Summary
在多电极阵列上培养的小鼠神经元细胞在电刺激后显示出响应的增加。该协议演示了如何培养神经元，如何记录活动，以及如何建立协议来训练网络来应对刺激模式。
Abstract
微电极阵列（MEA）可用于研究药物毒性，为下一代个性化医学设计范例，研究神经元培养中的网络动力学。与更传统的方法（例如仅能记录单个单元的活动的补丁夹）相反，MEA可以从网络中的多个站点同时记录，而不需要单独放置每个电极的艰巨任务。此外，可以在相同的实验装置中容易地应用许多控制和刺激配置，从而允许探索广泛的动力学。这些体外研究感兴趣的关键动力之一是培养的网络显示表征学习的属性的程度。在MEA上培养的小鼠神经元细胞显示由电刺激诱导的训练后的反应增加。该协议演示了如何在MEA上培养神经元细胞;成功地从超过95％的电镀盘中绳索;建立协议来训练网络来应对刺激模式;并对这些实验的结果进行排序，绘制和解释。证明了使用专有系统来刺激和记录神经元培养。软件包也用于排序神经元单位。定制设计的图形用户界面用于可视化刺激后时间直方图，脉冲间间隔和脉冲串持续时间，以及将训练协议之前和之后的细胞响应与刺激进行比较。最后，讨论了这项研究工作的代表性成果和未来发展方向。
Introduction
微电极阵列（MEA）可用于研究药物毒性，下一代个性化药物的设计范例，以及神经元培养中的网络动力学研究1 。与更传统的方法相反，例如仅能记录单个细胞的活性的片段钳位，或者用玻璃移液管进行现场记录，其可以记录来自单个位点的电极周围的神经元的细胞外反应--MOA可以同时在细胞培养中从多个位点记录，而不需要分别放置每个电极的艰巨任务。这允许研究在该文化中形成网络的细胞群之间的动态相互作用。此外，电刺激对网络发射模式2,3,4,5和网络控制6的影响/ sup>在神经元培养物中已经有很好的记录，并且可以在相同的实验装置中容易地应用许多电刺激和对照的配置，从而允许探索广泛的时空动力学。
这些体外研究感兴趣的关键动力之一是培养的网络显示表示学习的性质7,8,9,10,11,12,13。 Peixoto实验室以前研究了高频训练信号的影响，如Ruaro et al。 14 ，在微电极阵列15上铺板的小鼠神经网络上。在这些实验中，网络显示响应跟随性增加g电刺激引起的训练。增加的反应被认为是通过刺激识别的一种学习形式，其中网络在应用特定刺激（ 即培训）方案之后以一致的方式响应于刺激的改变。
该协议演示如何培养MEA上的神经元细胞，成功记录超过95％的电镀盘，建立培养网络以响应刺激模式，排序单一单位活动，绘制直方图并解释结果的方案这样的实验。证明使用专有系统（参见材料表 ）来刺激和记录神经元培养物，以及软件包的应用（参见材料表 ）来排序神经元单位。定制设计的图形用户界面（参见表格材料 ）用于可视化后期时间延迟时间直方图，突发间间隔和突发持续时间，以及将训练协议之前和之后的细胞响应与刺激进行比较。
Protocol
所有动物手术均遵循NIH指南和/或“人体护理和使用实验动物公共卫生服务政策”，并在乔治梅森大学获得制度上认可的动物护理和使用（IACUC）协议。
材料准备
- 高压灭菌以下材料：5.75英寸长的玻璃移液管垂直放置在（2）500 mL烧杯中，约24张滤纸（150 mm直径，每个切割成8个楔形物;孔径无关紧要），1,000μL过滤移液器提示，200μL过滤的吸管头，10μL过滤的吸管头和去离子水（DI）洗涤（至少200 mL）。
- 准备试剂和介质。
- 使用无菌技术准备生物中的所有试剂和培养基。
- 按照表1制备聚-D-赖氨酸（PDL）。
- 将PDL与无菌DI水混合至最终c浓度为50μg/ mL，如下。使用无菌血清移液管将96 mL无菌DI水转移到高压灭菌的玻璃试剂瓶中。
- 使用无菌血清移液管将4 mL无菌去离子水加入到含有PDL的制造商小瓶中。通过吸移溶解PDL。使用相同的移液管将PDL溶液转移到含有96 mL无菌去离子水的玻璃试剂瓶中。
- 将瓶子从生物系统中取出，然后旋转溶液，紧紧盖上瓶子。在生物学方面，将溶液分成5-mL等分试样;在-20°C下冻结任何未使用的溶液。解冻的PDL可以重新冻结一次。如果重新冻结，丢弃解冻的溶液。
- 根据表2制备层粘连蛋白溶液。
- 将层粘连蛋白与PBS混合至终浓度为20μg/ mL，如下。使用无菌血清移液管将49 mL PBS转移到50 mL离心管中。
- 使用无菌血清学l移液管将1 mL PBS加入含有适当重量层粘连蛋白的制造商小瓶中。通过移液溶解层粘连蛋白。使用相同的移液管将层粘连蛋白溶液转移到含有49 mL PBS的50mL离心管中。
- 在将其从生物体中取出之前将其密封，并旋转溶液。在生物学方面，将溶液分成5 mL等分试样;在-20°C下冻结任何未使用的溶液。解冻的层粘连蛋白不能重新冷冻;丢弃任何未使用的解冻液。
- 准备存储介质，如表3所示 。
注意：存储介质用于在环境CO 2水平下存储组织长达一个月。可以购买（参见表格），或者可以使用以下通用方法制备：环境型CO 2细胞储存培养基+ 2％无血清补充神经细胞培养+ 0.5mM细胞培养基，其含有稳定的L-谷氨酰胺的形式（见材料表）。- 为了制备10毫升储存培养基，将10毫升不含CaCl 2的胚胎组织储存培养基转移到15 mL离心管中。加入210μL无血清补充剂用于神经细胞培养和55μL稳定形式的L-谷氨酰胺。通过倒置轻轻混合。
- 由于存储介质对光敏感，通过用铝箔覆盖15-mL离心管来保护它。等分试样每管2 mL储存培养基，共5个等分试样。存放在冰箱中长达2周或直至准备使用，但不要冻结。
- 根据表4准备DMEM 5/5培养基。
- 解冻等分试样用于神经细胞培养，马血清（HS），胎牛血清（FBS）和抗坏血酸的无血清补体。解冻等量的pen-strep，如有必要，以控制细菌污染。将每种成分吸入50 mL离心管中。确保移液器吸头不接触任何表面或物体TS。
- 在生物圈内，将过滤器连接到真空管，真空度保持关闭。将混合物倒入过滤器顶部并关闭。打开生物的真空，让介质过滤到容器的底部。在关闭真空之前，将过滤器从真空中拔出。
- 将盖子拧紧在无菌培养基容器上，贴上标签，并将任何未使用的培养基在4°C下储存长达一个月。打开生物体内的容器，以保持培养基无菌。
- 根据表5准备DMEM +培养基。
- 用于神经细胞培养和抗坏血酸（和需要时的pen-strep）的无血清补充剂的解冻等分试样。将每种成分吸入50 mL离心管中。对剩余的过程重复步骤1.2.5.2-1.2.5.3。
阵列/盘准备
注意：本程序中使用的MEA是60通道数组o组合在一个8 x 8平方。电极间距离为200μm，每个电极的直径为10μm。用于轨迹的导电材料是钛，电极本身由TiN制成。电极周围的玻璃环为6毫米高，外径为24毫米。使用由聚甲醛（POM）制成的盖覆盖MEA，并且使用透气/液体不渗透的氟化乙烯丙烯（FEP）膜来防止在记录和刺激期间的污染。
- 电镀前一天
- 将未使用的MEA通过将其暴露于等离子体而使其亲水;这通常在第一次使用后不需要。确保用于对照培养物的玻璃盖玻片也接受等离子体处理。
注意：塑料培养皿（35毫米）也可用作对照菜肴，不需要任何预处理。- 使用等离子体蚀刻器以半功率（50W）维持40-60秒的等离子体处理室压力设定为100-150 mT。
- 立即用自来水填写多边环境协定。将盖玻片浸入装有DI水的培养皿中。将去离子水与处理过的表面接触约15分钟。
- 在生物圈内，吸出DI水。用70％乙醇将MEA填充到边缘。从含有盖玻片的培养皿中取出去离子水，并用乙醇填充培养皿，直至盖玻片完全浸没。让它坐10-15分钟。
- 用MEA ID＃，手术日期，细胞类型和缩写标记所有培养皿和对照菜肴。然后，将每个MEA放在标记的培养皿中。
- 将MEA放入单独的培养皿中，并用真空抽吸去除乙醇。用无菌去离子水填充MEA以除去残留的乙醇。使用真空抽吸去除去离子水。让多边环境协定在生物圈内空气干燥。
- 加入40-70μL的50μg/ mL聚-D-溶素e（PDL;高分子量，至少50kDa）到每个MEA的中心，0.2mL用无菌移液管吸头进行对照。
注意：确保不要用移液器，尖端接触MEA的中心，否则可能会损坏电极。分配的PDL的精确量取决于表面的亲水性。 - 将一小块实验室纸巾放入每个盘中，并用无菌水润湿以避免PDL蒸发过夜。在把它们从生物中除去之前，盖上所有的菜肴。将培养皿放在37℃的培养箱中过夜。
- 将未使用的MEA通过将其暴露于等离子体而使其亲水;这通常在第一次使用后不需要。确保用于对照培养物的玻璃盖玻片也接受等离子体处理。
- 电镀日
- 电镀日，解冻1份层粘连蛋白（20μg/ mL）;每个MEA需要40-50μL的层粘连蛋白，每个对照培养皿需要0.2mL层粘连蛋白。根据多边环境协定的数量和对照使用量计算所需的层粘连蛋白的体积。
- 将所有的菜从培养箱转移到生物。
- 用无菌填充所有多边环境协定使用无菌血清移液管去除水，并允许他们坐10-15分钟。使用无菌巴斯德吸管吸取去离子水，重复两次。
- 使用无菌移液器吸头，将40-50μL解冻的层粘连蛋白加入每个MEA的中心和0.2mL层粘连蛋白至对照板。覆盖生物中的所有MEA和对照菜，并将其转移到37℃的培养箱中1小时。
- 使用无菌巴斯德移液器抽吸，从多孔介质中心小心地清除多余的层粘连蛋白，并使表面在电镀前进行空气干燥。
- 将菜肴放在生物中，或将它们放在培养箱中，直到准备好将细胞平片。
注意：菜肴可以留在孵化器中，直到第二天。然而，如果需要更多的时间，建议清洁菜肴并从聚-D-赖氨酸（PDL）步骤重新开始（步骤2.1.6）。
胚胎去除和脑萃取
- 将L-15（Leibovitz）培养基倒入100毫升培养皿中的4只。盖上它们并将它们放在-20°C的冷冻箱中，直到培养基具有泥沙稠度，但没有冷冻固体（约40-60分钟）。
- 在解剖前约40分钟至1小时。
注意：这将迅速冷却胚胎和大脑，使其具有坚实的一致性，并且在提取时不分解。 - 准备解剖区域去除胚胎。
- 在靠近水槽的地方放置一个带有冰块的托盘，并布置外科手术器械和材料以进行胚胎移除。这些包括4只含冷冻L-15“蘸油”的培养皿，纸巾，70％乙醇的喷雾瓶，钝鼻拇指镊子，精镊子，小型手术剪刀和大型剪刀（ 图1 ）。
- 准备解剖区域进行大脑提取。
- 放置玻璃培养皿在一个充满冰的托盘中。
- 放置用于大脑提取的外科手术器械和材料，包括纸巾，小型手术剪刀，薄的双端刮刀，装有70％乙醇的喷雾瓶和用于处理屠体的塑料袋（ 图2 ）。
- 穿上实验室外套，面罩和手套。用70％乙醇喷洒所有工作表面，包括手套。
注意：虽然这不是无菌程序，但最好尽量减少污染的机会。 - 根据NIH指南16和/或关于人体护理和使用实验动物的公共卫生服务政策，并根据制度上批准的动物护理和使用协议（IACUC）对二氧化碳窒息进行安乐死一只E17定时怀孕的小鼠。确保在3至5分钟内缓慢释放CO 2气体，以避免引起恐慌或迪斯科舞蹈mfort在老鼠
- 取下鼠标并将其放在纸巾上，腹侧朝上。用70％乙醇喷洒其下腹部。使用小型手术剪刀，通过下腹部的皮肤和皮下脂肪进行V形切口，将切口延伸到胸腔的远端并暴露子宫。
- 使用镊子，小心地抬起胚胎之间的子宫。用解剖剪刀剪掉结缔组织，直到整个子宫都是自由的。用70％乙醇冲洗子宫以除去任何血液并将其置于装有冷L-15的4只培养皿中。
- 使用一对精细镊子从子宫和内胚胎囊释放每个胚胎。确保脐带已被切断，并将胎盘囊移除。将释放的胚胎放入冷L-15的第二道菜中。用镊子和剪刀剁碎胚胎。使用镊子，将头部转移到第三个培养皿和身体到第四，都是冷的L-15。
额叶皮质去除
- 在生物学方面，在冷冻玻璃培养皿阶段放置一块高压灭菌滤纸。将单个胚胎头放在滤纸上。握住颅骨，用非优势手放置一对镊子通过眼腔。用一对虹膜剪刀去除皮肤和下面的肌肉组织。
- 将虹膜剪刀的下部剪刀的切割边缘放入头骨的底部。保持较低的透明度抵抗头骨的内表面，远离脑部，穿过枕骨板，然后沿着顶叶板之间的中线切割。继续切割，在软骨前额头骨板之间。
- 从枕骨板的中心开始，在中心切割的左侧和右侧进行垂直切割。
- 通过小心地在小腹之间滑动小铲，去除大脑的大脑和底部的颅骨板，直到它完全在脑下。把铲子抬起来整个大脑会完整地出来。
- 将几滴L-15培养基放在滤纸上，使大脑不粘到纸上，轻轻地将刮刀上的大脑滑入滤纸上，腹侧朝下。用刮刀的尖端小心切开嗅球。
- 使用干净的铲子，以梯形图案解剖额叶。将组织转移到含有存储介质的15mL离心管中。重复上述与剩下的胚胎。确保每次使用新鲜的滤纸楔（ 即每头一个滤纸楔）。
细胞解离
- 在生物方面，组装表6中列出的项目。
- 使用无菌血清移液管将5mL DMEM +加入一瓶木瓜蛋白酶;加热的DMEM +可以用来更好地溶解木瓜蛋白酶。平缓移液管混合溶液。
- 使用无菌微量移液管将0.5mL的DMEM +加入一瓶DNA酶。在制造DNase溶液时避免强力吸取，因为DNase对剪切变性敏感。
- 将2.5mL木瓜蛋白酶溶液转移到无菌离心管中，并将125μL的DNase加入到同一管中。通过轻轻颠倒盖上的离心管约8次混合溶液。
- 使用无菌的大口径移液管，从含有储存介质的管中取出组织，并将其放入无菌的35 mm培养皿中。收集尽可能少的介质。使用无菌移液器去除尽可能多的多余的储存介质，而不需要去除组织。组织不宜在培养基中漂浮，但应保持湿润。
- 使用两个无菌解剖刀刀片来破坏组织。使用无菌血清移液管将2.5mL DNA酶/木瓜蛋白酶混合物加入培养皿中的切碎组织。轻轻旋转培养皿以确保t帽子所有的纸巾在溶液中都是游离的，不粘附到盘子的底部。将培养皿放入37℃的培养箱中15分钟。
- 在生物学方面，使用无菌的大孔转移移液管将所有培养基和组织转移到无菌的5 mL低温管中。将相同的大孔转移吸管的尖端放置在管底部附近。通过缓慢吸取10-15次轻轻地研磨。
- 避免在移液时形成气泡。使用小口径移液管重复该过程，直到达到均匀的混合物。如果组织不分离，使用1,000μL移液管研磨。
- 向分离的细胞混合物中加入2mL温热的DMEM 5/5。在离心管仍处于生物圈时盖住。通过倒置轻轻混合在室温（20-25℃）下以约573xg离心5分钟。
- 在生物学方面，使用无菌血清移液管去除并丢弃所有上清液，而不会破坏沉淀。使用无菌移液管将1mL温热的DMEM 5/5加入管中的沉淀物中以重新悬浮细胞。使用无菌的小口径移液管，通过轻轻地上下移动来分解沉淀，直到混合物均匀。
注意：吸移时避免形成气泡。如果收集很少的组织，只加入0.5mL的DMEM 5/5。 - 在生物体内，使用无菌移液管将10μL细胞悬浮液转移到微量离心管中。在生物发现之外，向微量离心管中的10μL细胞悬浮液中加入10μL台盼蓝。
注意：此步骤不需要不育。 - 将10μL台盼蓝细胞悬浮液装入一次性血细胞计数器芯片中，以计数细胞。
6.电镀细胞
- 在生物学方面，使用无菌微量移液器将50μL细胞悬浮液转移到每个阵列的中心，每个对照培养皿。使用一个pi每碟的小食尖确保将单元格完全放在阵列的中心。用无菌水重新润湿在盘子里的实验室纸巾，或者将新的纸巾放在每个碟子里。盖上菜。
- 将覆盖的培养皿放置在37℃和10％CO 2的培养箱中3-4小时。
- 在生物学方面，轻轻地向每个MEA加入1mL温热的DMEM 5/5。
注意：添加介质时，避免将电池从中心阵列中清洗干净（重要！）。非常仔细地，使用无菌微量移液管一次在内边缘添加一滴。 - 在每个MEA上放置一个含有透气性FEP膜的盖子。将他们送回孵化器两天。
注意：盖子防止污染和蒸发。按照无菌技术，将100％乙醇在生物体中干燥，然后放在MEA上。文化必须覆盖生物，并且必须始终保持上限。
7.主要培养文化
- 两天后，用加热的DMEM +进行完全的介质置换。
- 一次只能从孵化器转移到几个生物，以避免强调文化太久。
- 使用无菌的1-mL微量移液管将培养皿中的所有培养基小心地放在培养皿的内壁上，避免接触中心的细胞。每盘只能使用一个吸头，以避免污染。
- 使用无菌微量移液器分配1 mL温热的DMEM +，小心地将移液管的尖端放在盘子的内壁上。
- 如上所述，用温热的DMEM +进行50％的中等变化，每周2-3次，喂食之间不超过4天。
- 使用无菌的1 mL微量移液管从培养皿中抽出500μL培养基。使用无菌微量移液管分配500μL温热的DMEM +/ LI>
8.视觉检查和记录
- 在显微镜下每隔几天检查一次样品，以查找阵列上的细胞覆盖（使用4倍和10倍放大倍率）和污染（使用20倍放大倍数），细菌或真菌。
注意： 图3a显示了最佳细胞覆盖的实例，而图3b显示了细胞密度差的培养物。 - 电镀两周后，测试MEA餐具样品的自发活动。记录从多边环境协定，如下所述，3-5分钟。如果活动存在，将检测到峰值（ 图4 ）。
注意：由实验者根据实验类型和正在调查的假设确定何时开始测试。- 要在MEA中记录活动，请使用以下设备：电源，放大器，前台/前置放大器，温度控制器和刺激发生器（参见材料表和图5 ）。
- 将培养基从培养箱中取出之前，先插上温度控制器，然后打开电源（根据制造商的说明）打开系统，使前置放大器的加热底板达到35°C。
- 将封盖的文化放在前置放大器中，使MEA中的黑线与参考地面良好对齐。确保前置放大器引脚对齐，前置放大器的顶部固定，并且培养帽仍然打开。
- 将培养物置于板中后，取消选中数据采集软件上的“更改MEA”选项（参见软件名称和用户指南的材料表）。此外，在进行任何录制之前，请取消选中标有“空白”的框。
- 在t之后选择“MEA_Select”中的“Download”他的文化被放置在系统中。检查程序在继续之前是否显示“下载确定”。
- 在软件环境中按“开始”开始可视化信号。在主窗口中，选择“Spikes”→“检测”→“自动”，将“Std Dev”值更改为“5”，然后单击“刷新”重置阈值。
注意：“Spikes”窗口显示通过阈值的峰值。 - 在主窗口中，选择“录像机”→“录像机”→“浏览”。更改路径和文件名以识别日期，时间，菜单和实验。设置时间限制（ 例如， 5分钟）。点击“停止”，“录制”和“播放”。请注意，录制会自动停止。
- 打开刺激软件。选择“录像机”→“录像机”→“浏览”创建文件并设置时间e限制。单击“停止”，“录制”和“播放”再次录制。点击“下载和开始”（在刺激软件上），以刺激被传送到菜。
- 选择软件控件中的“更改MEA”按钮以更换菜肴。
注意：不要将文化从培养箱中保持30分钟以上，无需系统保持文化周围的二氧化碳气氛。如果需要更长时间的记录会话，请使用市售的适配器来提供CO 2 。
9.培训网络
注意： 图6显示了下面描述的步骤9.1-9.3的概述。
- 从细胞培养物记录自发活性的5分钟基线（如步骤8所述）。一旦建立基线，就进行5分钟的预训练探测刺激，由0.5Hz双相组成如图8所示 （参见材料表中的软件手册，了解有关如何选择刺激电极的详细信息），脉冲持续时间为200μs，脉冲幅度为900 mV（ 图7a ）。
- 在完成训练前的刺激之后，使用与探测刺激相同的电极向网络管理“训练”协议。如Hamilton 等人所述，每2秒提供一次高频列车。 15 （ 图7b和图7c ）。
注意：训练信号由40个脉冲列组成。每个脉冲串由100个双相脉冲组成，脉冲之间为4ms，脉冲持续时间为200μs，脉冲振幅为900 mV。 - 训练结束后，对细胞进行5分钟的训练后刺激，与训练前刺激相同。一旦训练后刺激结束，记录来自网络的刺激后自发活动的5分钟（如步骤8所述）。
- 使用单独的MEA控制组来解释由于自然波动或系统非平稳性导致的网络响应的可能变化。将上述相同的实验方案管理给那些对照组，除了对照组接受不给予实际训练信号的假手术训练期。
数据分析
注意：数据文件被保存，并使用专有的排序软件将其分类为神经元单元（参见材料表）。使用定制的图形用户界面（GUI）来加载单元并分析文化中的活动模式，突发间间隔，突发持续时间和刺激后时间直方图（PSTH）（参见材料表）。 PSTH是这是要分析的最重要的图形，因为它显示了网络的大小（可变长度）的网络活动，从而提供了网络对所呈现的刺激的响应的可视化表示。
- 使用专有的排序软件将.mcd数据文件转换为.plx格式（请参阅软件名称和用户指南的材料表）。将.plx文件导出到同一程序中的新.plx文件。将通道分成神经元单位（ 图9 ）。排序完成后，将数据导出为.nex文件。
- 在适当的软件中打开.nex文件（请参见“ 材料表” ），并将其另存为.mat文件，以便自定义的GUI进行分析（可自由使用）（请参见“ 材料表” ）。
注意：图形用户界面（参见材料表）根据用户输入绘制PSTHs（ 即群体PSTH，偏置平均值PSTH或单个通道PSTH），允许对刺激实验的概述和后刺激文件和预刺激文件之间的即时比较。它还绘制了初始对最终PSTHs，它将网络响应与前6个和最后6个刺激进行了比较。对于具有自发活动的刺激文件和文件，GUI执行其他几个功能，例如峰值速率，间隔间隔，每个突发的峰值，脉冲串间间隔和脉冲串持续时间。 - 首先，选择一个.mat文件，其变量包含尖峰列车和一个包含刺激工件的变量;脚本将分析数据，主GUI将弹出右侧的PSTH平均图（ 图10 ）。
- 与平均PSTH（红色）相比，单击活动电极按钮可查看单个PSTH（蓝色）。
注意：有源电极将被着色以显示热图，其中更高的值（更多的红色）表示较大峰值PSTH值，表明对刺激的反应较强。 - 使用弹出菜单选择分析选项。选择“偏向平均”按钮选择电极子集，绘制该子集的平均值;这对于比较文化中的子网行为是有用的。
注意：通过弹出菜单选择了多个不同的分析选项，并在软件中的“帮助”按钮中进行说明。 - 选择“保存图形”按钮将当前显示的图形保存为高分辨率的jpeg文件。选择“数据表”按钮将数据导出到电子表格中。
- 与平均PSTH（红色）相比，单击活动电极按钮可查看单个PSTH（蓝色）。
Representative Results
使用本文提出的步骤（ 图11 ） ，孵育铺有E17小鼠神经元细胞的60通道MEA，直到培养物覆盖细胞健康地毯中的阵列（ 图12和图3a ） 。在10％CO 2和37℃下孵育3周后，使用商业记录系统检查培养物的自发活性（参见材料表 ）。在记录过程中使用温度控制器将温度保持在37℃，因为温度影响神经元活动和发射速率。
测试活动
自发活动网络通常呈现出不同的信号模式。一般的活跃文化可以在一个活动中注册约40％的电极。在这些活性电极位置中，几乎一半记录自发信号，发射速率范围为5-10Hz。自发活动的代表性光栅图如图4a所示。刻度标记表示在20秒窗口内以9个有效电极记录的动作电位的时间戳，采集速率为25 kHz，带通滤波器范围为300 Hz至3 kHz。 图4b显示了在分选程序之前的8次活动突发期间的基线噪声和过滤的原始细胞外信号。为了将动作电位与噪声分离，每个通道的阈值被设置为基线噪声的标准偏差的5倍，并且在500ms窗口15上计算 。
在分析之前，每个电极的记录峰值在线下排序以区分物理学逻辑活动和刺激伪影使用k-means算法和主成分分析。被识别为生理反应的信号被分组在一起以在每个电极处产生群体响应（ 图13和图9 ） 。
训练具有电刺激的神经网络
使用刺激发生器（参见材料表），通过MEA电极直接施加到培养物上的电刺激来训练网络。在这组代表性的结果中，使用了由13个电极组成的“L”形结构（ 图8 ），尽管可以应用许多其他配置。探测和训练刺激基于Ruaro 等人定义的参数。 14 。
最初通过在刺激之前记录5分钟的自发活动来设定基线。一旦建立基线，通过选定的刺激位点（ 即 “L”）施用由具有200μs脉冲持续时间的0.5Hz双相脉冲和900mV脉冲幅度组成的5分钟预训练探测刺激（ 图7a ） -成形）。然后使用相同的电极组，每2秒向网络施加训练方案。训练信号包括40个脉冲序列，每个脉冲序列包含100个双相脉冲，4 ms脉冲周期，200μs脉冲持续时间和900 mV脉冲幅度（ 图7b和图7c ）。接下来的训练阶段是训练后5分钟，类似于训练前的刺激。那么协议是最终得出刺激后自发活动的5分钟记录。
将相同的实验方案应用于对照组的培养物以解决网络响应的自然波动。然而，控制协议的唯一区别是应用假手术训练期，在此期间没有实际的训练信号被施用。
数据集的统计分析（ 即培训与对照）采用单因素方差分析进行，变量“训练”作为受试者因素。潜伏期用作受试者内因素。如果发现重要的相互作用，则执行Tukey的事后程序。结果显示，刺激后20ms内的训练前反应，尽管第一次反应后活动范围不一致。但是，培训后的活动不仅仅表现在在训练前的前20ms内刺激后的反应，但在刺激后也显示30-50ms的显着活性（ 图14和图15 ）。 “尖峰频率”与“刺激后时间”和“刺激可靠度”与“刺激后时间”的统计学显着相关性。 “尖峰可靠性”可以定义为看到网络对刺激的响应的概率，其中对每个刺激的响应被分配为最大值1. 图16显示了尖峰频率几乎增加了50％，以及30培训网络的刺激可靠性增加-50％，刺激后20-50 ms范围内的控制增加。这些结果表明，培训从根本上改变了网络的动态。
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图1 ：用于去除胚胎的工具和材料。 （ A ）装满冰的托盘。 （ B ）装满冷L-15“雪泥”的培养皿。 （ C ）纸巾。 （ D ）用70％乙醇喷雾瓶。 （ E ）细镊子（x2）。 （ F ）小型手术剪刀。 （ G ）钝鼻拇指钳。 （ H ）大剪刀。 （ 一 ）身体袋。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：用于大脑提取的工具和材料。 （ A B ）包含胚胎头的培养皿。 （ C ）带盖的离心管与储存介质。 （ D ）倒置玻璃培养皿。 （ E ）高压灭菌滤纸。 （ F ）70％乙醇烧杯。 （ G ）塑料移液器。 （ H ）虹膜剪刀。 （ 一 ）精镊子。 （ J ）薄双层铲（ K ）纸巾。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3 ：最佳与非最佳文化。 （ A ）显示了覆盖阵列的细胞的健康地毯，与（ B ）相反，其中细胞增殖较差。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 ：自发活动的代表性结果。 （ A ）自发活动的代表光栅图。刻度标记表示在20秒窗口中以25 kHz的采集速率和3 kHz至300 Hz之间的带通滤波器范围从9个有效电极记录的动作电位。 （ B ）来自活性部位的代表性过滤的细胞外作用电位。参考文献15修改。 请点击这里查看更大的版本这个数字的n。
图5 ：录制设置。 （ A ）刺激发生器。 （ B ）温度控制器。 （ C ）电源。 （ D ）放大器（ E ）前台/前置放大器。 （ F ）包覆MEA。 请点击此处查看此图的较大版本。
图6 ：电气培训协议的示意图。记录5分钟的初始基线和3分钟的探针刺激。施用强直性刺激 90秒，没有记录。应用并记录第二次探针刺激3分钟，最终基线记录5分钟。 请点击此处查看此图的较大版本。
图7 ：探测刺激和训练信号参数。 （ A ）探测刺激包括以0.5 Hz的频率施用的±900 mV双相脉冲。 （ B ）脉冲串由频率为250 Hz的100±900 mV双相脉冲组成。 （ C ）训练信号由每2秒施加40个脉冲串组成。参考文献15修改。“_blank”>请点击此处查看此图的较大版本。
图8 ：“L”形状配置的表示。正方形表示来自MEA的单个电极。蓝色方块表示用于刺激的电极，而所有其他用于记录的电极。参考文献15修改。 请点击此处查看此图的较大版本。
图9 ：区分单位与噪声和刺激人工制品。几个上面板（ A -
图10 ：刺激后时间直方图（PSTH）。图形用户界面（参见材料表 ）根据用户输入绘制PSTHs（ 即群体PSTH，偏平均PSTH或个体通道PSTH），允许对刺激实验的概述，以及后刺激文件和预刺激文件之间的即时比较。它还绘制了初始与最终PSTHs;这比较了对前6和最后6个刺激的网络响应。对于具有自发活动的刺激文件和文件，GUI执行其他几个功能，例如峰值速率，间隔间隔，每个突发的峰值，脉冲串间间隔和脉冲串持续时间。 请点击此处查看此图的较大版本。
图11 ：细胞制备和电镀概述。 （ A ）将E17怀孕的小鼠用CO 2安乐死。 （ B ）小鼠是十。并且子宫被移除。 （ C ）胚胎被释放并断头。 （ D ）从每个胚胎中提取大脑，去除额叶。 （ E ）细胞解离。 （ F ）将解离的细胞悬浮于培养基中。 （ G ）将悬浮的电池电镀在60通道多电极阵列（MEA）上。 请点击此处查看此图的较大版本。
图12 ：放置在微电极阵列上的神经元培养物。将胚胎小鼠神经元铺板在60通道MEA上，这允许从每个电极同时记录网络上的神经元活动。 （图修改参考文献15 ）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图13 ：用于对每个通道对波形进行排序的排序程序。排序程序（请参见材料表 ）加载数据文件，并显示最初为每个通道获取的所有单位。选择几种方法之一以将信号分配给特定单元。在这个例子中，选择了k均值聚类算法，并且识别了黄色单元（在底部窗口上标记为“单位a”）。然后使用另一个程序（请参阅材料表 ）将.nex文件导出为.mat文件，该文件是定制GUI的输入文件（请参阅
图14 ：在训练期后改变对刺激的网络活动。来自八个电极的代表性光栅图。垂直红线表示刺激的时间，黑色刻度线表示动作电位。在训练前（ A ）中，对通道的刺激脉搏立即作出反应。在训练后（ B ）中，网络展现出更长时间的活动响应，以及对刺激的即时反应15 。.jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图15 ：经过培训的网络显着改变了尖峰频率。通过在每次刺激之后立即将超过50毫秒的峰值的积分与该周期之间的积分来计算控制网络的网络峰值频率。显示的是12个训练和10个控制网络的平均值（误差栏表示平均值的标准误差）。星号（*）表示两个数据集之间的统计差异（ p值 <0.05）。参考文献15修改。 请点击这里查看一个小号这个数字的ger版本。
图16 ：在受过培训的网络中进行了明显的修改。 （ A ）在10ms箱中测量并归一化到对照网络的峰值可靠性对于电极附近的神经元的直接激活（0-20ms）没有变化。因此，控制和训练有素的网络之间没有统计学差异。另一方面，更长的延迟响应（30-50ms）是突触介导的，表明该方法提供了比上述图15更可靠的调查。 （ B ）群体尖峰频率重复可靠性的行为，并且对直接激活（0-20 ms）没有修改，而统计对于长期反应（30-50毫秒），发现有明显的差异。此行为与上图15中的平均结果一致。误差条是对10个控制网络和12个训练网络计算的平均值的标准误差。 （*） p值 <0.05; （**） p值 <0.001。参考文献15修改。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 数量 | 项目 |
| 1 | 高压灭菌玻璃试剂瓶（至少100 mL） |
| 20 | 15 mL无菌离心管 |
| 1 | 10 mL无菌血清移液管 |
| 4 | 25 mL灭菌e血清移液管 |
| 2 | 50mL无菌血清移液管 |
| 1 | 离心管架 |
| 150 mL | 无菌去离子水 |
| 5毫克 | 聚-D-赖氨酸小瓶 |
表1： PDL准备 - 材料和试剂列表。
| 数量 | 项目 |
| 1 | 50mL无菌离心管 |
| 10 | 15 mL无菌离心管 |
| 2 | 1 mL无菌血清移液管 |
| 2 | 50mL无菌血清移液管 |
| 1 | 离心管架 |
| 1 mL | 磷酸盐缓冲盐水（PBS） |
| 1毫克 | 层粘连蛋白 |
表2： 层粘连蛋白制备 - 材料和试剂列表。
| 数量 | 项目 |
| 1 | 高压灭菌玻璃试剂瓶（至少100 mL） |
| 20 | 15 mL无菌离心管 |
| 1 | 10 mL无菌血清移液管 |
| 4 | 25 mL无菌血清移液管 |
| 2 | 50mL无菌血清移液管 |
| 1 | 离心管架 |
| 150 mL | 无菌去离子水 |
| 5毫克 | 聚-D-赖氨酸小瓶 |
表3： 存储介质准备 - 材料和试剂列表。
| 数量 | 项目 |
| 44毫升 | 具有稳定形式的L-谷氨酰胺的DMEM（参见材料表） |
| 1 mL | 无神经细胞培养补充剂（见材料表） |
| 2.5 mL | 马血清 |
| 100μL | 抗坏血酸[4mg / mL] |
| 2.5 mL | 胎牛血清（FBS） |
| 0.5 mL | 笔链（可选） |
| 1 | 50mL无菌离心管 |
| 2 | 25 mL无菌血清移液管 |
| 2 | 10 mL无菌血清移液管/ TD> |
| 2 | 1 mL无菌血清移液管 |
| 1 | 250 mL过滤器 |
表4： DMEM 5/5中等制剂 - 材料和试剂列表。
| 数量 | 项目 |
| 49 mL | 具有稳定形式的L-谷氨酰胺的DMEM（参见材料表） |
| 1 mL | 无神经细胞培养补充剂（见材料表） |
| 100μL | 抗坏血酸[4mg / mL] |
| 0.5 mL | 笔链（可选） |
| 1 | 50mL无菌离心管 |
| 2 | 25 mL无菌血清移液管 |
| 2 | 1 mL无菌血清移液管 |
| 1 | 250 mL过滤器 |
表5： DMEM +培养基制备 - 材料和试剂列表。
| 数量 | 项目 |
| 1 | 木瓜蛋白酶140 U /小瓶 |
| 1 | Dnase 1,260 U /小瓶 |
| 7 mL | DMEM +（冷冻） |
| 5 mL | DMEM 5/5（加温） |
| 10μL | 台盼蓝 |
| 2 | 手术刀片 |
| 1 | 35毫米无菌培养皿 |
| 4 | 15 mL无菌离心管 |
| 2 | 5 mL无菌低温管 |
| 2 | 2 mL无菌低温管 |
| 1 | 50mL无菌离心管 |
| 1 | 微量离心管 |
| 2 | 大口径移液器 |
| 3 | 小口径移液器 |
| 五 | 2 mL无菌血清移液管 |
| 五 | 1 mL无菌血清移液管 |
| 2 | 10μL无菌微量吸头 |
| 1 | 1000μL无菌微量吸头 |
| 1 | 血细胞计数器芯片 |
表6： 细胞分离 - 材料和试剂列表。
Discussion
本协议中概述的步骤提供了足够的细节，让初学者在多边环境协定中打造自己的神经元文化，并记录网络活动。该方案将有助于确保培养物正确粘附，在电极阵列上形成细胞层的地毯层，并保持健康和无污染的数月。
尽管最好遵守协议的所有部分，但整个过程中仍然存在对成功结果至关重要的步骤。在整个过程中使用无菌技术是防止培养物被污染的必要条件。如方案中所述，新的MEA必须是亲水的，否则将导致细胞粘附不良。在分离过程中避免刺激吸气和气泡形成会减少受损细胞的数量，并将导致更高和更健康的产量。第一次从DMEM 5/5切换到DMEM +喂养也很重要。 DMEM 5/5含有马血清，如果连续使用，会导致胶质细胞占主导地位，并导致差的神经元活性，尽管培养物将呈现健康状态。按照计划喂养文化，使其保持在适当的孵化条件下也是至关重要的。
多孔介质上的电镀细胞培养涉及许多可能导致不太理想结果的变量。虽然目标是细胞的完美“地毯”，但是未能解决上述关键步骤将导致细胞成熟或污染不良。细胞粘附不良与细胞成熟不同也是一个问题。这可以由几个因素引起，包括在电镀之前的MEA制备不良或使用旧介质。如果含有稳定形式的L-谷氨酰胺和用于神经细胞培养的无血清补充剂的老培养基（参见材料 表），细胞最初粘附，然后在约两周后漂浮。如果细菌污染是一个持续存在的问题，可以向培养基中加入抗生素，如氨苄青霉素或pen-strep。还有可用于治疗真菌污染的杀真菌剂。这些是可能影响文化结果的一些更常见的变量。还有很多其他的时间和经验才会遇到。
与使用玻璃微电极相比，该技术非常适用于研究网络动力学和药理学反应。它能够使用许多不同的时空刺激模式，并允许立即从多个区域记录神经元反应。以前的团体使用类似于这里描述的协议来证明有趣的结果18 。由于文化持续数周或数月，同样的文化可以重复使用，这种技术也是一样在同一网络上随着时间推移进行多次实验。
然而，这种技术有局限性。多边环境协定是非侵入性的。因此，它们只能记录细胞外活性，而不是用移液管进行贴片钳或细胞内记录。此外，由于阵列中的每个电极被几个细胞覆盖，所以不可能解决单个神经元的活性。相反，因为这些是体外培养，它们不能完全复制大脑网络的结构性质。此外，活性只能一次记录少于30分钟，没有一些机制为细胞提供CO 2气氛以保持其pH平衡。
一旦掌握了这种技术，就可以探索有或没有电刺激的药理学操作。探索神经网络学习和记忆形成的新方案也可以设计和测试，以及p海马或脊髓网络协议。以前已经公布了刺激和训练网络的方案，其中一些进一步发展成体内协议，如Eytan 等人提出的“选择性适应” 。 19 。测试了几种方案。然而，仅在Ruaro 2005年提出的破伤风手术修改的结果在这里提出了14,20。
Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作由国家科学基金会授予的CMMI-1300007资助。我们要感谢以前的实验室成员，他们帮助设计这些协议，并在乔治梅森大学维持文化五年以上：Dr. J. J. Pancrazio，Hamid Charkhkar博士，Gretchen Knaack博士，Franz Hamilton博士，Michael Maquera博士和Robert Graham。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
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