Summary
Le cellule neuronali del mouse coltivate su matrici multi-elettrodi mostrano un aumento della risposta dopo stimolazione elettrica. Questo protocollo illustra come coltivare i neuroni, come registrare l'attività e come stabilire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione.
Abstract
Le matrici di microelettrodi (MEAs) possono essere utilizzate per studiare la tossicità di farmaci, i paradigmi di progettazione per la medicina personalizzata di nuova generazione e la dinamica di rete di studio nelle culture neuronali. Contrariamente a metodi più tradizionali, quali la patch-clamping, che possono registrare solo attività da una singola cella, i MEA possono registrare contemporaneamente da più siti in una rete, senza richiedere l'arduo compito di posizionare ciascun elettrodo singolarmente. Inoltre, numerose configurazioni di controllo e stimolazione possono essere facilmente applicate nella stessa configurazione sperimentale, consentendo di esplorare un'ampia gamma di dinamiche. Una delle dinamiche chiave di interesse in questi studi in vitro è stata la misura in cui le reti coltivate mostrano proprietà che indicano l'apprendimento. Le cellule neuronali del mouse coltivate in MEA mostrano un aumento della risposta dopo la formazione indotta dalla stimolazione elettrica. Questo protocollo illustra come coltivare le cellule neuronali sulle MEA; Riuscito con successoCavo da oltre il 95% dei piatti placcati; Istituire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione; E ordinare, tracciare e interpretare i risultati di tali esperimenti. È stato dimostrato l'uso di un sistema proprietario per stimolare e registrare culture neuronali. I pacchetti software vengono utilizzati anche per ordinare le unità neuronali. Un'interfaccia utente grafica personalizzata viene utilizzata per visualizzare gli istogrammi del tempo post-stimolo, gli intervalli interpolati e la durata di scoppio, nonché confrontare la risposta cellulare alla stimolazione prima e dopo un protocollo di allenamento. Infine, vengono discussi risultati rappresentativi e indicazioni future di questo sforzo di ricerca.
Introduction
Le matrici di microelettrodi (MEAs) possono essere utilizzate per indagare la tossicità dei farmaci, i paradigmi di progettazione per la medicina personalizzata di nuova generazione e la dinamica di rete di studio nelle culture neuronali 1 . Contrariamente a metodi più tradizionali, come ad esempio il bloccaggio delle patch, che può registrare solo attività da una singola cella o registrazione in campo con una pipetta di vetro, in grado di registrare risposte extracellulari dai neuroni che circondano l'elettrodo in un unico sito-MEAs possono simultaneamente Registrare da siti multipli in una coltura cellulare senza richiedere l'arduo compito di posizionare ciascun elettrodo individualmente. Ciò consente di studiare le interazioni dinamiche tra gruppi di cellule che formano una rete all'interno di quella cultura. Inoltre, gli effetti della stimolazione elettrica sugli schemi di cottura di rete 2 , 3 , 4 , 5 e il controllo di rete 6 </ Sup> nelle culture neuronali sono state ben documentate e numerose configurazioni di stimolazione elettrica e controlli possono essere facilmente applicati all'interno della stessa configurazione sperimentale, consentendo di esplorare un'ampia gamma di dinamiche spazio-temporali.
Una delle dinamiche chiave di interesse in questi studi in vitro è stata la misura in cui le reti coltivate mostrano proprietà che indicano l'apprendimento 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Il Peixoto Lab ha esaminato in precedenza gli effetti dei segnali di allenamento ad alta frequenza, come descritto in Ruaro et al. 14 , sulle reti dei neuroni del mouse placcati sugli array di microelettrodi 15 . In questi esperimenti, le reti hanno mostrato un aumento della risposta in seguitoG allenamento indotto dalla stimolazione elettrica. L'aumento della risposta è stata considerata una forma di apprendimento tramite il riconoscimento dello stimolo, in base alle quali le reti hanno risposto in modo coerente a una modifica dello stimolo dopo l'applicazione di un protocollo di stimolazione specifica ( es .
Questo protocollo dimostra come coltivare le cellule neuronali in MEA, registrare con successo da oltre il 95% dei piatti placcati, stabilire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione, ordinare l'attività a singola unità, istogrammi della trama e interpretare i risultati Tali esperimenti. È stato dimostrato l'uso di un sistema proprietario (vedi tabella dei materiali ) per la stimolazione e la registrazione delle culture neuronali, nonché l'applicazione di pacchetti software (vedi tabella dei materiali ) per ordinare le unità neuronali . Un'interfaccia utente grafica personalizzata (vedere la tabella dei materiali ) viene utilizzata per visualizzare i post-sGli istogrammi temporali di timulus, gli intervalli interpolati e la durata di scoppio, nonché di confrontare la risposta cellulare alla stimolazione prima e dopo un protocollo di allenamento.
Protocol
Tutte le procedure animali seguono le linee guida di NIH e / o la Politica sanitaria pubblica sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio e sono sottoposti a un protocollo IACUC approvato istituzionalmente presso l'Università George Mason.
1. Preparazione del materiale
- Autoclave i seguenti materiali: pipette di vetro lunghe da 5,75 pollici disposte verticalmente in (2) bicchieri da 500 ml, circa 24 pezzi di carta filtrante (150 mm di diametro, ognuno tagliato in 8 cunei, dimensione dei pori non importa), 1000 μL pipetta filtrata Punte, 200 μL punte filtrate filtrate, 10 μL punte pipette filtrate e acqua deionizzata (DI) per le lavaggi (almeno 200 ml).
- Preparare i reagenti ei supporti.
- Preparare tutti i reagenti ei supporti nella bioinamica utilizzando tecniche asettiche.
- Preparare la poli-D-lisina (PDL) come da tabella 1 .
- Mescolare il PDL con acqua sterile DI fino ad una cConcentrazione di 50 μg / mL, come segue. Utilizzare una pipetta sterile sterile per trasferire 96 ml di acqua sterile DI in una bottiglia di reagente in vetro autoclavato.
- Utilizzare una pipetta sterile sterile per aggiungere 4 ml di acqua sterile per l'iniezione nel flaconcino del produttore contenente PDL. Sciogliere il PDL pipettando. Usare la stessa pipetta per trasferire la soluzione PDL alla bottiglia di reagente di vetro contenente 96 ml di acqua sterile DI.
- Fissare la bottiglia prima di rimuoverla dalla bioinfiammazione e vorticarla. Nella bioinformazione, dividere la soluzione in 5 mL di aliquote; Congelare qualsiasi soluzione inutilizzata a -20 ° C. Il PDL scosso può essere nuovamente congelato una volta. Scartare la soluzione scongelata se ri-frozen prima.
- Preparare la soluzione laminina secondo la Tabella 2 .
- Mescolare la laminina con PBS fino ad una concentrazione finale di 20 μg / mL, come segue. Usare una pipetta sterile sterile per trasferire 49 ml di PBS in un tubo centrifugo da 50 ml.
- Usare una serologica sterileL pipetta per aggiungere 1 ml di PBS alla fiala del produttore contenente il peso appropriato di laminina. Sciogliere la laminina pipettando. Utilizzare la stessa pipetta per trasferire la soluzione laminina nel tubo centrifuga da 50 ml contenente 49 ml di PBS.
- Fissare il tubo stretto prima di rimuoverlo dalla bioinamica e vorticarla. Nella bioinformazione, dividere la soluzione in 5 mL aliquote; Congelare qualsiasi soluzione inutilizzata a -20 ° C. La laminina scongelata non può essere congelata; Scartare qualsiasi soluzione scongelata non utilizzata.
- Preparare il supporto di memorizzazione, come per la Tabella 3 .
NOTA: Il supporto di memorizzazione è utilizzato per memorizzare i tessuti fino a un mese a livelli di CO 2 ambientali. Può essere acquistato (si veda la tabella dei materiali) o può essere preparata usando la ricetta generale di: mezzo di immagazzinaggio di celle di CO2 ambiente + 2% supplemento senza siero per la coltura di cellule neurali + mezzo di coltura di cellule di 0,5 mM che contiene uno stabilizzato Forma di L-glutamina (vedi tabella dei materiali).- Per fare 10 ml di supporto di stoccaggio, trasferire 10 ml di supporto di stoccaggio per il tessuto embrionale senza CaCl2 in un tubo da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 210 μl di supplemento senza siero per la coltura di cellule neurali e 55 μL di una forma stabilizzata di L-glutammina. Mescolare delicatamente per inversione.
- Poiché il mezzo di memorizzazione è sensibile alla luce, proteggerlo coprendo i tubi centrifughi da 15 ml con foglio di alluminio. Aliquota 2 mL di supporto di stoccaggio per tubo per un totale di 5 aliquote. Conservare in frigorifero fino a 2 settimane o fino a quando non sarà pronto per l'uso, ma non congelare.
- Preparare DMEM 5/5 media, come da tabella 4 .
- Aliquote di spargimento di integratore senza sangue per la coltura di cellule neurali, siero di cavallo (HS), siero di fegato fetale (FBS) e acido ascorbico. Sciogliere una aliquota di pen-strep, se necessario, per controllare la contaminazione batterica. Pipettare ogni ingrediente in un tubo centrifuga da 50 ml. Assicurarsi che le punte delle pipette non tocchino superfici o oggettits.
- All'interno della bioinformazione, collegare il filtro al tubo di vuoto con il vuoto ancora spento. Versare la miscela nella parte superiore del filtro e chiuderla. Accendere il vuoto nel bioinformazione e lasciare che il filtro medio sia in fondo al contenitore. Scollegare il filtro dal vuoto prima di spegnere il vuoto.
- Serrare il coperchio sul contenitore medio sterile, contrassegnarlo e memorizzare qualsiasi mezzo inutilizzato a 4 ° C per un massimo di un mese. Aprire il contenitore all'interno della bioinamica per mantenere il mezzo sterile.
- Preparare il mezzo DMEM + come da Tabella 5 .
- Aliquote di addensamento senza sangue per la coltura delle cellule neurali e l'acido ascorbico (e pen-strep, se necessario). Pipettare ogni ingrediente in un tubo centrifuga da 50 ml. Ripetere i passaggi 1.2.5.2-1.2.5.3 per il processo rimanente.
2. Array / Preparazione di piatti
NOTA: I MEA utilizzati nella procedura sono array a 60 canali oOrganizzato in un quadrato di 8 x 8. La distanza di interelectrode è di 200 μm ed ogni elettrodo è di 10 μm di diametro. Il materiale conduttore per i binari è titanio, e gli elettrodi stessi sono costituiti da TiN. L'anello di vetro attorno agli elettrodi è di 6 mm di altezza, con diametro esterno di 24 mm. Per coprire il MEA viene utilizzato un cappuccio in poliossimetilene (POM) e viene utilizzato un film propilene etilenico (FEP) fluorurato permeabile / liquido per evitare la contaminazione durante le sessioni di registrazione e stimolazione.
- Il giorno prima della placcatura.
- Rendere idrofili MEA non utilizzati esponendoli al plasma; Di solito non è necessario dopo il primo utilizzo. Assicurarsi che le copertine di vetro utilizzate per le colture di controllo ricevano anche un trattamento al plasma.
NOTA: I piatti in plastica Petri (35 mm) possono anche essere utilizzati come piatti di controllo e non necessitano di alcun pretrattamento.- Amministrare il trattamento con plasma utilizzando un etcherino a plasma per 40-60 s a mezzo potere (50 W), wiLa pressione della camera è impostata su 100-150 mT.
- Immediatamente riempire le MEA con acqua DI. Immergere le copertine in un piatto di Petri riempito con acqua DI. Lasciare l'acqua di DI a contatto con le superfici trattate per circa 15 minuti.
- All'interno della bioinimentazione, aspirare l'acqua di DI. Riempire i MEA al bordo con il 70% di etanolo. Rimuovere l'acqua DI dal piatto di Petri contenente le copertine e riempire il piatto di Petri con etanolo finché le copertine non sono completamente sommerse. Permettetelo di sedere per 10-15 min.
- Etichettare tutti i piatti di Petri e controllare i piatti con il MEA ID #, la data dell'intervento, il tipo di cella e le sigle. Quindi mettere ogni MEA nel suo piatto Petri etichettato.
- Posizionare i MEA in singoli piatti Petri e rimuovere l'etanolo usando l'aspirazione del vuoto. Riempire i MEA con acqua sterile DI per rimuovere qualsiasi etanolo residuo. Usare aspirazione sotto vuoto per rimuovere l'acqua di DI. Lasciate che i MEA si asciugano all'aria all'interno della bioinformazione.
- Aggiungere 40-70 μL di 50 μg / mL poli-D-lisina(PDL, alto peso molecolare, almeno 50 kDa) al centro di ciascuna MEA e 0,2 mL ai controlli usando pipette sterili.
NOTA: Assicurarsi di non toccare il centro della MEA con la pipetta, poiché ciò potrebbe danneggiare gli elettrodi. L'esatta quantità di PDL erogata dipende dall'idropoli della superficie. - Mettere un piccolo pezzo di carta tissue in ogni piatto e bagnarlo con acqua sterile per evitare l'evaporazione del PDL durante la notte. Coprire tutti i piatti prima di rimuoverli dalla bioinformazione. Posizionare i piatti in un incubatore a 37 ° C per una notte.
- Rendere idrofili MEA non utilizzati esponendoli al plasma; Di solito non è necessario dopo il primo utilizzo. Assicurarsi che le copertine di vetro utilizzate per le colture di controllo ricevano anche un trattamento al plasma.
- Giorno di placcatura.
- Al giorno di placcatura, scongelare 1 aliquota di laminina (20 μg / mL); Ogni MEA richiede 40-50 μL di laminina e ogni piatto di controllo richiede 0,2 ml di laminina. Calcolare il volume della laminina necessaria in base al numero di MEA e dei controlli da utilizzare.
- Trasferire tutti i piatti dall'incubatore alla bioinformazione.
- Riempire tutti i MEA con sterileDI utilizzando una pipetta sterile sterile e lasciarle sedere per 10-15 minuti. Aspirare l'acqua di DI utilizzando pipette sterilizzate Pasteur e ripetere due volte il processo.
- Aggiungere 40 - 50 μL di laminina scongelata al centro di ogni MEA e 0,2 ml di laminina sulle piastre di controllo usando punte sterili. Coprire tutti i MEA ei piatti di controllo nella bioinformazione e trasferirli in un incubatore a 37 ° C per 1 ora.
- Rimuovere attentamente la laminina in eccesso dal centro delle MEA usando l'aspirazione con pipette sterilizzate Pasteur e lasciare asciugare l'aria prima della placcatura.
- Lasciare i piatti nella bioinamica, o collocarli in un incubatore fino a quando non sarà pronto a piastrarlo.
NOTA: i piatti possono rimanere nell'incubatrice fino al giorno successivo. Tuttavia, se è necessario più tempo, è consigliabile pulire i piatti e ricominciare dal passo di poli-D-lisina (punto 2.1.6).
3. Rimozione dell'embrione e cervelloEstrazione
- Versare il mezzo L-15 (Leibovitz) in 4 dei 100 piatti di Petri. Coprirli e metterli in un congelatore da -20 ° C finché il mezzo non ha una consistenza dolce ma non è congelato solido (~ 40-60 min).
- Fai questo circa 40 minuti fino a 1 ora prima della dissezione.
NOTA: Questo farà raffreddare velocemente gli embrioni ei cervelli, in modo che possano avere una consistenza ferma e non disintegrarsi dopo l'estrazione. - Preparare l'area di dissezione per la rimozione degli embrioni.
- Posizionare un vassoio con ghiaccio vicino ad un lavandino e posare gli strumenti chirurgici e materiali per la rimozione di embrioni. Questi includono 4 piatti di Petri con lattine di L-15 "fredde", una bottiglia spray con etanolo al 70%, pinze a punta liscia, pinze fine, piccole forbici chirurgiche e grandi forbici ( Figura 1 ).
- Preparare l'area di dissezione per l'estrazione del cervello.
- Mettere un piatto di vetro Petri faCadere in un vassoio pieno di ghiaccio.
- Disporre gli strumenti chirurgici ed i materiali per l'estrazione del cervello, compresi gli asciugamani di carta, le piccole forbici chirurgiche, una spatola sottile a doppia chiusura, una bottiglia spray piena di etanolo al 70% e un sacchetto di plastica per lo smaltimento della carcassa ( Figura 2 ).
- Mettere su un cappotto di laboratorio, una maschera e guanti. Spruzzare tutte le superfici di lavoro, compresi i guanti, con il 70% di etanolo.
NOTA: Anche se questa non è una procedura sterile, è meglio ridurre al massimo le probabilità di contaminazione. - Eutanizzare un E17 timed-pregnant mouse seguendo le linee guida NIH 16 e / o la politica sanitaria pubblica per la cura e l'uso umano di animali da laboratorio e con un protocollo di cura e uso animale approvato istituzionalmente (IACUC) per l'asfissia del CO 2 . Assicurarsi di rilasciare lentamente il gas CO 2 nella camera per un periodo da 3 a 5 minuti per evitare di causare panico o discoMfort nel mouse.
- Decapitate il mouse e posizionatelo su un tovagliolo di carta, lato ventrale verso l'alto. Spruzzare l'addome inferiore con il 70% di etanolo. Utilizzando le piccole forbici chirurgiche, fare un taglio a forma di V attraverso la pelle e il grasso sottocutaneo dell'addome inferiore, estendendo il taglio alle estremità distali della cavità toracica e esponendo l'utero.
- Usando le pinze, sollevare con cura l'utero tra gli embrioni. Tagliare il tessuto connettivo con forbici di dissezione fino a quando l'intero utero non è libero. Sciacquare brevemente l'utero con il 70% di etanolo per rimuovere qualsiasi sangue e metterlo in uno dei 4 piatti Petri riempiti con freddo L-15.
- Rilasciare ogni embrione dall'utero e dal sacchino embrionale interno usando un paio di punte fine-tipped. Assicurarsi che il cordone ombelicale sia stato tagliato e che il sac. Placentario sia stato rimosso. Posizionare gli embrioni liberati nel secondo piatto pieno di L-15 freddo. Decapitate gli embrioni con pinze e forbici. Usando le pinze, trasferire le teste su un terzo piatto di Petri e sui corpiA un quarto, entrambi pieni di L-15 freddo.
4. Rimozione Frontale Cortex
- In una bioinformazione, posizionare un cuneo di carta filtrante autoclavata sul piano di vetro a raffreddamento Petri. Mettere una testa di embrione singola sulla carta filtrante. Grip il cranio mettendo una coppia di pinze attraverso le cavità oculari con la mano non dominante. Rimuovere la pelle e il tessuto muscolare sottostante con una coppia di forbici iride.
- Posizionare il bordo di taglio della punta inferiore delle forbici iride nella base del cranio. Mantenendo il petto più basso rispetto alla superficie interna del cranio, lontano dal cervello, tagliato attraverso la piastra occipitale e poi lungo la linea mediana tra le piastre parietali. Continuare a tagliare rostrally, tra le piastre frontali cranio cartilaginee.
- Partendo dal centro della piastra occipitale, fare un taglio perpendicolare a sinistra ea destra del taglio centrale.
- Rimuove il cervello scorrendo con cautela una piccola spatola tra la superficie ventraleDel cervello e delle lastre inferiori del cranio finché non è completamente sotto il cervello. Sollevare la spatola; L'intero cervello esce intatto.
- Mettere alcune gocce di materiale L-15 sulla carta del filtro in modo che il cervello non si attacchi alla carta e getta delicatamente il cervello dalla spatola sulla carta filtrante, con il lato ventrale verso il basso. Tagliare con cura la lampadina olfattiva con la punta della spatola.
- Utilizzando una spatola pulita, dissectare il lobo frontale in un pattern trapezoidale. Trasferire il tessuto a un tubo di centrifuga da 15 ml contenente un mezzo di stoccaggio. Ripetere quanto sopra con gli altri embrioni. Assicurarsi di utilizzare ogni volta un fresco cuneo di carta filtrante ( cioè un cuneo di carta filtrante per testa).
5. Dissociazione delle cellule
- Nella bioinformazione, assemblare gli elementi elencati nella tabella 6 .
- Usare una pipetta sterile sterile per aggiungere 5 ml di DMEM + ad una fiala di papain; Il riscaldamento DMEM + può essere usato per risolvere meglio il papaino. DelicatamentePipetta per mescolare la soluzione.
- Utilizzare una micropipetta sterile per aggiungere 0,5 mL di DMEM + ad una fiala di DNase. Evitare una pipettazione forzata durante la soluzione DNase, perché DNase è sensibile alla denaturazione del taglio.
- Trasferire 2,5 ml di soluzione papaina in un tubo centrifugo sterile e aggiungere 125 μL di DNase allo stesso tubo. Mescolare la soluzione invertendo delicatamente il tubo centrifugo chiuso circa 8 volte.
- Utilizzando una pipetta sterile e ampia, rimuovere il tessuto dal tubo contenente il mezzo di stoccaggio e collocarlo in un piatto di Petri da 35 mm sterile. Raccogli il più piccolo mezzo possibile. Usare una pipetta sterile per rimuovere il più possibile il mezzo di memorizzazione eccessivo senza togliere il tessuto. Il tessuto non deve essere fluttuante in mezzo, ma deve essere umido.
- Utilizzare due lame sterili per bisturi per frantumare il tessuto. Utilizzare una pipetta sterile sterile per aggiungere 2,5 ml di miscela DNasi / papain al tessuto macinato nel piatto Petri. Girare delicatamente il piatto di Petri per assicurare tCappello tutto il tessuto è libero nella soluzione e non aderito al fondo del piatto. Posizionare il piatto in un incubatore a 37 ° C per 15 minuti.
- Nella bioinfiammabilità, utilizzare una pipetta trasferente sterile e ampia per trasferire tutti i supporti e tessuti in un tubo criogenico sterile da 5 ml. Posizionare la punta della stessa pipetta di trasferimento largo bore vicino alla parte inferiore del tubo. Tritare delicatamente lentamente pipettando su e giù 10-15 volte.
- Evitare di formare bolle durante la pipettazione. Ripetere il processo utilizzando una pipetta di trasferimento di piccole dimensioni fino a ottenere una miscela omogenea. Se il tessuto non è dissociato, triturare con una pipetta da 1000 μL.
- Aggiungere 2 ml di DMEM 5/5 riscaldato alla miscela cellulare dissociata. Bloccare il tubo della centrifuga mentre è ancora in bioinformazione. Mescolare dolcemente per inversione. Centrifugare a circa 573 xg per 5 minuti a temperatura ambiente (20-25 ° C).
- Nella bioinformazione, utilizzare una pipetta sterile sterile per rimuovere e scartare tutto il surnatante, senza romperepellet. Utilizzare una pipetta sterile per aggiungere 1 ml di DMEM 5/5 riscaldato al pellet nel tubo per riassodire le cellule. Usare una pipetta di trasferimento sterile a piccole forature per rompere il pallone pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso fino a che la miscela non sia omogenea.
NOTA: Evitare di formare bolle durante la pipettazione. Se si raccolse pochissimi tessuti, aggiungere solo 0,5 mL di DMEM 5/5. - All'interno della bioinformazione, utilizzare una pipetta sterile per trasferire 10 μL di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga. Al di fuori della bioinformazione, aggiungere 10 μL di Trypan blu alla 10 μL di sospensione cellulare nel tubo di microcentrifuga.
NOTA: questo passaggio non richiede sterilità. - Caricare 10 μL della sospensione della cella blu Trypan in un chip di emocitometri monouso per contare le cellule.
6. Celle di placcatura
- Nella bioinformazione, utilizzare una micropipetta sterile per trasferire 50 μL di sospensione cellulare al centro di ogni matrice e ogni piatto di controllo Petri. Utilizza un piPunta di petta per piatto. Assicurati di mettere le celle esattamente al centro dell'array. Riaffilare la carta tissue del laboratorio che era nel piatto con acqua sterile, o inserire nuovi tessuti di carta in ogni piatto. Coprire i piatti.
- Posizionare i piatti coperti Petri in un incubatore impostato a 37 ° C e 10% CO 2 per 3-4 h.
- Nel bioinformazione, aggiungete delicatamente 1 ml di DMEM 5/5 riscaldati ad ogni MEA.
NOTA: Evitare di lavare le celle lontano dall'array centrale quando aggiungete il supporto (importante!). Molto attentamente, utilizzare una micropipetta sterile per aggiungere una goccia alla volta intorno ai bordi interni. - Posizionare un tappo contenente una membrana FEP permeabile a gas su ciascuna MEA. Rimetterli all'incubatore per due giorni.
NOTA: Il tappo impedisce la contaminazione e l'evaporazione. Seguire la tecnica asettica, asciugando i cappucci nel bioinfiammo con 100% etanolo prima di metterli sul MEA. Le culture devono essere coperte all'interno della bioinimità e devono rimanere sempre coperte.
7. PrincipaleMantenendo le culture
- Dopo due giorni, eseguire una sostituzione media completa con DMEM riscaldato.
- Trasferire solo pochi piatti dall'incubatore alla bioinzia alla volta per evitare di sottolineare troppo le culture.
- Utilizzare una micropipetta sterile da 1 ml per estrarre tutto il mezzo dal piatto inserendo accuratamente la punta della pipetta sulla parete interna del piatto, evitando di toccare le celle al centro. Utilizzare solo una punta pipetta per piatto per evitare la diffusione della contaminazione.
- Utilizzare una micropipetta sterile per erogare 1 ml di caldo DMEM +, posizionando con attenzione l'estremità della pipetta sulla parete interna del piatto.
- Eseguire i cambiamenti medi del 50% con DMEM riscaldato, come descritto in precedenza, 2-3 volte alla settimana e non più di 4 giorni tra gli alimenti.
- Utilizzare una micropipetta sterile da 1 ml per estrarre 500 μl di mezzo dal piatto. Utilizzare una micropipetta sterile per erogare 500 μL di caldo DMEM +. </ Li>
8. Ispezioni visive e registrazione
- Ispezionare i campioni di piatti ogni altro giorno sotto un microscopio per cercare la copertura cellulare sull'array (utilizzando ingrandimento 4X e 10X) e contaminazione (utilizzando ingrandimento 20X), sia batterica che fungina.
NOTA: la Figura 3a mostra un esempio di copertura ottimale delle cellule, mentre la Figura 3b mostra una coltura con una debole densità di cellule. - Due settimane dopo la placcatura, prova un campione dei piatti MEA per attività spontanea. Record da MEA, come descritto di seguito, per 3-5 minuti. Spikes verrà rilevato se l'attività è presente ( Figura 4 ).
NOTA: spetta allo sperimentatore determinare quando iniziare i test in base al tipo di esperimento e ipotesi in esame.- Per registrare un'attività in un MEA, utilizzare le seguenti apparecchiature: alimentazione, amplificatore, headstage / preamplificatore, Regolatore di temperatura e generatore di stimolazione (vedi tabella dei materiali e figura 5 ).
- Prima di togliere le colture dall'incubatore, collegare il regolatore di temperatura e accendere il sistema accendendo l'alimentazione elettrica (secondo le istruzioni del produttore), consentendo alla piastra di base riscaldata del preamplificatore di raggiungere 35 ° C.
- Posizionare la coltura coperta nel preamplificatore in modo che la linea nera nel MEA ben allinea con il terreno di riferimento. Assicurarsi che i pin di preamplificazione si allineino, che la parte superiore del preamplificatore sia protetta e che il tappo di coltura sia ancora acceso.
- Una volta inserita la coltura nella piastra, deselezionare l'opzione "Modifica MEA" sul software di acquisizione dati (vedere la tabella dei materiali per i nomi di software e le guide utente). Inoltre, deseleziona la casella "Blanking" prima di eseguire registrazioni.
- Selezionare "Download" in "MEA_Select" dopo tLa cultura viene inserita nel sistema. Controllare che il programma visualizzi "Download OK" prima di continuare.
- Premere "Start" nell'ambiente software per iniziare a visualizzare i segnali. Nella finestra principale, selezionare: "Spikes" → "Rilevamento" → "Automatico", modificare il valore "Std Dev" su "5" e fare clic su "refresh" per ripristinare la soglia.
NOTA: la finestra "Spikes" mostra i picchi che hanno superato la soglia. - Nella finestra principale, selezionare "Recorder" → "Recorder" → "Browse". Modificare il percorso e il nome del file per identificare la data, l'ora, il piatto e l'esperimento. Impostare il limite di tempo ( ad esempio, a 5 minuti). Fai clic su "Stop", "Registra" e "Riproduci". Si noti che la registrazione si arresta automaticamente.
- Aprire il software di stimolazione. Selezionare "Recorder" → "Recorder" → "Browse" per creare un file e impostare il timerE limite. Fai clic su "Stop", "Record" e "Play" per registrare di nuovo. Fare clic su "Scarica e avviare" (sul software di stimolazione) per la stimolazione da consegnare al piatto.
- Selezionare il pulsante "Change MEA" nel controllo software per cambiare i piatti.
NOTA: Non mantenere la cultura fuori dell'incubatore per più di 30 minuti alla volta senza un sistema per mantenere un'atmosfera di CO 2 attorno alla cultura. Se sono necessarie più sessioni di registrazione, utilizzare un adattatore disponibile in commercio per fornire CO 2 .
9. Reti di formazione
NOTA: la Figura 6 mostra una panoramica dei passaggi 9.1-9.3 descritti di seguito.
- Registrare un basale di 5 minuti di attività spontanea dalla coltura cellulare (come descritto nel passaggio 8). Una volta stabilita la linea di base, somministrare una stimolazione di sondaggio pre-allenamento da 5 minuti composta da un bifasico da 0,5 Hz( Figura 7a ) attraverso gli elettrodi di stimolazione selezionati, come mostrato in Figura 8 (vedere il manuale del software nella tabella dei materiali per ulteriori dettagli su come selezionare gli elettrodi di stimolazione).
- Al termine della stimolazione pre-allenamento, gestire un protocollo "addestramento" alle reti usando gli stessi elettrodi come nella stimolazione dei sondaggi. Consegnare i treni ad alta frequenza una volta ogni 2 secondi, come descritto in Hamilton et al. 15 ( figura 7b e figura 7c ).
NOTA: Il segnale di allenamento è costituito da 40 treni a impulsi. Ogni treno a impulsi è costituito da 100 impulsi bifasici, con 4 ms tra gli impulsi, una durata di impulso di 200 μs e un'ampiezza di impulso di 900 mV. - Dopo aver concluso il periodo di allenamento, somministrare una stimolazione post-formazione di 5 minuti alle cellule,Identico alla stimolazione pre-allenamento. Una volta terminata la stimolazione post-allenamento, registrare 5 minuti di attività spontanea post-stimolazione dalla rete (come descritto nel passaggio 8).
- Utilizzare un gruppo di controllo separato di MEA per tenere conto delle possibili modifiche della risposta in rete a causa di fluttuazioni naturali o di non stazionarietà del sistema. Amministrare lo stesso protocollo sperimentale sopra descritto a quei gruppi di controllo, fatta eccezione per i gruppi di controllo che ricevono un periodo di addestramento di sham in cui non viene somministrato alcun segnale di formazione reale.
10. Analisi dei dati
Nota: i file di dati vengono salvati e successivamente ordinati in unità neuronali utilizzando un software di selezione proprietario (vedere la tabella dei materiali). Un'interfaccia utente grafica personalizzata (GUI) viene utilizzata per caricare le unità e analizzare i pattern di attività nelle culture, intervalli di intervalli di intervalli, durata di scoppio e istogramma temporale post-stimolo (PSTH) (vedere la tabella dei materiali). Il PSTH èIl grafico più importante da analizzare, in quanto mostra l'attività della rete in dimensioni binarie (di lunghezza variabile), fornendo così una rappresentazione visiva della risposta della rete alla stimolazione presentata.
- Convertire i file di dati .mcd in formato .plx utilizzando un software di ordinamento proprietario (vedere la tabella dei materiali per i nomi di software e le istruzioni per l'utente). Esportare il file .plx in un nuovo file .plx all'interno dello stesso programma. Ordinare i canali in unità neuronali ( Figura 9 ). Una volta che l'ordinamento è completato, esportare i dati come file .nex.
- Aprire il file .nex nel software appropriato (vedere Tabella materiali ) e salvarlo come un file .mat per essere analizzato con la GUI personalizzata, disponibile gratuitamente (vedere tabella dei materiali ).
NOTA: L'interfaccia utente grafica (vedi tabella dei materiali) elabora PSTHs secondo l'input dell'utente ( vale a dire, la popolazione PSTH, il PSTH medio ponderato o il singolo canale PSTH), consentendo una panoramica dell'esperimento di stimolazione e confronto immediato tra i file post- e pre-stimoli. Inoltre raggruppa il PSTH iniziale vs finale, che confronta la risposta della rete ai primi 6 e agli ultimi 6 stimoli. La GUI esegue numerose altre funzioni, come ad esempio la frequenza di picco, l'intervallo di intervalli, i picchi per ogni istante, l'intervallo di intervalli e la durata di scoppio, sia per i file di stimolazione che per i file con attività spontanea. - Innanzitutto, selezionare un file .mat con variabili contenenti treni a picco e una variabile contenente l'artefatto di stimolazione; Lo script analizzerà i dati e la GUI principale si apre con un grafico medio PSTH a destra ( Figura 10 ).
- Clicca sui pulsanti dell'elettrodo attivo per vedere l'individuale PSTH (in blu) rispetto al PSTH medio (in rosso).
NOTA: Gli elettrodi attivi saranno colorati per mostrare una mappa di calore, dove valori più alti (più rossi) rappresentano maggioriValori di picco PSTH, indicando una risposta più forte alla stimolazione. - Selezionare un'opzione di analisi usando il menu a comparsa. Selezionare il pulsante "Biased Average" per selezionare un sottoinsieme di elettrodi e tracciare la media di quel sottoinsieme; Questo è utile per confrontare il comportamento della sub-rete all'interno di una cultura.
NOTA: Nel menu a comparsa sono selezionate più opzioni di analisi diverse e tutte sono spiegate nel pulsante "aiuto" del software. - Selezionare il pulsante "Salva grafico" per salvare il grafico attualmente visualizzato come file jpeg ad alta risoluzione. Selezionare il pulsante "Tabella dati" per esportare i dati in un foglio di calcolo.
- Clicca sui pulsanti dell'elettrodo attivo per vedere l'individuale PSTH (in blu) rispetto al PSTH medio (in rosso).
Representative Results
Utilizzando la procedura presentata qui ( Figura 11 ) , MEAs a 60 canali placcati con cellule neuronali del mouse E17 venivano incubate fino a quando le colture non coprivano le matrici in un tappeto sano delle cellule ( Figura 12 e Figura 3a ) . Dopo 3 settimane di incubazione al 10% di CO 2 e 37 ° C, le colture sono state controllate per attività spontanea utilizzando un sistema di registrazione commerciale (vedi tabella dei materiali ). La temperatura è stata mantenuta a 37 ° C durante la procedura di registrazione usando un regolatore di temperatura, poiché la temperatura influenza l'attività neuronale e la velocità di cottura.
Prova per attività
Le reti spontaneamente attive presentano normalmente pattern di segnali diversi. Una cultura attiva media può registrare l'attività in unCirca il 40% degli elettrodi. Di questi siti di elettrodi attivi, quasi la metà registra i segnali spontanei, con velocità di cottura che vanno da 5 a 10 Hz. Un diagramma raster rappresentativo di attività spontanea è mostrato in Figura 4a . I segni di spunta indicano i timestamp dei potenziali di azione registrati da 9 elettrodi attivi durante una finestra a 20 s, ad una frequenza di acquisizione di 25 kHz e un range di filtri a banda passante tra 300 Hz e 3 kHz. La figura 4b mostra il rumore di base e il segnale extracellulare grezzo filtrato durante 8 esplosioni di attività prima della procedura di smistamento. Per separare i potenziali di azione dal rumore, le soglie per ciascun canale vengono impostate a 5 volte la deviazione standard del rumore di base e vengono calcolate su una finestra di 500 ms 15 .
Prima dell'analisi, i picchi registrati per ciascun elettrodo sono stati ordinati in modalità offline per distinguere tra fisicoAttività logica e artefatti di stimolazione utilizzando un algoritmo k-means e l'analisi dei componenti principali. I segnali identificati come risposte fisiologici sono stati raggruppati per creare una risposta di popolazione ad ogni elettrodo ( Figura 13 e Figura 9 ) 15 .
Reti neurali di formazione con stimolazione elettrica
Le reti sono state addestrate usando stimolazione elettrica applicata direttamente alla cultura attraverso gli elettrodi MEA usando un generatore di stimoli (vedi tabella dei materiali). In questa serie di risultati rappresentativi, è stata utilizzata una configurazione "L" composta da 13 elettrodi ( Figura 8 ), anche se molte altre configurazioni possono essere applicate. La stimolazione del sondaggio e della formazione è stata basata sui parametri definiti in Ruaro et al. 14 .
Una linea di base è stata inizialmente impostata registrando 5 minuti di attività spontanea prima della stimolazione. Una volta stabilita la linea di base, è stata somministrata una stimolazione di stimolazione pre-allenamento da 5 minuti composta da un impulso bifasico da 0,5 Hz con una durata di impulso di 200 μs e un'ampiezza di impulso di 900 mV ( Figura 7a ), attraverso i siti di stimolazione selezionati ( ossia "L" -a forma di). Un protocollo di allenamento è stato poi somministrato alle reti ogni 2 s utilizzando lo stesso set di elettrodi. Il segnale di allenamento era composto da 40 treni a impulsi ciascuno contenente 100 impulsi bifasici con un intervallo di 4 ms, una durata di impulso di 200 μs e un'ampiezza di impulso di 900 mV ( figura 7b e figura 7c ). Questo periodo di formazione è stato seguito da una fase di post-formazione di 5 minuti, simile alla stimolazione pre-allenamento. Il protocollo era alloraConcluso con una registrazione di 5 minuti di attività spontanea post-stimolazione.
Lo stesso protocollo sperimentale è stato applicato ad un gruppo di controllo di culture per tenere conto delle fluttuazioni naturali nella risposta della rete. L'unica differenza nel protocollo di controllo, tuttavia, è stata l'applicazione di un periodo di addestramento dello sham, durante il quale non è stato somministrato alcun segnale di allenamento reale.
Le analisi statistiche dei set di dati ( cioè, la formazione contro il controllo) sono state effettuate con un ANOVA a senso unico, con la variabile "formazione" come fattore tra soggetto. La latenza è stata utilizzata come un fattore all'interno del soggetto. Se è stata trovata un'interazione significativa, è stata eseguita la procedura post-hoc di Tukey. I risultati hanno mostrato una risposta pre-allenamento entro 20 ms post-stimolo, anche se la gamma di attività era incoerente dopo la prima risposta. Tuttavia, l'attività post-formazione non ha mostrato solo ar Esponendo entro i primi 20 ms post-stimolo, come visto durante la pre-allenamento, ma ha anche mostrato un'attività significativa 30-50 ms post-stimolo ( Figura 14 e Figura 15 ) 15 . C'era anche una correlazione statisticamente significativa di "frequenza di picco" rispetto a "tempo dopo stimolo" e di "affidabilità spike" rispetto a "tempo dopo stimolo". L'affidabilità di spike può essere definita come la probabilità di vedere una risposta di rete a una stimolazione, dove una risposta a ciascun stimolo viene assegnato un valore massimo di 1. La figura 16 mostra quasi un aumento del 50% della frequenza di picco, nonché un valore di 30 -50% di incremento dell'affidabilità di picche per reti addestrate rispetto al controllo nell'intervallo di 20-50 ms post-stimolo. Questi risultati suggeriscono che la formazione cambiò fondamentalmente le dinamiche di rete.
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
Figura 1 : Strumenti e materiali utilizzati per l'embrione. ( A ) Vassoio pieno di ghiaccio. ( B ) Piatti di Petri pieni di freddo L-15 "slush". ( C ) Asciugamano carta. ( D ) Bottiglia a spruzzo con etanolo al 70%. ( E ) Fine pinza (x2). ( F ) Piccole forbici chirurgiche. ( G ) Pinze a punta del pollice del naso. ( H ) forbici grandi. ( I ) Borsa del corpo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Strumenti e materiali utilizzati per l'estrazione del cervello. ( A B ) Piatto di Petri contenente teste embrionali. ( C ) Tubo centrifugo rivestito in foglio con supporto di stoccaggio. ( D ) Piatto Petri invertito. ( E ) Carta filtrante autoclavata. ( F ) Beaker con etanolo al 70%. ( G ) Pipetta di plastica. ( H ) forbici Iris. ( I ) pinze fine. ( J ) Spatola sottile a doppia chiusura. ( K ) Asciugamano di carta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Cultura ottimale rispetto a non ottimali. ( A ) mostra un tappeto sano delle cellule che coprono gli array, contrariamente a ( B ),In cui vi è una scarsa proliferazione cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Risultati rappresentativi di attività spontanea. ( A ) Rappresentante trama raster di attività spontanea. I segni di spunta indicano i potenziali di azione registrati da 9 elettrodi attivi durante una finestra a 20 s ad una frequenza di acquisizione di 25 kHz e un range di filtro a banda passante tra 3 kHz e 300 Hz. ( B ) Potenziale di azione extracellulare filtrato rappresentativo da un sito attivo. Figura modificata dal riferimento 15 . Clicca qui per visualizzare una versione più grandeN di questa figura.
Figura 5 : Impostazione di registrazione. ( A ) Generatore di stimolazione. ( B ) Regolatore di temperatura. ( C ) Alimentazione. ( D ) Amplificatore. ( E ) Headstage / preamplificatore. ( F ) Cappato MEA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Rappresentazione schematica del protocollo di formazione elettrica. Registrare una linea di base iniziale per 5 minuti e una stimolazione della sonda per 3 min. Applicare stimoli tetanici Acceso per 90 s, che non è registrato. Applicare e registrare una seconda stimolazione della sonda per 3 minuti e una linea di base finale per 5 minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Parametri di segnale di stimolazione e formazione di prova. ( A ) La stimolazione stimolante è costituita da impulsi bi-fasici di ± 900 mV somministrati ad una frequenza di 0,5 Hz. ( B ) I treni di impulso sono costituiti da impulsi bi-fasici di 100, ± 900 mV ad una frequenza di 250 Hz. ( C ) Il segnale di allenamento è costituito da 40 treni a impulsi somministrati ogni 2 s. Figura modificata dal riferimento 15 ."_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 : Rappresentazione della "L" -shape Configuration. Le squadre rappresentano singoli elettrodi da un MEA. I quadrati blu indicano gli elettrodi usati per la stimolazione, mentre tutti gli altri vengono utilizzati per la registrazione. Figura modificata dal riferimento 15 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9 : Unità distintive da disturbi e da artificiali di stimolazione. I vari pannelli superiori ( A -
Figura 10 : istogramma del tempo post-stimolo (PSTH). Un'interfaccia utente grafica (vedi tabella dei materiali ) raggruppa i PSTH secondo l'input dell'utente ( ad esempio, la popolazione PSTH, la PSTH media polarizzata o l'individuoCanale PSTH), consentendo una panoramica dell'esperimento di stimolazione e per un confronto immediato tra i file post-e-pre-stimoli. Inoltre raggruppa il PSTH iniziale vs finale; Questo confronta la risposta della rete con i primi 6 e gli ultimi 6 stimoli. La GUI esegue numerose altre funzioni, come ad esempio la frequenza di picco, l'intervallo di intervalli, i picchi per ogni istante, l'intervallo di intervalli e la durata di scoppio, sia per i file di stimolazione che per i file con attività spontanea. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11 : Panoramica della preparazione e placcatura delle cellule. ( A ) Un topo incombente E17 viene eutanizzato con CO 2 . ( B ) Il mouse è decapitataEd l'utero viene rimosso. ( C ) Gli embrioni vengono rilasciati e decapitati. ( D ) Il cervello viene estratto da ogni embrione e i lobi frontali vengono rimossi. ( E ) Le cellule sono dissociate. ( F ) Le cellule dissociate sono sospese in mezzo. ( G ) Le cellule sospese sono placcate su matrici multi-elettrodo a 60 canali (MEAs). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12 : Culture neuronali placcate su matrici di microelettrodi. I neuroni embrionali del mouse sono placcati su MEA a 60 canali, che consentono la registrazione simultanea dell'attività neuronale in rete da ciascun elettrodo. (Figura modificataDal riferimento 15 ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13 : Programma di ordinamento utilizzato per ordinare le forme d'onda da ogni canale. Il programma di ordinamento (vedere Tabella materiali ) carica un file di dati e visualizza tutte le unità inizialmente acquisite per ciascun canale. Uno dei diversi metodi è selezionato per assegnare segnali a unità specifiche. In questo esempio, è stato selezionato l'algoritmo di clustering k-means e l'unità gialla (etichettata come "unità a" nella finestra di fondo) è stata identificata. Un altro programma (vedi Tabella Materiali ) viene quindi utilizzato per esportare il file .nex in un file .mat, che è il file di input per la GUI personalizzata (vedere
Figura 14 : Attività di rete alterata in risposta alla stimolazione dopo un periodo di addestramento. Rappresentante trama raster di attività da otto elettrodi. La linea rossa verticale indica l'ora dello stimolo e i segni di spunta neri indicano le potenzialità d'azione. Nella pre-formazione ( A ), vi è una risposta immediata all'impulso stimolo attraverso i canali. Nella formazione post-allenamento ( B ), la rete mostra una risposta di attività più prolungata, nonché la risposta immediata alla stimolazione 15 ..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15 : Le reti addestrate hanno significativamente alterato le frequenze di spike. La frequenza della rete per le reti di controllo viene calcolata integrando il numero di picchi superiori a 50 ms immediatamente dopo ogni stimolazione e suddivisione per quel periodo. Viene mostrata la media di 12 tracciati e 10 reti di controllo (le barre di errore indicano l'errore standard della media). L'asterisco (*) indica una differenza statistica ( p-valore <0.05) tra i due set di dati. Figura modificata dal riferimento 15 . Clicca qui per vedere un larGer di questa figura.
Figura 16 : Le risposte mediate sinapticamente sono significativamente modificate nelle reti addestrate. ( A ) L'affidabilità del picco, misurata in bidoni da 10 ms e normalizzata alle reti di controllo, non mostra alcuna modifica per l'attivazione diretta dei neuroni vicino agli elettrodi (0-20 ms). Non esiste quindi alcuna differenza statistica tra i controlli e le reti addestrate per quei contenitori. D'altra parte, le risposte di latenza più lunga (30-50 ms) sono sinapticamente mediate, indicando che questo metodo fornisce un'indagine più dettagliata dell'affidabilità rispetto alla figura 15 sopra. ( B ) La frequenza di frequenza della popolazione ripete il comportamento dell'affidabilità e non mostra alcuna modifica per l'attivazione diretta (0-20 ms), mentre una statLa differenza è significativamente significativa per le risposte a più lungo termine (30-50 ms). Questo comportamento è coerente con i risultati medi nella figura precedente 15 . Le barre di errore sono l'errore standard della media, calcolato per 10 reti di controllo e 12 reti addestrate. (*) Valore p <0,05; (**) valore p <0,001. Figura modificata dal riferimento 15 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Quantità | Articolo |
| 1 | Bottiglia di reagente in vetro autoclavato (dimensioni minime di 100 ml) |
| 20 | 15 ml di tubi centrifughi sterili |
| 1 | 10 ml di pipetta sterile sterile |
| 4 | 25 ml sterileE pipetta serologica |
| 2 | Pipetta serologica sterile da 50 ml |
| 1 | Rack per tubi centrifuga |
| 150 ml | Acqua sterile DI |
| 5 mg | Flacone di poli-D-lisina |
Tabella 1: Preparazione PDL - Elenco dei materiali e dei reagenti.
| Quantità | Articolo |
| 1 | 50 ml di tubi centrifughi sterili |
| 10 | 15 ml di tubi centrifughi sterili |
| 2 | 1 ml di pipetta sterile sterile |
| 2 | Pipetta serologica sterile da 50 ml |
| 1 | Rack per tubi centrifuga |
| 1 ml | FosfatoSalina tampone (PBS) |
| 1 mg | laminina |
Tabella 2: Preparazione di Laminina - Elenco dei materiali e dei reagenti.
| Quantità | Articolo |
| 1 | Bottiglia di reagente in vetro autoclavato (dimensioni minime di 100 ml) |
| 20 | 15 ml di tubi centrifughi sterili |
| 1 | 10 ml di pipetta sterile sterile |
| 4 | Pipetta serologica sterile da 25 ml |
| 2 | Pipetta serologica sterile da 50 ml |
| 1 | Rack per tubi centrifuga |
| 150 ml | Acqua sterile DI |
| 5 mg | Flacone di poli-D-lisina |
Tabella 3: Preparazione media di memorizzazione - Elenco dei materiali e dei reagenti.
| Quantità | Articolo |
| 44 mL | DMEM con una forma stabulizzata di L-glutamina (vedi tabella dei materiali) |
| 1 ml | Supplemento senza serum per la coltura di cellule neurali (vedere tabella dei materiali) |
| 2,5 mL | Siero del cavallo |
| 100 μL | Acido ascorbico [4 mg / ml] |
| 2,5 mL | Siero del bovino fetale (FBS) |
| 0,5 mL | Pen strep (opzionale) |
| 1 | 50 ml di tubi centrifughi sterili |
| 2 | Pipetta serologica sterile da 25 ml |
| 2 | Pipetta serologica sterile da 10 ml </ Td> |
| 2 | 1 ml di pipetta sterile sterile |
| 1 | Filtro da 250 ml |
Tabella 4: DMEM 5/5 Preparazione Medio - Elenco dei Materiali e dei Reattivi.
| Quantità | Articolo |
| 49 ml | DMEM con una forma stabulizzata di L-glutamina (vedi tabella dei materiali) |
| 1 ml | Supplemento senza serum per la coltura di cellule neurali (vedere tabella dei materiali) |
| 100 μL | Acido ascorbico [4 mg / ml] |
| 0,5 mL | Pen strep (opzionale) |
| 1 | 50 ml di tubi centrifughi sterili |
| 2 | Pipetta serologica sterile da 25 ml |
| 2 | 1 ml di pipetta sterile sterile |
| 1 | Filtro da 250 ml |
Tabella 5: DMEM + Preparazione Medio - Elenco dei Materiali e dei Reattivi.
| Quantità | Articolo |
| 1 | Papain 140 U / flaconcino |
| 1 | Dnase 1,260 U / flaconcino |
| 7 mL | DMEM + (raffreddato) |
| 5 mL | DMEM 5/5 (riscaldato) |
| 10 μL | Trypan blu |
| 2 | Lame a bisturi |
| 1 | Piatto di Petri sterile da 35 mm |
| 4 | 15 ml di tubi centrifughi sterili |
| 2 | 5 mL di tubi criogenici sterili |
| 2 | 2 mL di tubi criogenici sterili |
| 1 | 50 ml di tubi centrifughi sterili |
| 1 | Tubo di microcentrifuga |
| 2 | Grande pipetta di trasferimento del foro |
| 3 | Piccola pipetta di trasferimento del foro |
| 5 | 2 ml di pipetta sterile sterile |
| 5 | 1 ml di pipetta sterile sterile |
| 2 | 10 μL di punte micropipette sterili |
| 1 | 1000 μL di punte micropipette sterili |
| 1 | Chip emocytometrico |
Tabella 6: Dissociazione delle cellule - Elenco dei materiali e dei reagenti.
Discussion
I passi descritti in questo protocollo forniscono sufficienti dettagli per il principiante per piegare le proprie culture neuronali sulle MEA e per registrare l'attività di rete. Questo protocollo contribuirà a garantire che le culture aderiscano correttamente, formando uno strato di cellule di moquette sulle matrici degli elettrodi e rimangono sani e privi di contaminazione per mesi.
Anche se è meglio aderire a tutte le parti del protocollo, ci sono passaggi per tutto il processo che sono fondamentali per l'esito positivo. L'uso della tecnica asettica in tutto il processo è imperativo per impedire che le culture diventino contaminate. I nuovi MEA devono essere resi idrofili, come descritto nel protocollo, altrimenti si verificherà un'adeguata adesione cellulare. Evitando pipettature dure e la formazione di bolle d'aria durante la dissociazione ridurrà il numero di cellule danneggiate e porterà ad una resa più elevata e più sana. Passaggio da DMEM 5/5 a DMEM + dopo il primoL'alimentazione è anche importante. DMEM 5/5 contiene il siero di cavallo, che causerà le cellule gliali a dominare la cultura se usato continuamente e provocherà una cattiva attività neuronale, anche se le culture appariranno sane 17 . Nutrire le culture come previsto e mantenerle in condizioni di incubazione adeguate è anche cruciale.
Le colture di cellule di placcatura su MEA implicano molte variabili che possono portare a risultati inferiori al massimo. Sebbene l'obiettivo sia un "tappeto" perfetto delle cellule, l'insuccesso di affrontare i passaggi critici sopra menzionati comporterà una maturazione della cellula povera o una contaminazione. Anche la cattiva adesione cellulare, diversa dalla maturazione della cellula povera, è anche una preoccupazione. Ciò può essere causato da diversi fattori, tra cui la preparazione povera di MEA prima della placcatura o dell'utilizzo di vecchi supporti. Se vecchio mezzo contenente una forma stabilizzata di L-glutamina e senza supplemento di siero per la coltura di cellule neurali (cfr), Le cellule inizialmente si aderiscono, ma poi galleggiano dopo circa due settimane. Se la contaminazione batterica è un problema persistente, un antibiotico, ad esempio ampicillina o pen-strep, può essere aggiunto al mezzo. Ci sono anche fungicidi disponibili per trattare la contaminazione fungina. Queste sono alcune delle variabili più comuni che possono influenzare l'esito delle culture. Ci sono molti altri che verranno incontrati solo dopo il tempo e l'esperienza.
In confronto all'uso di microelettrodi di vetro, questa tecnica è eccellente per studiare le dinamiche di rete e le risposte farmacologiche. Consente l'uso di molti differenti modelli di stimolazione spaziometrica e temporale e consente la registrazione delle risposte neuronali da più aree contemporaneamente. I gruppi precedenti hanno dimostrato risultati interessanti utilizzando protocolli simili a quelli descritti qui 18 . Poiché le culture durano per settimane o mesi e le stesse culture possono essere riutilizzate, questa tecnica è anche unaPer esperimenti multipli nel tempo sulla stessa rete.
Tuttavia, esistono limitazioni a questa tecnica. I MEA sono non invasivi. Pertanto, possono registrare solo attività extracellulare, in contrasto con la registrazione delle patch o la registrazione intracellulare con pipette. Inoltre, poiché ogni elettrodo in una matrice è coperto da diverse cellule, non è possibile risolvere l'attività di un singolo neurone. Al contrario, perché queste sono culture in vitro , non possono riprodurre completamente le proprietà strutturali delle reti nel cervello. Inoltre, l'attività può essere registrata solo per meno di 30 minuti alla volta senza un meccanismo che fornisce un'atmosfera di CO 2 per le cellule per mantenere il loro equilibrio del pH.
Una volta acquisita questa tecnica, possono essere esplorate manipolazioni farmacologiche con o senza stimolazione elettrica. Possono anche essere progettati e testati nuovi protocolli per sondare l'apprendimento e la formazione della memoria nelle reti neuronali, insieme a pRotocoli per reti ippocampali o midollo spinale. I protocolli per la stimolazione e la formazione delle reti sono stati precedentemente pubblicati e alcuni di questi sono stati ulteriormente sviluppati in protocolli in vivo , come ad esempio l'adattamento selettivo proposto da Eytan et al. 19 . Sono stati testati diversi protocolli. Tuttavia, solo i risultati di una modifica alla procedura del tetano proposto da Ruaro nel 2005 sono presentati qui 14 , 20 .
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione della National Science Foundation CMMI-1300007. Vorremmo riconoscere ai membri del laboratorio che hanno contribuito alla progettazione di questi protocolli e al mantenimento delle culture da oltre cinque anni presso l'Università George Mason: il Dr. Joseph J. Pancrazio, il Dr. Hamid Charkhkar, il Dr. Gretchen Knaack , Il dottor Franz Hamilton, Michael Maquera e Robert Graham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
- Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
- Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C.
- Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Shahaf, G., Marom, S.
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S.
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871 (2010).
- Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
- Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399 (2015).
- Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
- Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
- Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
- Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).
