Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Systemisk levering av MicroRNA ved hjelp av rekombinant Adeno-assosiert Virus Serotype 9 til å behandle Neuromuscular sykdommen i gnagere

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/55724
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1, 1,4
1Neurogenetics Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Section on Nervous System Development and Plasticity, The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child and Human Development, National Institutes of Health, 3Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University, 4Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford

Summary

Her beskriver vi levering av microRNA bruker en rekombinant adeno-assosiert virus serotype 9 i en musemodell av en neuromuscular sykdommen. En enkelt ekstern administrasjon i mus resulterte i vedvarende miRNA overuttrykte i muskel og motor neurons, gir en mulighet til å studere miRNA funksjon og terapeutiske potensielle i vivo.

Abstract

RNA-interferens via endogene miRNA veien regulerer genuttrykk ved å kontrollere proteinsyntese gjennom post-transcriptional gene stanse. De siste årene, har miRNA-mediert genet regulering vist potensial for behandling av nevrologiske sykdommer forårsaket av en giftig gevinst funksjon mekanisme. Men har effektiv levering målet vev begrenset sin søknad. Vi brukte her en transgene musemodell for bulbar og spinal muskel atrofi (SBMA), en nevromuskulær sykdom forårsaket av polyglutamine ekspansjon i androgen reseptoren (AR), teste genet stanse ved en nylig identifisert AR målretting miRNA, miR-298. Vi overexpressed miR-298 bruker en rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) serotype 9 vektor for å lette Albin på ikke-dele celler. En enkelt halen blodåre injeksjon i SBMA mus indusert vedvarende og utbredt overuttrykte miR-298 i skjelettlidelser muskel og motor neurons og resulterte i forbedring av nevromuskulær fenotypen i mus.

Introduction

MiRNAs er ikke-koding RNAs, 21-23 nukleotider i lengde, som spiller en viktig rolle i regulering av genuttrykk og kontroll av ulike mobilnettet og metabolske veier. 1 genuttrykk reguleres hovedsakelig ved å indusere post-transcriptional gene stanse eller mRNA degradering. 2 MiRNAs er vanligvis komplementære til 3 uoversatt regionen (UTR) koding gener, men binding til den 5' UTR og koding regioner av målet mRNA har også vært beskrevet. 3

Som den nåværende forståelsen av rollene miRNA i patogenesen av menneskelige sykdommer utvides, blir stadig farmakologiske modulering av individuelle miRNAs eller miRNA familier et levedyktig terapeutisk alternativ. Sammenlignet med andre RNA hemming strategier, miRNAs har mange fordeler: miRNAs er mindre giftig og mindre immunogenic og kan lett leveres i celler på grunn av sin lille størrelse. 4 , 5 , 6 MiRNAs har vanligvis mange mål innen mobilnettverk, derfor potensielle off-målet effekter og sikkerhetsmessige hensyn må tas i betraktning, sammen med effektiv levering målet vev.

Neuromuscular sykdommen er ervervet eller arvet forhold som påvirker muskler og motor neurons. Målretting narkotika skjelettmuskulatur er en voksende område på forskning, der den største utfordringen er å oppnå utbredt distribusjon i vinduet terapeutisk. 7 Motor neurons er vanskeligere å målrette, hovedsakelig fordi narkotika tilgang er utelukket av blod-hjernebarrieren.

Celle kultur og musen modeller av bulbar og spinal muskel atrofi (SBMA) ble brukt i denne studien. SBMA er en neuromuscular sykdommen skyldes en giftig gevinst funksjon mekanisme, der både muskler og motor neurons er berørt. 8 , 9 SBMA (Kennedys sykdom; Sette OMIM #313200) er en X-tilknyttet sykdom, preget av muskelsvakhet og atrofi, forårsaket av CAG gjenta ekspansjon i AR genet, som koder et utvidet polyglutamine skrift i AR protein. 10 ingen sykdom-modifisere behandling er tilgjengelig for denne lidelsen. Transgene musemodell som brukes i denne studien viser funksjonene i sykdommen, inkludert kjønn spesifisitet, motoriske nervecellen patologi og progressiv muskelatrofi. 11

I denne studien satsingen fokusert på å identifisere en miRNA som direkte downregulates uttrykk mutant AR transgene og utforme en sikker og effektiv måte å levering av miRNA i ryggmargen og skjelettlidelser muskel av vår sykdom musemodell.

Her identifisert vi en relativt uncharacterized miRNA, miRNA-298 (tiltredelse nummer MIMAT0004901),12 direkte redusere mutant AR uttrykk i SBMA modeller. For å oppnå levering av miR-298 målet vev, brukte vi en viral strategi, med rekombinant adeno-assosiert virus serotype 9 (rAAV9). rAAV9 er i stand til krysset blod-hjernebarrieren og formidling langsiktige byggkorn under ikke-dele celler, inkludert nerveceller. 13 en enkelt systemisk administrasjon av AAV9-miR-298 resulterte i vedvarende uttrykk for miRNA, effektiv signaltransduksjon av muskel- og motor neurons, ned-regulering av AR uttrykk og forbedring av sykdom fenotypen i SBMA mus. 14 denne metoden kan brukes til å gi miRNA eller antagomirs overuttrykte i vivo.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide og bruk av forsøksdyr (8 ed., National Academies Press, revidert 2011), og er godkjent av NINDS dyr omsorg komiteen.

1. AAV9-miRNA design strategi og miRNA utvalg

  1. Bruk miRWalk prediktiv databasen for å velge kandidaten miRNAs som samhandler med mRNA 3 UTR regionen målet genet. 15
    Merk: Begrense minimum frø lengden av miRNA til minst 7 nukleotider. Velg andre etablerte miRNA prediksjon programmer (miRanda, miRDB, Targetscan) for komparativ analyse. Basert på disse utvalgskriterier, her, ble miR-185, miR-298, miR-873 og miR-877 valgt for videre evaluering.
  2. Hente sekvensen av den valgte miRNA fra miRBase (http://www.mirbase.org/).
  3. Klone pri-mir (60-70 nts) og dens 250-300 nts flankert genomisk orden på begge sider, eller en uekte sekvens, i den aktuelle AAV cis vektor.
    Merk: Flankemanøveren sekvensen er nødvendig for riktig pri-mir uttrykk og moden microRNA behandling. Velg en dual-arrangøren rAAV cis vektor med en uttrykk kassett består for eksempel av en menneskelig forlengelse faktor-1 alpha (EIF1α) promoter etterfulgt av den valgte miRNA eller uekte sekvens, og arrangøren av menneskelig cytomegalovirus (CMV) etterfulgt av cDNA koding GFP fluorescerende koden. EIFα selskapet ble valgt fordi det garanterer stabil og homogen uttrykk, med minimal risiko med demping. Vev spesifikke eller betinget arrangører kan brukes, avhengig av spesifikke applikasjoner.
  4. Forberede, rense og sjarmere AAV, følgende publiserte protokoller. 16
    Merk: Her, kloning av pri-mir i AAV vektor og viral produksjonen ble utført av en ekstern produsent.

2. hale blodåre injeksjon av AAV-miRNA plasmider

Merk: Dette trinnet må justeres i henhold til mål genet og alder og vekt av mus. Bruk Institutional og Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer for å bestemme spekter dose, volum og beste bruksmåten basert på alder og vekt av mus. GFP fluorescens signal og miRNA uttrykk nivåer i målet vev forventes å topp starter 2 uker etter injeksjon. Følgende protokollen refererer til mannlige mus i tidlig voksen alder. AAV skal behandles som en biohazard under biosikkerhet nivå 1 retningslinjer.

  1. Dele AAV-miRNA plasmider aksjer i 100-200 µL dele inneholder en viral belastning av 1010-1011 viral genomer per mL (vg/mL) bruker sterilt fosfat bufret saltvann (PBS). Laboratoriet biohazard personlig verneutstyr bør brukes til å håndtere AAV løsningen.
    Merk: Når en aliquot er tint det kan lagres på 4 ° C i opptil to uker. Viral lager kan lagres i-80 ° C fryseren.
  2. Holde musen i kommersielt tilgjengelig restrainers som plast eller konisk plastfilm tube av passende størrelse.
  3. Rengjør overflaten av halen med 70% alkohol wipes.
  4. Holde en varm pad (28-30 ° C) under halen å øke vasodilatasjon for 30 s. Alternativt, varm dyrene med en rød varmelampe (i en avstand på 2-3 fot) eller dipping halen i varmt vann.
  5. Utgangspunkt for halen, sette inn nålen (27-30 G) lastet med viral aliquot, skråkant, 15° fra halen, i venen. Før injeksjon, kan du kontrollere nålen er satt inn riktig.
    1. Hvis motstand er følte under injeksjon eller hevelse vises under huden, stoppe prosedyren. Fjern nålen og sett inn nålen over tidligere injeksjonsstedet.
      Merk: Alternativt, dette kan oppnås ved forsiktig aspirating nålen og observere blod. Hard aspirasjon kan skjule hale venen. Hvis venen blanches under injeksjon, inn nålen riktig.
  6. Etter injeksjon er fullført, vent noen sekunder før oppdra nålen.
  7. Observere injeksjonsstedet for blødning. Bruke moderate trykk bruke to fingre til området til blødning stopper.
  8. Tilbake dyret til buret sitt.

3. atferd analyser

Merk: Alle eksperimentene ble utført blindt av en tredjepart med skjule behandlinger av unik kodet hetteglass. For behandlinger ble randomisert. Når du utfører tester beskrevet nedenfor, bør eksperimentelle forhold (type rom) og klokkeslettet kontrolleres for å redusere variasjonen. Denne testen skal utføres på mus eldre enn fire uker å oppnå pålitelige resultater. Musen gjennomgikk behavioral assessment en gang før viral injeksjon for 5 ukens av alderen å få grunnlinjen til normal ytelse. Etter viral injeksjon, ble mus vurdert en gang i uken fra 48 timer etter injeksjon, opp til 40 uker gammel.

  1. Bringe musen injisert med AAV til et rolig, mørke rom som er fri for støy eller andre forstyrrelser minst 30 min før testene. Ikke forstyrr dyrene i denne perioden av Akklimatisering.
  2. Acclimatize musen til det nye rommet i 30 min, og start deretter følgende atferdsmessige analyser (trinn 3.3 og 3.4). Holde en avstand på 10 minutter mellom hver opptreden analysen.
  3. Hengende wire test
    Merk: Denne testen overvåker muskelstyrke og motor dysfunksjon.
    1. Bruke et polstring ark som en pute. Plukke opp musen ved halen og plassere den på midten av ledningen rutenettet stativet. Høyne stativet 15-20 tommer over overflaten og sakte Inverter skjermen for å tillate dyr å justere grepet på skjermen.
    2. Når brettet er helt invertert, starte tidtakeren og fortegnelse tid å falle.
      Merk: Mus vil henge med fire lemmer på et rutenett. Hvis ledningen er satt for lavt kan mus ikke henge på. Hvis mus faller av rutenettet før 60 s, plassere dem tilbake på nettet, restarte stopuret og gjenta dette til to flere prøver. Registrere best ytelse.
    3. Når fristen til 60 s er nådd, returnerer dyr baksiden til buret.
  4. Fot print analysen
    Merk: Absorberende arket bør være en smal rullebane ca 70 cm lang og 5 cm bred med 5 cm høye vegger.
    1. Hold musen forsiktig med en hånd og gjelder rødt blekk for foran paws og blått blekk til bakben paws med pensel.
    2. Plass absorberende arket på gulvet i en smal rullebane.
    3. La musen for å gå eller løpe over en absorberende ark i en rett linje i rullebanen fra den ene enden til andre.
    4. Gjenta prosessen to ganger med musen med en frisk absorberende ark.
    5. Måle avstanden mellom to påfølgende trinnene i fremover bevegelse. Ikke inkludere første og vare noen fotspor der dyr er bare starte og avslutte sin kjøre.

4. euthanasia og vev Harvest

  1. Bruk en euthanasia kammer eller en bjelle krukke. Hvis bruker en bjelle krukke, Følg fremgangsmåten under avtrekksvifte.
  2. Nyt bomull med isoflurane og plassere den i bell jar. Bruk fysisk skilletegn for å holde dyr fra fysisk kontakt med anestesi materialet. Plassere dyret i glasset umiddelbart etter dette trinnet.
    Merk: Bell jar bør ikke være pre-beregnet med isoflurane å unngå muligheten for hypoksemi i dyr.
  3. Fortsett isoflurane eksponering til 30 s etter puste stopper.
  4. Umiddelbart etter fjerning musen glasset, euthanize av cervical forvridning.
    Merk: Dette trinnet bør skje så raskt som mulig for å unngå vev degradering.
  5. Harvest spinal cord først og deretter quadriceps skjelettlidelser muskel.
    1. Å høste ryggmargen, utsette baksiden av musen og fikse fire beina på side en disseksjon styret.
    2. Vask stedet for disseksjon med 70% etanol.
    3. Utføre cervical forvridning bruker en skarp saks.
    4. Gjør et snitt i huden i median linjen. Fjerne pelt skjæring eller forsiktig rive av huden i tverrgående flyet, etterfulgt av trekke pelt opp og over hodet. Fjerne hodet ved å klippe med saks under skulderbladene og området C1-2 kolonnen (funnet ved foten av skallen).
      1. Skjær bukveggen muskulaturen på ventral side og fortsette lateralt, én retning om gangen, inntil ryggraden er nådd.
    5. Bruk en skarp saks Fjern ryggvirvlene fra livmorhalsen ryggmargen. Fjern de laterale delene av ryggsøylen ved å kutte over ryggvirvel buene på begge sider.
    6. Slipp ryggmargen etter fjerner hele ryggsøylen.
  6. Fest fryse høstet vev i pre kjølt 2-methylbutane med følgende metode:
    1. Halvparten fylle en rustfritt stål bolle med 2-methylbutane og senk den nedre kvarteret i bollen i en container fylt med flytende nitrogen.
    2. Pre chill i 2-methylbutane i flytende nitrogen i 1-2 min.
    3. Plass skjelettmuskelen med tang i 2-methylbutane til det blir hvitt. Øyeblikkelig overføre vevet å tørke is og deretter lagre det på-80 ° C.
  7. For ryggmargen immunostaining, bygge vevet i parafin blokker ved romtemperatur før snapin fryser som beskrevet. 17
  8. Biokjemiske analyse og miRNA kvantifisering,1 sett høstet vevet i en cryovial og fryse i flytende nitrogen. Lagre prøver på-80 ° C.

Representative Results

En viral belastning for 1011 vg av AAV9-miR-298 ble injisert gjennom en enkelt halen blodåre injeksjon i 5 uker gamle SBMA mus. Disse musene bærer den menneskelige AR transgene med unormalt utvidet polyglutamine skrift i AR (AR97Q) og utvikler underskriver av neuromuscular sykdommen ved 10 ukens av alderen (vekttap, bøyd tilbake og muskelatrofi). 11 lumbale ryggmargen og quadriceps muskel ble høstet 2, 4, 8 og 12 uker etter administrasjon for miRNA kvantifisering, biokjemiske analysen og immunohistochemistry (figur 1). Administrasjon av behandling og påfølgende analysene ble utført av blendet etterforskere.

qRT PCR analyse viste miR-298 uttrykk i skjelettmuskelen og ryggmargen to uker og fire uker etter behandlingen, med topp uttrykk nivå i 8 uker i skjelettmuskelen og 12 uker i ryggmargen etter injeksjon (figur 2 ). Bruker et mikroskop (Axiovert 100 M), ble grønn fluorescens signal oppdaget i muskelvev og spinal motor neurons av co lokalisering av GFP og motor neuron markør kolin acetyltransferase (ChAT) 10 uker etter behandlingen, når mus begynner å vise sykdom manifestasjoner (figur 2).

Bruker de samme dose diett, ble en kohort SBMA mus randomisert å motta enten miR-298 eller håne 7 uker gamle via hale blodåre injeksjon for biokjemiske analyser og funksjonell karakteristikk. Injeksjon ble etterfulgt av ukentlige vekt og atferdsmessige vurdering til 40 uker gammel. qRT PCR analyse viste at miR-298 behandling reduserer nivået av mutant AR berørte vev (Figur 3), og økt kroppsvekt og forbedret motor ytelse (Figur 4) starter på 10 uker etter injeksjon.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av studien design. For å øke uttrykk nivåer av miR-298 i vivo, injisert vi SBMA mus med (A) dobbel promoter AAV vektoren plasmider uttrykke GFP og miR-298 eller uekte. (B) musene ble injisert via en enkelt halen-forgjeves injeksjon 7 uker gamle (pre symptomatisk scenen). Ryggmargen og quadriceps muskel ble Hentet fra en kohort SBMA mus på ulike tidspunkt for vev distribusjon analyse (grønn). En kohort SBMA mus ble behandlet og ofret for 16 ukens av alderen for biokjemiske analyser (rød). Vekt og atferdsmessige analyser ble utført ukentlig opp til 40 uker alder for funksjonell karakteristikk (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: AAV9-miR-298 levering i mus. Mus med metoden beskrevet her og mottatt AAV9-miR-298-GFP eller AAV9-uekte-GFP gjennom intravenøs injeksjon. Totalt miRNA ble samlet inn fra lumbale ryggmargen og quadriceps muskel 2,4,8 og 12 uker etter injeksjon. qRT PCR ble utført for å beregne uttrykket nivå av miR-298 i (A) quadriceps muskel (n = 5) (B) lumbale ryggmargen (n = 5, P < 0,01). Alle data rapporteres som betyr ± standardfeil betyr. Den utbredt signaltransduksjon av AAV vektoren vev høstes ved 10 uker etter behandling ble bekreftet av lokalisering av farging for GFP i (C) quadriceps muskel (opprinnelige forstørrelse, 10 X. Skala bar = 100 µm) og (D) motor neurons i lumbal ryggmargen (opprinnelige forstørrelse, 40 X. Skala bar = 10 µm. GFP (grønn), ChAT (rød) og DAPI (blå). Figuren har blitt endret fra doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: MiRNA-298 over uttrykk downregulates mutant AR i ryggmargen og quadriceps muskel i mus. qRT PCR ble utført for å beregne uttrykket nivåer av AR mRNA (A) lumbale ryggmargen og (B) quadriceps muskel behandlet med AAV9-miR-298-GFP eller AAV9-uekte-GFP. Transkripsjon nivåer var normalisert til snoRNA202 (n = 5 per behandling). * P < 0,05, ** P < 0,01. Alle data rapporteres som betyr ± standardfeil. Figuren har blitt endret fra doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Figure 4
Figur 4: MiR-298 over uttrykk forbedrer funksjon og reduserer vekttap. Behavioral assessment ble utført en gang i uken (w), mellom uke 5 til 40. Kroppsvekt (venstre) og hengende wire (høyre) ytelse av mus (n = 15 per gruppe). Alle data rapporteres som betyr ± standardfeil. Figuren har blitt endret fra doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Discussion

Her viser vi en svært effektiv og tilgjengelig metode for å velge og levere via hale injeksjon en miRNA bruker rAAV9 som en viral vektor for å målrette skjelettlidelser muskel og motor neurons i mus. 14 sammenlignet med andre RNAi strategier, er miRNAs mindre giftig og mindre immunogenic. 18 i tillegg deres lille størrelsen gjør dem velegnet begrenset emballasje kapasiteten med viral vektorer. 2 beregningsformelen algoritmer og prediksjon verktøy tillate identifikasjon av antatte miRNA-mRNA mål. Når identifisert, må effekten av miRNA på målet genuttrykk bekreftes. En felles tilnærming er å overexpress en gitt miRNA i vitro og oppdage mål protein uttrykk nivå vestlige analyse. 14 , 19

Ulike studier har brukt viral og ikke-viral strategier for å levere miRNAs. 13 her vi brukte adeno-assosiert virus (AAV) som et gen leveringsverktøy. Sammenlignet med andre viral vektorer, AAV utløser lav immunogenisitet, gjør langsiktig genoverføring, og har et bredt spekter av tropism skiller og ikke-dele celler. 18 Denne leveringsmetoden kan også omgå behovet for kjemisk endring som kan påvirke funksjonalitet og spesifisitet av RNA molekylet. Det er flere serotyper av AAV, som er avhengig av sammensetningen av kapsid proteiner. Disse serotyper varierer i sine tropism og transduce forskjellige celletyper. Er det nødvendig å velge den riktige serotype når vevet. Vi valgte rAAV9, på grunn av sin høye signaltransduksjon effektivitet i sentralnervesystemet og skjelettlidelser muskel etter ekstern administrasjon19,20. Denne tilnærmingen har vist større signaltransduksjon effekt i neonatal dyr sammenlignet med voksen dyr, sannsynligvis på grunn av forskjeller i ekstracellulær matrix komposisjon, Nevron-til-glia forholdet og modenhet av blod-hjerne-barrieren. 21 , 22

Et viktig skritt i denne protokollen er utformingen av uttrykket vektoren. Sammenlignet med bicistronic vektorer, som er hemmet av lavere uttrykk av andre genet sammenlignet med første genet ved arrangøren, kan dobbelt promoter vektoren en back-to-back-konfigurasjon gir høy uttrykk for både miRNA og EGFP, dermed tillater lokalisering av miRNA i musen vev av immunofluorescence.

Intravenøs injeksjon av AAV9 resulterte i høy effektivitet og homogen signaltransduksjon i målet vev, skjelettlidelser muskel og motor neurons. Denne ruten av injeksjon tillater administrert dosen å nå systemisk sirkulasjonen og krysse hjerne blod barrieren, som er viktig for terapi målretting sentralnervesystemet. Videre er det en ikke-invasiv metode for levering til CNS. MiR-298 uttrykk økte i ryggmargen og muskel etter 2-4 uker med en enkelt ekstern injeksjon for 5 ukens av alderen. Når bruker enkelt-strandet genomet AAV vektorer, syntese de novo den andre DNA stranden kan står for den forsinkede signaltransduksjon. 23

Nivåer av menneskelig miR-298 var undetectable i behandlet mus 20 uker etter en enkelt administrasjon, antyder at for kroniske sykdommer, flere injeksjoner kan være nødvendig å nå en terapeutisk fordel. MiRNA nedverdigelsen over tid kan imidlertid begrense en livslang gjentatte administrasjon kreves. I tillegg kan adaptiv immunitet til AAV vektorer danner en barriere til en vellykket gen levering. 24 derfor generasjon AAV vektorer som immunologisk inert er avgjørende for gjentatte administrasjon og oppnå langtidseffekter med dette lovende leveringssystem. 25

En begrensning på bruk av miRNA som en terapeutisk strategi er risikoen for off-målet effekter. MiRNAs kan samhandle gjennom incomplementary base sammenkobling med andre gene transkripsjoner, som utgjør en sikkerhetsrisiko med denne tilnærmingen. Forbedret design av RNAi sekvenser, inkludert bruk av ikke-kanoniske miRNAs, som mirtrons, som omkjøringsvei mikro-prosessor komplekset og omfattende langsiktige sikkerhet og toleranse studier er kritiske før oversette denne strategien til et trygt og effektiv terapi. 26 , 27 , 28

Metoden beskrevet her ble opprinnelig utviklet for miRNA overuttrykte, men det kan også benyttes for miRNA hemming terapi bruker antagomirs.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erklære noen interessekonflikt. Vi takker SignaGen Laboratories (Rockvile, MD, USA) for AAV9 virus produksjon. Denne forskningen ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av NINDS, NIH. Philip R. Lee ble støttet av midler fra delingen av Intramural forskning av NICHD. Carlo Rinaldi ble støttet av et fellesskap fra Association Française contre les Myopathies (AFM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 Purification of miRNA and total RNA
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit ThermoFisher Scientific 4366596 A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs
snoRNA202 Primer ThermoFisher Scientific 1232 Taqman miRNA control assay in mouse
miR-298 Primer ThermoFisher Scientific 2190 Taqman miRNA-298 assay in mouse
Anti-GFP antibody abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade
Red ink pad Dovecraft Essentials
Blue ink pad Dovecraft Essentials
AAV9-GFP vector SignaGen Laboratories SL100840 Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification
mmu-miR-298-5p ThermoFisher Scientific MC12525 mirVana miRNA mimic
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP Vector Biosystems Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broderick, J. A., Zamore, P. D. miRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).
  3. Pickering, B. M., Willis, A. E. The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease. Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).
  4. Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration. Mol Cell. 24, 157-163 (2006).
  5. Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis. Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).
  6. Liu, N., et al. The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila. Nature. 482, 519-523 (2012).
  7. Ebner, D. C., et al. Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery. Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).
  8. Giorgetti, E., Lieberman, A. P. Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease. Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).
  9. Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management. Oral Dis. 20, 6-9 (2014).
  10. La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 352, 77-79 (1991).
  11. Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 35, 843-854 (2002).
  12. Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1. J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).
  13. Choudhury, S. R., et al. Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector. Mol Ther. 24, 726-735 (2016).
  14. Pourshafie, N., et al. MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy. Mol Ther. 24, 937-945 (2016).
  15. Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes. J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).
  16. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
  17. Stuard, D. A., Oorschot, D. E. Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord. J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).
  18. Huang, F., et al. miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3. FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).
  19. Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. Experimental validation of miRNA targets. Methods. 44, 47-54 (2008).
  20. Yang, N. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).
  21. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).
  22. Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  23. Wang, Z., Ma, H. -I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).
  24. Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).
  25. Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington’s disease. Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).
  26. Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
  27. Lowenstein, P. R. Crossing the rubicon. Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).
  28. Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. Silencing of Parkinson's disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224. Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).

Tags

Genetikk problemet 138 miRNA RNA therapeutics rAAV genterapi Gene stanse Neuromuscular sykdommen
Systemisk levering av MicroRNA ved hjelp av rekombinant Adeno-assosiert Virus Serotype 9 til å behandle Neuromuscular sykdommen i gnagere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pourshafie, N., Lee, P. R., Chen, K. … More

Pourshafie, N., Lee, P. R., Chen, K. l., Harmison, G. G., Bott, L. C., Fischbeck, K. H., Rinaldi, C. Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (138), e55724, doi:10.3791/55724 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter