Summary
Her er det demonstrert hvordan in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan brukes til å oppdage og visualisere direkte protein-protein-interaksjonene mellom ATM og p53 i suspensjoncellekulturer utsatt for genotoksisk stress.
Abstract
DNA skade respons respekterer reparasjon av DNA lesjoner som oppstår spontant, er forårsaket av genotoksisk stress, eller vises i sammenheng med programmerte DNA pauser i lymfocytter. Ataxia-Telangiectasia Mutated Kinase (ATM), ATM- og Rad3-relatert kinase (ATR) og den katalytiske underenheten av DNA-avhengig proteinkinase (DNA-PKcs) er blant de første som aktiveres ved induksjon av DNA-skade og er Sentrale regulatorer av et nettverk som styrer DNA-reparasjon, apoptose og celleoverlevelse. Som en del av en tumor-undertrykkende vei aktiverer ATM og ATR p53 gjennom fosforylering, og regulerer dermed transkriptjonsaktiviteten til p53. DNA-skade resulterer også i dannelsen av såkalt ioniserende strålingsinducert foci (IRIF) som representerer komplekser av DNA-skadesensor og reparasjonsproteiner som akkumuleres ved DNA-skader, som er visualisert ved fluorescensmikroskopi. Samlokalisering av proteiner i IRIF betyr imidlertid ikke nødvendigvis dEkstreme protein-protein-interaksjoner, da oppløsningen av fluorescensmikroskopi er begrenset.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) er en ny teknikk som muliggjør direkte visualisering av protein-protein-interaksjoner i celler og vev med uovertruffen spesifisitet og følsomhet. Denne teknikken er basert på den romlige nærheten til spesifikke antistoffer som binder til proteiner av interesse. Når de forhørte proteinene er innenfor ~ 40 nm, utløses en amplifikasjonsreaksjon av oligonukleotider som er konjugert til antistoffene, og amplifikasjonsproduktet visualiseres ved fluorescensmerking, hvilket gir et signal som tilsvarer den intercellulære plasseringen av de samvirkende proteiner. Ved å bruke den etablerte funksjonelle samspillet mellom ATM og p53 som et eksempel, er det demonstrert her hvor PLA kan brukes i suspensjonscellekulturer for å studere de direkte vekselvirkninger mellom proteiner som er integrerte deler av DNA-skaderesponsen.
Introduction
DNA-skader utløser en svært regulert serie hendelser som involverer protein-protein-interaksjoner og post-translasjonelle modifikasjoner som sikrer effektiv og rask reparasjon av DNA, og derved opprettholder genomisk integritet 1 . Typisk blir DNA-reparasjon studert i celler utsatt for ioniserende stråling ved å overvåke dannelsen av såkalt ioniserende strålingsinducert foci (IRIF) ved (konfokal) fluorescensmikroskopi. Mange DNA-reparasjon og DNA-skade-sensing-proteiner danner IRIF, som representerer proteinkomplekser som nukleerer ved kromatinsteder som opprettholder DNA-skade 2 , 3 . Plasseringen og oppløsningen av IRIFs over tid gir viktig innsikt i spatiotemporal organisering av DNA-reparasjon, og kan indikere involvering av forskjellige DNA-reparasjonsveier. Naturen til DNA-skaden og cellesyklus-scenen hvor skadene oppnås bestemmer hvilken DNA-reparasjonsvei som aktiveres. fo For eksempel, i celler som er aktivt engasjert i DNA-replikasjon (S-fase), er homolog rekombination (HR) den dominerende DNA-reparasjonsveien, mens i celler i G1- eller G2 / M-fasen av cellesyklusen, Homologe end-joining (NHEJ) reparasjonsveien dominerer. En av de tidligste hendelsene som følge av DNA-skade er aktiveringen av DNA-skade-sensing kinaser Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som hovedsakelig er aktiv i G1- og G2 / M-faser av cellesyklusen og regulerer NHEJ, Og Ataxia Telangiectasia og Rad3-relatert protein (ATR), som virker i S-fase ved å aktivere HR. Både ATM og ATR er svært pleiotropiske kinaser som fosforylerer mange proteiner som er involvert i DNA-reparasjon, celledød og overlevelse 4 . Begge kinaser har vist seg å fosforylere og aktivere tumor-suppressorproteinet p53 etter eksponeringen for genotoksisk stress, noe som indikerer at disse kinaser er oppstrøms mediatorer av en svingende svulstundertrykkende akse"Xref"> 5 , 6 .
Dannelsen og sammensetningen av IRIFs blir typisk vurdert ved å bestemme co-lokalisering av forskjellige proteiner ved bruk av tofarget immunfluorescensfarging og mikroskopi, men ikke alle proteiner som inngår i reparasjonsproteinkomplekser danner IRIF, som begrenser anvendeligheten av denne tilnærmingen. Videre er (konfokal) immunfluorescensmikroskopi begrenset av diffraksjonsegenskapene til lys, noe som resulterer i en ganske dårlig romlig oppløsning på ca. 200-300 nm, som overskrider størrelsen på de fleste subcellulære strukturer, som i det vesentlige forbyr direkte forhør av protein-protein-interaksjoner ved Molekylært nivå. Som sådan er co-lokalisering av immunfluorescensfargemønstre som detekteres av (konfokal) fluorescensmikroskopi ikke nødvendigvis indikativ for direkte protein-protein-interaksjoner. Nylig ble det utviklet nye superoppløsnings teknologier, for eksempel tredimensjonale strucTured illuminasjonsmikroskopi (3D-SIM) 7 , som ble vellykket brukt til å studere 53BP1- og BRCA1-IRIF-dannelse ved nanoskala detaljer, avslørende de romlige fordelingsegenskapene til disse proteinene som ikke kunne detekteres ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi 8 .
Flere andre metoder kan brukes til å oppdage protein-protein-interaksjoner in vivo , slik som co-immunutfelling, nedtrekksmetoder og gjær-to-hybrid screening tilnærminger. Imidlertid er disse teknikkene ganske besværlige, krever store mengder celler eller proteiner eller involverer overekspresjon av proteiner, som introduserer eksperimentelle artefakter. Mer nylig er det utviklet en ny teknikk som muliggjør visualisering og kvantifisering av protein-protein-interaksjoner in situ ( dvs. i celler og i vev), som kalles Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrImary-antistoffer som gjenkjenner to proteiner av interesse, oppdages av sekundære antistoffer som er konjugert til oligonukleotider (såkalte PLA-prober). Hvis de to forskjellige sekundære antistoffene er tilstrekkelig tette på grunn av interaksjoner mellom proteiner som er anerkjent av de primære antistoffene, hybridiserer de konjugerte oligonukleotider og kan ligeres for å danne et lukket, sirkulært DNA-substrat. Dette sirkulære substratet amplifiseres deretter ved hjelp av rullesirkelforsterkning og visualiseres med fluorokrom-konjugerte komplementære oligonukleotider. Ved bruk av PLA, blir den subcellulære lokalisering av protein-protein-interaksjonen bevaret da det fluorescensmerkede merkesirkulasjonsforsterkningsprodukt forblir festet til PLA-prober. Oppløsningen av denne analysen er <50 nm, basert på funnet at diameteren av et antistoff er ca. 7-10 nm 11 . Ringsirkulasjonsforsterkning kan bare skje dersom to par antistoffer (primær + sekonDary) fysisk samhandle innenfor perimeter som er definert av deres størrelse (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalforsterkningstrinnet øker sensitiviteten til PLA-analysen og muliggjør gjenkjenning av vekselvirkninger av knapt uttrykte proteiner. PLA genererer punkterte, foci-lignende signaler som kan kvantifiseres per per-cellebasis, hvorved intra- og intercellulær variasjon i protein-protein-interaksjoner kan vurderes.
Dannelsen og sammensetningen av DNA-reparasjonskomplekser og IRIF-er blir for det meste studert i adherente cellelinjer, slik som epitelcellelinjen U2OS, den humane embryonale nyrelinje HEK293 og den retinale pigmentepitelcellelinjen RPE-1, som er hurtig- Voksende og lett å transfektere. Suspensjoncellekulturer slike lymfoide og myeloidcellelinjer benyttes sjeldnere, da disse er mindre mottagelige for transfeksjon og generelt ikke holder seg til dekselglass, og krever dermed tillegg / alternativ stEps for bildebehandling. Oppløsningen av DNA-skade er imidlertid svært relevant i sammenheng med lymfoide og myeloid maligniteter, da DNA-skaderesponsen ofte blir påvirket av genomiske (driver) avvik i disse svulstene, og spiller en sentral rolle i den ondartede transformasjonen av normal lymfoid og myeloid ( Progenitor) celler 12 , 13 , 14 .
Denne protokollen beskriver hvordan PLA kan brukes til å vurdere og kvantifisere protein-protein-interaksjoner etter induksjon av DNA-skade i suspensjonscellekulturer. Her blir PLA utført for å bestemme og visualisere interaksjonene mellom ATM og p53 ved DNA-skade i humane B-celle leukemiceller som er indusert til å gjennomgå en G1-fase celle-syklusarrest. Av notatet er protokollen som presenteres her ikke begrenset til å studere ATM- og p53-interaksjoner i G1-arresterte leukemiceller, men kan også brukes til å visualisere andre protein-protein-interaksjonerI forskjellige celletyper og suspensjoncellekulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Behandling av celler og DNA-skadeinduksjon
- Kultur de humane BCR-ABL + B-cellens akutte lymfoblastiske cellelinjer BV173 eller SUP-B15 i IMDM suppleret med 20% FCS, 50 μM p-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære av 5% C02. Telle celler og plate ved 2 x 106 celler / ml i 6 brønner plater, ved 5 ml / brønn.
MERK: Suspensjonscellelinjer av forskjellig opprinnelse kan eventuelt brukes. - For å arrestere BCR-ABL + B-ALL-cellene i G1-fasen av cellesyklusen, tilsett 5 μM imatinibmetansulfonat (STI571) og inkuber natten over.
- Eventuelt, utelat dette trinnet når du studerer protein-protein-interaksjoner gjennom cellesyklusen eller i BCR-ABL-negative celletyper.
- Inducer DNA-skade ved å tilsette 50 ng / mL neocarzinostatin (NCS) til kulturen, og inkuber i 2 timer.
- Alternativt,Indusere DNA-skade ved å bestråle cellene ved bruk av en radioaktiv kilde [ 137 Cs] ved 0,5 Gy / min ved en dose på 5 Gy. Etter bestråling, la cellen gjenvinne i 2 timer ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2.
- Eventuelt, for å vurdere involveringen av ATM-kinaseaktivitet som svar på DNA-skade, tilsett 5 μM av ATM-kinaseinhibitoren KU55933 før tilsetning av NCS eller bestrålingsbehandlingen.
- Forbered 1x PBS + 10% BSA ved lagring 5 g fraksjon-V BSA på toppen av 50 ml 1 x PBS i en beger eller Erlenmeyer-kolbe, og la sitte ved RT til BSA er oppløst. Ikke rist eller rør da dette vil føre til omfattende skumdannelse. Filter langsomt gjennom et 0,22 μm filter og hold på is.
- Harvest celler og vask to ganger med iskald 1x PBS. Telle cellene og resuspendere ved 2 x 10 6 / ml i 1x PBS + 10% BSA. Hold celler på is.
2. Cytocentrifugering, fiksering og permeabilisering
- Forbered den4% paraformaldehydoppløsning i 1x PBS fersk. Tilsett 2 g PFA til 50 ml 1 x PBS og inkuber i et 55 ° C rystende vannbad til løsningen er klar. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 μm filter og lagre ved RT til bruk.
MERK: Eventuelt kan 4% PFA fikseringsmiddel lagres frosset ved -20 ° C. Etter frysing, tine bare en gang til bruk. Ellers kan 4% PFA-løsningen i PBS kjøpes direkte. - Forsiktig poler 76 mm x 26 mm mikroskopisk lysbilder med lintfritt vev og avfett dem ved å plassere i 96% etanol i en Coplin-krukke i 5 minutter. La mikroskopien glir lufttørke i 10 minutter.
- Monter mikroskopisk lysbilder i cytospin / cytologi-tårnene med et område på 6 mm. Pre-coat slides ved pipettering 50 μl 1x PBS + 10% BSA i hver trakt og sentrifuge i 1 min ved 500 rpm.
- Tilsett 100 μl av cellesuspensjonen (tilsvarer 0,2 x 106 celler) til hver trakt og sentrifuger i 5 minutter ved 500 rpm. For hver antistoffkombinasjon, ved leAst 4 preparater kreves (dobbelt-antistoff-eksperiment, to enkelt-antistoff kontroller, ingen antistoffer kontroll).
- Demonter forsiktig traktene, og sørg for ikke å berøre flekkene. Fortsett med prøvefiksering umiddelbart.
- Eventuelt, la lysbildene lufttørke i minst 30 minutter. Etter lufttørking, pakk glidene individuelt i aluminiumsfolie og oppbevar ved -20 ° C til bruk. Når du bruker frosne preparater, må du tine lysbildene som er pakket inn i et papirhåndkle for å hindre åpen kondens på glidene.
- Tegn en sirkel (omtrentlig diameter 15-20 mm) rundt stedet ved hjelp av en PAP-pennevæskeblokker (5 mm spiss).
- Tilsett 50 μl 4% PFA-fikseringsløsning til hvert sted og inkuber i 30 minutter ved RT.
- Vask cellene 3 ganger i 5 minutter med 1x PBS i en Coplin-krukke ved RT med forsiktig omrøring.
- Tør lysbildene rundt flekkene med et lintfritt vev og fjern så mye væske fra stedet som mulig ved hjelp av en piKjæledyr uten å berøre stedet, eller ved å vippe lysbildet. Tilsett 50 μl 0,25% Triton-X i 1x PBS til hvert sted og inkuber i 10 minutter ved RT uten omrøring.
- Vask objektglassene 3 ganger i 5 minutter i ~ 50-60 ml 0,05% Tween-20 i TBS (TBS-T) i en Coplin-krukke ved RT med forsiktig omrøring. 10 lysbilder kan behandles samtidig på denne måten.
3. Blokkering og primær antistoffinkubasjon
- Tapp av TBS-T og tørk lysbildene rundt flekkene med et lintfritt vev. Fjern så mye væske fra stedet som mulig ved å bruke en pipette uten å berøre stedet, eller ved å vippe lysbildet. Vortex kortvarig løsningen og legg til en dråpe (~ 40 μL) til hvert sted. Inkuber i 1 time ved 37 ° C i et forvarmet fuktig kammer.
- Klargjør antistoff-cocktail ved å blande geit-anti-ATM ved 1: 1000 og kanin-anti-fosfor-Ser15-p53 ved 1: 100 i kommersielt antistoff fortynningsmiddel, vortex antistoff fortynningsmiddel før bruk. For kontrolleksperimentTs, lag antistoff fortynninger som bare inneholder geit-anti-ATM og kun kanin-anti-fosfor-Ser15-p53-antistoffet (enkeltantistoffkontrollene).
- Tapp av blokkeringsløsningen, men vær forsiktig så du ikke lar cellene tørke før du legger til antistoff fortynninger. Tilsett 30 μl av hver antistoff-cocktailfortynning og inkuber i et fuktig kammer over natten ved 4 ° C.
- Klargjør in situ vaskbuffer A og vaskbuffer B ved å løse innholdet i en pose av buffer A og buffer B-blanding i et sluttvolum på 1000 ml vann hver.
- Alternativt kan du fremstille vaskebuffer A ved å oppløse 8,8 g NaCl, 1,2 g Tris-base og 0,5 ml Tween-20 i 800 ml vann. Juster pH til 7,4 ved å bruke HC1 og tilsett til et sluttvolum på 1000 ml.
- Alternativt kan du fremstille vaskbuffer B ved å oppløse 5,84 g NaCl, 4,24 av Tris-base og 26,0 g Tris-HCl i 500 ml vann. Juster pH til 7,5 ved bruk av HC1. Tilsett vann til et sluttvolum på 1000 ml.
- FilterBegge løsninger gjennom et 0,22 μm filter.
- Vask lysbildene 2 ganger i 5 minutter med 1x in situ vaskebuffer A i en Coplin-krukke ved RT med forsiktig omrøring.
4. PLA Probes, Ligation and Amplification
- Forbered PLA prober ved å fortynne anti-geit PLUS og anti-kanin MINUS både 1: 5 i det kommersielle antistoff fortynningsmiddel. Tapp av 1x in situ vaskebuffer A fra lysbildene og tilsett 30 μL av PLA-probeblandingen til hvert sted. Inkuber 1 time ved 37 ° C i et forvarmet fuktet kammer.
MERK: Enhver kombinasjon av sekundære antistoffer PLUS og MINUS PLA-prober kan brukes (anti-mus, anti-kanin, anti-geit), så lenge de påførte primære antistoffene heves i forskjellige arter, og kombinasjonen av PLA-prober bør alltid Inneholde en PLUS-sonde og en MINUS-probe. - Vask lysbildene 2 ganger i 5 minutter med ~ 50-60 ml 1x in situ vaskebuffer A i en Coplin-krukke ved RT med forsiktig omrøring. </ Li>
- Forbered Ligation-Ligase-oppløsningen på is ved å tilsette 1 μl Ligase til 39 μL Ligation-oppløsning og tilsett 40 μL Ligation-Ligase-løsning til hvert sted. Inkubér 30 minutter ved 37 ° C i et forvarmet fuktet kammer.
- Vask objektglassene 2 ganger i 5 minutter med ~ 50-60 ml 1x in situ vaskebuffer A i en Coplin-krukke ved RT med forsiktig omrøring.
- Forbered Amplification-Polymerase-blandingen på is ved å fortynne Amplification stock solution 1: 5 i vann. Deretter tilsettes 0,5 μl polymerase til 39,5 μl 1x amplifikasjonsløsning for hvert sted.
MERK: Amplifieringsreagensene er lysfølsomme og bør beskyttes mot direkte eksponering mot lys. Amplifiseringsreagenset kommer i fire forskjellige farger (RED: excitasjon 594 nm, utslipp 624 nm, FarRED: eksitasjon 644 nm, utslipp 669 nm; ORANGE: excitasjon 554 nm, utslipp 576 nm; GREEN: eksitasjon 501 nm, utslipp 523 nm) Sørg for at mikroskopi-oppsettet er tilgjengelig sEksponeringsegenskaper og filtre for å vise disse fargene. - Tapp av 1x in situ vaskebuffer A og tilsett 40 μl Amplification-Polymerase-blanding per punkt. Inkuber i 100 minutter ved 37 ° C i et forvarmet fuktig kammer.
5. Montering og bildebehandling
- Tilbered 0,01x in situ vaskebuffer B ved å tilsette 1 ml 1x vaskbuffer B til 99 ml vann.
- Tapp av Amplification-Polymerase-blandingen og vaske lysbildene 2 ganger i 10 minutter med 1x in situ vaskebuffer B i en Coplin-krukke ved RT med forsiktig omrøring.
- Vask lysbildene 1 min i 0,01x vaskebuffer B.
- Tapp av overflødig 0,01x vaskebuffer B og tørk lysbildene rundt flekkene med et lintfritt vev. Fjern så mye væske fra stedet som mulig ved å bruke en pipette uten å berøre stedet, eller ved å vippe lysbildet.
- Fortynn DAPI-holdig monteringsmedium 1: 5 i monteringsmedium uten DAPI for å unngå overhaling av kjernene.
- Legg til 25-30 μL 1: 5 DAPI-holdig monteringsmedium til en 24 mm x 24 mm deksel og ta opp dekselet med glidebryteren, bruk lite trykk for å sikre at det ikke er noen fanget luftbobler. Tett dekselglasset med neglelakk og vent minst 15 min før avbildning.
- Analyser lysbildene ved hjelp av et (konfokalt) fluorescensmikroskop.
- Teller antall punkterte PLA-signaler per celle i minst 4 innsamlede bildefelt (20x objektiv, teller minst 20 celler per tilstand eller antistoffkombinasjon, basert på en effektberegning ved å bruke et forventet gjennomsnitt på 7 ± 5 signaler i de behandlede celler, Og 2 ± 2 signaler i de ubehandlede cellene, med en sannsynlighet for en type I-feil på 0,05 og en effekt på 80% som tidligere rapportert 15 ).
MERK: Den beste oppløsningen oppnås ved oppkjøp av en Z-stack og deconvolution ved hjelp av programvarepakker ( f.eks . ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). SignalenDet burde lett gjenkjennes innenfor kjernefysisk omkrets, som definert ved DAPI-fargingen. - Teller ikke signaler som tydeligvis kommer utenfor kjernen. Vanligvis resulterer NCS-behandling eller y-bestråling i omtrent 5-10 phosho-p53 / ATM PLA-signaler per celle. 'Single-antibody' kontrollene kan gi noe bakgrunnssignal, men dette bør ikke overstige 1-2 PLA signaler per 1 av hver 20 celler.
- For publisering og presentasjon formål, ta opp bilder ved hjelp av et 40X eller 63X nedsenkningsoljemål. Lysbildene kan lagres ved 4 ° C og skal beskyttes mot eksponering mot lys.
- Teller antall punkterte PLA-signaler per celle i minst 4 innsamlede bildefelt (20x objektiv, teller minst 20 celler per tilstand eller antistoffkombinasjon, basert på en effektberegning ved å bruke et forventet gjennomsnitt på 7 ± 5 signaler i de behandlede celler, Og 2 ± 2 signaler i de ubehandlede cellene, med en sannsynlighet for en type I-feil på 0,05 og en effekt på 80% som tidligere rapportert 15 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fosforylering av p53 ved rest Ser15 ble vist å være avhengig av ATM-kinaseaktivitet 16 . For å demonstrere og bekrefte spesifisiteten til PLA-teknikken på cytospinpreparater av suspensjoncellekulturer, er det vist at induksjon av DNA-skade ved 2 timers NCS-behandling av BCR-ABL + B-ALL-celler arrestert i G1-fasen av cellesyklusen Resulterte i den spesifikke interaksjonen mellom ATM og fosfor-Ser15-p53, som forventet. Punkterte PLA-signaler ble observert i kjernen til flertallet av celler behandlet med NCS ( figur 1B ) med et gjennomsnitt på 7 PLA signaler per celle 15 , mens disse signalene ikke ble detektert i celler som ikke ble behandlet med NCS ( figur 1A ) . Forbehandling av cellene med den spesifikke ATM-kinaseinhibitoren KU55933 før induksjon av DNA-skade tydeligvis reduserte antall PLA-signaler til et gjennomsnitt av2 PLA signaler / celle ( figur 1C ). ATM-fosfo-Ser15-p53 PLA-signaler ble detektert eksklusivt i kjernen, som forventet. PLA-eksperimenter hvor enten geit-anti-ATM eller kanin-anti-fosfor-Ser15-p53-antistoffet ble utelatt (kontroll av enkeltantistoff) ikke ga noen spesifikke PLA-signaler ( figurene 1D og 1E ). Kvantifisering og statistiske analyser av disse resultatene er presentert i figur 1F (tilpasset fra Ochodnicka et al., J. Immunol. 2016) 15 .
Figur 1: In situ PLA for ATM / fosfo-Ser15-p53-interaksjoner i BV173 humant BCR-ABL + celler. ( A ) Celler ble behandlet over natten med 5 uM imatinib (spesifikk Abl kinaseinhibitor som provoserer en G1-fase cellecyklE-arrestasjon i BCR-ABL + -celler), med imatinib og 50 ng / ml NCS, som induserte DNA-skade ( B ) eller med imatinib og forhåndsbehandlet med 5 μM av den spesifikke ATM-kinaseinhibitoren KU55933 før NCS-behandling ( C ) . Enkelt-antistoff-kontroll-PLA-eksperimenter for geit-anti-ATM (D) og kanin-anti-fosfor-Ser15-p53-antistoffene ( E ) er vist. Røde fluorescenspunktsignaler representerer in situ protein nærhet (<50 nm) av ATM og fosfo-Ser15-p53 proteiner. Skalestenger = 5 μm (hvite linjer). ( F ) Kvantifisering av antall PLA-signaler i minst 20 celler behandlet under forskjellige eksperimentelle betingelser er vist. Horisontale linjer representerer midler; Statistiske signifikanser ble bestemt ved enveisanalyse av varians (ANOVA; *** p <0,001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten er det påvist at PLA kan brukes til å bestemme og visualisere den spesifikke samspillet mellom proteiner i suspensjonscellekulturer. Av protokollen er protokollen beskrevet her ikke begrenset til studiet av DNA-reparasjonskomplekser, men gjelder også for å visualisere og kvantifisere andre protein-protein-interaksjoner i suspensjonscellekulturer. Det er vist at ATM-kinasen interagerer med fosforylert p53 i G1-arresterte BCR-ABL + B-ALL-celler når de eksponeres for et DNA-skadefremkallende middel. Tidligere ble PLA-teknikken brukt av oss for å vise at ATM og FOXO1 transkripsjonsfaktoren interagerte i BCR-ABL + B-ALL-celler, men dette interaksjonen har trolig ikke resultert i den ATM-avhengige fosforyleringen av FOXO1. Til støtte for PLA-data ble det bekreftet ved immunutfelling av endogene ATM / ATR-fosforylerte proteiner som, i motsetning til de etablerte ATM-substratene p53 og NBS1, ikke fosforyleres FOXO1 ved ATM ved induksjon av DNA skade 15 . I tillegg ble PLA-tilnærmingen vellykket anvendt for å studere dannelsen av feilparametere-reparasjonskomplekser ( f.eks . Interaksjonen mellom MSH2 og MSH6) -interaksjoner i forskjellige humane B-celle lymfomcellelinjer (data ikke vist). I slike sammenhenger tilbys PLA-teknikken en alternativ tilnærming til å støtte våre funn. Det er påvist at PLA muliggjør halvkvantitativ vurdering av protein-protein-interaksjoner mellom eksperimentelle forhold og gir innsikt i celle-til-cellevariasjonen i disse interaksjonene.
Analysen av spesifikke protein-protein-interaksjoner i celler (eksponert for forskjellige eksperimentelle forhold) har typisk vært utfordrende og er gjenstand for eksperimentelle artefakter. Generelt har protein-co-immunutfelling vært den valgte metode, men krever stort antall celler og / eller proteiner, i det vesentlige forbyr analysen av protein-protein-interaksjoner i sjeldne cellerTyper eller mellom proteiner som uttrykkes i lave nivåer. Videre fører overekspresjon av proteiner i (irrelevante) cellelinjemodeller ofte til overekspresjonsartefakter, og resultater kan være svært vanskelig å bekrefte / validere in vivo eller i de aktuelle celletyper. Samtidig krever co-immunutfelling lysis av celler og oppløseliggjøring av proteiner, noe som kan føre til tap av signal når protein-protein-interaksjoner er svake. Viktig er at protein-co-immunutfelling og gjær-to-hybrid-tilnærminger ikke kan oppdage intra- og intercellulær variasjon i protein-protein-interaksjoner. PLA-teknikken gir et attraktivt og enkelt alternativ for disse teknikkene, og gir viktig ekstra innsikt. PLA kan brukes i en standard (diagnostisk) laboratorieinnstilling, da den ikke krever høyt spesialiserte ferdigheter utover evnen til å utføre immunhistokjemi.
Utviklingen av superoppløsningsmikroskopi har gjort det mulig å gjøre det i dybdenAnalyse av molekylær arkitektur av proteinkomplekser. Denne teknikken er imidlertid ikke lett tilgjengelig og innebærer en dedikert forskningsinfrastruktur. PLA tilbyr en tilgjengelig, enkel og billig alternativ tilnærming til studiet av proteinkompleksdannelse, med en sammenlignbar oppløsning. En åpenbar begrensning av PLA-teknikken er tilgjengeligheten av spesifikke primære antistoffer oppdratt i forskjellige arter. Imidlertid tilbyr flere selskaper nå dedikerte (og validerte) antistoffkombinasjoner som strømlinjeformer bruken av PLA-teknikken.
Studier på involvering av proteiner i DNA-skadereparasjon og DNA-skaderesponsen stammer sterkt fra analysen av IRIF-dannelse og sammensetning. Det må imidlertid bemerkes at co-lokalisering av proteiner i IRIF ikke nødvendigvis innebærer direkte protein-protein-interaksjoner. PLA-teknikken gir en unik mulighet til å studere DNA-reparasjonsproteiner og dannelse av reparasjonskomplekser mer detaljert. SpAtiotemporal analyse av dannelsen av slike komplekser kan kartlegges mer detaljert ved bruk av PLA. Videre vil det tillate forskere å vurdere dannelsen av reparasjonskomplekser i vev og kliniske prøver av pasienter som har blitt behandlet med DNA-skadelige midler eller terapier, noe som kan gi viktig innsikt i effekten av disse behandlingsmodalitetene og kan til og med hjelpe til med utvelgelsen Av pasientene som vil ha mest nytte av disse behandlingene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning i Guikema laboratoriet er finansiert av Innovative Research Incentives Scheme fra Den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (VIDI-stipend 016126355) og Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (prosjekt 252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
