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Biochemistry

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l'ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l'essai de ligature de proximité

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55703
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Lymphoma and Myeloma Center Amsterdam (LYMMCARE)

Summary

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Abstract

La réponse aux dommages à l'ADN orchestrale la réparation des lésions de l'ADN qui se produisent spontanément, sont causées par un stress génotoxique ou apparaissent dans le contexte des ruptures d'ADN programmées dans les lymphocytes. L'Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM et Rad3-kinase (ATR) et la sous-unité catalytique de la protéine Kinase dépendante de l'ADN (DNA-PKcs) sont parmi les premiers qui sont activés lors de l'induction de dommages à l'ADN et sont Régulateurs centraux d'un réseau qui contrôle la réparation de l'ADN, l'apoptose et la survie cellulaire. Dans le cadre d'une voie suppresseur de tumeur, ATM et ATR activent p53 par phosphorylation, régulant ainsi l'activité transcriptionnelle de p53. Les dommages causés par l'ADN entraînent également la formation de soi-disant foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) qui représentent des complexes de capteurs de dégâts d'ADN et des protéines de réparation qui s'accumulent sur les sites d'endommagement de l'ADN, qui sont visualisés par microscopie à fluorescence. La co-localisation des protéines dans les IRIF, cependant, n'implique pas nécessairement dInteractions directes protéines-protéines, car la résolution de la microscopie à fluorescence est limitée.

L' essai de ligament de proximité in situ (PLA) est une technique novatrice qui permet la visualisation directe des interactions protéine-protéine dans les cellules et les tissus avec une spécificité et une sensibilité sans précédent. Cette technique est basée sur la proximité spatiale des anticorps spécifiques liés aux protéines d'intérêt. Lorsque les protéines interrogées se situent à environ 40 nm, une réaction d'amplification est déclenchée par des oligonucléotides qui sont conjugués aux anticorps et le produit d'amplification est visualisé par un marquage fluorescent, ce qui donne un signal qui correspond à l'emplacement subcellulaire des protéines interagissant. En utilisant l'interaction fonctionnelle établie entre ATM et p53 comme exemple, il est démontré ici comment PLA peut être utilisé dans des cultures cellulaires en suspension pour étudier les interactions directes entre les protéines qui font partie intégrante de la réponse aux dommages à l'ADN.

Introduction

Le dégât de l'ADN déclenche une série d'événements hautement réglementés impliquant des interactions protéine-protéine et des modifications post-traductionnelles qui garantissent une réparation efficace et rapide de l'ADN, protégeant ainsi l'intégrité génomique 1 . Typiquement, la réparation de l'ADN est étudiée dans des cellules exposées aux rayonnements ionisants en surveillant la formation de soi-disant foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) par microscopie de fluorescence (confocale). De nombreuses protéines de détection de l'ADN et de détection des dommages à l'ADN forment des IRIF, qui représentent des complexes de protéines qui se nucléent sur des sites de chromatine endommagés par l'ADN 2 , 3 . L'emplacement et la résolution des IRIF au fil du temps donnent un aperçu important de l'organisation spatio-temporelle de la réparation de l'ADN et peuvent indiquer l'implication de différentes voies de réparation de l'ADN. La nature de l'endommagement de l'ADN et l'étape du cycle cellulaire dans laquelle le dommage est atteint déterminent la voie de réparation de l'ADN activée. Fo Par exemple, dans les cellules activement engagées dans la replication de l'ADN (phase S), la recombinaison homologue (HR) est la voie de réparation de l'ADN dominante, alors que dans les cellules de la phase G1 ou G2 / M du cycle cellulaire, La voie de réparation homologue de jointure finale (NHEJ) prédomine. L'activation des kinases sensibles aux dommages à l'ADN Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM), qui est principalement active dans les phases G1 et G2 / M du cycle cellulaire et régule le NHEJ, Et Ataxia Telangiectasia et protéines liées à Rad3 (ATR), qui agit en phase S en activant des ressources humaines. L'ATM et l'ATR sont des kinases très pleiotropes qui phosphorylent de nombreuses protéines impliquées dans la réparation de l'ADN, la mort cellulaire et la survie 4 . Les deux kinases se sont révélées phosphoryler et activer la protéine suppresseur de tumeur p53 après l'exposition au stress génotoxique, ce qui indique que ces kinases sont des médiateurs en amont d'un axe de signalisation suppresseur de tumeur pivot"Xref"> 5 , 6 .

La formation et la composition des IRIF sont généralement évaluées en déterminant la co-localisation de différentes protéines en utilisant une coloration et une microscopie à double couleur d'immunofluorescence, mais toutes les protéines qui font partie des complexes de protéines de réparation forment IRIF, ce qui limite l'applicabilité de cette approche. Par ailleurs, la microscopie d'immunofluorescence (confocal) est limitée par les propriétés de diffraction de la lumière, ce qui entraîne une résolution spatiale assez faible d'environ 200 à 300 nm, dépassant la taille de la plupart des structures subcellulaires, ce qui interdit essentiellement l'interrogation directe des interactions protéine-protéine au Le niveau moléculaire. En tant que tel, la co-localisation des motifs de coloration par immunofluorescence détectés par microscopie de fluorescence (confocale) n'est pas nécessairement indicative d'interactions directes protéines-protéines. Récemment, de nouvelles technologies de super résolution ont été développées, telles que la structure tridimensionnelle(3D-SIM) 7 , qui a été utilisé avec succès pour étudier la formation d'IRIF 53BP1 et BRCA1 à des détails à l'échelle nanométrique, révélant les caractéristiques de distribution spatiale de ces protéines qui n'ont pas été détectées par microscopie confocale à balayage laser 8 .

Plusieurs autres méthodes peuvent être utilisées pour détecter les interactions protéine-protéine in vivo , telles que la co-immunoprécipitation, les méthodes d'extraction et les approches de dépistage à deux hybrides de levure. Cependant, ces techniques sont plutôt encombrantes, nécessitent de grandes quantités de cellules ou de protéines ou impliquent une surexpression de protéines, qui introduit des artefacts expérimentaux. Plus récemment, une nouvelle technique a été développée qui permet la visualisation et la quantification des interactions protéine-protéine in situ ( c.- à -d. Dans les cellules et dans les tissus), appelée Ensemble de ligature de proximité (PLA) 9 , 10 . PrLes anticorps généraux qui reconnaissent deux protéines d'intérêt sont détectés par des anticorps secondaires conjugués aux oligonucléotides (appelés sondes PLA). Si les deux anticorps secondaires différents sont suffisamment proches en raison des interactions entre les protéines reconnues par les anticorps primaires, les oligonucléotides conjugués s'hybrident et peuvent être ligaturés pour former un substrat d'ADN circulaire fermé. Ce substrat circulaire est ensuite amplifié par amplification du cercle roulant et visualisé avec des oligonucleotides complémentaires conjugués au fluorochrome. En utilisant PLA, la localisation subcellulaire de l'interaction protéine-protéine est préservée lorsque le produit d'amplification du cercle roulant marqué par fluorescence reste attaché aux sondes PLA. La résolution de ce dosage est <50 nm, en fonction de la constatation que le diamètre d'un anticorps est d'environ 7 à 10 nm 11 . L'amplification du cercle circulant ne peut avoir lieu que dans le cas où deux paires d'anticorps (primaire + seconDary) interagissent physiquement dans le périmètre qui est défini par leur taille (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). L'étape d'amplification du signal augmente la sensibilité du test PLA et permet de détecter les interactions de protéines à peine exprimées. La PLA génère des signes de signaux ponctuels et axiaux qui peuvent être quantifiés par cellule, par lesquels la variation intra-et inter-cellulaire des interactions protéine-protéine peut être évaluée.

La formation et la composition des complexes de réparation de l'ADN et des IRIF sont principalement étudiées dans des lignées cellulaires adhérentes telles que la lignée cellulaire épithéliale osseosarcome du os humain U2OS, la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine HEK293 et ​​la lignée cellulaire épithéliale du pigment rétinien RPE-1, Croissant et facile à transfecter. Des cultures de cellules de suspension telles que des lignées lymphoïdes et des liaisons myéloïdes sont utilisées moins fréquemment, étant donné qu'elles sont moins susceptibles d'être transfectées et, en général, elles ne respectent pas les lamelles, nécessitant ainsi une alternative supplémentaireEps pour l'imagerie. La résolution des dommages à l'ADN est cependant très pertinente dans le contexte des tumeurs malignes lymphoïdes et myéloïdes, car la réponse aux dommages à l'ADN est fréquemment affectée par des aberrations génomiques (conducteurs) dans ces tumeurs, jouant un rôle central dans la transformation maligne du lymphoïde et de la myéloïde normaux ( Cellules progénitrices 12 , 13 , 14 .

Ce protocole décrit comment l'APL peut être utilisé pour évaluer et quantifier les interactions protéine-protéine suite à l'induction d'un endommagement de l'ADN dans des cultures cellulaires en suspension. Ici, le PLA est réalisé pour déterminer et visualiser les interactions entre ATM et p53 lors d'un endommagement de l'ADN dans des cellules de leucémie à cellules B humaines qui sont induites à subir une arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Il est à noter que le protocole présenté ici ne se limite pas à l'étude des interactions ATM et p53 dans les cellules de leucémie arrêtées par G1, mais peut également être utilisé pour visualiser d'autres interactions protéines-protéinesDans divers types de cellules et cultures cellulaires en suspension.

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Protocol

1. Traitement des cellules et induction des dommages à l'ADN

  1. Culturez les lignées cellulaires lymphoblastiques aiguës BCR-ABL + B de cellules B humaines BV173 ou SUP-B15 dans IMDM complétées par 20% de FCS, 50-bit de mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine, 100 U / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine au 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 . Comptez les cellules et la plaque à 2 x 10 6 cellules / mL dans des plaques à 6 puits, à 5 ml / puits.
    REMARQUE: optionnellement, des lignées de cellules de suspension d'origine diverse peuvent être utilisées.
  2. Pour arrêter les cellules BCR-ABL + B-ALL dans la phase G1 du cycle cellulaire, ajouter 5 μM de méthanesulfonate d'imatinib (STI571) et incuber pendant la nuit.
    1. En option, omettre cette étape lors de l'étude des interactions protéine-protéine tout au long du cycle cellulaire ou dans les types de cellules BCR-ABL-négatives.
  3. Induire les dommages à l'ADN en ajoutant 50 ng / mL de néocarzinostatine (NCS) à la culture et incuber pendant 2 h.
    1. Alternativement,Induit des dommages à l'ADN en irradiant les cellules en utilisant une source radioactive [ 137 Cs] à 0,5 Gy / min, à une dose de 5 Gy. Après irradiation, laisser la cellule récupérer pendant 2 h à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 .
  4. En option, pour évaluer l'implication de l'activité kinase ATM en réponse à des dommages à l'ADN, ajouter 5 μM de l'inhibiteur kinase ATM KU55933 avant l'addition de NCS ou le traitement d'irradiation.
  5. Préparer 1x PBS + 10% de BSA en superposant 5 g de fraction-V BSA sur 50 ml de 1x PBS dans un bécher ou une fiole Erlenmeyer, et laisser reposer à température ambiante jusqu'à ce que BSA soit dissoute. Ne pas secouer ou remuer car cela entraînera une formation massive de mousse. Filtrer lentement à travers un filtre de 0,22 μm et garder la glace.
  6. Cueillir des cellules et laver deux fois avec du PBS 1x glacé. Comptez les cellules et resuspendez à 2 x 10 6 / mL dans 1x PBS + 10% de BSA. Garder les cellules sur la glace.

2. Cytocentrifugation, Fixation et Perméabilisation

  1. Préparer la4% de solution de paraformaldehyde dans 1x PBS fraîchement. Ajouter 2 g de PFA à 50 ml de 1x PBS et incuber dans un bain d'eau de secours à 55 ° C jusqu'à ce que la solution soit limpide. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm et stocker à la température ambiante jusqu'à l'utilisation.
    REMARQUE: optionnellement, 4% de fixateur PFA peuvent être stockés congelés à -20 ° C. Après la congélation, décongeler une fois pour l'utiliser. Sinon, la solution PFA à 4% dans PBS peut être achetée directement.
  2. Pulvériser soigneusement les lames de microscopie de 76 mm x 26 mm avec un tissu sans peluches et les dégraisser en plaçant dans de l'éthanol à 96% dans un pot de Coplin pendant 5 min. Laissez la microscopie glisser à l'air pendant 10 min.
  3. Assembler les lames de microscopie dans les entonnoirs de cytospin / cytologie avec une surface de 6 mm. Préparer les glissières en pipetant 50 μL de 1x PBS + 10% de BSA dans chaque entonnoir et centrifuger pendant 1 min à 500 tr / min.
  4. Ajouter 100 μL de la suspension cellulaire (égal à 0,2 x 10 6 cellules) à chaque entonnoir et centrifuger pendant 5 minutes à 500 tr / min. Pour chaque combinaison d'anticorps, auAst 4 préparations sont requises (expérience à double anticorps, deux contrôles à anticorps uniques, pas de contrôle des anticorps).
  5. Démonter soigneusement les entonnoirs et veiller à ne pas toucher les taches. Procéder immédiatement à la fixation de l'échantillon.
    1. En option, laissez les lames sécher à l'air pendant au moins 30 minutes. Après séchage à l'air, enveloppez les glissières individuellement dans du papier d'aluminium et conservez à -20 ° C jusqu'à l'utilisation. Lorsque vous utilisez des préparations congelées, assurez-vous de décongeler les glissières enroulées dans une serviette en papier pour éviter la condensation sur les glissières.
  6. Dessinez un cercle (diamètre approximatif de 15 à 20 mm) autour de la tache à l'aide d'un bloqueur de liquide PAP (pointe de 5 mm).
  7. Ajouter 50 μL de solution de fixation à 4% de PFA à chaque tache et incuber pendant 30 minutes à la température ambiante.
  8. Lavez les cellules 3 fois pendant 5 min avec 1x PBS dans un pot de Coplin à la température ambiante avec une agitation douce.
  9. Séchez les diapositives autour des taches avec un tissu sans peluches et retirez autant de liquide de l'endroit que possible en utilisant un piAnimal sans toucher l'endroit, ou en basculant la glissière. Ajouter 50 μL de Triton-X à 0,25% dans 1x PBS à chaque tache et incuber pendant 10 minutes à TA sans agitation.
  10. Laver les diapositives 3 fois pendant 5 min dans ~ 50-60 ml de Tween-20 à 0,05% dans TBS (TBS-T) dans un pot de Coplin à la température ambiante avec une agitation douce. 10 diapositives peuvent être traitées simultanément de cette manière.

3. Blocage et incubation primaire d'anticorps

  1. Tapotez le TBS-T et séchez les diapositives autour des taches avec un tissu sans peluches. Retirez autant de liquide que possible à l'aide d'une pipette sans toucher la tache ou en basculant la glissière. Provoquer rapidement la solution de blocage et ajouter une goutte (~ 40 μL) à chaque point. Incuber pendant 1 h à 37 ° C dans une chambre humidifiée préchauffée.
  2. Préparer le cocktail d'anticorps en mélangeant le goat-anti-ATM à 1: 1 000 et le lapin-anti-phospho-Ser15-p53 à 1: 100 dans le diluant d'anticorps commercial, diluant d'anticorps vortex avant utilisation. Pour l'expérience de contrôleTs, préparez des dilutions d'anticorps contenant seulement le chèvre-anti-ATM et seulement l'anticorps anti-phospho-Ser15-p53 de lapin (contrôle anti-anticorps).
  3. Effacez la solution de blocage, mais prenez soin de ne pas laisser sécher les cellules avant d'ajouter les dilutions d'anticorps. Ajouter 30 μL de chaque dilution de cocktail d'anticorps et incuber dans une chambre humidifiée pendant une nuit à 4 ° C.
  4. Préparer le tampon de lavage A in situ et le tampon de lavage B en dissolvant le contenu d'une poche de tampon A et de mélange tampon B dans un volume final de 1 000 ml d'eau chacun.
    1. En variante, préparer le tampon de lavage A en dissolvant 8,8 g de NaCl, 1,2 g de Tris-base et 0,5 mL de Tween-20 dans 800 ml d'eau. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du HCl et ajouter à un volume final de 1 000 ml.
    2. En variante, préparer le tampon de lavage B en dissolvant 5,84 g de NaCl, 4,24 de Tris-base et 26,0 g de Tris-HCl dans 500 ml d'eau. Ajuster le pH à 7,5 en utilisant du HCl. Ajouter de l'eau à un volume final de 1 000 ml.
    3. FiltreLes deux solutions par un filtre de 0,22 μm.
  5. Laver les diapositives 2 fois pendant 5 min avec 1x tampon de lavage in situ A dans un pot de Coplin à la température ambiante avec une agitation douce.

4. Sondes PLA, ligature et amplification

  1. Préparer les sondes PLA en diluant le MOA anti-chèvre PLUS et le MOIN anti-lapin à la fois 1: 5 dans le diluant d'anticorps commercial. Tirez sur le tampon de lavage in situ A 1 des lames et ajoutez 30 μL du mélange de sonde PLA à chaque point. Incuber 1 h à 37 ° C dans une chambre humidifiée préchauffée.
    NOTE: Toute combinaison de sondes anticorps secondaires PLUS et MINUS PLA peut être utilisée (anti-souris, anti-lapin, anti chèvre), tant que les anticorps primaires appliqués sont élevés dans différentes espèces, et la combinaison de sondes PLA devrait toujours Contiennent une sonde PLUS et une sonde MINUS.
  2. Laver les diapositives 2 fois pendant 5 min avec ~ 50-60 mL 1x tampon de lavage in situ A dans un pot de Coplin à la température ambiante avec une agitation douce. </ Li>
  3. Préparez la solution Ligation-Ligase sur de la glace en ajoutant 1 μL de Ligase à 39 μL de solution Ligature et ajoutez 40 μL de Ligation-Ligase à chaque tache. Incuber 30 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée préchauffée.
  4. Laver les diapositives 2 fois pendant 5 min avec ~ 50-60 mL 1x tampon de lavage in situ A dans un pot de Coplin à la température ambiante avec une agitation douce.
  5. Préparer le mélange Amplification-Polymerase sur glace en diluant la solution mère Amplification 1: 5 dans l'eau. Ensuite, ajouter 0,5 μL de polymérase à 39,5 μL de 1x solution d'amplification pour chaque point.
    REMARQUE: les réactifs d'amplification sont sensibles à la lumière et doivent être protégés contre l'exposition directe à la lumière. Le réactif d'amplification se décline en quatre couleurs différentes (RED: excitation 594 nm, émission 624 nm; FarRED: excitation 644 nm, émission 669 nm; ORANGE: excitation 554 nm, émission 576 nm; GREEN: excitation 501 nm, émission 523 nm), Assurez-vous que la configuration de microscopie disponible est sDes propriétés d'excitation utiles et des filtres pour l'image de ces couleurs.
  6. Tapoter le tampon de lavage in situ A 1x et ajouter 40 μL de mélange Amplification-Polymerase par point. Incuber pendant 100 minutes à 37 ° C dans une chambre humidifiée préchauffée.

5. Montage et Imagerie

  1. Préparer 0,01x de tampon de lavage in situ B en ajoutant 1 ml de 1x tampon de lavage B à 99 ml d'eau.
  2. Tirez le mélange Amplification-Polymerase et lavez les diapositives 2 fois pendant 10 minutes avec 1x tampon de lavage in situ B dans un pot de Coplin à la température ambiante avec une agitation douce.
  3. Laver les diapositives 1 min dans un tampon de lavage 0,01x B.
  4. Effacez l'excès de 0,01x de tampon de lavage B et séchez les diapositives autour des taches avec un tissu sans peluches. Retirez autant de liquide que possible à l'aide d'une pipette sans toucher la tache ou en basculant la glissière.
  5. Diluer le support de fixation contenant DAPI 1: 5 en milieu de montage sans DAPI pour éviter d'avoir dépassé les noyaux.
  6. Ajouter 25-30 μL de support de support contenant 1: 5 DAPI à une lamelle de 24 mm x 24 mm et retirer le patin de recouvrement avec la glissière, appliquer une légère pression pour s'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air piégées. Scellez la lamelle avec un vernis à ongles et attendez au moins 15 minutes avant l'imagerie.
  7. Analyser les diapositives à l'aide d'un microscope à fluorescence (confocal).
    1. Comptez le nombre de signaux PLA ponctuels par cellule dans au moins 4 champs d'image acquis (objectif 20x, comptant au moins 20 cellules par condition ou combinaison d'anticorps, sur la base d'un calcul de puissance utilisant une moyenne anticipée de 7 ± 5 signaux dans les cellules traitées, Et 2 ± 2 signaux dans les cellules non traitées, avec une probabilité d'une erreur de type I de 0,05, et une puissance de 80%, comme indiqué précédemment 15 ).
      REMARQUE: la meilleure résolution est obtenue grâce à l'acquisition d'une pile Z et d'une déconvolution à l'aide de logiciels ( par exemple , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). La signaIl doit être facilement perceptible dans le périmètre nucléaire, tel que défini par la coloration DAPI.
    2. Ne comptez pas les signaux qui apparaissent clairement en dehors des noyaux. Typiquement, le traitement NCS ou l'irradiation γ aboutit à environ 5 à 10 signaux de PLA phosho-p53 / ATM par cellule. Les contrôles «anticorps individuels» peuvent donner un certain signal de fond, mais cela ne doit pas dépasser 1-2 signaux PLA pour 1 sur 20 cellules.
    3. À des fins de publication et de présentation, capturez des images en utilisant un objectif d'huile d'immersion 40X ou 63X. Les diapositives peuvent être conservées à 4 ° C et doivent être protégées de l'exposition à la lumière.

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Representative Results

On a montré que la phosphorylation de p53 au résidu Ser15 dépendait de l'activité kinase ATM 16 . Pour démontrer et confirmer la spécificité de la technique PLA sur les préparations cytospin de cultures cellulaires en suspension, il est démontré que l'induction d'un endommagement de l'ADN par 2 h de traitement NCS des cellules BCR-ABL + B-ALL arrêtées dans la phase G1 du cycle cellulaire A entraîné l'interaction spécifique entre ATM et phospho-Ser15-p53, comme prévu. Des signaux PLA ponctuels ont été observés dans le noyau de la majorité des cellules traitées avec NCS ( Figure 1B ), avec une moyenne de 7 signaux PLA par cellule 15 , alors que ces signaux n'ont pas été détectés dans des cellules qui n'ont pas été traitées avec NCS ( Figure 1A ) . Le prétraitement des cellules avec l'inhibiteur spécifique de kinase ATM KU55933 avant l'induction des dommages à l'ADN a clairement diminué le nombre de signaux PLA à une moyenne de2 signaux PLA / cellule ( Figure 1C ). Les signaux PLA ATM-phospho-Ser15-p53 ont été détectés exclusivement dans le noyau, comme prévu. Les expériences de PLA dans lesquelles on a omis l'anticorps contre chèvre anti-ATM ou l'anticorps anti-phospho-Ser15-p53 de lapin (contrôle «unique anticorps») n'ont pas donné de signaux PLA spécifiques ( figures 1D et 1E ). La quantification et les analyses statistiques de ces résultats sont présentées dans la figure 1F (adapté d'Ochodnicka et al., J.Iununol 2016) 15 .

Figure 1
Figure 1: PLA in situ pour ATM / phospho-Ser15-p53 Interactions dans BV173 Human BCR-ABL + Cells. ( A ) Les cellules ont été traitées pendant une nuit avec 5 000 μm d'imatinib (inhibiteur spécifique de la kinase Abl qui provoque un cycle cellulaire de phase G1E) dans les cellules BCR-ABL +), avec de l'imatinib et 50 Ng / mL NCS, ce qui a induit un dommage à l'ADN ( B ) ou avec de l'imatinib et a été prétraité avec 5 μM de l'inhibiteur spécifique de Kinase KU55933 avant traitement NCS ( C ) . Des expériences de PLA de contrôle d'anticorps unique pour les anticorps contre chèvre-anti-ATM (D) et anti-phospho-Ser15-p53 de lapin ( E ) sont présentées. Les signaux ponctuels de fluorescence rouge représentent la proximité in situ de la protéine (<50 nm) des protéines ATM et phospho-Ser15-p53. Barres d'échelle = 5 μm (lignes blanches). ( F ) La quantification du nombre de signaux PLA dans au moins 20 cellules traitées dans différentes conditions expérimentales est montrée. Les lignes horizontales représentent les moyens; Les significations statistiques ont été déterminées par une analyse de variance à sens unique (ANOVA; *** p <0,001). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Dans ce rapport, il est démontré que le PLA peut être utilisé pour déterminer et visualiser l'interaction spécifique entre les protéines dans les cultures de cellules en suspension. Il est à noter que le protocole décrit ici n'est pas limité à l'étude des complexes de réparation d'ADN, mais s'applique également à visualiser et quantifier d'autres interactions protéines-protéines dans des cultures de cellules en suspension. Il est démontré que la kinase ATM interagit avec le p53 phosphorylé dans les cellules BCR-ABL + B-ALL arrêtées par G1 lorsqu'elles sont exposées à un agent inducteur de dégâts de l'ADN. Auparavant, la technique PLA a été utilisée par nous pour montrer que l'ATM et le facteur de transcription FOXO1 interagissaient dans les cellules BCR-ABL + B-ALL, mais cette interaction n'a probablement pas abouti à la phosphorylation ATM-dépendante de FOXO1. À l'appui des données PLA, il a été confirmé par l'immunoprécipitation de protéines endogènes ATM / ATR-phosphorylées qui, contrairement aux substrats ATM établis p53 et NBS1, FOXO1 n'est pas phosphoryé par ATM lors de l'induction de DDégâts de NA 15 . En outre, l'approche PLA a été appliquée avec succès pour étudier la formation d'interactions de réparations non correspondantes ( par exemple, l'interaction entre MSH2 et MSH6) dans différentes lignées cellulaires de lymphome B humain (données non présentées). Dans ces contextes particuliers, la technique PLA offrait une approche alternative pour soutenir nos résultats. Il est démontré que PLA permet l'évaluation semi-quantitative des interactions protéine-protéine entre les conditions expérimentales et donne un aperçu de la variation cellule-à-cellule dans ces interactions.

L'analyse des interactions protéine-protéine spécifiques dans les cellules (exposées à différentes conditions expérimentales) a généralement été difficile et est soumise à des artefacts expérimentaux. En général, la co-immunoprécipitation des protéines a été la méthode de choix, mais nécessite un grand nombre de cellules et / ou de protéines, interdisant essentiellement l'analyse des interactions protéine-protéine dans une cellule rareDes types ou entre des protéines qui sont exprimées à des niveaux faibles. En outre, la surexpression des protéines dans des modèles de cellules (non pertinents) conduit souvent à des artefacts de surexpression, et les résultats peuvent être très difficiles à confirmer / à valider in vivo ou dans les types de cellules concernés. En outre, la co-immunoprécipitation nécessite une lyse des cellules et une solubilisation des protéines, ce qui peut entraîner une perte de signal lorsque les interactions protéines-protéines sont faibles. Il est important de noter que la co-immunoprécipitation des protéines et les approches hybrides de levure-deux sont incapables de détecter la variation intra-et inter-cellulaire dans les interactions protéine-protéine. La technique PLA offre une alternative attrayante et facile pour ces techniques, et offre une meilleure compréhension. Le PLA peut être utilisé dans un laboratoire standard (diagnostic) car il ne nécessite pas de compétences hautement spécialisées au-delà de la capacité à effectuer l'immunohistochimie.

Le développement de la microscopie de super résolution a permis l'approfondissementAnalyse de l'architecture moléculaire des complexes protéiques. Cette technique, cependant, n'est pas facilement disponible et implique une infrastructure de recherche dédiée. PLA offre une approche alternative accessible, simple et peu coûteuse pour l'étude de la formation de complexes protéiques, avec une résolution comparable. Une limitation évidente de la technique PLA est la disponibilité d'anticorps primaires spécifiques élevés dans différentes espèces. Cependant, plusieurs entreprises offrent maintenant des combinaisons d'anticorps dédiées (et validées) qui rationalisent l'utilisation de la technique PLA.

Les études sur l'implication des protéines dans la réparation des dommages à l'ADN et la réponse aux dommages à l'ADN dépendent fortement de l'analyse de la formation et de la composition de l'IRIF. Cependant, il faut noter que la co-localisation des protéines dans les IRIF n'implique pas nécessairement des interactions protéines-protéines directes. La technique PLA offre une occasion unique d'étudier plus en détail les protéines de réparation d'ADN et la formation de complexes de réparation. Le spUne analyse atiotemporale de la formation de tels complexes peut être cartographiée plus en détail en utilisant le PLA. En outre, il permettra aux chercheurs d'évaluer la formation de complexes de réparation dans les tissus et les spécimens cliniques de patients qui ont été traités avec des agents ou des traitements nuisibles à l'ADN, ce qui peut fournir un aperçu important de l'efficacité de ces modalités de traitement et peut même aider à la sélection Des patients qui bénéficieront le plus de ces traitements.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

La recherche dans le laboratoire de Guikema est financée par Innovational Research Incentives Scheme de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (subvention VIDI 016126355) et le KiKA «Stichting Kinderen Kankervrij» (projet 252).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV173 cell line DSMZ AC-20 BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line DSMZ ACC-389 BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco (Life Technologies) 21980-032
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich F7524 lot #: 064M3396
L-glutamine Gibco (Life Technologies) 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco (Life Technologies) 15140-122
imatinib methanesulfonate LC Laboratories I-5508 Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin Sigma Aldrich N9162 Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933 Selleckchem S1092 Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides Waldemar Knittel VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker Sigma Aldrich Z377821-1EA
Cytospin funnel Q Path Labonord SAS 003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit Sigma Aldrich DUO92105 Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM Bethyl Laboratories A300-136A PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 Cell Signaling Technology 9284 We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Vectashield antifading mounting medium Vector Labs H-1000
4% paraformaldehyde in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Also available from various other vendors

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References

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Biochimie problème 124 endommagement de l'ADN réparation de l'ADN ATM p53 culture cellulaire en suspension leucémie lymphoblastique aiguë BCR-ABL + B-cellule interaction protéine-protéine,
Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité
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Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der … More

Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der Veen, A., de Wilde, G., Maas, C., Guikema, J. E. J. Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (124), e55703, doi:10.3791/55703 (2017).

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