Summary
Här demonstreras hur in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan användas för att detektera och visualisera direkt protein-protein-interaktioner mellan ATM och p53 i suspensionscellkulturer utsatta för genotoxisk stress.
Abstract
DNA-skadans svar orkestrerar reparationen av DNA-lesioner som uppträder spontant, orsakas av genotoxisk stress eller framträder i samband med programmerade DNA-raster i lymfocyter. Ataxia-Telangiectasia-muterad kinas (ATM), ATM- och Rad3-besläktad kinas (ATR) och den katalytiska subenheten av DNA-beroende proteinkinase (DNA-PKcs) är bland de första som aktiveras vid induktion av DNA-skada och är Centrala regulatorer av ett nätverk som kontrollerar DNA-reparation, apoptos och cellöverlevnad. Som en del av en tumörundertryckande väg aktiverar ATM och ATR p53 genom fosforylering, varigenom p53-transkriptionsaktiviteten regleras. DNA-skada resulterar också i bildandet av så kallad joniserande strålningsinducerad foci (IRIF) som representerar komplex av DNA-skada sensor och reparationsproteiner som ackumuleras vid ställena för DNA-skada, vilka visualiseras genom fluorescensmikroskopi. Samlokalisering av proteiner i IRIF innebär emellertid inte nödvändigtvis dIrect protein-protein interaktioner, eftersom upplösningen av fluorescensmikroskopi är begränsad.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) är en ny teknik som möjliggör direkt visualisering av protein-protein interaktioner i celler och vävnader med oöverträffad specificitet och känslighet. Denna teknik är baserad på den rumsliga närheten av specifika antikroppar som binder till proteiner av intresse. När de utfrågade proteinerna ligger inom ~ 40 nm utlöses en amplifieringsreaktion av oligonukleotider som är konjugerade till antikropparna och amplifieringsprodukten visualiseras genom fluorescerande märkning, vilket ger en signal som motsvarar den intercellulära placeringen av de interaktiva proteinerna. Genom att använda den etablerade funktionella interaktionen mellan ATM och p53 som exempel visas det hur PLA kan användas i suspensionscellkulturer för att studera de direkta interaktionerna mellan proteiner som är integrerade delar av DNA-skadans respons.
Introduction
DNA-skada utlöser en starkt reglerad serie av händelser som involverar protein-protein-interaktioner och post-translationella modifieringar som säkerställer effektiv och snabb reparation av DNA, varigenom genomisk integritet skyddas 1 . Typiskt studeras DNA-reparation i celler som exponeras för joniserande strålning genom att övervaka bildningen av så kallad joniserande strålningsinducerad foci (IRIF) genom (konfokal) fluorescensmikroskopi. Många DNA-reparation och DNA-skada-sensingproteiner bildar IRIF, vilka representerar proteinkomplex som kärnar vid kromatinställen som upprätthåller DNA-skada 2 , 3 . Placeringen och upplösningen av IRIFs över tid ger en viktig inblick i spatiotemporal organisation av DNA-reparation och kan indikera involvering av olika DNA-reparationsvägar. Naturen hos DNA-skadorna och cellcykelsteget där skadan uppnås bestämmer vilken DNA-reparationsväg som aktiveras. Fo I celler som är aktivt involverade i DNA-replikation (S-fas) är homolog rekombination (HR) den dominerande DNA-reparationsvägen, medan i celler i G1- eller G2 / M-fasen av cellcykeln är den icke- Homologa slutförbindningsvägar (NHEJ) dominerar. En av de tidigaste händelserna som följer DNA-skada är aktiveringen av DNA-skada-sensing-kinaserna Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som är mest aktiv i cellcykeln G1 och G2 / M och reglerar NHEJ, Och Ataxia Telangiectasia och Rad3-relaterat protein (ATR), som verkar i S-fas genom att aktivera HR. Både ATM och ATR är mycket pleiotropa kinaser som fosforylerar många proteiner som är inblandade i DNA-reparation, celldöd och överlevnad 4 . Båda kinaserna har visat sig fosforylera och aktivera tumör-suppressorproteinet p53 efter exponeringen för genotoxisk stress, vilket indikerar att dessa kinaser är uppströms mediatorer av en svängbar tumördämpande signalaxel"Xref"> 5 , 6 .
Bildandet och sammansättningen av IRIFs bedöms typiskt genom att bestämma samlokalisering av olika proteiner med användning av dubbelfärgad immunfluorescensfärgning och mikroskopi, men inte alla proteiner som ingår i reparationsproteinkomplex bildar IRIF, vilket begränsar tillämpningen av denna metod. Vidare begränsas (konfokal) immunofluorescensmikroskopi av diffraktionsegenskaperna hos ljus, vilket resulterar i en ganska dålig rumsupplösning av ca 200-300 nm, som överskrider storleken på de flesta subcellulära strukturerna, vilket väsentligen förbjuder direktinterrogation av protein-protein-interaktioner vid Molekylär nivå. Som sådan är co-lokalisering av immunofluorescensfärgningsmönster som detekteras av (konfokal) fluorescensmikroskopi inte nödvändigtvis indicativ för direkta protein-protein-interaktioner. Nyligen har nya superresolutionstekniker utvecklats, såsom tredimensionell strucTured illuminationsmikroskopi (3D-SIM) 7 , som framgångsrikt användes för att studera 53BP1- och BRCA1-IRIF-bildning vid nanoskala detaljer, vilket avslöja de spatiala fördelningsegenskaperna hos dessa proteiner som inte kunde detekteras med konfokal laserskanningsmikroskopi 8 .
Flera andra metoder kan användas för att detektera protein-protein-interaktioner in vivo , såsom samimmunutfällning, neddragnings-metoder och jäst-två-hybrid-screeningsmetoder. Emellertid är dessa tekniker ganska besvärliga, kräver stora mängder celler eller proteiner eller involverar överuttryck av proteiner, som introducerar experimentella artefakter. Nyligen har en ny teknik utvecklats som möjliggör visualisering och kvantifiering av protein-protein-interaktioner in situ ( dvs i celler och i vävnader), som benämns Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrImariantikroppar som känner igen två proteiner av intresse detekteras av sekundära antikroppar som är konjugerade till oligonukleotider (så kallade PLA-prober). Om de två olika sekundära antikropparna är tillräckligt nära på grund av interaktioner mellan de proteiner som känns igen av de primära antikropparna hybridiserar de konjugerade oligonukleotiderna och kan ligeras för att bilda ett slutet cirkulärt DNA-substrat. Detta cirkulära substrat förstärks därefter genom valscirkelförstärkning och visualiseras med fluorokrom-konjugerade komplementära oligonukleotider. Med användning av PLA bevaras den subcellulära lokaliseringen av protein-protein-interaktionen, eftersom den fluorescensmärkta rullecirkelförstärkningsprodukten förblir bunden till PLA-proberna. Upplösningen av denna analys är <50 nm, baserat på det konstaterande att diametern av en antikropp är ungefär 7-10 nm 11 . Rullande cirkelförstärkning kan endast ske om två antikroppar (primära + sekonDary) interagerar fysiskt inom perimetern som definieras av deras storlek (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalförstärkningsteget ökar känsligheten av PLA-analysen och möjliggör detektering av interaktioner av knappt uttryckta proteiner. PLA genererar punktade, foci-liknande signaler som kan kvantifieras per percellsbasis, genom vilken den intra- och intercelliga variationen i protein-protein-interaktioner kan bedömas.
Bildandet och sammansättningen av DNA-reparationskomplex och IRIF-sekvenser studeras mestadels i vidhäftande cellinjer, såsom den mänskliga ben-osteosarkomepitelcellinjen U2OS, den humana embryonala njurcellinjen HEK293 och retinalpigmentepitelcellinjen RPE-1, som är snabb- Växer och lätt att transfektera. Suspension cellkulturer sådana lymfoida och myeloidcellinjer används mindre ofta, eftersom dessa är mindre mottagliga för transfektion och i allmänhet inte vidhäftar täckglas, vilket därmed kräver ytterligare / alternativ stEps för bildbehandling. Upplösningen av DNA-skada är emellertid väldigt relevant i samband med lymfoida och myeloid maligniteter, eftersom DNA-skadornas reaktion ofta påverkas av genomiska (förare) aberrationer i dessa tumörer, spelar en nyckelroll i den maligna transformationen av normal lymfoid och myeloid ( Stamceller) 12 , 13 , 14 .
Detta protokoll beskriver hur PLA kan användas för att bedöma och kvantifiera protein-protein-interaktioner efter induktion av DNA-skada i suspensionscellkulturer. Här utförs PLA för att bestämma och visualisera interaktionerna mellan ATM och p53 vid DNA-skada i humana B-cellleukemiceller som induceras att genomgå en G1-fascellcykelhållande. Observera är protokollet som presenteras här inte begränsat till att studera ATM- och p53-interaktioner i G1-arresterade leukemi-celler, men kan också användas för att visualisera andra protein-proteininterI olika celltyper och suspensionscellkulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Behandling av celler och DNA-skadainduktion
- Kultur de humana BCR-ABL + B-cellens akuta lymfoblastiska cellinjer BV173 eller SUP-B15 i IMDM kompletterad med 20% FCS, 50 | iM p-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2. Räkna celler och platta vid 2 x 106 celler / ml i 6-brunnsplattor, vid 5 ml / brunn.
OBS: Eventuellt kan suspensionscellslinjer av olika ursprung användas. - För att arrestera BCR-ABL + B-ALL-cellerna i cellfasens G1-fas, tillsätt 5 μM imatinibmetansulfonat (STI571) och inkubera över natten.
- Alternativt, utelämna detta steg när man studerar protein-protein-interaktioner genom cellcykeln eller i BCR-ABL-negativa celltyper.
- Inducerar DNA-skada genom att tillsätta 50 ng / ml neocarzinostatin (NCS) till odlingen och inkubera i 2 timmar.
- Alternativt,Inducera DNA-skada genom att bestråla cellerna med användning av en radioaktiv källa [ 137 Cs] vid 0,5 Gy / min vid en dos av 5 Gy. Efter bestrålning låt cellen återvinna i 2 h vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2.
- Eventuellt, för att utvärdera involveringen av ATM-kinasaktivitet som svar på DNA-skada, tillsätt 5 μM av ATM-kinashämmaren KU55933 före tillsats av NCS eller bestrålningsbehandlingen.
- Förbered 1x PBS + 10% BSA genom att lägga 5 g fraktion-V BSA ovanpå 50 ml 1x PBS i en bägare eller Erlenmeyer-kolv och låt sitta vid RT tills BSA är upplöst. Skaka inte eller rör då det här medför stor skumning. Långsamt filtrera genom ett 0,22 μm filter och behåll på is.
- Skörda celler och tvätta två gånger med iskallt 1x PBS. Räkna cellerna och resuspendera vid 2 x 10 6 / ml i 1x PBS + 10% BSA. Håll celler på is.
2. Cytocentrifugering, fixering och permeabilisering
- Förbereda4% paraformaldehydlösning i 1x PBS-färskt. Tillsätt 2 g PFA till 50 ml 1x PBS och inkubera i ett 55 ° C skakvattenbad tills lösningen är klar. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter och lagra vid RT tills användning.
OBS: Eventuellt kan 4% PFA fixativ lagras fryst vid -20 ° C. Efter frysning, tina bara en gång för användning. Annars kan 4% PFA-lösningen i PBS köpas direkt. - Torka försiktigt 76 mm x 26 mm mikroskopglas med luddfri vävnad och avfett dem genom att placera i 96% etanol i en Coplin-burk i 5 minuter. Låt mikroskopiet glida lufttorka i 10 minuter.
- Montera mikroskopi diabilder i cytospin / cytologi tågarna med ett område på 6 mm. Förbeläggningsglas glider genom pipettering av 50 | il 1x PBS + 10% BSA i varje tratt och centrifuger i 1 min vid 500 rpm.
- Tillsätt 100 μl av cellsuspensionen (lika med 0,2 x 106 celler) till varje tratt och centrifugera i 5 minuter vid 500 rpm. För varje antikroppskombination, vid leAst 4 preparat krävs (dubbel-antikroppsexperiment, två enskilda antikroppskontroller, ingen antikroppskontroll).
- Ta försiktigt ut trakterna och var noga med att inte vidröra fläckarna. Fortsätt till provfixering direkt.
- Låt sliderna lufttorka i minst 30 minuter. Efter lufttorkning, svep in individuellt i aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C tills användning. När du använder frysta preparat, se till att tina glidorna i en pappershandduk för att förhindra uppenbar kondens på glidbanorna.
- Rita en cirkel (ungefärlig diameter 15-20 mm) runt platsen med en PAP-penna vätskeblockerare (5 mm spets).
- Tillsätt 50 μl 4% PFA fixeringslösning till varje fläck och inkubera i 30 min vid RT.
- Tvätta cellerna 3 gånger i 5 min med 1x PBS i en Coplin burk vid RT med försiktig omröring.
- Torka glidbanorna runt fläckarna med en luddfri vävnad och ta bort så mycket vätska från platsen som möjligt med hjälp av en piHusdjur utan att röra på platsen, eller genom att luta sliden. Tillsätt 50 μl 0,25% Triton-X i 1x PBS till varje fläck och inkubera i 10 minuter vid RT utan omröring.
- Tvätta bilderna 3 gånger under 5 minuter i ~ 50-60 ml 0,05% Tween-20 i TBS (TBS-T) i en Coplin-burk vid RT med försiktig omröring. 10 bilder kan bearbetas samtidigt på detta sätt.
3. Blockering och primär antikroppsinkubation
- Tappa av TBS-T och torka glidbanorna runt fläckarna med en luddfri vävnad. Ta bort så mycket vätska från platsen som möjligt med hjälp av en pipett utan att röra på platsen, eller genom att luta gliden. Vortex kortvarig lösningen och tillsätt en droppe (~ 40 μL) till varje plats. Inkubera i 1 h vid 37 ° C i en förvärmd fuktad kammare.
- Förbered antikroppscocktailen genom att blanda get-anti-ATM vid 1: 1000 och kanin-anti-fosfor-Ser15-p53 vid 1: 100 i kommersiellt antikroppspädningsmedel, vortexantikroppspädningsmedel före användning. För kontrollprovTs, förbereda antikroppsutspädningar innehållande endast get-anti-ATM och endast kanin-anti-fosfor-Ser15-p53-antikroppen (enkelantikroppskontroller).
- Tappa bort blockeringslösningen, men var försiktig så att inte cellerna torkar innan de tillsätter antikroppspädningar. Tillsätt 30 μl av varje antikroppscocktailutspädning och inkubera i en fuktad kammare över natten vid 4 ° C.
- Förbered in situ tvättbuffert A och tvättbuffert B genom att lösa innehållet i en påse Buffert A och Buffer B-blandning i en slutlig volym på 1000 ml vatten vardera.
- Alternativt förbereder tvättbuffert A genom upplösning av 8,8 g NaCl, 1,2 g Tris-bas och 0,5 ml Tween-20 i 800 ml vatten. Justera pH till 7,4 med HCl och tillsätt till en slutvolym på 1000 ml.
- Alternativt bereder man tvättbuffert B genom upplösning av 5,84 g NaCl, 4,24 av Tris-bas och 26,0 g Tris-HCl i 500 ml vatten. Justera pH till 7,5 med användning av HCl. Tillsätt vatten till en slutlig volym på 1000 ml.
- FiltreraBåda lösningarna genom ett 0,22 μm filter.
- Tvätta bilderna 2 gånger i 5 min med 1x in situ tvättbuffert A i en Coplinburk vid RT med mild omrörning.
4. PLA Probes, Ligation och Amplification
- Förbered PLA-prober genom att spädning av anti-get PLUS och anti-kanin MINUS både 1: 5 i det kommersiella antikroppsutspädningsmedlet. Tappa av 1x in situ tvättbuffert A från objektglasen och sätt 30 μL av PLA-sondblandningen till varje plats. Inkubera 1 h vid 37 ° C i en förvärmd fuktad kammare.
OBS: Varje kombination av sekundära antikroppar PLUS och MINUS PLA-prober kan användas (anti-mus, anti-kanin, anti-get), så länge de applicerade primära antikropparna är upphöjda i olika arter och kombinationen av PLA-prober bör alltid Innehåller en PLUS-sond och en MINUS-sond. - Tvätta diabilden 2 gånger i 5 min med ~ 50-60 ml 1x in situ tvättbuffert A i en Coplinburk vid RT med mild omröring. </ Li>
- Förbered Ligation-Ligase-lösningen på is genom att tillsätta 1 μl Ligase till 39 μL Ligation-lösning och tillsätt 40 μL Ligation-Ligase-lösning till varje plats. Inkubera 30 minuter vid 37 ° C i en förvärmd fuktad kammare.
- Tvätta bilderna 2 gånger i 5 min med ~ 50-60 ml 1x in situ tvättbuffert A i en Coplin burk vid RT med försiktig omröring.
- Förbered Amplification-Polymeras-blandningen på is genom att späda Amplification stock-lösningen 1: 5 i vatten. Därefter tillsättes 0,5 μl polymeras till 39,5 μl 1x amplifieringslösning för varje plats.
OBS: Förstärkningsreagenserna är ljuskänsliga och bör skyddas mot direkt exponering för ljus. Amplifieringsreagenset kommer i fyra olika färger (RED: excitation 594 nm, emission 624 nm; FarRED: excitation 644 nm, emission 669 nm; ORANGE: excitation 554 nm, emission 576 nm; GREEN: excitation 501 nm, emission 523 nm) Se till att den tillgängliga mikroskopinställningen har sAvable excitation egenskaper och filter för att bilda dessa färger. - Tappa av 1x in situ tvättbuffert A och tillsätt 40 μl Amplification-Polymerase-blandning per punkt. Inkubera i 100 min vid 37 ° C i en förvärmd fuktad kammare.
5. Montering och bildbehandling
- Förbered 0,01x in situ tvättbuffert B genom tillsats av 1 ml 1x tvättbuffert B till 99 ml vatten.
- Tryck av Amplification-Polymerase-blandningen och tvätta diabilden 2 gånger i 10 minuter med 1x in situ tvättbuffert B i en Coplin-burk vid RT med försiktig omröring.
- Tvätta skivorna 1 minut i 0,01x tvättbuffert B.
- Tryck av överskott på 0,01x tvättbuffert B och torka glidbanorna runt fläckarna med en luddfri vävnad. Ta bort så mycket vätska från platsen som möjligt med hjälp av en pipett utan att röra på platsen, eller genom att luta gliden.
- Späd DAPI-innehållande monteringsmedium 1: 5 i monteringsmedium utan DAPI för att undvika överhettning av kärnorna.
- Lägg till 25-30 μL 1: 5 DAPI-hållande monteringsmedium till en 24 mm x 24 mm täckglas och plocka upp skyddsglaset med glidbanan, använd ett litet tryck för att säkerställa att det inte finns några fångade luftbubblor. Täta täckglaset med nagellack och vänta minst 15 minuter före bildbehandling.
- Analysera diabilderna med hjälp av ett (konfokalt) fluorescensmikroskop.
- Räkna antalet punktade PLA-signaler per cell i minst 4 förvärvade bildfält (20x objekt, räkna med minst 20 celler per tillstånd eller antikroppskombination, baserat på en effektberäkning med användning av ett förväntat medelvärde av 7 ± 5 signaler i de behandlade cellerna, Och 2 ± 2 signaler i de obehandlade cellerna, med en sannolikhet för ett typ I-fel på 0,05 och en effekt på 80%, som rapporterats tidigare 15 ).
OBS! Den bästa upplösningen uppnås genom förvärv av en Z-stack och deconvolution med mjukvarupaket ( t.ex. ImageJ, Leica Acquisitions Suite (LAS)). SignalenDet skulle lätt kunna urskiljas inom kärnvattensperimetern, såsom definieras av DAPI-färgningen. - Räkna inte signaler som tydligt förekommer utanför kärnorna. Vanligtvis resulterar NCS-behandling eller y-bestrålning i cirka 5-10 phosho-p53 / ATM PLA-signaler per cell. Kontrollerna med enkel antikropp kan ge viss bakgrundssignal, men detta bör inte överstiga 1-2 PLA-signaler per 1 av 20 celler.
- För publicering och presentationsändamål, ta bilder med hjälp av ett 40X eller 63X nedsänkt oljemål. Skivor kan förvaras vid 4 ° C och bör skyddas mot exponering för ljus.
- Räkna antalet punktade PLA-signaler per cell i minst 4 förvärvade bildfält (20x objekt, räkna med minst 20 celler per tillstånd eller antikroppskombination, baserat på en effektberäkning med användning av ett förväntat medelvärde av 7 ± 5 signaler i de behandlade cellerna, Och 2 ± 2 signaler i de obehandlade cellerna, med en sannolikhet för ett typ I-fel på 0,05 och en effekt på 80%, som rapporterats tidigare 15 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fosforylering av p53 vid rest Ser15 visade sig vara beroende av ATM-kinasaktivitet 16 . För att demonstrera och bekräfta specificiteten av PLA-tekniken på cytospinpreparat av suspensionscellkulturer visas det att induktion av DNA-skada genom 2 h NCS-behandling av BCR-ABL + B-ALL-celler som arresteras i G1-fasen av cellcykeln Resulterade i den specifika interaktionen mellan ATM och fosfor-Ser15-p53, som förväntat. Punkterande PLA-signaler observerades i kärnan hos majoriteten av celler behandlade med NCS ( Figur IB ) med i genomsnitt 7 PLA-signaler per cell 15 , medan dessa signaler inte detekterades i celler som inte behandlades med NCS ( Figur 1A ) . Förbehandling av cellerna med den specifika ATM-kinashämmaren KU55933 före induktion av DNA-skada minskade klart antalet PLA-signaler till ett medelvärde av2 PLA signaler / cell ( Figur 1C ). ATM-fosfo-Ser15-p53 PLA-signalerna detekterades exklusivt i kärnan, som förväntat. PLA-experiment, där antingen get-anti-ATM eller kanin-anti-fosfor-Ser15-p53-antikroppen utelämnades (kontroll med enkel antikropp) inte gav några specifika PLA-signaler ( figurerna 1D och 1E ). Kvantifiering och statistiska analyser av dessa resultat presenteras i Figur 1F (anpassad från Ochodnicka et al., J. Imunol. 2016) 15 .
Figur 1: In situ PLA för ATM / fosfo-Ser15-p53-interaktioner i BV173 humant BCR-ABL + celler. ( A ) Celler behandlades över natten med 5 | im Imatinib (specifik Abl-kinasinhibitor som provar en G1-fascellcykelE-arrestering i BCR-ABL + -celler) med imatinib och 50 ng / ml NCS, vilket inducerade DNA-skada ( B ) eller med imatinib och förbehandlades med 5 | im av den specifika ATM-kinashämmaren KU55933 före NCS-behandling ( C ) . Enkeltantikroppskontroll-PLA-experiment för get-anti-ATM (D) och kanin-anti-fosfor-Ser15-p53-antikroppar ( E ) visas. Röda fluorescenspunkta signaler representerar in situ protein närhet (<50 nm) av ATM och fos-Ser-5-p53 proteiner. Skalstänger = 5 μm (vita linjer). ( F ) Kvantifiering av antalet PLA-signaler i åtminstone 20 celler behandlade under olika experimentbetingelser visas. Horisontella linjer representerar medel; Statistiska signifikanser bestämdes genom envägsanalys av varians (ANOVA; *** p <0,001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport demonstreras att PLA kan användas för att bestämma och visualisera den specifika interaktionen mellan proteiner i suspensionscellkulturer. Observera är protokollet som beskrivs här inte begränsat till studien av DNA-reparationskomplex, men gäller även för att visualisera och kvantifiera andra protein-protein-interaktioner i suspensionscellkulturer. Det visas att ATM-kinaset interagerar med fosforylerad p53 i G1-arresterade BCR-ABL + B-ALL-celler när de utsätts för ett DNA-skada-inducerande medel. Tidigare användes PLA-tekniken av oss för att visa att ATM och FOXO1 transkriptionsfaktorn interagerades i BCR-ABL + B-ALL-celler, men denna interaktion resulterade sannolikt inte i den ATM-beroende fosforyleringen av FOXO1. Till stöd för PLA-data bekräftades det genom immunutfällning av endogena ATM / ATR-fosforylerade proteiner som, i motsats till de etablerade ATM-substraten p53 och NBS1, inte FOXO1 fosforyleras av ATM vid induktion av DNA skada 15 . Dessutom användes PLA-tillvägagångssättet framgångsrikt för att studera bildandet av mismatchreparationskomplex ( t.ex. interaktionen mellan MSH2 och MSH6) -interaktioner i olika humana B-celllymfomcellinjer (data ej visade). I dessa specifika sammanhang erbjöd PLA-tekniken ett alternativt tillvägagångssätt för att stödja våra resultat. Det visas att PLA tillåter den halvkvantitativa bedömningen av protein-protein-interaktioner mellan försöksbetingelserna och ger insikt i cell-till-cellvariationen i dessa interaktioner.
Analysen av specifika protein-protein-interaktioner i celler (exponerade för olika experimentella tillstånd) har typiskt varit utmanande och är föremål för experimentella artefakter. Generellt har proteinkomimmunutfällning varit den metod som valts men kräver ett stort antal celler och / eller proteiner, vilket väsentligen förbjuder analys av protein-protein-interaktioner i sällsynt cellTyper eller mellan proteiner som uttrycks i låga halter. Dessutom leder överuttryck av proteiner i (irrelevanta) cellmodeller ofta till överexpression artefakter, och resultat kan vara mycket svårt att bekräfta / validera in vivo eller i relevanta celltyper. Vidare kräver samimmunutfällning lys av celler och solubilisering av proteiner, vilket kan resultera i förlust av signal när protein-protein-interaktioner är svaga. Viktigt är att proteinkomimmunutfällning och jäst-två-hybrid-metoder inte kan detektera intra- och intercellellär variation i protein-proteininteraktioner. PLA-tekniken erbjuder ett attraktivt och enkelt alternativ för dessa tekniker, och ger viktig extra insikt. PLA kan användas i en standard (diagnostisk) laboratorieinställning eftersom det inte kräver högspecialiserade färdigheter utöver förmågan att utföra immunhistokemi.
Utvecklingen av superresolutionmikroskopi har gjort det möjligt att fördjupaAnalys av molekylär arkitektur av proteinkomplex. Denna teknik är emellertid inte lättillgänglig och innebär en särskild forskningsinfrastruktur. PLA erbjuder ett tillgängligt, enkelt och billigt alternativ tillvägagångssätt för studier av proteinkomplexbildning, med en jämförbar upplösning. En uppenbar begränsning av PLA-tekniken är tillgängligheten av specifika primära antikroppar upptagna i olika arter. Men flera företag erbjuder nu dedikerade (och validerade) antikroppskombinationer som effektiviserar användningen av PLA-tekniken.
Studier om proteins involvering vid reparation av DNA-skador och DNA-skadans respons är starkt beroende av analysen av IRIF-bildning och sammansättning. Det måste dock noteras att samlokalisering av proteiner i IRIF inte nödvändigtvis innebär direkta protein-protein-interaktioner. PLA-tekniken erbjuder en unik möjlighet att studera DNA-reparationsproteiner och bildandet av reparationskomplex i mer detalj. SpAtiotemporal analys av bildningen av sådana komplex kan kartläggas mer detaljerat med användning av PLA. Dessutom kommer det att göra det möjligt för forskare att bedöma bildandet av reparationskomplex i vävnader och kliniska prover av patienter som har behandlats med DNA-skadliga medel eller terapier, vilket kan ge en viktig inblick i effekten av dessa behandlingsmodaliteter och kan till och med hjälpa till vid valet Av patienter som drabbar mest av dessa behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Forskning i Guikema-laboratoriet finansieras av Innovationsforskningsincitamentprogrammet från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (VIDI-bidrag 016126355) och Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (projekt 252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
