Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55703
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Lymphoma and Myeloma Center Amsterdam (LYMMCARE)

Summary

Her er det demonstreret, hvordan in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan anvendes til at detektere og visualisere de direkte protein-proteininteraktioner mellem ATM og p53 i suspensionscellekulturer udsat for genotoksisk stress.

Abstract

DNA-skaderesponset orkestrerer reparationen af ​​DNA-læsioner, som forekommer spontant, forårsages af genotoksisk stress eller forekommer i sammenhæng med programmerede DNA-pauser i lymfocytter. Ataxia-Telangiectasia-muteret kinase (ATM), ATM- og Rad3-beslægtet kinase (ATR) og den katalytiske underenhed af DNA-afhængig proteinkinase (DNA-PKcs) er blandt de første, der aktiveres ved induktion af DNA-beskadigelse og er Centrale regulatorer af et netværk, der styrer DNA-reparation, apoptose og celleoverlevelse. Som en del af en tumorundertrykkende vej aktiverer ATM og ATR p53 gennem phosphorylering og derved regulerer den transkriptionelle aktivitet af p53. DNA-beskadigelse resulterer også i dannelsen af ​​såkaldt ioniserende strålingsinduceret foci (IRIF), som repræsenterer komplekser af DNA-beskadigelsesføler og reparationsproteiner, der akkumulerer ved DNA-beskadigelsesstederne, som visualiseres ved fluorescensmikroskopi. Samlokalisering af proteiner i IRIF'er indebærer imidlertid ikke nødvendigvis dIrect protein-proteininteraktioner, da opløsningen af ​​fluorescensmikroskopi er begrænset.

In situ Proximity Ligation Assay (PLA) er en ny teknik, der muliggør direkte visualisering af protein-protein interaktioner i celler og væv med hidtil uset specificitet og følsomhed. Denne teknik er baseret på den rumlige nærhed af specifikke antistoffer, som binder til proteiner af interesse. Når de forhørte proteiner er inden for ~ 40 nm, udløses en amplifikationsreaktion af oligonukleotider, som er konjugeret til antistofferne, og amplifikationsproduktet visualiseres ved fluorescensmærkning, hvilket giver et signal, som svarer til den intercellulære placering af de interagerende proteiner. Ved hjælp af den etablerede funktionelle vekselvirkning mellem ATM og p53 som et eksempel, er det her vist, hvordan PLA kan anvendes i suspensionscellekulturer til at studere de direkte interaktioner mellem proteiner, som er integrerende dele af DNA-skaderesponsen.

Introduction

DNA-skader udløser en stærkt reguleret serie af hændelser, der involverer protein-protein-interaktioner og post-translationelle modifikationer, der sikrer effektiv og hurtig reparation af DNA, hvorved der sikres genomisk integritet 1 . Typisk bliver DNA-reparation undersøgt i celler udsat for ioniserende stråling ved at overvåge dannelsen af ​​såkaldt ioniserende strålingsinduceret foci (IRIF) ved (konfokal) fluorescensmikroskopi. Mange DNA-reparations- og DNA-skadesfølerproteiner danner IRIF'er, som repræsenterer proteinkomplekser, der nucleerer ved chromatinsteder, der opretholder DNA-beskadigelse 2 , 3 . Placeringen og opløsningen af ​​IRIF'er over tid giver et vigtigt indblik i spatiotemporal organisering af DNA-reparation og kan indikere involvering af forskellige DNA-reparationsveje. Arten af ​​DNA-beskadigelsen og cellecyklusfasen, hvor skaden er opnået, bestemmer hvilken DNA-reparationsvej der aktiveres. fo For eksempel er homolog rekombination (HR) i celler, der er aktivt involveret i DNA-replikation (S-fase), den dominerende DNA-reparationsvej, hvorimod i celler i G1- eller G2 / M-fasen af ​​cellecyklussen, Homolog end-joining (NHEJ) reparationsvej dominerer. En af de tidligste hændelser, der følger med DNA-beskadigelse, er aktiveringen af ​​DNA-beskadigende kinaser Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som hovedsagelig er aktiv i Cellecyklets G1- og G2 / M-faser og regulerer NHEJ, Og Ataxia Telangiectasia og Rad3-relateret protein (ATR), som virker i S-fase ved at aktivere HR. Både ATM og ATR er meget pleiotropiske kinaser, der phosphorylerer mange proteiner, der er involveret i DNA-reparation, celledød og overlevelse 4 . Begge kinaser har vist sig at phosphorylere og aktivere tumor-suppressorproteinet p53 efter eksponeringen for genotoksisk stress, hvilket indikerer, at disse kinaser er opstrøms mediatorer af en svingende tumorundertrykkende signalakse"Xref"> 5 , 6 .

Dannelsen og sammensætningen af ​​IRIF'er vurderes typisk ved at bestemme co-lokalisering af forskellige proteiner ved anvendelse af dobbeltfarve immunofluorescensfarvning og mikroskopi, men ikke alle proteiner, som er en del af reparationsproteinkomplekser, danner IRIF'er, hvilket begrænser anvendeligheden af ​​denne fremgangsmåde. Desuden er (konfokal) immunofluorescensmikroskopi begrænset af diffraktionsegenskaberne af lys, hvilket resulterer i en ret dårlig rumlig opløsning på ca. 200-300 nm, der overstiger størstedelen af ​​de fleste subcellulære strukturer, hvilket i det væsentlige forbyder direkte undersøgelse af protein-proteininteraktioner ved Det molekylære niveau. Som sådan er co-lokalisering af immunofluorescensfarvningsmønstre som detekteret af (konfokal) fluorescensmikroskopi ikke nødvendigvis indicative for direkte protein-protein-interaktioner. For nylig er der udviklet nye superopløsnings teknologier, såsom tredimensionelle strukturerTured illuminationsmikroskopi (3D-SIM) 7 , som med succes blev brugt til at studere 53BP1 og BRCA1 IRIF-dannelse ved nano-skala-detaljer, hvilket afslørede de rumlige fordelingsegenskaber for disse proteiner, som ikke kunne detekteres ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi 8 .

Adskillige andre metoder kan anvendes til at detektere protein-protein-interaktioner in vivo , såsom co-immunopræcipitation, pull-down-metoder og gær-to-hybrid screeningsmetoder. Imidlertid er disse teknikker ret besværlige, kræver store mængder af celler eller proteiner eller involverer overekspression af proteiner, som introducerer eksperimentelle artefakter. For nylig er der udviklet en ny teknik, der muliggør visualisering og kvantificering af protein-protein-interaktioner in situ ( dvs. i celler og i væv), som kaldes Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . prImary-antistoffer, som genkender to proteiner af interesse, detekteres af sekundære antistoffer, som er konjugeret til oligonukleotider (såkaldte PLA-prober). Hvis de to forskellige sekundære antistoffer er tilstrækkeligt tætte på grund af interaktioner mellem proteinerne genkendt af de primære antistoffer, hybridiserer de konjugerede oligonukleotider og kan ligeres til dannelse af et lukket cirkulært DNA-substrat. Dette cirkulære substrat amplificeres efterfølgende ved hjælp af rullende cirkelamplifikation og visualiseres med fluorochrom-konjugerede komplementære oligonukleotider. Ved anvendelse af PLA bevares den subcellulære lokalisering af protein-proteininteraktionen, idet det fluorescensmærkede rullecirkelforstærkelsesprodukt forbliver fastgjort til PLA-proberne. Opløsningen af ​​dette assay er <50 nm, baseret på den konstatering, at diameteren af ​​et antistof er ca. 7-10 nm 11 . Rulcirkelforstærkning kan kun finde sted, hvis to par antistoffer (primær + seconDary) fysisk interagere inden for perimeteren, der er defineret af deres størrelse (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalforstærkningstrinnet øger følsomheden af ​​PLA-analysen og muliggør detektion af interaktioner af knap udtrykte proteiner. PLA genererer punkterede, foci-lignende signaler, der kan kvantificeres pr. Cellebasis, hvormed den intra- og intercellulære variation i protein-protein-interaktioner kan vurderes.

Dannelsen og sammensætningen af ​​DNA-reparationskomplekser og IRIF'er studeres for det meste i adhærente cellelinjer, såsom den humane knogle osteosarkomepithelcellelinie U2OS, den humane embryonale nyrelinje HEK293 og den retinale pigmentepitelcellelinie RPE-1, som er hurtig- Voksende og let at transfektere. Suspension celle kulturer sådanne lymfoide og myeloid cellelinier anvendes mindre hyppigt, da disse er mindre modtagelige for transfektion og generelt ikke klæber til coverlips, hvilket således kræver yderligere / alternativ stEps til billedbehandling. Opløsningen af ​​DNA-beskadigelse er imidlertid meget relevant i forbindelse med lymfoide og myelide maligniteter, da DNA-skaderesponset ofte påvirkes af genomiske (driver) aberrationer i disse tumorer og spiller en afgørende rolle i den ondartede transformation af normal lymfoid og myeloid ( Stamceller) celler 12 , 13 , 14 .

Denne protokol beskriver, hvordan PLA kan anvendes til at vurdere og kvantificere protein-proteininteraktioner efter induktionen af ​​DNA-beskadigelse i suspensionscellekulturer. Her udføres PLA for at bestemme og visualisere interaktionerne mellem ATM og p53 ved DNA-beskadigelse i humane B-celle-leukæmiceller, som induceres at gennemgå en G1-fase cellecyklusarrest. Bemærk, at protokollen, der præsenteres her, ikke er begrænset til at studere ATM- og p53-interaktioner i G1-arresterede leukæmiceller, men kan også anvendes til at visualisere andre protein-proteininterI forskellige celletyper og suspensionscellekulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Behandling af celler og DNA-skadeinduktion

  1. Kultur de humane BCR-ABL + B-celle-akutte lymfoblastiske cellelinier BV173 eller SUP-B15 i IMDM suppleret med 20% FCS, 50 μM p-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære på 5% CO2. Tæl celler og plade ved 2 x 106 celler / ml i 6-brøndsplader ved 5 ml / brønd.
    BEMÆRK: Suspension cellelinjer af forskellig oprindelse kan eventuelt anvendes.
  2. For at arrestere BCR-ABL + B-ALL-cellerne i G1-fasen af ​​cellecyklussen, tilsættes 5 μM imatinibmetansulfonat (STI571) og inkuberes natten over.
    1. Fjern eventuelt dette trin, når du studerer protein-proteininteraktioner i løbet af cellecyklusen eller i BCR-ABL-negative celletyper.
  3. Inducer DNA-beskadigelse ved at tilføje 50 ng / ml neocarzinostatin (NCS) til kulturen og inkuber i 2 timer.
    1. AlternativtInducerer DNA-beskadigelse ved at bestråle cellerne ved anvendelse af en radioaktiv kilde [ 137 Cs] ved 0,5 Gy / min ved en dosis på 5 Gy. Efter bestråling, lad cellen gendanne i 2 timer ved 37 ° C i en atmosfære på 5% CO2.
  4. Eventuelt, for at vurdere involveringen af ​​ATM-kinaseaktivitet som reaktion på DNA-beskadigelse, tilsættes 5 μM af ATM-kinaseinhibitoren KU55933 før tilsætning af NCS eller bestrålingsbehandlingen.
  5. Forbered 1x PBS + 10% BSA ved at lægge 5 g fraktion-V BSA oven på 50 ml 1x PBS i en bæger- eller Erlenmeyer-kolbe og lad sidde ved stuetemperatur, indtil BSA er opløst. Skud ikke eller rør, da dette vil forårsage omfattende skumdannelse. Filter langsomt gennem et 0,22 μm filter og hold på is.
  6. Høstceller og vask to gange med iskold 1x PBS. Tæl cellerne og resuspender ved 2 x 106 / ml i 1x PBS + 10% BSA. Hold celler på is.

2. Cytocentrifugering, fixering og permeabilisering

  1. Forbered den4% paraformaldehydopløsning i 1x PBS frisk. Tilsæt 2 g PFA til 50 ml 1x PBS og inkuber i et 55 ° C rystende vandbad, indtil opløsningen er klar. Filtrer opløsningen gennem et 0,22 μm filter og opbevar ved RT indtil brug.
    BEMÆRK: Eventuelt kan 4% PFA fixativet opbevares frosset ved -20 ° C. Efter frysning, tø kun én gang til brug. Ellers kan 4% PFA-opløsningen i PBS købes direkte.
  2. Forsigtig polere 76 mm x 26 mm mikroskopiske dias med fnugfri væv og affedt dem ved at placere i 96% ethanol i en Coplin-krukke i 5 minutter. Lad mikroskopien glide lufttørre i 10 minutter.
  3. Saml mikroskopi dias ind i cytospin / cytology tragterne med et areal på 6 mm. Pre-coat glider ved at pipettere 50 μl 1x PBS + 10% BSA i hver tragt og centrifuge i 1 min ved 500 omdr./min.
  4. Tilsæt 100 μl af cellesuspensionen (svarende til 0,2 x 106 celler) til hver tragt og centrifuge i 5 minutter ved 500 omdrejninger pr. Minut. For hver antistofkombination, ved leAst 4 præparater er nødvendige (dobbelt-antistof eksperiment; to enkelt-antistof kontroller; ingen antistoffer kontrol).
  5. Tag forsigtigt togene af og sørg for ikke at røre ved pletterne. Fortsæt med prøvefiksering med det samme.
    1. Lad slidene lufttørre i mindst 30 minutter. Efter lufttørring sættes gliderne individuelt i aluminiumsfolie og opbevares ved -20 ° C indtil brug. Når du bruger frosne præparater, skal du sørge for at optøne gliderne, der er pakket i et papirhåndklæde for at forhindre åben kondensering på gliderne.
  6. Tegn en cirkel (omtrentlig diameter 15-20 mm) rundt om stedet ved hjælp af en PAP pen væskebloker (5 mm tip).
  7. Tilsæt 50 μl 4% PFA-fikseringsopløsning til hvert punkt og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
  8. Vask cellerne 3 gange i 5 minutter med 1x PBS i en Coplin-krukke ved stuetemperatur ved forsigtig omrøring.
  9. Tør gliderne rundt om pletterne med et fnugfri væv og fjern så meget væske fra stedet som muligt ved hjælp af en piKæledyr uden at røre stedet, eller ved at vippe glideren. Tilsæt 50 μl 0,25% Triton-X i 1x PBS til hvert sted og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur uden omrøring.
  10. Vask diaserne 3 gange i 5 minutter i ~ 50-60 ml 0,05% Tween-20 i TBS (TBS-T) i en Coplin-krukke ved stuetemperatur ved forsigtig omrøring. 10 dias kan behandles samtidigt på denne måde.

3. Blokerende og primær antistofinkubering

  1. Tapp off TBS-T og tør gliderne rundt om pletterne med et fnugfri væv. Fjern så meget væske fra stedet som muligt ved hjælp af en pipette uden at røre stedet eller ved at vippe glideren. Vortex kortvarig opløsningen og tilsæt en dråbe (~ 40 μL) til hvert sted. Inkubér i 1 time ved 37 ° C i et forvarmet befugtet kammer.
  2. Forbered antistofcocktailen ved at blande gede-anti-ATM'en ved 1: 1000 og kanin-anti-phospho-Ser15-p53 ved 1: 100 i kommercielt antistoff-fortyndingsmiddel, vortexantistofffortyndingsmiddel før anvendelse. Til kontrolforsøgTs, forberede antistofffortyndinger indeholdende kun gede-anti-ATM og kun kanin-anti-phospho-Ser15-p53-antistoffet (enkelt-antistofkontrol).
  3. Tap af blokeringsopløsningen, men pas på ikke at lade cellerne tørre før tilsætning af antistoffet fortyndinger. Tilsæt 30 μl af hver antistofcocktailfortynding og inkuber i et fugtigt kammer natten over ved 4 ° C.
  4. Forbered in situ vaskbuffer A og vaskebuffer B ved at opløse indholdet af en pose af buffer A og buffer B blanding i et slutvolumen på 1.000 ml vand hver.
    1. Alternativt fremstilles vaskebuffer A ved at opløse 8,8 g NaCl, 1,2 g Tris-base og 0,5 ml Tween-20 i 800 ml vand. Juster pH til 7,4 ved anvendelse af HCI og tilsæt til et slutvolumen på 1.000 ml.
    2. Alternativt fremstilles vaskbuffer B ved at opløse 5,84 g NaCl, 4,24 i Tris-base og 26,0 g Tris-HCI i 500 ml vand. Juster pH til 7,5 ved anvendelse af HCI. Tilsæt vand til et slutvolumen på 1.000 ml.
    3. FilterBegge løsninger gennem et 0,22 μm filter.
  5. Vask diaserne 2 gange i 5 minutter med 1x in situ vaskebuffer A i en Coplin-krukke ved RT med forsigtig omrøring.

4. PLA Probes, Ligation og Amplification

  1. Forbered PLA prober ved fortynding af anti-geit PLUS og anti-kanin MINUS både 1: 5 i det kommercielle antistoffens fortyndingsmiddel. Tapp 1x in situ vaskebuffer A ud fra lysbilledet og tilsæt 30 μL af PLA-probeblandingen til hvert sted. Inkubér 1 time ved 37 ° C i et forvarmet befugtet kammer.
    BEMÆRK: Enhver kombination af sekundære antistoffer PLUS og MINUS PLA-prober kan anvendes (anti-mus, anti-kanin, anti-ged), så længe de påførte primære antistoffer hæves i forskellige arter, og kombinationen af ​​PLA-prober bør altid Indeholder en PLUS-probe og en MINUS-probe.
  2. Vask diaserne 2 gange i 5 minutter med ~ 50-60 ml 1x in situ vaskebuffer A i en Coplin-krukke ved stuetemperatur ved forsigtig omrøring. </ Li>
  3. Forbered Ligation-Ligase-opløsningen på is ved at tilsætte 1 μL Ligase til 39 μL Ligation-opløsning og tilsæt 40 ​​μL Ligation-Ligase-opløsning til hvert sted. Inkubér 30 minutter ved 37 ° C i et forvarmet befugtet kammer.
  4. Vask diaserne 2 gange i 5 minutter med ~ 50-60 ml 1x in situ vaskebuffer A i en Coplin-krukke ved stuetemperatur ved forsigtig omrøring.
  5. Forbered Amplification-Polymerase-blandingen på is ved fortynding af Amplification stock-opløsningen 1: 5 i vand. Derefter tilsættes 0,5 μl polymerase til 39,5 μl 1x amplifikationsopløsning for hvert punkt.
    BEMÆRK: Amplificeringsreagenserne er lysfølsomme og bør beskyttes mod direkte eksponering for lys. Amplificeringsreagenset kommer i fire forskellige farver (RED: excitation 594 nm, emission 624 nm; FarRED: excitation 644 nm, emission 669 nm; ORANGE: excitation 554 nm, emission 576 nm; GREEN: excitation 501 nm, emission 523 nm) Sørg for at den tilgængelige mikroskopi opsætning har sUtilgængelige exciteringsegenskaber og filtre til at billedere disse farver.
  6. Tryk på 1x in situ vaskebuffer A, og tilsæt 40 ​​μl Amplification-Polymerase-blanding pr. Punkt. Inkubér i 100 minutter ved 37 ° C i et forvarmet befugtet kammer.

5. Montering og billeddannelse

  1. Forbered 0,01x in situ vaskebuffer B ved at tilsætte 1 ml 1x vaskbuffer B til 99 ml vand.
  2. Tap off Amplification-Polymerase-blandingen og vask skinnerne 2 gange i 10 minutter med 1x in situ vaskebuffer B i en Coplin-krukke ved stuetemperatur ved forsigtig omrøring.
  3. Vask diaserne 1 min i 0,01x vaskebuffer B.
  4. Tap off overskydende 0,01x vaskebuffer B og tør gliderne rundt om pletterne med et fnugfri væv. Fjern så meget væske fra stedet som muligt ved hjælp af en pipette uden at røre stedet eller ved at vippe glideren.
  5. Fortynd DAPI-indeholdende monteringsmedium 1: 5 i monteringsmedium uden DAPI for at undgå overskridelse af kernerne.
  6. Tilsæt 25-30 μL 1: 5 DAPI-holdigt monteringsmedium til en 24 mm x 24 mm dæksel og tag dækslet op med glideren, læg let tryk for at sikre, at der ikke er fanget luftbobler. Tæt dækslet med neglelak og vent mindst 15 minutter før billeddannelse.
  7. Analysér diaserne ved hjælp af et (konfokalt) fluorescensmikroskop.
    1. Tæl antallet af punkterede PLA-signaler pr. Celle i mindst 4 overførte billedfelter (20x objektiv, tæller mindst 20 celler pr. Tilstand eller antistofkombination baseret på en effektberegning ved anvendelse af et forventet gennemsnit på 7 ± 5 signaler i de behandlede celler, Og 2 ± 2 signaler i de ubehandlede celler med en sandsynlighed for en type I-fejl på 0,05 og en effekt på 80% som tidligere rapporteret 15 ).
      BEMÆRK: Den bedste løsning opnås ved at erhverve en Z-stack og deconvolution ved hjælp af softwarepakker ( f.eks . ImageJ, Leica Acquisitions Suite (LAS)). SignaDet bør let kunne mærkes inden for den nukleare omkreds, som defineret ved DAPI-farvningen.
    2. Tæl ikke signaler, der tydeligt fremstår uden for kernerne. Typisk resulterer NCS-behandling eller y-bestråling i ca. 5-10 phosho-p53 / ATM PLA signaler pr. Celle. Kontrolerne med enkelt antistof kan give noget baggrundssignal, men dette bør ikke overstige 1-2 PLA signaler pr. 1 ud af hver 20 celler.
    3. Til offentliggørelse og præsentationsformål optager du billeder ved brug af et 40X eller 63X nedsænkningsmål. Slides kan opbevares ved 4 ° C og skal beskyttes mod udsættelse for lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fosforylering af p53 ved rest Ser15 viste sig at være afhængig af ATM-kinaseaktivitet 16 . For at demonstrere og bekræfte specificiteten af ​​PLA-teknikken på cytospinpræparater af suspensionscellekulturer, er det vist, at induktion af DNA-beskadigelse ved 2 timers NCS-behandling af BCR-ABL + B-ALL-celler arresteret i G1-fasen af ​​cellecyklussen Resulterede i den specifikke interaktion mellem ATM og phospho-Ser15-p53 som forventet. Punctate PLA-signaler blev observeret i kernen i hovedparten af ​​celler behandlet med NCS ( Figur 1B ) med et gennemsnit på 7 PLA signaler pr. Celle 15 , hvorimod disse signaler ikke blev detekteret i celler, der ikke blev behandlet med NCS ( Figur 1A ) . Forbehandling af cellerne med den specifikke ATM-kinaseinhibitor KU55933 forud for induktion af DNA-beskadigelse reducerede klart antallet af PLA-signaler til et gennemsnit af2 PLA signaler / celle ( figur 1C ). ATM-phospho-Ser15-p53 PLA signalerne blev udelukkende detekteret i kernen som forventet. PLA-eksperimenter, hvor enten gede-anti-ATM eller kanin-anti-phospho-Ser15-p53-antistoffet blev udeladt (kontrol med enkelt-antistof) ikke gav nogen specifikke PLA-signaler ( figur 1D og 1E ). Kvantificering og statistiske analyser af disse resultater er præsenteret i figur 1F (tilpasset af Ochodnicka et al., J. Immunol. 2016) 15 .

figur 1
Figur 1: In situ PLA for ATM / phospho-Ser15-p53-interaktioner i BV173 humant BCR-ABL + celler. ( A ) Celler blev behandlet natten over med 5 μM imatinib (specifik Abl-kinaseinhibitor, der fremkalder en G1-fase cellecyklusE-arrest i BCR-ABL + -celler) med imatinib og 50 ng / ml NCS, hvilket inducerede DNA-beskadigelse ( B ) eller med imatinib og forbehandlet med 5 μM af den specifikke ATM-kinaseinhibitor KU55933 inden NCS-behandling ( C ) . Enkelt-antistof-kontrol-PLA-eksperimenter for gede-anti-ATM (D) og kanin-anti-phospho-Ser15-p53-antistoffer ( E ) er vist. Røde fluorescens punkterede signaler repræsenterer in situ protein nærhed (<50 nm) af ATM og phospho-Ser15-p53 proteiner. Skalestænger = 5 μm (hvide linjer). ( F ) Kvantificering af antallet af PLA signaler i mindst 20 celler behandlet under forskellige forsøgsbetingelser er vist. Horisontale linjer repræsenterer midler; Statistiske signifikanser blev bestemt ved envejsanalyse af varians (ANOVA; *** p <0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapport er det påvist, at PLA kan anvendes til at bestemme og visualisere den specifikke interaktion mellem proteiner i suspensionscellekulturer. Bemærk, at den her beskrevne protokol ikke er begrænset til undersøgelsen af ​​DNA-reparationskomplekser, men også gælder for visualisering og kvantificering af andre protein-protein-interaktioner i suspensionscellekulturer. Det er vist at ATM-kinasen interagerer med phosphoryleret p53 i G1-arresterede BCR-ABL + B-ALL-celler, når de udsættes for et DNA-skadefremkaldende middel. Tidligere blev PLA-teknikken brugt af os for at vise, at ATM og FOXO1-transkriptionsfaktoren interagerede i BCR-ABL + B-ALL-celler, men denne interaktion resulterede sandsynligvis ikke i den ATM-afhængige phosphorylering af FOXO1. Til støtte for PLA-data blev det bekræftet ved immunpræcipitation af endogene ATM / ATR-phosphorylerede proteiner, som i modsætning til de etablerede ATM-substrater p53 og NBS1 ikke phosphoryleres FOXO1 ved ATM ved induktion af DNA skade 15 . Derudover blev PLA-fremgangsmåden anvendt succesfuldt for at studere dannelsen af ​​mismatch reparationskomplekser ( fx interaktionen mellem MSH2 og MSH6) interaktioner i forskellige humane B-celle lymfomcellelinier (data ikke vist). I disse særlige sammenhænge tilbød PLA-teknikken en alternativ tilgang til at understøtte vores resultater. Det påvises, at PLA tillader den semikvantitative vurdering af protein-protein-interaktioner mellem forsøgsbetingelser og giver indsigt i celle-til-cellevariationen i disse interaktioner.

Analysen af ​​specifikke protein-protein-interaktioner i celler (udsat for forskellige eksperimentelle tilstande) har typisk været udfordrende og er genstand for eksperimentelle artefakter. Generelt har protein-co-immunpræcipitation været den valgte metode, men kræver stort antal celler ogleller proteiner, hvilket i det væsentlige forbyder analyse af protein-protein-interaktioner i sjælden celleTyper eller mellem proteiner, der udtrykkes i lave niveauer. Desuden fører overekspression af proteiner i (irrelevante) celleliniemodeller ofte til overekspression artefakter, og resultater kan være meget vanskelige at bekræfte / validere in vivo eller i de relevante celletyper. Samme immunpræcipitation kræver også lys af celler og opløseliggørelse af proteiner, som kan resultere i tab af signal, når protein-protein-interaktioner er svage. Det er vigtigt, at protein-co-immunopræcipitation og gær-to-hybrid-metoder ikke er i stand til at påvise intra- og intercellulær variation i protein-proteininteraktioner. PLA-teknikken giver et attraktivt og nemt alternativ til disse teknikker, og giver vigtig ekstra indsigt. PLA kan anvendes i en standard (diagnostisk) laboratorieindstilling, da den ikke kræver meget specialiserede færdigheder ud over evnen til at udføre immunhistokemi.

Udviklingen af ​​superopløsningsmikroskopi har muliggjort dybdenAnalyse af molekylær arkitektur af proteinkomplekser. Denne teknik er imidlertid ikke let tilgængelig og indebærer en dedikeret forskningsinfrastruktur. PLA tilbyder en tilgængelig, enkel og billig alternativ tilgang til undersøgelsen af ​​proteinkompleksdannelse med en sammenlignelig opløsning. En åbenbar begrænsning af PLA-teknikken er tilgængeligheden af ​​specifikke primære antistoffer opdraget i forskellige arter. Imidlertid tilbyder flere virksomheder nu dedikerede (og validerede) antistofkombinationer, som strømlinerer anvendelsen af ​​PLA-teknikken.

Undersøgelser af inddragelse af proteiner i DNA-skadereparation og DNA-skadesresponsen er stærkt afhængige af analysen af ​​IRIF-dannelse og sammensætning. Det skal dog bemærkes, at co-lokalisering af proteiner i IRIF ikke nødvendigvis indebærer direkte protein-proteininteraktioner. PLA-teknikken giver en enestående mulighed for at studere DNA-reparationsproteiner og dannelsen af ​​reparationskomplekser mere detaljeret. SpAtiotemporal analyse af dannelsen af ​​sådanne komplekser kan kortlægges mere detaljeret ved anvendelse af PLA. Desuden vil det give forskere mulighed for at vurdere dannelsen af ​​reparationskomplekser i væv og kliniske prøver af patienter, der er blevet behandlet med DNA-skadelige midler eller terapier, hvilket kan give et vigtigt indblik i effekten af ​​disse behandlingsformer og kan endda hjælpe med udvælgelsen Af patienter, der vil få mest ud af disse behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskning i Guikema laboratoriet finansieres af Innovationsforskningsincentiverne fra Den Hollandske Organisation for Videnskabelig Forskning (VIDI-bevilling 016126355) og Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (projekt 252).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV173 cell line DSMZ AC-20 BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line DSMZ ACC-389 BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco (Life Technologies) 21980-032
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich F7524 lot #: 064M3396
L-glutamine Gibco (Life Technologies) 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco (Life Technologies) 15140-122
imatinib methanesulfonate LC Laboratories I-5508 Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin Sigma Aldrich N9162 Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933 Selleckchem S1092 Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides Waldemar Knittel VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker Sigma Aldrich Z377821-1EA
Cytospin funnel Q Path Labonord SAS 003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit Sigma Aldrich DUO92105 Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM Bethyl Laboratories A300-136A PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 Cell Signaling Technology 9284 We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Vectashield antifading mounting medium Vector Labs H-1000
4% paraformaldehyde in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Also available from various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
  2. Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
  3. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
  4. Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
  5. Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
  6. Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
  9. Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
  10. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  11. Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
  12. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  13. Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
  14. Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
  15. Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
  16. Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).

Tags

Biokemi udgave 124 DNA-beskadigelse DNA-reparation ATM p53 suspensionscellekultur BCR-ABL + B-celle akut lymfoblastisk leukæmi protein-proteininteraktion,
Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der … More

Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der Veen, A., de Wilde, G., Maas, C., Guikema, J. E. J. Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (124), e55703, doi:10.3791/55703 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter