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Genetics

रिकॉमबिनेंट Adeno-एसोसिएटेड वायरस सीरोटाइप 9 का उपयोग कर MicroRNA की प्रणालीगत डिलिवरी कुतर में Neuromuscular रोगों का इलाज

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/55724
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1, 1,4
1Neurogenetics Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Section on Nervous System Development and Plasticity, The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child and Human Development, National Institutes of Health, 3Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University, 4Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford

Summary

यहां हम एक neuromuscular रोग के एक माउस मॉडल में एक रिकॉमबिनेंट adeno-जुड़े वायरस सीरोटाइप 9 का उपयोग कर microRNA के वितरण का वर्णन । चूहों में एक एकल परिधीय प्रशासन मांसपेशियों और मोटर न्यूरॉन्स में निरंतर miRNA के परिणामस्वरूप, miRNA समारोह और vivo मेंचिकित्सीय क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक अवसर प्रदान.

Abstract

अंतर्जात miRNA मार्ग के माध्यम से आरएनए हस्तक्षेप पोस्ट-transcriptional जीन मुंह बंद करने के माध्यम से प्रोटीन संश्लेषण को नियंत्रित करके जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है । हाल के वर्षों में, miRNA-मध्यस्थता जीन विनियमन तंत्रिका विज्ञान समारोह तंत्र का एक विषाक्त लाभ की वजह से विकारों के उपचार के लिए क्षमता दिखाया गया है । हालांकि, लक्ष्य ऊतकों को कुशल वितरण अपने आवेदन सीमित है । यहाँ हम रीढ़ की हड्डी और bulbar पेशी शोष (SBMA), एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) में polyglutamine विस्तार की वजह से एक neuromuscular बीमारी के लिए एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का इस्तेमाल किया, एक नए पहचान ए. ए.-लक्ष्यीकरण मुंह बंद करने द्वारा जीन miRNA परीक्षण करने के लिए, मीर-२९८. हम मीर-२९८ एक रिकॉमबिनेंट adeno-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) सीरोटाइप 9 वेक्टर का उपयोग करने के लिए गैर-विभाजित कोशिकाओं के transduction की सुविधा का प्रयोग । SBMA चूहों में एक एकल पूंछ नस इंजेक्शन कंकाल मांसपेशी और मोटर न्यूरॉन्स में मीर के निरंतर और बड़े पैमाने पर अधिक व्यक्त-२९८ और चूहों में neuromuscular phenotype की उंनति के परिणामस्वरूप प्रेरित ।

Introduction

MiRNAs गैर कोडिंग RNAs, लंबाई में 21-23 न्यूक्लियोटाइड, कि जीन अभिव्यक्ति और विविध सेलुलर और चयापचय रास्ते के नियंत्रण के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । 1 जीन अभिव्यक्ति मुख्य रूप से उत्प्रेरण पोस्ट-transcriptional जीन मुंह बंद करने या mRNA क्षरण द्वारा विनियमित है । 2 MiRNAs आमतौर पर कोडन जीन के 3 ' untranslated क्षेत्र (UTR) के पूरक हैं, हालांकि 5 ' UTR और कोडिंग लक्ष्य mRNA के क्षेत्रों के लिए बाध्यकारी भी वर्णित किया गया है । 3

मानव रोगों के रोगजनन में miRNA की भूमिकाओं की वर्तमान समझ के रूप में फैलता है, व्यक्तिगत miRNAs या miRNA परिवारों के औषधीय मॉडुलन तेजी से एक व्यवहार्य चिकित्सीय विकल्प बनता जा रहा है । अन्य आरएनए निषेध रणनीतियों की तुलना में, miRNAs कई फायदे हैं: miRNAs कम विषाक्त और कम immunogenic हैं और आसानी से उनके छोटे आकार की वजह से कोशिकाओं में दिया जा सकता है । 4 , 5 , 6 MiRNAs आम तौर पर सेलुलर नेटवर्क के भीतर कई लक्ष्य है, इसलिए संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव और सुरक्षा चिंताओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए, साथ में कुशल वितरण के ऊतकों को लक्षित करने के लिए ।

Neuromuscular रोगों प्राप्त कर रहे है या विरासत में मिली है कि मांसपेशियों और मोटर ंयूरॉंस प्रभावित । कंकाल की मांसपेशी के लिए दवाओं के लक्ष्यीकरण अनुसंधान के एक उभरते क्षेत्र है, जहां मुख्य चुनौती चिकित्सीय खिड़की के भीतर व्यापक वितरण प्राप्त करने के लिए है । 7 मोटर न्यूरॉन्स अधिक लक्षित करने के लिए मुश्किल हैं, मुख्य रूप से क्योंकि दवा का उपयोग रक्त मस्तिष्क बाधा से precluded है.

सेल कल्चर और स्पाइनल और bulbar दमदार शोष (SBMA) के माउस मॉडलों का इस्तेमाल इस अध्ययन में किया गया. SBMA एक neuromuscular समारोह तंत्र का एक विषाक्त लाभ की वजह से बीमारी है, जिसमें दोनों मांसपेशियों और मोटर न्यूरॉन्स प्रभावित होते हैं । 8 , 9 SBMA (कैनेडी की बीमारी; OMIM #313200) एक एक्स-लिंक्ड रोग, मांसपेशी कमजोरी और शोष की विशेषता, ar जीन में सीएजी दोहराने के विस्तार के कारण होता है, जो एआर प्रोटीन में एक विस्तारित polyglutamine पथ को एनकोड करते हैं । 10 कोई रोग-संशोधित उपचार इस विकार के लिए वर्तमान में उपलब्ध है । इस अध्ययन में प्रयुक्त ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में लिंग विशिष्टता, मोटर-न्यूरॉन पैथोलॉजी, और प्रगतिशील मांसपेशी शोष सहित रोग की विशेषताएं recapitulates हैं । 11

इस अध्ययन में, हमारे एक miRNA है कि सीधे उत्परिवर्ती एआर transgene के downregulates अभिव्यक्ति और रीढ़ की हड्डी और हमारे रोग माउस मॉडल के कंकाल की मांसपेशी को miRNA के वितरण के एक सुरक्षित और कुशल मोड डिजाइनिंग पर की पहचान पर ध्यान केंद्रित प्रयास ।

यहां हम एक अपेक्षाकृत uncharactered miRNA, miRNA-२९८ (प्रवेश संख्या MIMAT0004901),12 की पहचान के लिए सीधे SBMA मॉडल में उत्परिवर्ती एआर अभिव्यक्ति को कम । आदेश में मीर की डिलीवरी प्राप्त करने के लिए-२९८ ऊतकों को लक्षित करने के लिए, हम एक वायरल रणनीति का इस्तेमाल किया, रिकॉमबिनेंट adeno के साथ-एसोसिएटेड वायरस सीरोटाइप 9 (rAAV9) । rAAV9 रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने में सक्षम है और गैर में लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति मध्यस्थता, न्यूरॉन्स सहित कोशिकाओं,. 13 AAV9 के एक एकल प्रणालीगत प्रशासन-मीर-२९८ miRNA की निरंतर अभिव्यक्ति में हुई, मांसपेशी और मोटर न्यूरॉन्स के कुशल transduction, नीचे एआर अभिव्यक्ति के विनियमन, और SBMA चूहों में phenotype रोग की उंनति. 14 इस पद्धति का उपयोग vivo मेंmiRNA या antagomirs का एक् सप्रेस देने के लिए किया जा सकता है ।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ अनुसार किए गए (8 एड., राष्ट्रीय अकादमियों प्रेस, संशोधित २०११), और NINDS पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. AAV9-miRNA डिजाइन रणनीति और miRNA चयन

  1. लक्ष्य जीन के mRNA 3 ' UTR क्षेत्र के साथ बातचीत करने वाले उम्मीदवार miRNAs का चयन करने के लिए miRWalk पूर्वानुमानित डाटाबेस का प्रयोग करें । 15
    नोट: miRNA अनुक्रम की ंयूनतम बीज लंबाई को सीमित से कम 7 न्यूक्लियोटाइड । अंय की स्थापना की miRNA भविष्यवाणी कार्यक्रम (मिरांडा, miRDB, Targetscan) तुलनात्मक विश्लेषण के लिए चुनें । इन चयन मानदंडों के आधार पर, यहां मीर-१८५, मीर-२९८, मीर-८७३, और मीर-८७७ को आगे के मूल्यांकन के लिए चुना गया ।
  2. miRBase (http://www.mirbase.org/) से चयनित miRNA का अनुक्रम पुनर्प्राप्त करें ।
  3. पंचायती राज-मीर (६०-७० एनटीएस) और उसके 250-300 एनटीएस दोनों पक्षों पर जीनोमिक अनुक्रम पार्श्व, या एक नकली अनुक्रम क्लोन, उचित AAV सीआईएस वेक्टर में ।
    नोट: पार्श्व अनुक्रम सही पंचायती राज-मीर अभिव्यक्ति और परिपक्व microRNA प्रसंस्करण के लिए आवश्यक है । एक दोहरे प्रमोटर rAAV सीआईएस वेक्टर का चयन करें एक अभिव्यक्ति कैसेट के साथ एक मानव बढ़ाव कारक के उदाहरण के लिए मिलकर-1 अल्फा (EIF1α) प्रमोटर चयनित miRNA या नकली अनुक्रम द्वारा पीछा किया, और मानव cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर सीडीएनए एन्कोडिंग द्वारा पीछा किया GFP फ्लोरोसेंट टैग । EIFα प्रमोटर चुना गया था क्योंकि यह स्थिर और सजातीय अभिव्यक्ति की गारंटी देता है, मुंह बंद करने के ंयूनतम जोखिम के साथ । विशिष्ट अनुप्रयोगों के आधार पर ऊतक विशिष्ट या सशर्त प्रवर्तकों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. तैयार, शुद्ध, और अनुमापन AAV, निंनलिखित प्रकाशित प्रोटोकॉल । 16
    नोट: यहां, AAV वेक्टर और वायरल उत्पादन में पंचायती राज-मीर की क्लोनिंग एक बाहरी निर्माता द्वारा प्रदर्शन किया गया ।

2. AAV की पूंछ नस इंजेक्शन-miRNA प्लाज्मिड

नोट: इस कदम के लक्ष्य जीन और चूहों की उम्र और वजन के अनुसार समायोजन की जरूरत है. चूहों की आयु और भार के आधार पर प्रशासन की खुराक रेंज, मात्रा और सर्वोत्तम मार्ग निर्धारित करने के लिए संस्थागत और पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) दिशानिर्देशों का उपयोग करें. GFP प्रतिदीप्ति संकेत और लक्ष्य के ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति स्तर इंजेक्शन के बाद 2 सप्ताह शुरू पीक करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल जल्दी वयस्कता में पुरुष चूहों को संदर्भित करता है । AAV को एक प्रकार का खतरा हो सकता है ।

  1. विभाजित AAV-miRNA प्लाज्मिड शेयर 100-200 µ एल aliquots में 10 10-1011 वायरलजीनोम का एक वायरल लोड युक्त (वी. पी./) बाँझ फॉस्फेट का उपयोग कर रहे हैं खारा (पंजाब). प्रयोगशाला के लिए AAV समाधान को संभालने के लिए निजी सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग किया जाना चाहिए ।
    नोट: एक बार एक aliquot गल गया है यह दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । वायरल शेयर-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. उचित आकार के प्लास्टिक या पतला प्लास्टिक फिल्म ट्यूब के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निरोधकों में माउस को नियंत्रित ।
  3. ७०% अल्कोहल पोंछे के साथ पूंछ की सतह को साफ ।
  4. 30 एस के लिए vasodilation बढ़ाने के लिए पूंछ के नीचे एक गर्म पैड (28-30 डिग्री सेल्सियस) पकड़ो । वैकल्पिक रूप से, एक लाल गर्मी लैंप (2-3 फीट की दूरी पर) या गर्म पानी में पूंछ की सूई का उपयोग कर जानवरों को गर्म ।
  5. पूंछ के बाहर के हिस्से से शुरू, सुई (27-30 G) वायरल aliquot के साथ भरी हुई, ऊपर बेवल, पूंछ से 15 डिग्री, नस में डालें । इंजेक्शन से पहले, सुई सही ढंग से डाला जाता है सुनिश्चित करें ।
    1. अगर प्रतिरोध इंजेक्शन के दौरान महसूस किया है, या सूजन त्वचा के नीचे प्रकट होता है, प्रक्रिया को रोकने के । सुई निकालें और फिर से पिछले इंजेक्शन साइट के ऊपर सुई डालें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, इस सुई aspirating और रक्त देख धीरे से प्राप्त किया जा सकता है । कठिन आकांक्षा पूंछ नस ढह सकती है । यदि इंजेक्शन के दौरान नस-आधे उबले, सुई सही ढंग से डाला जाता है ।
  6. इंजेक्शन के पूरा हो जाने के बाद, सुई जुटाने से पहले कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें ।
  7. रक्तस्राव के लिए इंजेक्शन साइट का निरीक्षण । रक्तस्राव बंद हो जाता है जब तक साइट के लिए दो उंगलियों का उपयोग मध्यम दबाव लागू करें ।
  8. इसके पिंजरे में पशु लौटें ।

3. व्यवहार परख

नोट: सभी प्रयोगों विशेष रूप से कोडित शीशियों द्वारा उपचार की पनाह के साथ एक तीसरी पार्टी द्वारा अंधे आयोजित किया गया । उपचार के क्रम यादृच्छिक किया गया । जब नीचे वर्णित परीक्षण प्रदर्शन, प्रयोगात्मक स्थितियों (दिन के कमरे और समय के प्रकार) परिवर्तन को कम करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए । यह परीक्षण विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए चार सप्ताह से अधिक पुराने चूहों पर किया जाना चाहिए. माउस सामांय प्रदर्शन की आधारभूत प्राप्त करने के लिए उंर के 5 हफ्तों में वायरल इंजेक्शन से पहले एक बार व्यवहार मूल्यांकन से गुजरा । वायरल इंजेक्शन के बाद, चूहों को इंजेक्शन के बाद ४८ ज शुरू सप्ताह में एक बार मूल्यांकन किया गया, उम्र के ४० सप्ताह तक.

  1. माउस लाओ AAV के साथ एक शांत, अंधेरे कमरे में है कि शोर या अंय गड़बड़ी से मुक्त है परीक्षण शुरू करने से पहले ंयूनतम 30 मिनट । acclimatization की इस अवधि के दौरान जानवरों को परेशान न करें ।
  2. 30 मिनट के लिए नए कमरे में माउस Acclimatize और फिर निंनलिखित व्यवहार परख शुरू (कदम ३.३ और ३.४) । प्रत्येक व्यवहार परख के बीच में 10 मिनट के अंतराल रखें ।
  3. हैंगिंग वायर परीक्षण
    नोट: यह परीक्षण मांसपेशियों की ताकत और मोटर रोग पर नज़र रखता है ।
    1. एक गद्दे के लिए एक तकिया के रूप में कार्य शीट का प्रयोग करें । अपनी पूंछ से माउस उठाओ और यह तार ग्रिड रैक के केंद्र पर जगह है । रैक 15-20 इंच सतह से ऊपर उठाएं और धीरे स्क्रीन उलटा करने के लिए पशु स्क्रीन पर अपनी पकड़ को समायोजित करने की अनुमति ।
    2. रैक पूरी तरह से औंधा है एक बार, टाइमर शुरू, और गिरने के लिए समय रिकॉर्ड ।
      नोट: चूहों एक ग्रिड पर चार अंगों के साथ लटका होगा. यदि तार बहुत कम सेट है चूहों पर लटका नहीं हो सकता है । यदि चूहों से पहले ग्रिड गिर ६० s, उंहें वापस ग्रिड पर रखें, टाइमर रीसेट करें, और इस प्रक्रिया को दोहराने के लिए दो और अधिक की कोशिश करता है । श्रेष्ठ प्रदर्शन पंजीकृत करें ।
    3. ६० एस की समय सीमा समाप्त हो जाने पर पशु वापस पिंजरे में लौट आते हैं ।
  4. पैर प्रिंट परख
    नोट: शोषक चादर 5 सेमी उच्च दीवारों के साथ एक संकीर्ण रनवे के बारे में ७० सेमी लंबी और 5 सेमी चौड़ा होना चाहिए ।
    1. एक हाथ से धीरे से माउस पकड़ो और एक ब्रश के साथ हिंद पंजे को सामने पंजे और नीली स्याही के लिए लाल स्याही लागू होते हैं ।
    2. एक संकीर्ण रनवे के फर्श पर शोषक चादर रखें ।
    3. माउस को चलने के लिए या एक छोर से अंय रनवे में एक सीधी रेखा में एक शोषक शीट पर चलाने के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. एक ताजा शोषक शीट का उपयोग कर माउस के साथ दो बार इस प्रक्रिया को दोहराएं ।
    5. आगे के आंदोलन में लगातार दो चरणों के बीच की दूरी को मापने । पहले और पिछले कुछ पैरों के निशान शामिल नहीं है जहां पशु सिर्फ शुरुआत है और अपने रन परिष्करण ।

4. इच्छामृत्यु और ऊतक फसल

  1. एक इच्छामृत्यु चैंबर या एक घंटी जार का उपयोग करें । यदि एक बेल जार का उपयोग कर, एक धुएं डाकू के तहत प्रक्रिया प्रदर्शन ।
  2. कॉटन को isoflurane के साथ भिगो दें और इसे बेल जार में रखें । पशुओं को संज्ञाहरण सामग्री के साथ शारीरिक संपर्क से रखने के लिए एक भौतिक विभाजक का उपयोग करें । इस कदम के तुरंत बाद पशु को जार में रखें ।
    नोट: isoflurane से पशुओं में hypoxemia की संभावना से बचने के लिए बेल जार से पूर्व चार्ज नहीं करना चाहिए ।
  3. isoflurane जोखिम जारी रखें जब तक साँस रुकने के बाद 30 एस.
  4. तुरंत बाद जार से माउस को हटाने, ग्रीवा विस्थापन द्वारा euthanize ।
    नोट: इस कदम के रूप में तेजी से ऊतक क्षरण से बचने के लिए संभव के रूप में जगह ले जाना चाहिए ।
  5. फसल रीढ़ की हड्डी पहले और फिर quadriceps कंकाल मांसपेशी ।
    1. रीढ़ की हड्डी फसल के लिए, माउस की पीठ बेनकाब और एक विच्छेदन बोर्ड के पक्ष में चार अंगों को ठीक ।
    2. ७०% इथेनॉल के साथ विच्छेदन की साइट धो लो ।
    3. एक तेज कैंची का उपयोग कर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन ।
    4. औसत लाइन में त्वचा में एक चीरा बनाओ । या तो काटने या सावधान अनुप्रस्थ विमान में त्वचा की फाड़ द्वारा खाल निकालें, खाल खींच और सिर के ऊपर से पीछा किया । कंधे ब्लेड के नीचे कैंची से काटने और स्तंभ के C1-2 क्षेत्र पर सिर को हटाने (खोपड़ी के आधार के लिए आसंन पाया) ।
      1. ventral ओर उदर की दीवार पेशियां काटें और बाद में जारी रखें, एक समय में एक दिशा, जब तक रीढ़ की हड्डी स्तंभ तक पहुंच जाता है ।
    5. एक तेज कैंची का उपयोग कर ग्रीवा रीढ़ की हड्डी से शुरू कशेरुकाओं निकालें । दोनों किनारों पर कशेरुका मेहराब के पार काटने से कशेरुकाओं के पार्श्व भागों को हटा दें ।
    6. हटाने के बाद पूरे कशेरुकाओं रीढ़ की हड्डी रिलीज ।
  6. स्नैप पूर्व ठंडा 2-methylbutane निंनलिखित विधि का उपयोग में काटा ऊतकों फ्रीज:
    1. आधा एक स्टेनलेस स्टील बाउल 2-methylbutane के साथ भरें और कटोरे के नीचे चौथाई तरल नाइट्रोजन से भरा एक कंटेनर में जलमग्न ।
    2. पूर्व ठंडा 1-2 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में 2-methylbutane ।
    3. 2-methylbutane में संदंश के साथ कंकाल की मांसपेशी प्लेस जब तक यह सफेद हो जाता है । तुरंत ऊतक बर्फ सूखी और फिर यह दुकान पर-८० डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण ।
  7. रीढ़ की हड्डी immunostaining के लिए, तेल ब्लॉक में कमरे के तापमान पर के ऊतकों में एंबेड स्नैप ठंड से पहले वर्णित के रूप में । 17
  8. जैव रासायनिक विश्लेषण और miRNA ठहराव के लिए, एक cryovial में1 जगह काटा ऊतक और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।

Representative Results

AAV9 के 1011 वी-मीर-२९८ के एक वायरल लोड 5 सप्ताह पुराने SBMA चूहों में एक एकल पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से इंजेक्शन था । ये चूहे एआर (AR97Q) में असामान्य रूप से विस्तारित polyglutamine पथ के साथ मानव एआर transgene ले और उम्र के 10 सप्ताह (वजन घटाने, वापस कूबड़, और मांसपेशी शोष) द्वारा neuromuscular रोग के लक्षण विकसित करना । 11 काठ की रीढ़ की हड्डी और quadriceps मांसपेशी miRNA ठहराव, जैव रासायनिक परख और immunohistochemistry (चित्रा 1) के लिए प्रशासन के बाद 2, 4, 8 और 12 सप्ताह में काटा गया । इलाज के प्रशासन और बाद में विश्लेषणों अंधा अंवेषकों द्वारा प्रदर्शन किया गया ।

qRT-पीसीआर विश्लेषण से पता चला मीर-२९८ अभिव्यक्ति कंकाल की मांसपेशी और रीढ़ की हड्डी में दो सप्ताह और चार सप्ताह के उपचार के बाद क्रमशः, चरम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ 8 सप्ताह में कंकाल की मांसपेशी और 12 सप्ताह में रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन के बाद (2 चित्रा ). एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना (Axiovert १०० M), हरी प्रतिदीप्ति संकेत मांसपेशियों के ऊतकों में और रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स में पाया गया GFP के सह-स्थानीयकरण और मोटर ंयूरॉन मार्कर choline acetyltransferase (चैट) 10 सप्ताह के उपचार के बाद, जब चूहों को दिखाने के लिए शुरू रोग अभिव्यक्तियाँ (चित्रा 2).

एक ही खुराक आहार, SBMA चूहों के एक पलटन का उपयोग करने के लिए या तो मीर-२९८ या नकली प्राप्त करने के लिए किया गया था 7 सप्ताह की उम्र में जैव रासायनिक विश्लेषण और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से । इंजेक्शन साप्ताहिक वजन और व्यवहार मूल्यांकन के द्वारा ४० के लिए उंर के सप्ताह के बाद किया गया । qRT-पीसीआर विश्लेषण से पता चला कि मीर-२९८ उपचार प्रभावित ऊतकों में उत्परिवर्ती एआर के स्तर को कम कर देता है (चित्रा 3), और वृद्धि हुई शरीर के वजन और सुधार मोटर प्रदर्शन (4 चित्रा) इंजेक्शन के बाद 10 सप्ताह में शुरू ।

Figure 1
चित्रा 1: अध्ययन डिजाइन के योजनाबद्ध । vivo में मीर-२९८ की अभिव्यक्ति का स्तर बढ़ाने के लिए, हम (क) दोहरी प्रमोटर AAV वेक्टर प्लाज्मिड व्यक्त GFP और या तो मीर-२९८ या नकली के साथ SBMA चूहों इंजेक्शन । (ख) चूहों को एक-एक पूंछ के माध्यम से इंजेक्शन लगाया जाता था-उम्र के 7 सप्ताह में व्यर्थ इंजेक्शन (पूर्व रोगसूचक अवस्था). रीढ़ की हड्डी और quadriceps मांसपेशी ऊतक वितरण विश्लेषण (ग्रीन) के लिए अलग समय बिंदुओं पर SBMA चूहों के एक पलटन से एकत्र किए गए थे । SBMA चूहों के एक पलटन का इलाज किया और जैव रासायनिक विश्लेषण (लाल) के लिए उम्र के 16 सप्ताह में बलिदान दिया गया था । वजन और व्यवहार परख साप्ताहिक कार्यात्मक लक्षण वर्णन (नीला) के लिए उंर के ४० सप्ताह के लिए प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: AAV9-मीर-२९८ चूहों में डिलिवरी । विधि का उपयोग यहां वर्णित है, चूहों या तो AAV9-मीर-२९८-GFP या AAV9-नकली GFP नसों में इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया । कुल miRNA काठ का रीढ़ की हड्डी और quadriceps मांसपेशी से 2, 4, 8 और 12 सप्ताह के इंजेक्शन के बाद एकत्र किया गया था । qRT-पीसीआर मीर के अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान करने के लिए प्रदर्शन किया गया था-२९८ में (A) quadriceps मांसपेशी (n = 5) (B) काठ का रीढ़ की हड्डी (एन = 5, पी < 0.01) । सभी डेटा का अर्थ है ± मानक त्रुटि मतलब के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं । ऊतकों में AAV वेक्टर के व्यापक transduction 10 सप्ताह के उपचार के बाद में काटा GFP के लिए (ग) quadriceps मांसपेशी (मूल आवर्धन, 10x में दाग के स्थानीयकरण द्वारा पुष्टि की गई । स्केल बार = १०० µm) और (घ) काठ की रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स (मूल आवर्धन, 40X. स्केल बार = 10 µm. GFP (हरा), चैट (लाल) और DAPI (नीला) । यह आंकड़ा दोी: 10.1038/एमटी. 2016.13 से संशोधित किया गया है । 14 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: MiRNA-२९८ ओवर-एक्सप्रेशन downregulates उत्परिवर्ती एआर रीढ़ की हड्डी में और चूहों में quadriceps मांसपेशी । qRT-पीसीआर में एआर mRNA की अभिव्यक्ति के स्तर का अनुमान करने के लिए प्रदर्शन किया गया था (क) काठ का रीढ़ की हड्डी और (ख) quadriceps मांसपेशी AAV9 के साथ इलाज-मीर-२९८-GFP या AAV9-नकली-GFP । प्रतिलिपि स्तर snoRNA202 के लिए सामान्यीकृत थे (n = 5 उपचार के प्रति) । * p < 0.05, * * p < 0.01 । सभी डेटा का अर्थ है के रूप में रिपोर्ट कर रहे है ± मानक त्रुटि । यह आंकड़ा दोी: 10.1038/एमटी. 2016.13 से संशोधित किया गया है । 14

Figure 4
चित्रा 4: मीर-२९८ से अधिक-अभिव्यक्ति मोटर समारोह में सुधार और वजन घटाने कम कर देता है । व्यवहार मूल्यांकन सप्ताह में एक बार प्रदर्शन किया था (डब्ल्यू), 5 सप्ताह ४० के बीच । शरीर के वजन (बाएं) और हैंगिंग वायर (दाएँ) चूहों के प्रदर्शन (n = 15 प्रति समूह). सभी डेटा का अर्थ है के रूप में रिपोर्ट कर रहे है ± मानक त्रुटि । यह आंकड़ा दोी: 10.1038/एमटी. 2016.13 से संशोधित किया गया है । 14

Discussion

यहां हम एक अत्यंत कुशल और सुलभ पद्धति का चयन करें और पूंछ इंजेक्शन एक वायरल वेक्टर के रूप में rAAV9 का उपयोग कर miRNA के माध्यम से वितरित करने के लिए चूहों में कंकाल की मांसपेशी और मोटर ंयूरॉंस लक्ष्य का प्रदर्शन । 14 अंय RNAi रणनीतियों के मुकाबले, miRNAs कम विषाक्त और कम immunogenic हैं । 18 इसके अलावा, उनके छोटे आकार उंहें अच्छी तरह से वायरल वैक्टर की सीमित पैकेजिंग क्षमता के लिए अनुकूल बनाते हैं । 2 अभिकलनी एल्गोरिदम और पूर्वानुमान उपकरण ख्यात miRNA-mRNA लक्ष्यों की पहचान की अनुमति देते हैं । एक बार पहचान की, लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति पर miRNA के प्रभाव सत्यापित किया जाना चाहिए । एक आम दृष्टिकोण के लिए इन विट्रो में एक दिया miRNA व्यक्त और लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी विश्लेषण का उपयोग कर स्तर का पता लगाने है । 14 , 19

विभिंन अध्ययनों miRNAs वितरित करने के लिए वायरल और गैर वायरल रणनीतियों का इस्तेमाल किया है । 13 यहां हमने एक जीन डिलिवरी टूल के रूप में adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) का इस्तेमाल किया । अन्य वायरल वैक्टर की तुलना में, AAV कम immunogenicity बटोरता है, दीर्घकालिक जीन हस्तांतरण की अनुमति देता है, और विभाजन और गैर-विभाजित कोशिकाओं में tropism की एक व्यापक स्पेक्ट्रम है । 18 इस प्रसव विधि भी रासायनिक संशोधन है कि कार्यक्षमता और आरएनए अणु की विशिष्टता को प्रभावित कर सकते है की जरूरत को दरकिनार कर सकते हैं । AAV के कई serotypes हैं, जो अधिकांशतः कैप्सिड प्रोटीन की संरचना से निर्धारित होते हैं. ये serotypes उनके tropism और transduce विभिन्न प्रकार के सेल में अलग होते हैं । यह सही सीरोटाइप जब लक्ष्य ऊतक पर विचार का चयन करने के लिए आवश्यक है । हम rAAV9 चयनित, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और परिधीय प्रशासन के बाद कंकाल की मांसपेशी में अपनी उच्च transduction दक्षता के कारण19,20. यह दृष्टिकोण वयस्क जानवरों की तुलना में नवजात जानवरों में अधिक से अधिक transduction प्रभावकारिता दिखाया गया है, extracellular मैट्रिक्स संरचना में अंतर के कारण होने की संभावना, न्यूरॉन-टू-glia अनुपात, और रक्त मस्तिष्क बाधा की परिपक्वता. 21 , 22

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम अभिव्यक्ति वेक्टर के डिजाइन है । bicistronic वैक्टर के साथ तुलना में, जो दूसरे जीन की कम अभिव्यक्ति से बाधा है पहले प्रवर्तक के बगल में जीन के साथ तुलना में, दोहरी प्रमोटर वेक्टर एक वापस करने वाली वापस विंयास दोनों miRNA और EGFP की उच्च अभिव्यक्ति उपज की अनुमति देता है, इस प्रकार इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा माउस ऊतक में miRNA के स्थानीयकरण की अनुमति.

AAV9 के नसों में इंजेक्शन उच्च दक्षता और लक्ष्य ऊतकों, कंकाल की मांसपेशी, और मोटर न्यूरॉन्स में समरूप transduction में हुई । इंजेक्शन का यह मार्ग प्रशासित खुराक प्रणालीगत संचलन तक पहुंचने और मस्तिष्क रक्त बाधा है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को लक्षित उपचारों के लिए महत्वपूर्ण है पार करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, यह सीएनएस को प्रसव के लिए एक गैर इनवेसिव विधि है । मीर-२९८ अभिव्यक्ति रीढ़ की हड्डी में वृद्धि हुई और मांसपेशियों में 2-4 सप्ताह के बाद एक एकल परिधीय इंजेक्शन के साथ उंर के 5 सप्ताह में । जब एकल असहाय जीनोम AAV वैक्टर का उपयोग कर, दूसरा डीएनए किनारा के de नोवो संश्लेषण देरी transduction के लिए खाते में हो सकता है । 23

मानव मीर के स्तर-२९८ इलाज चूहों में undetect थे 20 सप्ताह एक प्रशासन के बाद, सुझाव है कि पुराने रोगों के लिए, कई इंजेक्शन एक चिकित्सीय लाभ तक पहुंचने के लिए आवश्यक हो सकता है । हालांकि, समय के साथ miRNA गिरावट सीमित किया जा सकता है जब एक आजीवन दोहराया प्रशासन की आवश्यकता है । इसके अलावा, AAV वैक्टर करने के लिए अनुकूली उन्मुक्ति एक सफल जीन वितरण के लिए एक और बाधा फार्म कर सकते हैं । 24 AAV वैक्टर कि immunologically निष्क्रिय कर रहे है के इस प्रकार पीढ़ी दोहराया प्रशासन के लिए महत्वपूर्ण है और इस होनहार वितरण प्रणाली के साथ दीर्घकालिक प्रभाव को प्राप्त करने । 25

एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में miRNA के उपयोग पर एक सीमा ऑफ लक्ष्य प्रभाव का खतरा है । MiRNAs अंय जीन टेप है, जो इस दृष्टिकोण के साथ एक सुरक्षा जोखिम बन गया है के साथ जोड़कर पूरक आधार के माध्यम से बातचीत कर सकते हैं । RNAi दृश्यों की डिजाइनिंग में सुधार, गैर विहित miRNAs के उपयोग सहित, mirtrons, जो माइक्रो-प्रोसेसर जटिल और व्यापक दीर्घकालिक सुरक्षा और सहनशीलता अध्ययन बाईपास एक सुरक्षित में इस रणनीति का अनुवाद करने से पहले महत्वपूर्ण हैं और प्रभावी चिकित्सा । 26 , 27 , 28

विधि यहां वर्णित मूल miRNA के लिए विकसित किया गया था, लेकिन यह भी antagomirs का उपयोग कर miRNA अवरोध चिकित्सा के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की । हम AAV9 वायरस के उत्पादन के लिए SignaGen प्रयोगशालाओं (Rockvile, प्रबंध निदेशक, संयुक्त राज्य अमेरिका) धंयवाद । इस शोध को NINDS, NIH के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया । फिलिप आर ली ने niched के अंदर अनुसंधान के विभाजन से धन का समर्थन किया था । कार्लो रिनाल्डी एसोसिएशन फ़्रांसेज़ contre लेस Myopathies (AFM) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 Purification of miRNA and total RNA
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit ThermoFisher Scientific 4366596 A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs
snoRNA202 Primer ThermoFisher Scientific 1232 Taqman miRNA control assay in mouse
miR-298 Primer ThermoFisher Scientific 2190 Taqman miRNA-298 assay in mouse
Anti-GFP antibody abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade
Red ink pad Dovecraft Essentials
Blue ink pad Dovecraft Essentials
AAV9-GFP vector SignaGen Laboratories SL100840 Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification
mmu-miR-298-5p ThermoFisher Scientific MC12525 mirVana miRNA mimic
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP Vector Biosystems Inc

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References

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आनुवंशिकी अंक १३८ miRNA आरएनए चिकित्सीय rAAV जीन थेरेपी जीन मुंह बंद करने Neuromuscular रोग
रिकॉमबिनेंट Adeno-एसोसिएटेड वायरस सीरोटाइप 9 का उपयोग कर MicroRNA की प्रणालीगत डिलिवरी कुतर में Neuromuscular रोगों का इलाज
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