Summary
Här beskriver vi leveransen av mikroRNA använda en rekombinant adeno-associerade virus serotyp 9 i en musmodell av en neuromuskulär sjukdom. En perifer administrering hos möss medförde varaktiga miRNA överuttryck i muskel och motoriska nervceller, vilket ger en möjlighet till studie miRNA funktion och terapeutiska potential i vivo.
Abstract
RNA-interferens via endogena miRNA vägen reglerar genuttryck genom att kontrollera proteinsyntes genom post-transcriptional nedtystning. Under de senaste åren har miRNA-medierad genreglering visat potential för behandling av neurologiska sjukdomar som orsakas av en giftig vinst på funktion mekanism. Effektiv leverans till målvävnaderna har dock begränsat dess tillämpning. Använde här vi en transgen musmodell för spinal och bulbär muskelatrofi (SBMA), en neuromuskulär sjukdom orsakas av polyglutamine expansion i androgenreceptorn (AR), att testa nedtystning av en nyligen identifierade AR-targeting miRNA, miR-298. Vi i ökad utsträckning miR-298 använder en rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) serotyp 9 vektor för att underlätta transduktion av icke-dela celler. En enda svans-ven injektion i SBMA möss inducerad ihållande och utbredd överuttryck av miR-298 i skelettmuskulaturen och motoriska nervceller och resulterade i förbättring av den neuromuskulära fenotypen i möss.
Introduction
MicroRNA icke-kodande RNAs, 21-23 nukleotider i längd, som spelar en viktig roll i reglering av genuttryck och kontroll av olika cellulära och metabola vägar. 1 genuttrycket regleras främst genom att inducera post-transcriptional gene silencing eller mRNA nedbrytning. 2 MicroRNA är vanligtvis kompletterande till 3' oöversatta regionen (UTR) kodande gener, även om bindande till de 5' UTR och kodning regioner i målet mRNA har också beskrivits. 3
Som den nuvarande förståelsen av miRNA i patogenesen av mänskliga sjukdomar roller expanderar, blir farmakologisk modulering av enskilda MicroRNA eller miRNA familjer alltmer ett terapeutiskt alternativ. MicroRNA jämfört med andra strategier för hämning av RNA, och har många fördelar: MicroRNA är mindre giftiga och mindre immunogent och enkelt kan levereras i celler på grund av sin ringa storlek. 4 , 5 , 6 MicroRNA har vanligtvis många mål inom mobilnät, därför potentiella off-target effekter och säkerhetsaspekter måste beaktas, tillsammans med effektiv leverans till målvävnaderna.
Neuromuskulära sjukdomar är förvärvade eller ärftliga förhållanden som påverkar muskler och motoriska nervceller. Inriktningen av droger till skelettmuskulaturen är ett framväxande område för forskning, där den största utmaningen är att uppnå omfattande utbredning inom det terapeutiska fönstret. 7 motoriska nervceller är svårare att rikta, främst eftersom drog tillgång hindras av blod-hjärnbarriären.
Kultur och mus cellmodeller av spinal och bulbär muskelatrofi (SBMA) användes i denna studie. SBMA är en neuromuskulär sjukdom som orsakas av en giftig vinst av funktionen mekanism, då både muskler och nervceller motor påverkas. 8 , 9 SBMA (Kennedys sjukdom; OMIM #313200) är en X-bunden sjukdom, som kännetecknas av muskelsvaghet och atrofi, följd av CAG upprepad expansion i AR-genen, som kodar en utökad polyglutamine tarmkanalen i AR proteinet. 10 ingen sjukdomsmodifierande behandling är för närvarande tillgänglig för denna sjukdom. Transgen musmodell används i denna studie recapitulates funktioner av sjukdomen, inklusive kön specificitet, motorneuron patologi och progressiv muskelatrofi. 11
I denna studie, våra ansträngningar inriktade på att identifiera ett miRNA som direkt downregulates uttryck för den muterade AR transgenens och på att utforma en säker och effektiv läge för leverans av miRNA till ryggmärgen och skelettmuskulaturen av vår sjukdom musmodell.
Här identifierat vi en relativt uncharacterized miRNA, miRNA-298 (anslutningen nummer MIMAT0004901),12 att direkt minska mutant AR uttryck i SBMA modeller. För att uppnå leverans av miR-298 till målvävnaderna, använde vi en viral strategi, med rekombinant adeno-associerade virus serotyp 9 (rAAV9). rAAV9 kan korsa blod-hjärnbarriären och medla långsiktiga genuttryck i icke-dela celler, inklusive nervceller. 13 en enda systemisk administrering av AAV9-miR-298 resulterade i ihållande uttryck för miRNA, effektiv transduktion av muskler och motoriska nervceller, down-förordning AR yttrandefrihet, och förbättringen av den sjukdom fenotypen i SBMA möss. 14 denna metod kan användas för att tillhandahålla miRNA eller antagomirs överuttryck i vivo.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med den nationella institut för hälsa Guide för skötsel och användning av försöksdjur (8th ed., nationella akademier Press, reviderad 2011), och har godkänts av utskottet NINDS djur för hand.
1. AAV9-miRNA design strategi och miRNA urval
- Använd miRWalk prediktiva databas för att välja kandidat MicroRNA som samverkar med mRNA 3' UTR regionen av målgenen. 15
Obs: Begränsa minsta frö längd av miRNA sekvens till minst 7 nukleotider. Välj andra etablerade miRNA prognos program (miRanda, miRDB, Targetscan) för jämförande analys. Baserat på dessa urvalskriterier, här, valdes miR-185, miR-298, miR-873 och miR-877 ut för vidare utvärdering. - Hämta sekvensen av den valda miRNA från miRBase (http://www.mirbase.org/).
- Klona pri-mir (60-70 nts) och dess 250-300 nts flankerande genomiska sekvensen på både sidor, eller en mock sekvens, i den lämpliga AAV cis vektor.
Obs: Kompletterande sekvensen krävs för rätt pri-mir uttryck och mogen mikroRNA bearbetning. Välj en dual-promotorn rAAV cis vektor med en uttryck kassett som består till exempel av en mänsklig töjning factor-1 alpha (EIF1α) arrangören följt av det valda miRNA eller håna sekvens och promotorn human cytomegalovirus (CMV) följt av cDNA kodning GFP fluorescerande etiketten. EIFα arrangören valdes eftersom det garanterar stabilt och homogent uttryck, med minimal risk för ljuddämpning. Vävnaden specifika eller villkorlig initiativtagare kan användas, beroende på specifika program. - Förbereda, rena och titrera AAV, följande publicerade protokoll. 16
Obs: Här, kloning av pri-mir i AAV vektor och viral produktionen utfördes av en extern tillverkare.
2. svansen ven injektion av AAV-miRNA Plasmid
Obs: Detta steg måste justering enligt målgenen och ålder och vikt av möss. Använd institutionella och djur vård och användning kommittén (IACUC) riktlinjer för att fastställa dosintervallet, volym och bästa administreringsvägen baserat på ålder och vikt av möss. GFP fluorescens signal och miRNA uttrycksnivåerna i målvävnad förväntas topp start 2 veckor efter injektionen. Följande protokoll refererar till hanmöss i tidig vuxen ålder. AAV ska hanteras som ett biologiskt enligt riktlinjerna för biosäkerhet nivå 1.
- Dela AAV-miRNA plasmid lager i 100-200 µL portioner som innehåller en virusbelastning på 1010-1011 virala genomer per mL (vg/mL) med hjälp av steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Laboratoriet biohazard personlig skyddsutrustning bör användas för att hantera AAV lösningen.
Obs: När en alikvot är tinade det kan lagras vid 4 ° C i upp till två veckor. Viral lager kan lagras i-80 ° C frys. - Hindra musen i kommersiellt tillgängliga restrainers såsom plast eller avsmalnande plastfilm tub av rätt storlek.
- Ren ytan på svansen med 70% spritkompresser.
- Hålla en varm pad (28-30 ° C) under svansen för att öka vasodilatation för 30 s. Alternativt, varma djuren med en röd värmelampa (på ett avstånd av 2-3 fot) eller genom att doppa svansen i varmt vatten.
-
Start från den distala delen av svansen, stick in nålen (27-30 G) laddade med den virala alikvoten, avfasning, 15° från svansen, i venen. Före injektion, se till att nålen är isatt.
- Om motstånd känns under injektion eller svullnad visas under huden, stoppa förfarandet. Ta bort nålen och stick in nålen ovan tidigare injektionsstället.
Obs: Alternativt, detta kan uppnås genom aspirera försiktigt nålen och observera blod. Hårda aspiration kan komprimera svans venen. Om venen blanches under injektionen, ligger nålen isatt.
- Om motstånd känns under injektion eller svullnad visas under huden, stoppa förfarandet. Ta bort nålen och stick in nålen ovan tidigare injektionsstället.
- Efter injektionen har slutförts, vänta några sekunder innan höja nålen.
- Iaktta injektionsstället för blödning. Använd måttligt tryck med två fingrar till platsen tills blödningen stannar.
- Tillbaka djuret till sin bur.
3. beteendemässiga analyser
Obs: Alla experiment genomfördes blint av en tredje part med döljande av behandlingar av unikt kodad injektionsflaskor. Beställning av behandlingar var randomiserade. När du utför de tester som beskrivs nedan, bör experimentella förhållanden (typ av rum) och tid på dagen kontrolleras för att minska variationen. Detta test bör utföras på möss som är äldre än fyra veckor att uppnå tillförlitliga resultat. Mus genomgick beteendemässiga bedömning en gång innan viral injektion vid 5 veckors ålder att få baslinjen av normala prestanda. Efter viral injektion bedömdes möss en gång i veckan börjar 48 h efter injektion, upp till 40 veckors ålder.
- Föra musen injiceras med AAV till ett tyst, mörkt rum som är fri från buller eller andra störningar i minst 30 min innan testerna. Stör inte djuren under denna period av acklimatisering.
- Acklimatisera sig musen till nya rummet i 30 min och sedan starta de följande beteende analyserna (steg 3.3 och 3.4). Hålla en lucka på 10 min mellan varje beteende analys.
-
Hängande tråd test
Obs: Detta test övervakar muskelstyrka och oralmotorisk dysfunktion.- Använda ett stoppning för att agera som en kudde. Plocka upp musen genom sin svans och placera den i mitten av tråd rutnät racket. Höja racket 15-20 inches ovanför ytan och sakta Invertera skärmen för att låta djuret att justera greppet på skärmen.
- När räcket är helt inverterad, starta tiduret och registrera den tid att falla.
Obs: Möss kommer att hänga med fyra lemmar på ett rutnät. Om kabeln är för lågt inställd kan möss inte hänga på. Om möss ramla nätet innan 60 s, placera dem tillbaka på nätet, nollställa timern och upprepa proceduren upp till två ytterligare försök. Registrera dig bästa prestanda. - När den tidsfrist på 60 s nås, returnera animaliska baksidan till buren.
-
Foot print assay
Obs: Den absorberande ark bör vara en smal bana ca 70 cm långa och 5 cm bred med 5 cm höga murar.- Håll musen försiktigt ena handen och applicera rött bläck till främre tassar och blått bläck till hind tassarna med en borste.
- Placera den absorberande ark på golvet i en smal bana.
- Låt musen för att gå eller springa över en absorberande ark i en rak linje i banan från ena änden till andra.
- Upprepa processen två gånger med musen med en färsk absorberande ark.
- Mät avståndet mellan två på varandra följande steg i den framåt rörelsen. Inte inkluderar först och sist några fotspår där djuret är bara inleda och avsluta dess körning.
4. dödshjälp och vävnad skörd
- Använd en dödshjälp kammare eller en glaskupa. Om du använder en glaskupa, följer du anvisningarna under ett dragskåp.
- Fukta bomull med isofluran och placera den i en glaskupa. Använd en fysisk avgränsare för att hålla djuret från fysisk kontakt med anestesi material. Placera djuret i burken omedelbart efter detta steg.
Obs: Glaskupa bör inte pre laddade med isofluran att undvika risken för hypoxemi i djuren. - Fortsätt isofluran exponering till 30 s efter andningen stannar.
- Omedelbart efter bort musen från burken, eutanasi av cervikal dislokation.
Obs: Detta steg bör ske så snabbt som möjligt att undvika vävnad nedbrytning. -
Skörd av spinal cord först och sedan quadriceps skelettmuskulaturen.
- Att skörda ryggmärgen, exponera baksidan av musen och fixa fyra armar och ben på sidan till en dissektion styrelse.
- Tvätta platsen för dissekering med 70% etanol.
- Utföra cervikal dislokation med hjälp av en vass sax.
- Gör ett snitt i huden i mittlinjen. Ta bort pelt genom att antingen skära eller försiktig rivning av huden i tvärplanet, följt av att dra pelt upp och över huvudet. Ta bort huvudet genom att skära med sax under skulderbladen och i regionen C1-2 i kolumnen (finns i anslutning till basen av skallen).
- Skär den buk-vägg muskulaturn på ventrala sida och fortsätta sidled, en riktning i taget, tills ryggrads-kolonnen är nådd.
- Med en skarp sax ta bort Kotor start från den cervikala ryggmärgen. Ta bort de laterala delarna av kotorna genom att skära över ryggraden valv på båda sidor.
- Efter att ta bort hela kotorna släpp ryggmärgen.
-
Snapin frysa skördade vävnader i förväg kylda 2-methylbutane med följande metod:
- Hälften Fyll en rostfri skål med 2-methylbutane och dränka kvarteret botten av skålen i en behållare fylld med flytande kväve.
- Pre chill den 2-methylbutane i flytande kväve för 1-2 min.
- Placera skelettmuskulaturen med pincett i den 2-methylbutane tills den blir vit. Omedelbart överföra vävnaden torr is och sedan lagra den vid-80 ° C.
- För ryggmärgen immunfärgning, bädda in vävnaden i paraffinblock rumstemperatur före snapin frysning som beskrivs. 17
- För biokemisk analys och miRNA kvantifiering,1 placera skördade vävnaden i en cryovial och frysa i flytande kväve. Lagra proverna vid-80 ° C.
Representative Results
En virusbelastning 1011 VG av AAV9-miR-298 injicerades genom en engångsinjektion svans-ven i 5 veckor gamla SBMA möss. Dessa möss bära den mänskliga AR transgenens med onormalt utvidgade polyglutamine tarmkanalen i AR (AR97Q) och utveckla tecken på neuromuskulär sjukdom genom 10 veckors ålder (viktminskning, krökt rygg och muskelatrofi). 11 ländryggen ryggmärgen och quadriceps muskel skördades på 2, 4, 8 och 12 veckor efter administrering för miRNA kvantifiering, biokemisk analys och immunohistokemi (figur 1). Administrering av behandling och efterföljande analyser utfördes av blindad utredare.
qRT-PCR analys visade miR-298 uttryck i skelettmuskulaturen och ryggmärgen två veckor och fyra veckor efter behandling respektive med uttrycket toppnivåer på 8 veckor i skelettmuskulaturen och 12 veckor i ryggmärgen efter injektionen (figur 2 ). Med Mikroskop (Axiovert 100 M) upptäcktes grön fluorescens signal i muskelvävnad och spinal motoriska nervceller av samtidig lokalisering av god Jordbrukarsed och den motorneuronen markör kolin kolinacetyltransferas (ChAT) 10 veckor efter behandling, när mössen börja Visa sjukdom manifestationer (figur 2).
Använder den samma dosregimen, var en kohort av SBMA möss randomiserades till att få antingen miR-298 eller håna vid 7 veckors ålder via svans ven injektion för biokemiska analyser och funktionell karakterisering. Injektion följdes av veckans vikt och beteendemässiga bedömning till 40 veckors ålder. qRT-PCR-analys visade att miR-298 behandling minskar nivåerna av mutant AR i drabbade vävnader (figur 3), och ökad kroppsvikt och förbättrad motor prestanda (figur 4) börjar vid 10 veckor efter injektionen.
Figur 1: Schematisk av studiedesign. För att öka uttrycksnivåerna av miR-298 in vivo injiceras vi SBMA möss med (A), dubbla arrangören AAV vektorn plasmid uttrycker GFP och miR-298 eller mock. (B) möss injicerades via en enda svans-förgäves injektion vid 7 veckors ålder (pre-symtomatiska Stadium). Ryggmärgen och quadriceps muskel samlades in från en kohort av SBMA möss vid olika tidpunkter för vävnadsanalys distribution (grön). En kohort av SBMA möss var behandlade och offras vid 16 veckors ålder för biokemiska analyser (röd). Vikt och beteendemässiga analyser utfördes varje vecka upp till 40 veckors ålder för funktionell karakterisering (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: AAV9-miR-298 leverans hos möss. Möss med metoden som beskrivs här, och fick antingen AAV9-miR-298-GFP eller AAV9-mock-GFP genom intravenös injektion. Totala miRNA inhämtades från ländryggen ryggmärgen och quadriceps muskel på 2,4,8 och 12 veckor efter injektionen. qRT-PCR utfördes för att uppskatta uttryck av miR-298 (A) quadriceps-muskeln (n = 5) (B) ländryggen ryggmärgen (n = 5, P < 0,01). Alla data rapporteras som betyder ± medelfel medelvärdet. Den utbredda transduktion AAV vektorns i vävnader som skördas på 10 veckor efter behandling bekräftades av lokalisering av färgning för god Jordbrukarsed i (C) quadriceps muskeln (ursprungliga förstoring, 10 X. Skalstapeln = 100 µm) och (D) motoriska nervceller i ländryggen ryggmärgen (ursprungliga förstoring, 40 X. Skalstapeln = 10 µm. GFP (grön), chatt (röd) och DAPI (blå). Figuren har ändrats från doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: MiRNA-298 över uttrycket downregulates mutant AR i ryggmärgen och quadriceps muskel i möss. qRT-PCR utfördes för att uppskatta uttrycksnivåerna för AR mRNA i (A) ländryggen ryggmärgen och (B) quadriceps muskler behandlas med AAV9-miR-298-GFP eller AAV9-mock-GFP. Avskrift nivåer var normaliserade till snoRNA202 (n = 5 per behandling). * P < 0,05, ** P < 0,01. Alla data rapporteras som betyder ± standardfel. Figuren har ändrats från doi: 10.1038/mt.2016.13. 14
Figur 4: MiR-298 över uttryck förbättrar motorik och minskar viktminskning. Beteendemässiga bedömning utfördes en gång i veckan (w), mellan vecka 5 till 40. Kroppsvikt (vänster) och hängande tråd (höger) prestanda hos möss (n = 15 per grupp). Alla data rapporteras som betyder ± standardfel. Figuren har ändrats från doi: 10.1038/mt.2016.13. 14
Discussion
Här visar vi en mycket effektiv och tillgänglig metod för att välja och leverera via svans injektion en miRNA med rAAV9 som en viral vektor för att rikta skelettmuskulaturen och motoriska nervceller hos möss. MicroRNA 14 jämfört med andra RNAi-strategier, och är mindre giftiga och mindre immunogena. 18 dessutom deras ringa storlek gör dem väl lämpade för begränsad förpackning kapacitet virala vektorer. 2 computational algoritmer och prognosverktyg tillåter identifiering av förmodad miRNA-mRNA mål. När identifierat, måste effekterna av miRNA på target genuttryck verifieras. En vanlig metod är att överuttrycka en given miRNA in vitro- och upptäcka målnivåer protein uttryck för att använda västra analys. 14 , 19
Olika studier har använt viral och icke-virala strategier för att leverera microRNA. 13 här använde vi adeno-associerade virus (AAV) som ett verktyg för leverans av genen. AAV jämfört med andra virala vektorer, och framkallar låg immunogenicitet, tillåter långsiktiga genöverföring, och har ett brett spektrum av tropism dela och icke-dela celler. 18 detta leveranssätt kan även kringgå behovet av kemisk modifiering som kan påverka funktionalitet och specificitet av RNA-molekylen. I området i närheten finns det flera serotyper av AAV, vilka bestäms huvudsakligen av sammansättning av kapsid proteiner. Dessa serotyper skiljer sig åt i deras tropism och transduce olika celltyper. Det är nödvändigt att välja rätt serotypen när man överväger målvävnaden. Vi valde rAAV9, på grund av dess höga transduktion effektivitet i centrala nervsystemet och skelettmuskel efter perifer administrering19,20. Denna strategi har visat större transduktion effekt hos neonatala djur jämfört med vuxna djur, troligen på grund av skillnader i extracellulär matrix sammansättning, baserat på neuron-till-glia och mognad av den blod-hjärna-barriären. 21 , 22
Ett viktigt steg i detta protokoll är design av uttrycket vektorn. Dubbla arrangören vektorn jämfört med bicistronic vektorer, som hämmas av lägre uttryck av andra genen jämfört med den första genen bredvid arrangören, och tillåter en back-to-back konfiguration som ger hög uttryck för både miRNA och andra, således så att lokalisering av miRNA i mus vävnad genom immunofluorescens.
Intravenös injektion av AAV9 resulterade i hög effektivitet och homogen transduktion i målvävnaderna, skelettmuskel och motoriska nervceller. Denna väg av injektion tillåter den administrerade dosen når den systemiska cirkulationen och passera blod-hjärnbarriären, vilket är viktigt för terapier riktar sig det centrala nervsystemet. Dessutom är det en icke-invasiv metod för leverans till CNS. MiR-298 uttryck ökade i ryggmärgen och muskel efter 2-4 veckor med en enda perifer injektion vid 5 veckors ålder. När använder enkelsträngade genomet AAV vektorer, de novo syntesen av de andra DNA-strängen kan redovisa den fördröjda transduktion. 23
Nivåerna av mänskliga miR-298 var omätbara i behandlade möss 20 veckor efter en engångsdos, vilket tyder på att för kroniska sjukdomar, flera injektioner kan krävas att nå en terapeutisk fördel. MiRNA nedbrytning över tiden kan dock vara begränsande när ett livslångt upprepad administrering krävs. Adaptiv immunitet mot AAV vektorer kan dessutom utgör ett annat hinder för en framgångsrik gen leverans. 24 således generation av AAV vektorer som är immunologiskt inerta är avgörande för upprepad administrering och att uppnå långsiktiga effekter med denna lovande leveranssystem. 25
En begränsning av användningen av miRNA som en terapeutisk strategi är risken för off-target effekter. MicroRNA kan interagera genom incomplementary bas ihopkoppling med andra gen avskrifter, som utgör en säkerhetsrisk med detta synsätt. Förbättrad utformning av RNAi sekvenser, inklusive användning av icke-kanoniska MicroRNA, såsom mirtrons, som kringgå mikro-processor komplex och omfattande långsiktiga säkerhet och tolerabilitet studier är kritiska innan att omsätta denna strategi i en säker och effektiv behandling. 26 , 27 , 28
Den metod som beskrivs här utvecklades ursprungligen för miRNA överuttryck, men det kan också användas för miRNA hämning terapi med antagomirs.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna förklarar någon intressekonflikt. Vi tackar SignaGen laboratorier (Rockvile, MD, USA) för AAV9 virus produktion. Denna forskning stöds av intramurala forskningsprogrammet av NINDS, NIH. Philip R. Lee stöddes av medel från den uppdelning av intramurala forskning av NICHD. Carlo Rinaldi stöddes av ett stipendium från Association Française contre les myopatier (AFM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
| snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
| miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
| Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade |
| Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
| mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
| AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |
References
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. miRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).
- Pickering, B. M., Willis, A. E. The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease. Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).
- Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration. Mol Cell. 24, 157-163 (2006).
- Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis. Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).
- Liu, N., et al. The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila. Nature. 482, 519-523 (2012).
- Ebner, D. C., et al. Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery. Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).
- Giorgetti, E., Lieberman, A. P. Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease. Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).
- Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management. Oral Dis. 20, 6-9 (2014).
- La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 352, 77-79 (1991).
- Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 35, 843-854 (2002).
- Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1. J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).
- Choudhury, S. R., et al. Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector. Mol Ther. 24, 726-735 (2016).
- Pourshafie, N., et al. MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy. Mol Ther. 24, 937-945 (2016).
- Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes. J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Stuard, D. A., Oorschot, D. E. Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord. J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).
- Huang, F., et al. miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3. FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).
- Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. Experimental validation of miRNA targets. Methods. 44, 47-54 (2008).
- Yang, N. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).
- Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).
- Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Wang, Z., Ma, H. -I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).
- Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington’s disease. Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).
- Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Lowenstein, P. R. Crossing the rubicon. Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).
- Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. Silencing of Parkinson's disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224. Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).
