Summary
여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.
Abstract
DNA 손상 반응은 자발적으로 발생하거나, 유전 독성 스트레스에 의해 유발되거나, 또는 림프구에서 프로그램 된 DNA 붕괴의 문맥에서 나타나는 DNA 병변의 수리를 조율합니다. Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM 및 Rad3 관련 키나아제 (ATR) 및 DNA 의존성 단백질 키나제 (DNA-PKcs)의 촉매 서브 유닛은 DNA 손상의 유도시 활성화되는 첫 번째 물질이며, DNA 복구, 세포 사멸 및 세포 생존을 조절하는 네트워크의 중앙 조절 자. 종양 억제 경로의 일환으로 ATM과 ATR은 인산화를 통해 p53을 활성화시킴으로써 p53의 전사 활성을 조절합니다. DNA 손상은 또한 형광 현미경에 의해 시각화 된 DNA 손상 부위에 축적되는 DNA 손상 센서 및 수리 단백질의 복합체를 나타내는 소위 이온화 방사선 유도 초점 (IRIF)의 형성을 초래한다. 그러나 IRIFs에서 단백질의 공동 위치 화는 반드시 d직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 형광 현미경 검사의 해상도가 제한되어 있기 때문에 가능합니다.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA)는 전례가없는 특이성과 민감성으로 세포와 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 직접 시각화 할 수있는 새로운 기술입니다. 이 기술은 관심있는 단백질에 결합하는 특정 항체의 공간적 근접성을 기반으로합니다. 질문 단백질이 ~ 40 nm 내에 있으면 증폭 반응은 항체에 접합 된 올리고 뉴클레오타이드에 의해 촉발되고 증폭 생성물은 형광 표지에 의해 시각화되어 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치에 해당하는 신호를 생성합니다. 예를 들어 ATM과 p53 사이에 확립 된 기능적 상호 작용을 사용하여 PLA가 DNA 손상 반응의 핵심 부분 인 단백질 간의 직접적인 상호 작용을 연구하기 위해 서스펜션 세포 배양에서 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다.
Introduction
DNA 손상은 단백질 - 단백질 상호 작용 및 DNA의 효율적이고 신속한 수리를 보장하는 번역 후 변형을 포함하는 고도로 규제 된 일련의 사건을 유발하여 게놈 무결성을 보호합니다 1 . 전형적으로, DNA 수리는 (공 초점) 형광 현미경에 의해 소위 이온화 방사선 유발 성 초점 (IRIF)의 형성을 모니터링함으로써 이온화 방사선에 노출 된 세포에서 연구된다. 많은 DNA 복구 및 DNA 손상 감지 단백질이 IRIF를 형성하는데, 이는 DNA 손상을지지하는 염색질 부위에서 핵 생성하는 단백질 복합체를 나타냅니다 2 , 3 . 시간 경과에 따른 IRIF의 위치와 해상도는 DNA 복구의 시공간적 조직에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 다양한 DNA 복구 경로의 참여를 나타낼 수 있습니다. DNA 손상의 특성과 손상이 이루어진 세포주기 단계에 따라 어떤 DNA 복구 경로가 활성화되는지가 결정됩니다. 포 예를 들어, DNA 복제 (S 상)에 적극적으로 관여하는 세포에서 상 동성 재조합 (homologous recombination, HR)이 세포 복제의 G1 또는 G2 / M 상 세포에서 우세한 DNA 복구 경로 인 반면, homologous end-joining (NHEJ) repair pathway가 우세하다. DNA 손상 후 가장 초기의 사건 중 하나는 DNA 손상 감지 키나제 인 Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM)의 활성화로 세포주기의 G1- 및 G2 / M- 상에 주로 활성화되고 NHEJ를 조절하며, 및 Ataxia Telangiectasia 및 Rad3 관련 단백질 (ATR) (HR 활성화에 의해 S 상으로 작용 함). ATM과 ATR은 모두 DNA 복구, 세포 사멸 및 생존과 관련된 많은 단백질을 인산화시키는 매우 pleiotropic kinases입니다. 두 키나아제 모두 유전 독성 스트레스에 노출 된 후 종양 억제 단백질 p53을 인산화시키고 활성화시키는 것으로 나타 났는데, 이는 이들 키나아제가 중추적 인 종양 억제 시그널링 축의 상류 중재자임을 나타낸다"xref"> 5 , 6 .
IRIF의 형성과 구성은 전형적으로 이중 색 면역 형광 염색법과 현미경 검사법을 사용하여 여러 단백질의 공존을 결정함으로써 평가되지만 수리 단백질 복합체의 일부인 모든 단백질이 IRIF를 형성하는 것은 아니며이 접근법의 적용 가능성을 제한합니다. 또한, (공 초점) 면역 형광 현미경 검사는 빛의 회절 특성에 의해 제한되어 약 200-300 nm의 공간 분해능을 나타내며, 대부분의 세포 하부 구조의 크기를 초과하며, 단백질 - 단백질 상호 작용의 직접적인 조사를 기본적으로 금지합니다 분자 수준. 이와 같이, (공 초점) 형광 현미경에 의해 검출 된 면역 형광 염색 패턴의 공동 위치 화는 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 나타내는 것은 아닙니다. 최근에, 3 차원 구조와 같은 새로운 초 - 해상도 기술이 개발되었다공 초점 레이저 스캐닝 현미경으로 검출 할 수 없었던 이들 단백질의 공간 분포 특성을 밝혀내는, 나노 스케일의 53BP1 및 BRCA1 IRIF 형성을 성공적으로 연구하는데 사용 된 tured illumination microscopy (3D-SIM) 7 .
공동 면역 침전법, 풀다운 방법 및 효모 2 하이브리드 스크리닝 방법과 같은 생체 내에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 데 몇 가지 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 다소 번거롭고 다량의 세포 또는 단백질을 필요로하거나 단백질의 과발현을 포함하여 실험적 인공물을 유발합니다. 보다 최근에는 Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 이라고 불리는 인 - 시튜 ( 즉 , 세포와 조직에서)의 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 새로운 기술이 개발되었습니다. Pr관심있는 두 단백질을인지하는 imary 항체는 올리고 뉴클레오티드 (이른바 PLA 프로브)에 접합 된 2 차 항체에 의해 검출된다. 2 개의 상이한 2 차 항체가 1 차 항체에 의해 인식되는 단백질 사이의 상호 작용으로 인해 충분히 가깝다면, 접합 된 올리고 뉴클레오티드는 하이브리드 화되고 폐쇄 된 원형 DNA 기질을 형성하도록 연결될 수있다. 이 순환 기질은 롤링 서클 증폭에 의해 증폭되고, 형광색 - 결합 된 상보적인 올리고 뉴클레오타이드로 가시화된다. PLA를 사용하면, 단백질 - 단백질 상호 작용의 세포 내 위치는 형광 라벨 된 롤링 서클 증폭 - 제품이 PLA 프로브에 부착 된 상태로 보존된다. 이 분석법의 분해능은 항체의 직경이 약 7-10 nm 인 것으로 밝혀지면 <50 nm입니다. 롤링 서클 증폭은 두 쌍의 항체 (primary + secondary)는 크기 (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm)로 정의 된 경계 내에서 물리적으로 상호 작용합니다. 신호 증폭 단계는 PLA 분석의 감도를 증가시키고 거의 발현되지 않은 단백질의 상호 작용을 검출 할 수있게합니다. PLA는 세포 간 기초 (per cell basis)로 정량화 할 수있는 뾰족한, 초점과 같은 신호 패턴을 생성함으로써 단백질 - 단백질 상호 작용의 세포 내 및 세포 간 변이를 평가할 수있다.
DNA 복구 복합체 및 IRIF의 형성 및 조성은 인간 골육종 육종 상피 세포주 U2OS, 인간 배아 신장 세포주 HEK293 및 망막 색소 상피 세포주 RPE-1과 같은 접착 성 세포주에서 주로 연구된다. 성장하고 transfect하기 쉽습니다. 서스펜션 세포 배양은 림프 성 및 골수성 세포주와 같이 덜 사용되는데, 이들은 트랜스 팩션에 덜 민감하고 일반적으로 커버 슬립을 준수하지 않으므로 추가 / 대체 스트레스가 필요하다.이미징을위한 eps. 그러나 DNA 손상 반응은이 종양의 게놈 (운전자) 수차에 의해 자주 영향을 받기 때문에 림프계 및 골수 악성 종양의 맥락에서 매우 관련이 있으며 정상 림프구 및 골수이의 악성 형질 전환에 중추적 인 역할을한다 ( 전구 세포 (12 , 13 , 14) .
이 프로토콜은 정지 세포 배양에서 DNA 손상 유도 후 단백질 - 단백질 상호 작용을 평가하고 정량화하기 위해 PLA를 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 여기에서, PLA는 G1 상 세포주기 정지를 겪도록 유도 된 인간 B 세포 백혈병 세포에서 DNA 손상시 ATM과 p53 간의 상호 작용을 결정하고 시각화하기 위해 수행된다. 참고로 여기에 제시된 프로토콜은 G1 구속 백혈병 세포에서 ATM 및 p53 상호 작용을 연구하는 것에 국한되지 않고 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수도 있습니다다양한 세포 유형 및 현탁 세포 배양 물에 사용된다.
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Protocol
1. 세포 및 DNA 손상 유도 처리
- 20 % FCS, 50 μM β- 메르 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM에서 인간 BCR-ABL + B 세포 급성 림프 아교 성 세포주 BV173 또는 SUP-B15를 5 % CO2의 분위기에서 37 ℃. 5 ML / 잘 6 잘 접시에 2 X 10 6 세포 / ML에서 세포와 접시를 세고.
참고 : 선택적으로, 다양한 원산지의 서스펜션 세포주를 사용할 수 있습니다. - 세포주기의 G1 단계에서 BCR - ABL + B - ALL 세포를 체포하기 위해 5 μM의 imatinib methanesulfonate (STI571)를 첨가하고 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 선택적으로, 세포주기 또는 BCR-ABL 음성 세포 유형에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구 할 때이 단계를 생략하십시오.
- 50 ng / ML neocarzinostatin (NCS)를 배양 물에 첨가하여 DNA 손상을 유도하고, 2 시간 동안 배양한다.
- 또는,0.5Gy / 분의 방사능 원을 사용하여 5Gy의 선량으로 세포를 조사함으로써 DNA 손상을 유도한다. 조사 후 5 % CO2의 분위기에서 37 ° C에서 2 시간 동안 세포를 회복 시키십시오.
- 선택적으로 DNA 손상에 대한 ATM 키나아제 활성의 관련성을 평가하려면 NCS 또는 방사선 치료를 추가하기 전에 5 μM의 ATM 키나아제 억제제 KU55933을 첨가하십시오.
- 비이커 또는 삼각 플라스크에 1x PBS 50 mL에 분획 -V BSA 5 g을 겹쳐서 1 x PBS + 10 % BSA를 준비하고 BSA가 용해 될 때까지 RT에 놓습니다. 흔들 리거나 휘 저지 마십시오. 거품이 심하게 발생합니다. 0.22 μm 필터를 통해 천천히 여과하고 얼음 위에서 계속하십시오.
- 세포를 수확하고 얼음처럼 차가운 1x PBS로 두 번 씻으십시오. 1x PBS + 10 % BSA에서 2 x 10 6 / mL로 세포를 카운트하고 resuspend. 세포를 얼음에 보관하십시오.
2. 세포 원심 분리, 고정 및 침투
- 준비하기1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액. 용액이 깨끗해질 때까지 1x PBS 50 mL에 PFA 2 g을 넣고 55 ° C의 물을 가라 앉힌다. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 여과하고 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.
참고 : 선택적으로 4 % PFA 고정액을 -20 ° C에서 냉동 보관할 수 있습니다. 냉동 후 사용하기 위해 한 번만 해동하십시오. 그렇지 않으면 PBS의 4 % PFA 용액을 직접 구입할 수 있습니다. - 보풀이없는 조직으로 76 mm x 26 mm 현미경 슬라이드를 조심스럽게 연마하고 5 분 동안 Coplin 병에 96 % 에탄올에 넣음으로써 탈지하십시오. 현미경 검사가 10 분 동안 공기 건조 슬라이드하자.
- 6mm의 영역과 cytospin / cytology 퍼널에 현미경 슬라이드를 조립. 500 RPM에서 1 분 동안 각 깔때기와 원심 분리기에 1x PBS + 10 % BSA 50 μL를 pipetting하여 슬라이드를 pre-coat하십시오.
- 500 rpm에서 5 분 동안 각 깔때기와 원심 분리기에 세포 현탁액 (0.2 x 10 6 세포와 동일) 100 μL를 추가합니다. 각 항체 조합의 경우,ast 4 준비가 필요합니다 (이중 항체 실험, 2 개의 단일 항체 대조군, 항체 대조군 없음).
- 조심스럽게 깔때기를 분해하고 그 부분을 만지지 않도록주의하십시오. 샘플 고정 즉시 진행하십시오.
- 선택적으로 슬라이드를 30 분 이상 공기 건조시킵니다. 공기 건조 후 알루미늄 호일로 슬라이드를 개별적으로 감싸고 사용하기 전까지 -20 ° C에 보관하십시오. 냉동 제제를 사용할 때는 슬라이드에 과도한 응결이 생기지 않도록 종이 타월에 싸서 슬라이드를 녹여야합니다.
- PAP 펜 액 차단기 (팁 5 mm)를 사용하여 스폿 주위에 원 (대략 직경 15-20 mm)을 그립니다.
- 각 지점에 4 % PFA 고정 솔루션의 50 μL를 추가하고 RT에서 30 분 동안 품어.
- 온화한 교반과 RT에서 Coplin 항아리에 1x PBS와 5 분 동안 세포를 3 번 씻으십시오.
- 보풀이없는 티슈로 얼룩 주위의 슬라이드를 건조시키고 파이를 사용하여 가능한 한 많은 양의 액체를 제거하십시오애완 동물을 그 자리에 닿지 않거나 슬라이드를 기울여서 닦으십시오. 각 지점에 1x PBS에 0.25 % 트리톤 X 50 μL를 추가하고 교반없이 RT에서 10 분 동안 품어 둡니다.
- 부드럽게 교반하면서 실온에서 Coplin jar의 TBS (TBS-T) 중 0.05 % Tween-20 ~ 50-60 mL로 5 분 동안 3 번 슬라이드를 씻는다. 이 방식으로 10 개의 슬라이드를 동시에 처리 할 수 있습니다.
3. 차단 및 일차 항체 인큐베이션
- 보푸라기가없는 티슈로 TBS-T를 두드려 주변의 슬라이드를 말립니다. 스팟을 만지거나 슬라이드를 기울이지 않고 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액을 스폿에서 제거하십시오. 잠깐 블로킹 용액을 보텍스하고 한 방울 (~ 40 μL)을 각 지점에 첨가하십시오. 사전 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다.
- 사용하기 전에 상업용 항체 희석제, 와류 항체 희석제에 1 : 1,000의 염소 - 항 -ATM과 1 : 100의 토끼 항 - 포스 포 -Ser15-p53을 혼합하여 항체 칵테일을 준비한다. 대조군 실험자염소 - 항 -ATM 및 토끼 - 항 - 포스 포 - Ser15-p53 항체 (단일 항체 대조군)만을 함유하는 항체 희석액을 제조한다.
- 차단 용액을 두 드리되 항체 희석액을 첨가하기 전에 세포가 건조하지 않도록주의하십시오. 각 항체 칵테일 희석액 30 μL를 첨가하고 밤새 가습 한 챔버에서 4 시간 동안 항온 배양하십시오.
- 완충액 A와 완충액 B의 한 봉지의 내용물을 최종 용적이 각각 1,000mL 인 물에 용해시켜 원심 분리 완충액 A와 완충액 B를 준비한다.
- 또는 8.8 g의 NaCl, 1.2 g의 Tris-base 및 0.5 mL의 Tween-20을 800 mL의 물에 녹여서 완충액 A를 준비하십시오. HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피 1,000 mL에 넣는다.
- 또는 5.84 g의 NaCl, 4.24의 Tris-base 및 26.0 g의 Tris-HCl을 500 mL의 물에 녹여 세척 완충제 B를 준비한다. HCl을 사용하여 pH를 7.5로 조정한다. 1,000 mL의 최종 부피에 물을 넣으십시오.
- 필터두 용액은 0.22 μm 필터를 통과했다.
- 온화한 교반과 RT에서 Coplin 항아리에 1x 현장 세척 버퍼 A와 함께 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으십시오.
4. PLA 프로브, 연결 및 증폭
- 안티 - 염소 플러스와 안티 - 토끼 마이너스를 상업용 항체 희석액에서 1 : 5로 희석하여 PLA 프로브를 준비하십시오. 슬라이드에서 1x 현장 세척 버퍼 A를 떼어 내고 PLA 프로브 혼합물 30 μL를 각 지점에 첨가하십시오. 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C로 1 시간 동안 품어주십시오.
참고 : 적용된 기본 항체가 다른 종에서 자라는 한, 보조 항체 PLUS 및 MINUS PLA 프로브 (항 마우스, 항 토끼, 항 염소)의 모든 조합을 사용할 수 있으며 PLA 프로브의 조합은 항상 사용해야합니다 PLUS 프로브와 MINUS 프로브가 있습니다. - 부드럽게 교반하면서 RT에서 Coplin jar에서 ~ 50-60 mL 1x in situ 세척 완충액으로 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으시오. </ li>
- 라이 게이션 용액 39 μL에 리가 제 1 μL를 첨가하여 얼음 위에서 라이 게이션 - 리가 제 용액을 준비하고 각 리간드 - 라이 게이션 용액 40 μL를 첨가한다. 미리 데워진 가습 챔버에서 37 ° C로 30 분 동안 품어 낸다.
- 온화한 교반과 RT에서 코 플린 항아리에 ~ 50-60 ML 1x 현장 세척 버퍼 A와 함께 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으십시오.
- Amplification 원액을 물에 1 : 5로 희석하여 얼음 위에서 증폭 - 중합 효소 혼합물을 준비한다. 그런 다음 각 지점마다 1x Amplification solution 39.5 μL에 0.5 μL의 polymerase를 첨가합니다.
참고 : 증폭 시약은 빛에 민감하므로 빛에 직접 노출되지 않도록 보호해야합니다. 증폭 시약은 4 가지 다른 색상 (RED : 여기 594 nm, 방출 624 nm, FarRED : 여기 644 nm, 방출 669 nm, ORANGE : 여기 554 nm, 방출 576 nm, 녹색 : 여기 501 nm, 방출 523 nm) 사용할 수있는 현미경 설정이uitable 여기 속성 및 이러한 색상을 이미지 필터. - 1x in situ 세척 완충액 A를 가볍게 두드려서 증폭 증폭 효소 중합 효소 혼합물 40 μL를 첨가하십시오. 사전 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C로 100 분 동안 품어 둡니다.
5. 장착 및 이미징
- 물 99mL 에 1X 세척 버퍼 B 1mL를 추가하여 현장 세척 버퍼 B를 0.01x 준비합니다.
- Amplification - Polymerase 혼합물을 꺼내 부드럽게 교반하면서 RT에서 Coplin jar에서 1x in situ 세척 완충액으로 10 분 동안 2 번 슬라이드를 씻는다.
- 0.01x 세척 버퍼 B에서 1 분 슬라이드를 씻으십시오.
- 0.01x 초과 세척 버퍼 B를 두드리고 보풀이없는 조직으로 스폿 주변의 슬라이드를 건조시킵니다. 스팟을 만지거나 슬라이드를 기울이지 않고 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액을 스폿에서 제거하십시오.
- DAPI가 포함 된 장착 매체를 DAPI가없는 장착 매체에 1 : 5로 희석하여 핵의 과도한 염색을 피하십시오.
- 25 - 30 μL의 1 : 5 DAPI 함유 장착 매체를 24 mm x 24 mm coverslip에 추가하고 슬라이드와 함께 커버 슬립을 집어 올리십시오. 약간의 압력을 가해 공기 방울이 없음을 확인하십시오. 매니큐어로 coverslip을 봉쇄하고 이미징하기 전에 적어도 15 분을 기다립니다.
- (공 촛점) 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석합니다.
- 적어도 4 개의 취득 이미지 필드 (20x 객관적, 조건 또는 항체 조합 당 20 세포를 계산, 처리 세포에서 7 ± 5 신호의 예상 평균을 사용하여 전력 계산을 기반으로 세포 당 punctate PLA 신호의 수를 세고, 이전에보고 된 바와 같이, 유형 I 오차가 0.05, 확률이 80 % 인 확률로 치료되지 않은 세포에서 2 ± 2 개의 신호가 발생했다.
참고 : 최상의 해결 방법은 소프트웨어 패키지 ( 예 : ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS))를 사용하여 Z- 스택 및 디콘 볼 루션을 얻는 것입니다. 신호DAPI 염색에 의해 정의 된대로 핵 경계 내에서 쉽게 식별 할 수 있어야한다. - 핵 외부에 명확하게 나타나는 신호는 세지 마십시오. 전형적으로, NCS 처리 또는 γ- 조사는 세포 당 약 5-10 개의 phosho-p53 / ATM PLA 신호를 초래한다. '단일 항체'컨트롤은 배경 시그널을 제공 할 수 있지만, 이것은 매 20 개의 세포 중 1 개당 1-2 개의 PLA 신호를 초과해서는 안됩니다.
- 출판 및 프리젠 테이션 목적으로 40X 또는 63X 침지 오일 대물 렌즈를 사용하여 이미지를 캡처하십시오. 슬라이드는 4 ° C에서 보관할 수 있으며 빛에 노출되지 않도록 보호해야합니다.
- 적어도 4 개의 취득 이미지 필드 (20x 객관적, 조건 또는 항체 조합 당 20 세포를 계산, 처리 세포에서 7 ± 5 신호의 예상 평균을 사용하여 전력 계산을 기반으로 세포 당 punctate PLA 신호의 수를 세고, 이전에보고 된 바와 같이, 유형 I 오차가 0.05, 확률이 80 % 인 확률로 치료되지 않은 세포에서 2 ± 2 개의 신호가 발생했다.
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Representative Results
잔류 Ser15에서의 p53의 인산화는 ATM 키나제 활성에 의존하는 것으로 나타났다. 부유 세포 배양 물의 cytospin 조제에 대한 PLA 기술의 특이성을 증명하고 확인하기 위해, 세포주기의 G1- 단계에서 정지 된 BCR-ABL + B-ALL 세포의 2 시간 NCS 처리에 의한 DNA 손상 유도가 나타났다 예상대로 ATM과 phospho-Ser15-p53 사이의 특이 적 상호 작용을 일으켰다. Punctate PLA 신호는 NCS ( 도 1B )로 처리 된 세포의 대다수의 핵에서 관찰되었고, NCS로 처리하지 않은 세포에서는 신호가 검출되지 않았지만 ( 도 1A ), 세포 당 평균 7 PLA 신호가 관찰되었다 . DNA 손상 유도 전에 특정 ATM 키나아제 억제제 인 KU55933으로 세포를 전처리하면 PLA 신호의 수를 평균적으로 감소시켰다2 개의 PLA 신호 / 세포 ( 도 1C ). ATM-phospho-Ser15-p53 PLA 신호는 예상대로 핵에서 독점적으로 검출되었습니다. 염소 - 항 -ATM 또는 토끼 항 - 포스 포 -Ser15-p53 항체가 제거 된 단일 항체 대조군 ( 도 1D 및 1E )은 특정 PLA 신호를 나타내지 않았다. 이 결과의 정량 및 통계 분석은 그림 1F 에 제시되어 있다 (Ochodnicka et al. J. Immunol. 2016) 15 .
그림 1 : BV173 인간 BCR-ABL + 세포에서 ATM / phospho-Ser15-p53 상호 작용을위한 in situ PLA. ( A ) 세포는 5 μM 이마 티 니브 (G1- 상 세포 - 사이클을 유발하는 특이 Abl 키나아제 억제제(imatinib)과 imatinib (imatinib)과 50 ng / mL NCS (DNA 손상을 유도 한 것) ( B ), imatinib과 NCS 처치 전에 특정 ATM 키나아제 억제제 KU55933으로 미리 치료 한 것 . 염소 - 항 -ATM (D) 및 토끼 - 항 - 포스 포 - Ser15-p53 항체 ( E )에 대한 단일 항체 제어 PLA 실험이 제시되어있다. 적색 형광 점을 나타내는 신호는 ATM과 phospho-Ser15-p53 단백질의 in situ protein proximity (<50 nm)를 나타냅니다. 눈금 막대 = 5 μm (흰색 선). ( F ) 상이한 실험 조건 하에서 처리 된 적어도 20 개의 세포에서 PLA 신호의 수의 정량화가 제시된다. 수평선은 의미를 나타냅니다. 통계적 유의성은 편도 분석 (ANOVA; *** p <0.001)에 의해 결정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고서에서 PLA는 현탁 세포 배양에서 단백질 간의 특이 적 상호 작용을 결정하고 시각화하는 데 사용될 수 있음이 입증되었습니다. 참고로 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA 복구 복합체의 연구에만 국한되지 않고 정지 세포 배양에서 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하고 정량화하는 데에도 적용됩니다. ATM 키나아제가 DNA 손상 유도제에 노출되었을 때 G1- 구속 된 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 인산화 된 p53과 상호 작용하는 것으로 나타났다. 이전에 PLA 기술은 ATM과 FOXO1 전사 인자가 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 상호 작용한다는 것을 보여주기 위해 사용되었지만,이 상호 작용은 FOXO1의 ATM 의존성 인산화를 초래하지 않을 가능성이 높습니다. PLA 데이터를 뒷받침하기 위해, 내인성 ATM / ATR- 인산화 단백질의 면역 침전에 의해, 확립 된 ATM 기질 p53 및 NBS1과 대조적으로, FOXO1은 D의 유도시 ATM에 의해 인산화 되지 않는다는 것이 확인되었다NA 피해 15 . 또한, PLA 접근법은 다양한 인간 B 세포 림프종 세포주에서 미스 매치 수리 복합체 ( 예 : MSH2와 MSH6 사이의 상호 작용)의 형성을 연구하는데 성공적으로 적용되었다 (데이터는 표시되지 않음). 이러한 특정 상황에서 PLA 기법은 우리의 연구 결과를 뒷받침하는 대안적인 접근법을 제시했다. PLA는 실험 조건 들간의 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 반 정량적 인 평가를 허용하고 이러한 상호 작용에서의 세포 간 변이에 대한 통찰력을 제공한다는 것이 증명되었다.
세포에서의 특정 단백질 - 단백질 상호 작용 분석 (다른 실험 조건에 노출)은 일반적으로 도전적이었으며 실험적 인공물의 영향을받습니다. 일반적으로 단백질 동시 면역 침전은 선택 방법 이었지만 많은 세포 및 / 또는 단백질을 필요로하며 희소 한 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 분석을 본질적으로 금지합니다유형 또는 저수준으로 표현되는 단백질 사이에 존재할 수있다. 또한, (관련성이없는) 세포주 모델에서 단백질의 과발현은 종종 과잉 발현 인공물을 초래하고 결과는 생체 내 또는 관련 세포 유형에서 확인 / 검증하기가 매우 어려울 수 있습니다. 또한, 동시 면역 침전은 세포의 용해 및 단백질의 가용화를 요구하며, 이는 단백질 - 단백질 상호 작용이 약할 때 신호의 손실을 초래할 수있다. 중요하게, 단백질 동시 면역 침전 및 효모 - 2 - 하이브리드 접근법은 단백질 - 단백질 상호 작용에서 세포 내 및 세포 간 편차를 검출 할 수 없다. PLA 기술은 이러한 기술에 대해 매력적이고 쉬운 대안을 제시하며 중요한 추가 통찰력을 제공합니다. PLA는 면역 조직 화학 검사를 수행 할 수있는 능력을 초월한 고도의 전문 기술을 필요로하지 않기 때문에 표준 (진단) 실험실 환경에서 사용할 수 있습니다.
초 - 해상도 현미경의 개발로 심층적 인 연구가 가능 해졌다.단백질 복합체의 분자 구조 해석 그러나이 기술은 쉽게 사용할 수 없으며 전담 연구 인프라가 필요합니다. PLA는 단백질 복합체 형성 연구를위한 접근 가능하고 간단하며 저렴한 대체 접근법을 제공합니다. PLA 기술의 분명한 한계는 다른 종에서 자란 특정 1 차 항체의 이용 가능성이다. 그러나 몇몇 회사는 현재 PLA 기술의 사용을 간소화하는 전용 (및 유효성이 입증 된) 항체 조합을 제공합니다.
DNA 손상 회복 및 DNA 손상 반응에 단백질이 관여한다는 연구는 IRIF 형성 및 구성 분석에 크게 의존합니다. 그러나 IRIFs에서 단백질의 co-localization은 반드시 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 의미하지 않는다는 것을 알아야한다. PLA 기술은 DNA 수리 단백질 및 수리 복합체의 형성을보다 자세히 연구 할 수있는 독창적 인 기회를 제공합니다. SP그러한 복합체의 형성에 대한 동 시체 분석은 PLA를 사용하여보다 상세하게 매핑 될 수있다. 또한 연구자는 DNA 손상 제제 또는 치료법으로 치료받은 환자의 조직 및 임상 표본에서 수복 복합체의 형성을 평가할 수있게되어 이러한 치료법의 효능에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 선택 영역을 도울 수있다 이 치료법으로 가장 많은 혜택을 볼 수있는 환자들.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Guikema 연구소의 연구는 네덜란드 연구기구 (VIDI grant 016126355)와 Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (프로젝트 252)의 Innovational Research Incentives Scheme에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
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