Filter verlässt. Dann befestigen Sie den Schlauch an den Einlass der YPD-Kulturflasche (siehe Abbildung 1B ).
- Um zu verhindern, dass luftgetragene Hefe aus dem Kulturkolben in die experimentelle Arena fährt, befestigen Sie ein Glasrohr (6,5 cm lang, Außendurchmesser = 0,5 cm und Innendurchmesser = 0,3 cm) zum Auslass jeder YPD-Kulturflasche mit kleinen Schläuchen. Befestigen Sie die PVC-Schläuche an der anderen Seite des Glasrohres und führen Sie diese in Richtung der unteren Löcher (gebohrt an jeder Seite) des Experimentierkastens.
- Füllen Sie das Röhrchen mit Glasfaser und autoklavieren Sie es vor Gebrauch.
- Fügen Sie einen weiteren 15-ml-Röhrenteiler (beschrieben in Abschnitt 6.2) zu den kleinen PVC-Schläuchen, auf jeder Seite der Versuchsbox, um zwei Röhrchen in die Schachtel sowohl auf der experimentellen Seite (am nächsten zu Auspuff der Fan-Luftstrom, rechts) Und die Steuerseite (am nächsten zum Einlass des Lüfterluftstroms, links).
- Bereiten Sie 8x 25 mL serologische Pipetten mit jeweils 10 Ausgängen vor, um 80 Paarpaare gleichzeitig zu testen, dh 40 für jede Klimaanlage.
- Brennen Sie 10 Löcher von ~ 0,8 cm Durchmesser, 2 cm auseinander in die Pipette.
- Schneiden Sie den äußeren Teil einer 1-ml-Spritze in einen kleinen (2,5 cm) und einen großen (5 cm) Auslass.
- Kleben Sie diese Steckdosen in die Löcher mit Heißleim.
- Wickeln Sie ein kleines Band aus Plastik-Paraffin-Film um das Ende der Steckdosen und befestigen Sie eine 1.000 μl Pipettenspitze. Der Durchmesser der Spitzenöffnung beträgt 0,1 cm. Verwenden Sie für jeden Versuch saubere Tipps.
- Befestigen Sie zwei serologische Pipetten, mit einem T-Splitter mit Außendurchmesser ≥ 0,5 cm und kurzen Stücken von kleinen PVC-Schläuchen, an jedem der beiden Auslässe auf beiden Seiten. Tip die Pipetten flach auf dem weißen Papierblatt (unter den Kameras im Stahlkasten).
- Mit einem Luftstrommonitor den Luftstrom so einstellen, dass die Luftgeschwindigkeit am Ausgang der 1000 μl Pipettenspitze 0,5 m / s beträgt. Dies entspricht einem Luftstrom von 0,0017 L / s pro Spitze.
7. Überwachung des Paarungsverhaltens
- Verwenden Sie eine Mundpipette (wie in Referenz 26 beschrieben ), um eine experimentelle Frau in eine kleine Petrischale (beschrieben in Abschnitt 4) um 15:00 Uhr (ZT 6) zu stellen und ihr 1 h zu geben, um sich an die Paarungsarena zu akklimatisieren.
- Richten Sie die Versuchsbox (siehe Abschnitt 1) wie folgt ein:
- Schalten Sie die Lichter ein, dh weiße Licht-LEDs auf einem 12h: 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, der mit einem Timer verbunden ist, der einschaltetLicht um 09:00 (ZT0) und kontinuierliche Rotlicht-LEDs zur Überwachung der Fliegen während der Dunkelphase des Experiments. Schalten Sie die Lüfter ein, um das Aufheizen des Schranks durch die Lichtquelle zu begrenzen und um sicherzustellen, dass überschüssige Gerüche außerhalb des Testbereichs entlüftet werden.
- Verbinden Sie Webcam-Kameras mit einem Computer und starten Sie sie mit der Überwachungssoftware für die Bildüberwachung.
- Für jede Kamera stellen Sie den Fokus, die Helligkeit ein und vergrößern Sie die Überwachungssoftware.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Kamerabildschirm, öffnen Sie "Kameraleigenschaften" und klicken Sie auf "automatischer Fokus". Passen Sie den "Fokus" an, um das Raster oder irgendwelche schriftlichen Wörter auf dem Papierblatt zu klären. Ändern Sie ggf. "Helligkeit" und "Zoom".
- Stellen Sie das Programm der Überwachungssoftware ein, um 1 Bild alle 2 min zu erfassen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jeden Kamerabildschirm und wählen Sie "Kamera bearbeiten" und dann die Option "Aktionen". Klicken Sie hier, um die Aktionen zu startenErvals "und ändern Sie die Zeit auf" 2 Minuten ". Wählen Sie" Take Photo "für ausgewählte Aktionen ausführen und schließlich auf" ok "klicken.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jeden Kamerabildschirm und wählen Sie "Monitor starten".
- Nach 1 h (bei ZT 7), transferiere einen Wildtyp-Mann in die Petrischale mit der Mundpipette, platziere das Teller auf die A4-Papierblätter unter den Webcam-Kameras und klicke auf "Start-Monitoring" für 24 Stunden. Für das Luftpumpen-Experiment legen Sie die Schale so, dass ein Pipettenauslass mit dem Eingangsloch der Gegenarena verbunden ist.
- Um das Paarungsverhalten des Paares zu analysieren, gehen Sie wie folgt vor.
- Wählen Sie alle Bilder in einer Bildbetrachtungssoftware aus und öffnen Sie sie in chronologischer Reihenfolge.
- Notieren Sie das Datum, die Versuchsnummer, die Tellernummer und die Startzeit in eine Tabellenkalkulation innerhalb derselben Zeile. Nehmen Sie die Startzeit jeder Arena aus dem Moment, dass es unter der Webca platziert istM Kamera. Notieren Sie den Zeitstempel aus den Bildern.
- Markieren Sie die Startzeit jeder Kopulation in der gleichen Zeile in die Kalkulationstabelle. Zählen Sie eine Paarung als ein Ereignis, wenn das Männchen hat die weibliche und das Paar bleibt mäßig stationär und in der gleichen Haltung für mindestens fünf aufeinander folgenden Frames (10 min).
HINWEIS: Dieses Kriterium basiert auf der gemeldeten Länge der Kopulation, von 12 bis 27 min in D. melanogaster und die Beobachtung, dass Kopulationen von 10 min und mehr fruchtbar sind 27 , 28 . - Zählen Sie die Anzahl der Kopulationen für jede Zeile in der Kalkulationstabelle, um die Paarungsfrequenz zu bestimmen. Alternativ subtrahieren Sie die Startzeit des Experiments von der Zeit der ersten Paarung für jede Zeile als Maß für die Paarungslatenz, oder subtrahieren Sie die Zeit der ersten Paarung von der Zeit der zweiten Paarung als ein Maß für die Beantwortung der Latenz.
- Um die Latenzzeit zu berechnen, stellen Sie sicherDefinieren die Daten der ersten und der zweiten Paarung als aufeinanderfolgende Tage in der Tabellenkalkulationssoftware.
- Analysieren Sie die Daten mit Mixed-Effects-Modellen, unter der Annahme einer normalen Verteilung der Daten und einschließlich des Datums des Experiments als zufälliger Faktor unter Verwendung einer statistischen Software (siehe Tabelle der Materialien), um die statistische Signifikanz der unabhängigen Variablen zu bestimmen - Lebensmittelmedium, Lufttyp und Interaktion - wie zuvor beschrieben 5 .
- Wählen Sie das beste erklärende Modell aus, indem Sie die Rückwärts-Beseitigung von nicht signifikanten unabhängigen Variablen mit Hilfe von Log-Likelihood-Ratio-Tests und den zugehörigen Akaike-Informationen durchführen. Nach dem Ausführen des Modells visuell die Datenreste überprüfen, um die Normalität zu bestätigen. Bestätigen Sie die Homogenität der Abweichungen mit dem Levene-Test. Im Falle einer ungleichen Homogenität verwandelt die Quadratwurzel die Daten.
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Representative Results
Mit diesem kontinuierlichen Assay, Paarungsverhalten und Paarungsfrequenz im spezifischen, kann unter experimentellen Umgebungsbedingungen bestimmt werden. Um die Umgebungsbedingungen zu kontrollieren, haben wir einen Edelstahl-Küchenschrank in einen Testbereich mit eigener Lichtquelle und Diffusion verwandelt, der eine hohe Lichtmenge und eine minimale Blendung von der Oberseite der Paarungsarenen gewährleistet ( Abbildung 1A ) . Der innere Testbereich ist komplett aus Edelstahl und Glas umhüllt, was die Reinigung mit organischen Lösungsmitteln wie Hexan oder Ethanol ermöglicht. Darüber hinaus ist das Gehäuse mit Löchern ausgestattet, die als Einlässe für Schläuche dienen und flüchtige Stichwörter aus dem Druckluftsystem bringen (siehe Abb. 1A und 1B ). Das auf Hefegeruch abgestimmte Druckluftsystem besteht aus einem Luftstrom, der durch eine flüssige Hefekultur geführt wird, bevor er durch 4 Pipettensplitter mit den Testarenen eintrittJe 10 Ausgänge ( Abbildung 1C ). Das ganze System ist luftdicht und mit mehreren Partikelfiltern versehen, sowohl vor als auch nach dem Eintritt in die Hefekultur, um die Kontamination mit verunreinigenden Gerüchen zu minimieren ( Abbildung 1B ).
Um die Anwendung dieses Assays zu demonstrieren, haben wir getestet, ob flüchtige Cues aus einer Hefekultur das Paarungsverhalten beeinflussen können. Luft wurde durch eine flüssige Hefekultur für 24 h geblasen, und die Luftauslässe wurden in den Eingang jeder Paarungsarena gelegt (siehe 2A ). Die Hälfte der zusammenpassenden Arenen enthielt Fliegenfutter mit Hefe (Nahrung + Hefe), und die andere Hälfte enthielt Fliegenfutter ohne Hefe hinzugefügt (Nahrungsmittelhefe). Ein Wildtyp männlich und weiblich wurden den Gerüchen aus der äußeren Hefekultur ausgesetzt, und ihre Paarungshäufigkeit wurde aufgezeichnet. Um festzustellen, welche Variablen notwendig sind, um die Graphen Ergebnisse zu erklären, liefen wir Mixed-Effects-Modelle, entweder einschließlich oder ausschließenDie unabhängigen Variablen von Nahrungsmittelmedium, Hefeluft und eine Wechselwirkung der beiden. Die Daten in Fig. 2B sind am besten durch ein Modell dargestellt, das die unabhängigen Variablen des Nahrungsmittelmediums (p = 0,001) und Hefeluft (p = 0,061) enthält, aber es gibt keinen erklärenden Wechselwirkungseffekt. Auch wenn die Hefe-Luft-Variable in diesem vollständigen Datensatz nicht signifikant ist, ist es notwendig, die Ergebnisse zu erklären. Die Analyse der Hefe-Luft, die für das Nahrungsmittelmedium getrennt ist, zeigt, dass ein Paarungspaar nicht auf Hefegeruch reagiert, wenn keine Hefe im Nahrungsmittelmedium vorhanden ist (Luft: p = 0,992), aber sie erhöhen ihre Paarungshäufigkeit in Hefeluft, wenn Hefe ist Auch dem Nahrungsmittelmedium zugesetzt (Luft: p = 0,018). Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse die Anwendbarkeit des Druckluftsystems, um den Einfluss von Umweltgerüchen in Kombination mit Lebensmitteln zu prüfen.
Wir veranschaulichen auch, wie das Druckluftsystem byp sein kannDurch das Hinzufügen von umweltchemischen Cues direkt zur Testarena. Um zu zeigen, welche spezifischen Hefeverbindungen die Paarungshäufigkeit beeinflussen, haben wir die Hypothese getestet, dass der Aminosäuregehalt der Hefe für ihre Wirkung auf die Paarung notwendig ist, indem eine Dosis von Pepton (hydrolysierte Proteine) entsprechend den von der Hefe im Agar gelieferten Aminosäuren platziert wird Substrat-Futter die Paarung Arena. Wir haben auch die Notwendigkeit von Essigsäure, eines der wichtigsten flüchtigen Fermentationsprodukte von Hefe, getestet, um die Paarungsfrequenz zu erhöhen. Dies geschah durch Zugabe von Essigsäure direkt zum Nahrungsmittelmedium. Ein Wildtyp-Männchen und Weibchen wurden in Arenen, die Agar oder Agar mit Pepton enthielten, mit oder ohne Essigsäure direkt im Nahrungsmedium getestet ( Abbildung 3B ). Dies macht für ein sehr einfaches Lebensmittel-Medium und eine schlechte Umwelt; Daher wird auch die durchschnittliche Paarungsfrequenz im Vergleich zu Fig. 2B verringert. Die Daten in Fig. 3B sind am besten durch ein Modell dargestellt, das dieUnabhängige Variablen des Nahrungsmittelmediums (p = 0,002), Essigsäureluft (p = 0,001) und die Wechselwirkung der beiden (p = 0,022). Die weibliche Empfänglichkeit erhöht sich bei der Anwesenheit von Essigsäure, aber nur in dem Zustand, in dem Pepton im Medium vorhanden ist. Dies zeigt, dass Fliegen gleichzeitig Aminosäuren und Essigsäure spüren müssen, um ihre Paarungsfrequenz zu erhöhen ( Abbildung 3B ). Dies zeigt, dass das Hinzufügen von Geruchsstoffen direkt zur Testarena das Paarungsverhalten beeinflussen kann und dass diese Einflüsse in sehr einfachen Umgebungsbedingungen nachgewiesen werden können.
Abbildung 1: Schema der Versuchsbox und Druckluftanlage mit Hefe. ( A ) Schematische Darstellung der umweltgerechten Gegenbox, die in Abschnitt 1 beschrieben ist. Beschreibung der annotierten Zahlen und Pfeile: 1. Leuchttafel mit al Ternierende weiße und rote Lichter; 2. kleiner Ventilator; 3. 3 Schichten Filterpapier, wobei jede Schicht aus zwei Filterpapierblättern besteht; 4. Glasdiffusionsplatte ruht auf Klammern, die an 3 Seiten des Kastens befestigt sind; 5. großer Fan; 6. Löcher für Schläuche und Kabel; 7. Versuchsbereich; Großer Pfeil, 50 cm zur Glasplatte; Mittlerer Pfeil, 35 cm Höhe für die Seilbohrungen; Und kleiner Pfeil, 7 cm Höhe für die Schlauchbohrungen. ( B ) Schematische Darstellung der flüssigen Hefekultur mit Luftstrom, wie in den Abschnitten 5, 6.4 und 6.5 beschrieben. Beschreibung der kommentierten Nummern: 1. Einweg-Filtereinheit; 2. Kappe mit Silikon-Septum und Out- und Einlässe; 3. flüssiges Medium; Und 4. Glasröhre mit Glasfaser. ( C ) Schematische Darstellung der Luftauslässe wie in Abschnitt 6.7 beschrieben. Beschreibung der kommentierten Zahlen: 1. serologische Pipette; 2. Schlauchschnitt aus 1 ml Spritze und 3. 1000 μl Pipettenspitze.Target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Hefegeruch erhöht die weibliche Empfänglichkeit in Gegenwart von Hefe im Nahrungsmittelsubstrat. ( A ) Schematische Darstellung einer Paarungsarena mit einer männlichen und einer weiblichen und einer Pipettenspitze aus dem Luftauslass in Abbildung 1C, die durch das Eingangsloch eintritt. ( B ) Grafische Darstellung der Antwort in der Paarungshäufigkeit eines Canton-S- Paarungspaares mit Hefegeruch mit und ohne Hefe im Fliegenfuttermedium (Nahrungsmittelhefe: mittlere Luft n = 12, Hefeluft n = 13 und Nahrung + Hefe : Mittlere Luft n = 24, Hefe Luft n = 23). Liniendiagramm mit SEM-Fehlerbalken und statistischer Ausgabe von Mixed-Effects-Modellen mit Luft als unabhängige Variable und das Datum als Zufallsvariable für jedes Lebensmittelmedium unabhängig. Die wichtigsten statisticaL-Modell enthält Lebensmittel (p = 0,001) und Hefeluft (p = 0,061). Angepasst aus Referenz 5 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Essigsäure im Fliegenfuttersubstrat erhöht die weibliche Empfänglichkeit in Gegenwart von Pepton. ( A ) Schematische Darstellung einer Paarungsarena, mit Fliegenfuttermedium, das Essigsäure und einen Plastik-Paraffin-Filmstopfen enthält, der das Eintrittsloch schließt. ( B ) Eine graphische Darstellung der Paarungsfrequenz eines Canton-S- Paarungspaares als Reaktion auf Essigsäure entweder auf Agar- oder Pepton-Medium (Agar: -essigsäure n = 52, + Essigsäure n = 40 und Pepton: Essigsäure N = 28, + Essigsäure n = 25). Liniendiagramm mit SEM-Fehlerbalken und dem Stati(P = 0,002), Essigsäure-Luft (p = 0,001) und Nahrung * Luft (p = 0,022) als unabhängige Variablen und das Datum als Zufallsvariable. Angepasst aus Referenz 5 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen Assay, um das Paarungsverhalten über 24 h zu testen, während kontinuierlich die Umgebungsbedürfnisse kontrolliert werden, dass ein Paarungspaar hypothetisch verwendet wird, um die Paarungsfrequenz zu bestimmen. Es ist möglich, die Gegenfrequenz in Reaktion auf Hefeluft zu erhöhen, die durch ein Druckluftsystem zugeführt wird, wenn das Medium auch Hefe enthält ( 2B ). Zusätzlich kann eine ähnliche Antwort in der Paarungsfrequenz mit einem vereinfachten Nahrungsmittelmedium beobachtet werden, das nur Agar-, Pepton- und Essigsäuregeruch direkt im Medium enthält ( 3B )
Mit den hier vorgestellten Experimenten lassen sich nur Schlussfolgerungen über das allgemeine Paarungsverhalten des Paares ziehen, da beide Geschlechter den gleichen Umgebungsbedingungen ausgesetzt sind. Allerdings wissen wir aus früheren Untersuchungen, dass 47% der Veränderung der Paarungshäufigkeit von der Frau bestimmt wird, während der männliche Beitrag nur 11% der Variation ausmacht20 Daher sind die meisten Änderungen der Paarungsfrequenz beobachtet wahrscheinlich ein Ergebnis der weiblichen sexuellen Empfänglichkeit. Erhöhte männliche Balz noch verlässt das Weibchen zu akzeptieren oder ablehnen Paarung, wie Erwachsene D. melanogaster Frauen können erfolgreich ablenken Paarung Versuche 29 . Für feste Schlussfolgerungen und um spezifische Unterschiede in der Paarungshäufigkeit der weiblichen sexuellen Empfänglichkeit zuzuordnen, ist es notwendig, zusätzliche Paarungspaare zu testen, bei denen der Genotyp des Weibchens variiert wird, aber der des Mannes konstant gehalten wird.
Dieses Protokoll hat zwei Möglichkeiten gezeigt, um geräuschvolle Verbindungen zu einem Paarungspaar zu liefern, entweder mit einem Druckluftsystem oder direkt in das Nahrungsmittelmedium. Das Druckluftsystem hat den Vorteil, dass jegliche Wirkung auf die durch die Luft gelieferten Verbindungen zurückzuführen ist, während dies nicht abgeschlossen werden kann, wenn die Verbindungen direkt in das Lebensmittelmedium gegeben werden. Auf der anderen Seite, wBei der Druckluftanlage wird kein Effekt festgestellt, es bedeutet nicht automatisch, dass das Cue das Verhalten nicht beeinträchtigt. Es könnte auch bedeuten, dass die Verbindung nicht effizient durch das Druckluftsystem abgegeben wird. Die Zusammensetzung der Luft am Auslaß des Luftabgabesystems kann analysiert werden, indem man einen Kohlenwasserstofffilter platziert und den eingefangenen Luftgehalt mit Gaschromatographie, gepaart mit Massenspektrometrie, analysiert. Das Druckluftsystem ist ein guter Test, um Verbindungen zu testen, die leicht über einen längeren Bereich luftgetragen werden können. Weniger flüchtige Verbindungen müssen direkt in das Lebensmittelmedium gebracht werden. Ein weiterer Nachteil des Druckluftsystems ist die Wirkung, die die Luftgeschwindigkeit auf das Fliegenverhalten haben kann. Fliegen stoppen zu bewegen, wenn die Luftgeschwindigkeit zu hoch ist (über 0,7-1,6 m / s) 30 . Zusätzlich kann das Druckluftsystem eine einfache, qualitativ minderwertige Umgebung durch das Austrocknen des Nahrungsmittelmediums unerträglich machen. In beiden Fällen können die Fliegen nicht perfOrm gleich gut, und es können dann keine Rückschlüsse auf die getesteten spezifischen Verbindungen zurückgeführt werden.
Bei der Vorbereitung auf den optimalen Betrieb dieser Assays sind mehrere Schritte unerlässlich. Der erste Schritt, der Aufmerksamkeit erfordert, ist die Vorbereitung des Mediums. Es ist wichtig, dass das Medium, einschließlich riechender flüchtiger Verbindungen wie Essigsäure, am Tag des Experiments hergestellt wird und nicht früher, um Verdunstung zu vermeiden. Auch das Medium muss auf einer Oberfläche ohne zusätzlichen Luftstrom härten (Vermeidung von Dunstabzugshauben), da der Luftstrom die Verdunstung des Geruchs anregen kann. Der zweite Schritt, der besondere Sorgfalt erfordert, ist die Einrichtung des Druckluftsystems. Der Luftstrom muss hoch genug sein, um die Hefekultur sanft zu blasen, ohne irgendeine Flüssigkeit in die Arena zu übertragen.
Dieses Protokoll zeigt einen Verhaltenstest mit Hefegeruch in Kombination mit Paarungsverhalten. Dieses System kann jedoch auf beliebige angewendet werdenArt des Geruchs, sowie auf andere Arten von Verhaltensweisen. Um dieses System für andere Gerüche zu verwenden, ist es notwendig, den Luftstrom und das Geruchsmedium einzustellen, um die Übertragung der Verbindungen auf das Geschirr zu optimieren. Jedoch kann im Allgemeinen jede Verbindung, die durch Luft übertragen werden kann, mit diesem System getestet werden. Darüber hinaus kann jede Art von Verhalten, sowohl bei Männern als auch bei Frauen, entweder durch die Verwendung der gleichen Art von Geschirr oder durch die Einstellung der Schläuche zu erreichen und verbinden zu größeren oder kleineren Testgebieten getestet werden. Darüber hinaus, wenn detailliertere Verhaltensweisen getestet werden, müssen die Bildraten und Auflösungen der verwendeten Kameras erneut überdacht werden. In jedem Fall, wenn beide Experimente mit und ohne den Testgeruch gleichzeitig ausgeführt werden und mit der gleichen Luftquelle, kann jede Reaktion auf das Umwelt-Cue erkannt werden, unabhängig von Änderungen des Drucks oder der Konzentration von einem Experiment zum anderen. Schließlich kann der hier vorgestellte Assay für mindestens einen weiteren LD-Zyklus (bis zu 48 h) verlängert werden, solange der fOod Versorgung trocknet nicht aus.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken der Bloomington Drosophila Stock Center für die Fliegenbestände; C. Gahr, JT Alkema und S. van Hasselt für ihren frühen Versuch, den Druckluft-Assay zu entwickeln; Jasper Bosman für den Rat zum Anbau von Hefe; Und Rezza Azanchi und Joel Levine für die ursprüngliche Entwicklung der Zeitraffer-Überwachung von Drosophila Paarung Verhalten. JA Gorter wurde von einer Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program Grant unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Referenz: 821.02.020) an JC Billeter unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
References
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
- Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
- Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
- Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
- Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
- Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
- Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
- Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
- Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
- Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
- Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
- Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
- Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
- Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
- Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
- Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
- Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
- Montell, C.
- Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
- Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
- Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
