Summary
אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.
Abstract
שרירי השלד בעל יכולת ההתחדשות בשל רקמת תושב, יצירת סיבי שריר (myogenic) תאים הלוויין (SCs), אשר יכול ליצור סיבי שריר חדשים בתנאים הנכונים. למרות SCs ובביצים רקמת השריר ותרבותית במבחנה, התאים myoblast וכתוצאה מכך אינם יעילים מאוד בקידום myogenesis כאשר מושתלים לתוך השריר המארח. בניתוח חשיפת השריר מארח ואת הרכבה מקטעי רקמת השריר תורם או על סיבי השריר מבודד עם SCs שלהם על גבי המחשב המארח שריר, מקדם myogenesis טוב יותר בהשוואה השתלת myoblast. פיתחנו שיטה הרומן הזה שנקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME). MIME כרוך עובר מחט כירורגית דרך השריר המארח, ציור חתיכה של התורם רקמת השריר דרך במסלול מחט, ואז עוזב רקמה מוטבע בתוך השריר מארח כך רשאית לפעול כמקור SCs עבור שריר המארח. כאן נתאר בפירוט השלבים המעורבים בביצוע MIME במודל עכבר immunodeficient המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של כל התאים שלו. כשל חיסוני העכבר מארח מפחיתה את הסיכון של המערכת החיסונית דחיית הרקמה, ומאפשרת ביטוי GFP זיהוי קל של סיבי השריר המארח (GFP +) ותורם-תא-derived סיבי שריר (נולד ב- GFP). הנתונים הטייס שלנו מראים כי MIME יכול לשמש כדי להשתיל השריר של פושט האצבעות הארוך (EDL) מן העכבר התורם לתוך השריר השוקתי הקדמי (TA) של עכבר מחשב מארח. הנתונים שלנו מציע גם כאשר myotoxin (בריום כלוריד, BaCl2) מוזרק לתוך השריר המארח לאחר MIME, שיש הוכחות של תורם-תא-נגזר myogenesis בשריר המארח, עם 5%, 26%, 26% 43% של הסיבים מארח אחד ת א שריר מציג אין מארח את התרומה התרומה מארח מינימלי, התרומה מארח מתון, התרומה מארח מקסימלי, בהתאמה.
Introduction
בריא שרירי השלד, למרות שלאחר mitotic, בעל יכולת ההתחדשות מעולה בשל נוכחותם של תושב רקמת תאים myogenic המכונה תאים הלוויין (SCs)1,2; שנסקרה3,4. עם זאת, בתנאים פתולוגי הנגרם על ידי dystrophies שרירים, טראומה או הזדקנות מואצת, התחדשות השרירים עלול לא לשמור על קשר עם שריר התמוטטות, ומתרחשת לפיכך, סיבי השריר מתקדמת5. למרות שיטות יעילות פותחו כדי לבודד SCs מן השריר ולהרחיב אותם בתרבות כדי לייצר מספר גדול של myoblasts (ובהמשך myotubes), יש ניסיונות לייצר מספרים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של סיבי שריר שריר מארח הניב הצלחה מינימלית רק6. כמו עם סוגי תאים רבים אחרים, כאשר myoblasts מוזרקים לבד לתוך רקמות הפונדקאי, רוב התאים לא engraft7,8. אנחנו הראו כי גירוי עצבי חשמלי (NMES) מקלה על התורם-תא-נגזר myogenesis בשריר העכבר חשוכת-התחדשות מארח זה הוזרק עם האדם myoblasts8. אחרים הראו כי בניתוח הרכבה שריר ביופסיה או סיבי שריר בודד עם SCs המצורפת, להקל myogenesis מתון גם בלי NMES, רומז כי השתלת שכל סיבי השריר עם SCs עשוי להיות יתרון יותר מאשר השתלת תאים myogenic לבד9,10. מאז התורם או רקמת השריר המהונדס הושתל לשריר מארח מפיקה תוצאות טובות יותר מאשר משתילים תאים לבד, זה אפשרי רקמות או מבנים דמויי רקמה עשוי לספק רמזים מכריע עבור התורם-תא engraftment; תפיסה אשר הופך יותר ויותר ניכר טיפול בתאי מחקרים שכללו11,10,סוגי תאים שונים12.
נתונים עדכניים מראים כי SCs המתקבל בני יותר מ 2 שבועות אחרי המוות לייצר myotubes תרבות13. ולכן בכוונתנו להעריך אם ההשתלה של שריר רקמות שנקטפו פוסט-מורטם לתוך גוף חי תהפוך אובדן סיבי השריר. פיתחנו הרומן טכניקה הנקראת MIME כדי להשתיל רקמת השריר התורם לתוך רקמת שריר השלד של גוף חי על מנת לקדם את התורם-תא-נגזר myogenesis. MIME כרוך עובר מחט כירורגית דרך השריר המארח כדי ליצור מסלול המחט; לציור מקטע קטן של התורם רקמת שריר דרך במסלול המחט; עוזב את הרקמות של התורם מוטבע בתוך השריר מארח; לסגור את החורים מחט עם דבק רקמות. לאחר תרגול הטכניקה בעכברים לאללה למד בניסויים אחרים, אנחנו עכשיו ביצעתי MIME בעכברים לחיות כי הם immunodeficient ו ubiquitously express של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), ולאחר מעקב ב- 3 עד 14 ימים שלאחר באמצעות MIME. ב- MIME שלאחר 3 ימים, אנו אשר תורם עכבר (GFP-) EDL שריר מושתל לתוך עכבר המחשב המארח שריר (GFP +) ת א, נשאר בתוך השריר המארח. ב- פוסט-MIME 14 ימים, לאחר BaCl2 myotoxin פציעה כדי לגרום נזק, myogenesis, נאשר כי כ 5%, 26%, 26% ו- 43% של הסיבים מארח אחד TA שריר להראות לא מארח את התרומה, התרומה מארח מינימלי, המארח מתון התרומה ולאחר מקסימלי לארח את התרומה, בהתאמה. התגרענות המרכזית (סמן של בליה והתחדשות עוקבות) נתפסת כ- 95% של סיבי השריר ת א לאחר ההזרקה MIME ו- myotoxin.
נלמד השרירים ת א 14 ימים לאחר MIME + BaCl2 כי נקודת זמן זו לוכדת בשלב ביניים של התחדשות, כאשר רוב הסיבים regenerated נמצאים מרכזי nucleated. אנחנו לומדים GFP + עכברים כפונדקאים עבור MIME, כך כאשר אנו בסופו של דבר השתלת שריר cadaveric אנושי לתוך המארח עכברים, נוכל להבחין בקלות בין סיבי השריר של המארח ומקור התורם. אנחנו להשתמש בעכבר אדי שרירים כמו רקמה ניסיוני, מאז יחיד סיבי השריר הזה הראו פוטנציאל myogenic גדול יותר שרירי ת א9. השריר אדי הוא גם סינרגטי את השריר ת א ובעל הרכב סיבים מסוג דומה. הראשוניים שלנו מראים כי MIME הוא לסייע התורם-תא-נגזר myogenesis בשריר המארח.
Protocol
כל מחקרים שכללו בעלי חיים מאושרים על ידי מוסד חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת וויין, דטרויט, מישיגן, ארה ב, והם על פי המדריך (טיפול, שימוש של חיות מעבדה המהדורה השמינית, 2011, שפורסם על ידי נבחרת באקדמיות העיתונות, 500 החמישי Street NW, הכספת 285, וושינגטון, DC 20055, ארה ב). לפי הפרוטוקולים IACUC שאושרו, נהלים הקשורים כאב ו/או מצוקה בוצעו בהרדמה כללית, אשר המושרה, המתוחזקים על-ידי שאיפה איזופלוריין (1.5-5% אפקט). הרדמה אומתה על ידי חוסר משיכה שאורך צביטה, חוסר palpebral או vibrissae התגובות (האחוז של איזופלוריין היה גדל לפי הצורך כדי לשמור על האפקט). בשל אופיו פולשנית של הפרוטוקולים, " טיפים סטרילי " עקבו אחרי טכניקה. בעוד בעלי החיים היו תחת הרדמה, וזלין הוחל על העיניים למניעת יובש. טיפולים מיוחדים לא נדרשו; עם זאת, הדיאטה ג'ל סופקה החיות עבור 24 שעות בעקבות הליכים מעורבים כללי הרדמה. החוקר אושרה על ידי IACUC לעכב את שיכוך כאבים בעקבות MIME, מאז ההליך אינו כרוך בניתוח שחשף את מארח שריר, כי זה מוגבל hindlimb אחד לא משפיעה על תפקוד תקין, ומכיוון ובתרופה נפוצים רבים ידועים משפיעים על התחדשות שרירים תקין.
1. מודלים בעלי חיים
- עכברים מארח עבור MIME
- שימוש NSG-GFP עכברים (8-10 שבועות, זכר) כפונדקאים עבור השריר שתלי מחקרים.
הערה: אלו עכברים הם מארחים אידיאלי עבור שתלים allogeneic שריר בגלל היעדר לימפוציטים T ו- B בוגרים ותאי הרוצח פונקציונלי הטבעי, והגברים ציטוקין איתות חסרים והם שימשו על-ידי אחרים לתאי השריר ללא allografting או האורתופדיה < מה המצב class = "xref" > 14. בכל מקום ביטוי GFP מאפשר זיהוי קל של המחשב המארח (GFP +) ותורם-תא-derived (GFP-) סיבי השריר.
- שימוש NSG-GFP עכברים (8-10 שבועות, זכר) כפונדקאים עבור השריר שתלי מחקרים.
- התורם עכברים עבור MIME
- לשימוש C57BL/6J עכברים (שבוע 12-16) כמו עכברי התורם.
הערה: אלו עכברים הם עכברים תורם מתאים כי יש גנום ממופה באופן מלא, לא ידועים לי כל פתולוגיה שרירי השלד, הינם זמינים בקלות וחסכוני והם לא מבטא GFP.
- לשימוש C57BL/6J עכברים (שבוע 12-16) כמו עכברי התורם.
2. הכנת רקמת השריר התורם
- קשירת התפרים המנחה והשרירים אדי קצירת התורם
- המתת חסד העכברים התורמים מאת נקע בצוואר הרחם, ניקור חזה מבוצע בהרדמה כללית, מנוהל על ידי פלטת שולחן מאדה איזופלוריין מונע על ידי חמצן רפואי (בשאיפה איזופלוריין; 2-5% לאפקט).
- לגשת השרירים אדי, השתמש זוג מספריים כירורגיים כדי לפתוח את העור על פני השטח הקדמי של הרגל. לאתר את השריר TA ברגל קדמית ולהסיר אותו לדמיין השריר אדי ממוקם מאחורי השריר ת א. להחליק את קצה זוג מלקחיים מאחורי השריר אדי ולהחיל המתיחה בעדינות כדי לראות אם האצבעות להרחיב (זה מאשר כי השריר הוא ה-EDL).
הערה: אזור הרקמה התורם אמור להיות בניתוח, לפני גילוח ורחיצה כירורגית יהיה לקצור. - שימוש ~ מקטעים 10 ס מ של חוט משי 4-0 בתפר קלועה, נספגים, סטרילי, יצירת קשר כפול שני כדי להחיל התפרים המנחה הגידים הפרוקסימלית ו דיסטלי של שריר אדי. ( איור 1 א').
- חתך הגיד אדי הדיסטלי, לשקף את השריר אדי, חתך הגיד הפרוקסימלית.
- המקום התורם אדי השרירים בצלחת פטרי מלא עם העכבר צלצול פתרון.
3. הכנת המחשב המארח עכברים MIME
- הרדמה
- הנח את העכבר המארח תחת הרדמה כללית (בשאיפה איזופלוריין; 1.5-5% לאפקט) מנוהל על ידי מכשיר אידוי שולחן איזופלוריין מונע על ידי חמצן רפואי.
- לגרום הרדמה בחדר אינדוקציה ולאחר מכן להעביר את העכבר על האף-חרוט כדי לשמור על ההרדמה בעת ביצוע הליכים אחרים על החיה. לספק תמיכה תרמי ג'ל איזותרמי חימום משטח בעוד החיה נמצאת תחת הרדמה.
- הכנת העור
- כדי להסיר את החיה ' s פרווה, להחיל קרם depilatory על החלק הקדמי של הרגל השמאלית האחוריות חולית. רגל ימין משמש פקד רגל להליכי עוקבות.
- לעזוב קרם depilatory ב 2 דק נקיים את הקרם depilatory יחד עם תלוש הפרווה עם מגבונים טבולים פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). לאחר הסרת פרווה, לשפשף את העור עם שלושה מתחלפים מגבונים של אתנול פתרון ו- 70% לקירצוף, מקרצפים ממך povidone יוד.
- יצירת מסלול המחט בשריר ת א מארח
- עוברים מחט כירורגית (ארוך בתוך 1) בקוטר 18 דרך המרכז של המחשב המארח TA שרירים לאורך השריר ' s ציר זמן ( איור 1B). להעביר את המחט בכיוון cephalo-סימטרית, לאורכו של שריר ת א, דרך המרכז של שריר הבטן ( איור 1B).
הערה: מטרתו של שלב זה היא ליצור מסלול מחט, שלתוכו ניתן להטביע חתיכה של התורם שריר. הטבעה הרקמה במרכז של שריר ת א העלול לאפשר ה-SCs של הרקמה כדי להעביר וכדי להקל על myogenesis על פני המארח כל שריר ת א.
- עוברים מחט כירורגית (ארוך בתוך 1) בקוטר 18 דרך המרכז של המחשב המארח TA שרירים לאורך השריר ' s ציר זמן ( איור 1B). להעביר את המחט בכיוון cephalo-סימטרית, לאורכו של שריר ת א, דרך המרכז של שריר הבטן ( איור 1B).
- רקמה Embedding במסלול המחט של מארח TA שריר
- ברגע שהמחט כירורגי בתוך המארח TA שריר, לעבור התפרים המנחה בקצה אחד של הרקמה באמצעות לומן של מחט כירורגית כיוון caudo-cephalic ( איור 1C).
- לצייר רקמה דרך במסלול המחט המחט היא מופנמת של השריר מארח ת א לכיוון caudo-cephalic.
- השתמש התפרים המנחה בקצות סימטרית, cephalic הרקמה כדי להתאים את המיקום של הרקמה. להבטיח כי הרקמה היא שהסתתר בתוך המארח TA שריר ( איור 1D).
- פעם מיקום רקמה התורם ממוטבת, לחתוך את התפרים המנחה, לערוך כיוונונים הסופי למיקום רקמות תורם עם מלקחיים שקצהו בסדר.
- חותם עורית מחט פצעים ( איור 1E -F) על-ידי קירוב קצה הפצע עם מלקחיים והחלת רקמות וטרינרי דבק עם קצה מחט כירורגית 27-מד-
4. זריקה תוך שרירית Myotoxin כדי לגרום ניוון שרירים ופעולה מתואמים והתחדשות
- לאחר MIME, להזריק 50-60 µL של 1.2% BaCl 2 (myotoxin) לתוך המארח TA שריר לזירוז סיבי השריר הנרחב נזק לשריר המארח ו הרקמה מוטבע בתוך זה 15.
- BaCl להזריק 2 3 אתרים לאורכו של המארח TA שריר (לקרע, האמצעי, שליש של שריר הבטן).
הערה: הזרקת myotoxins כמו BaCl 2, cardiotoxins, notexin לתוך שרירי השלד גורמת נזק סיבי השריר מתואמת ואחריו התחדשות 16.
- BaCl להזריק 2 3 אתרים לאורכו של המארח TA שריר (לקרע, האמצעי, שליש של שריר הבטן).
5. אכפת לי חיה procedural
- לאחר MIME, הזרקת BaCl 2, נקה את העכבר המארח ' הינד שמאל s רגל עם אתנול, למרוח שכבה דקה של ריבה נפט כדי להגן על העור.
- לאחר טיפוח העור procedural, להסיר את העכבר מארח קונוס האף.
- הנח את העכבר בתוך כלוב ההתאוששות בודד ללא מצעים. לספק תמיכה תרמי לחיה בגמילה באמצעות רכיב pad חימום של gel איזותרמי הניח מתחת חצי בכלובי ההתאוששות.
הערה: אחד חצי אינה מחוממת אז החיה הזו עשויים לנוע הרחק כרית החימום במידת הצורך. - אחרי העכבר מארח התאושש לחלוטין מפני הרדמה, להחזיר את החיה לכלוב המקורי שלה. מקום מאחור בעלי חיים המתקן בעלי חיים עד לביצוע ניסויים להמשך טיפול. לפקח על העכבר מארח מדי יום עד שזה מוכן להמשך – דוגמה: ב- 3 או 14 ימים שלאחר MIME. בעקבות MIME, חיות המפוקחים על-ידי עובדי מעבדה גם על ידי צוות וטרינרי – זה בעיקר כרוך בהערכת אם בעלי החיים בהירים, ולהגיב; והערכה גם אם בעלי חיים מראים סימנים גלויים כאב או בקושי זז, האכלה, שתייה, לטפח.
6. אוסף רקמה
- קציר מארח שריר
- העכברים מארח על-ידי נקע בצוואר הרחם ניקור חזה מבוצע בהרדמה כללית, מנוהל על ידי מכשיר אידוי שולחן איזופלוריין מונע על ידי חמצן רפואי (המתת חסד בשאיפה איזופלוריין; 2-5% לאפקט). החוקר יש גם אישור IACUC לשרירים TA הקציר בהרדמה כללית לפני המתת חסד.
- כדי לגשת השרירים מארח TA, משתמש בזוג מספריים כירורגיים כדי לפתוח את העור על פני השטח הקדמי של הרגל. לאתר את השריר TA ברגל קדמית הגיד הדיסטלי, לשקף את השריר אך הוא עגול הקבצים המצורפים proximal שריר (ראו סעיף 2.1).
- לאסוף שמאלה (ניסיוני) והן ת א נכון (בקרה) השרירים.
- הצמד השרירים שנקטפו מקפיא
- שוקל את השרירים שנקטפו על-ידי הצבת שוקל נייר, מאזניים.
- לטבול בקצרה את שרירי שמן מינרלי עבור cryoprotection. למחוק את עודף השמן. השרירים
- מקום על רדיד אלומיניום והצמדה להקפיא את השרירים על ידי במהירות אנו ממליצים להם חנקן נוזלי מולאו דיואר. להעביר את הדגימות cryovials שכותרתו ולאחסן את הדגימות במקפיא-80 ° C ללימודים מאוחר יותר.
7. מחקרים היסטולוגית
- Cryosectioning רקמת השריר כדי לאסוף את חתכי רוחב טורי
- להעביר את הדגימות מהמקפיא-80 ° C cryostat על-ידי הצבתם דיואר המכילה חנקן נוזלי.
- Cryostat, להתמודד עם דוגמא אחת בכל פעם. עם קר תער (להב המאוחסן ב- cryostat), לחתוך את הדגימה פעמיים על אמצע הבטן של שריר ת א כדי לייצר מקטע של שריר זה בערך 1-2 מ"מ עובי. לשמור את קטע זה לביצוע הסעיפים cryostat ולחזור על החלקים הנותרים של שריר שלו cryovial.
- עם חיתוך אופטימום הטמפרטורה (אוקטובר) קפוא מורכבים, לאבטח את המקטע עבה של רקמות לדיסק הדגימה cryostat. מניחים את הדיסק הדגימה על המחזיק הדגימה.
- מחוספס-פרצוף המדגם על ידי חיתוך סעיפים 20 מיקרומטר. לאסוף כמה חלקים מיקרומטר 20 בשקופיות זכוכית עבור הסעיפים cryostat.
- אם האיכות של 20 מהמקטעים מיקרומטר משביעת רצון, שינוי העובי חיתוך 5 מיקרומטר ולאסוף כמה חלקים כדי להעריך את האיכות. אם הסעיפים 5 מיקרומטר משביעות באיכות, איסוף מקטעים טורי. לאסוף את סעיפים 2-3 לכל שקופית ולאסוף מספיק מקטעים עבור 3 מגלשות.
- לאסוף במקטעים ניסיוני (משמאל) והן שליטה (מימין) השרירים TA של כל חיה.
- לומד GFP ביטוי
הערה: לייעד סט אחד של שקופיות שהוכנו מראש (סעיף 7.1) ללמוד GFP ביטוי סיבי השריר.- µL ~ 50 אנטי לדעוך בינוני למרוח את הסעיפים ולהחיל coverslip של זכוכית. לאטום את הקצוות coverslip עם לק ברור.
- באמצעות מיקרוסקופ אור, פלורסנט (ראה טבלה של חומרים), ללמוד את הסעיפים עם 10 X אובייקטיבית, במסנן המתאים להמחשת GFP.
- לאסוף תמונות דיגיטליות (~ 15) של צולבת חזותי כדי לכסות את כל חתך של השריר ת א. לאסוף את התמונות חדות שלב עבור כל אחד מהשדות חזותי על ידי מעבר של קרינה פלואורסצנטית למצב הניגודיות שלב על המיקרוסקופ.
- לפתוח תמונות עם תוכנת הדמיה מתאימים ניתן לפרוש תמונות בודדות כדי להפיק תמונה מורכבת יחיד; למשל, שימוש " ' מיזוג תמונות ' " אפשרות תחת תפריט קובץ בתוכנת הדמיה המופיעים בטבלה של חומרים.
- פתח את התמונות פלורסצנטיות GFP עם תוכנת ניתוח תמונה מתאימה (למשל, ImageJ). מעגל סיבי שריר בודדים באמצעות " רועי כלי " ולהקליט את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כלומר עבור כל סיב.
- חישוב עוצמת GFP המרבי (זריחה) על ידי לקיחת הממוצע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית מתכוון הסיבים 10 הצג ביטוי GFP גבוהה ויש מורפולוגיה תקינה. לחשב את העוצמה המקסימלית GFP % עבור כל סיב על-ידי חלוקת העוצמה Florescence כלומר עבור כל סיב מאת העוצמה המקסימלית GFP והכפלתם במאה. משיבים את התוצאות של הניתוח GFP עבור כל שריר ת א, כפי שמוצג באיור 3E.
- לומד שלמות סיבי השריר ומיקום myonuclear על-ידי תיוג Immunofluorescent של desmin ו- 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), בהתאמה.
הערה: לייעד סט אחד של שקופיות שהוכנו, לעיל, כדי ללמוד desmin תיוג של סיבי השריר.- התיקון סעיפים עם paraformaldehyde 2% ב- PBS במשך 10 דקות לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS.
התראה: ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) בעת טיפול בעת טיפול paraformaldehyde. - בלוק מקטעים עם 3% שור אלבומין מדולל ב- PBS המכיל 0.01% טריטון X100 למשך 30 דקות. פתרון חסימה זה נקרא הבא בתור diluent הראשית.
- לדלל נוגדן anti-desmin הארנב G (IgG) ב- diluent ראשי (1:200).
- לאחר חסימת השלמת, להחיל הנוגדנים העיקרי מדולל על חלקים, דגירה למשך הלילה במקרר בשטיפת ~ 4 מעלות צלזיוס הסעיפים פעם אחת (5 דקות) עם PBS המכיל 0.1% טריטון X-100. פתרון זה נקרא מכאן והלאה כמו המאגר השטיפה הראשונה.
- לרחוץ את הסעיפים 3 פעמים (5 דקות לכל לשטוף) עם PBS.
- להכין נוגדן משני על ידי דילול עז אנטי ארנב IgG (מצומדת כדי הפלורסנט אדום) ב- PBS המכיל 0.01% טריטון X-100.
- החל הנוגדן משני מדולל על הסעיפים, דגירה בטמפרטורת החדר (~ 23 ° C) במשך 60 דק.
- לשטוף את המקטעים פעם אחת (5 דקות) עם המאגר השטיפה הראשונה. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים (5 דקות לכל לשטוף) עם PBS.
- החל דאפי במשך 3 דקות יש לשטוף הסעיפים 3 פעמים (1 דקות לכל לשטוף) עם PBS. החלת ~ 50 µL של המדיום לדעוך אנטי במקטעי ולהחיל coverslip זכוכית. לאטום את הקצוות coverslip עם לק ברור.
- באמצעות מיקרוסקופ אור, פלורסנט (ראה טבלה של חומרים), המחקר טורי מקטעים עם 10 X אובייקטיבית, במסנן המתאים להמחשת אדום הפלורסנט.
- לאסוף את התמונות הדיגיטלית (~ 15) של השדות חופפים חזותי כדי לכסות את כל חתך של השריר ת א. לאסוף את התמונות זריחה של דאפי תיוג עבור כל אחד מהשדות חזותי על ידי מיתוג הגדרת הסינון המתאימה.
- פתח ולנתח את התמונות באמצעות תוכנת הדמיה מתאימים כמתואר בצעדים 7.2.3 - 7.2.4.
הערה: לימוד תמונות כדי לזהות, אילו סיבי השריר הם פגומים (desmin שלילי), אילו סיבי השריר התגרענות המרכזית (desmin חיובי סיבי בעלי גרעינים התווית על-ידי דאפי ממוקם מבפנים ולא באופן עקיף), ואתה, אילו אזורים של המקטע יש לי דלקת ו/או פיברוזיס (אזורים גרעינים רבים התווית על-ידי דאפי, מקובצים יחד, אך הם חסרי סיבי השריר).
- התיקון סעיפים עם paraformaldehyde 2% ב- PBS במשך 10 דקות לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS.
Representative Results
ב- MIME שלאחר 3 ימים, התורם אדי זה הוא מושתל מאת MIME נכלל בתוך תא השריר ת א מארח (איור 2A–C). כצפוי, חתכי רוחב של שריר TA של התורם עכברים, למד תחת קרינה פלואורסצנטית אופטיקה, אינם מראים פלורסצנטיות ירוק כי הם לא מבטא GFP (איור דו-ממדי). לעומת זאת, חתכי רוחב של שריר TA של עכברים המארח לא מושתלים עם רקמה, הצג פלורסצנטיות ירוק אחיד סיבי השריר של ת א, כפי הסיבים אקספרס GFP (2E איור). חתכי רוחב של השרירים באמצעות MIME. מושתל רקמת השריר תורם, יש קו התיחום בין סיבי השריר המארח (GFP +) לבין התורם סיבי שריר (נולד ב- GFP). התמונות חדות שלב של השדות חזותי באיור איור דו-ממדי–F מוצגים באיור 2E'–נ' מציע כי אכן ישנם סיבי השריר נוכח באזורים איפה שיש אין GFP האות.
פוסט-MIME 14 ימים, הזרקת2 BaCl, על ידי לימוד טורי בין המקטעים של שריר TA שנותרו ללא תווית או מסומנות עם נוגדנים desmin (איור 3), אנו לומדים כי האות GFP מתבטא בכך כל סיבי השריר ב שריר שאינו מטופל של עכברים המארח, אך לא את השריר שטופלו MIME (desmin אדום תיוג מגלה קיימא סיבי שריר). בשריר מארח TA מטופלים עם הזרקת2 MIME, BaCl, myogenesis התורם-תא-derived ניכרת מן הנוכחות של סיבי שריר desmin(+) רבים המציגים אין אות GFP לזיהוי (איור 3C–D, 3 C' –D'). סיבי השריר chimeric הנובעות הפיוז'ן סביר של התאים myogenic המארח ו התורם ניתן להבחין נמוכה רמות מתונות של זריחה GFP הוצגו על ידי סיבים אלו. סיבי chimeric רבים מופיעים על פני קוטר כל שריר ת א רומז כי התורם SCs מסוגלים מעביר כמה מאות מיקרונים בתוך epimysium של השריר המארח. כימות של GFP + סיבים מוצג באיור 3E. איור 4 מציג בהגדלה תמונות של טורי חתכי רוחב כל שריר ת א2 מטופלים MIME + BaCl.
איור 1 . השלבים הכרוכים מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME).
MIME מתבצע בהרדמה כללית. זה כרוך הצבת ~ 10 מ"ג של התורם שריר (התורם עכבר EDL) בתמיסה צלצול קשירת התפרים המנחה לקצוות שלה (א). מחט בקוטר 18 עבר דרך לציר הארוך של שריר המארח (B) , הרקמה נשאבים דרך במסלול המחט (C). הרקמה שמאל שמוטבע לשריר המארח (D), התפרים המנחה נחתכים, החורים המחט חתומות עם דבק רקמות (E). הפצעים המחט אטום מצוינים עם החצים (נ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . מחקרים של שריר ת א 3 ימים לאחר MIME.
שריר מארח שנאספו 3 ימים לאחר MIME; סימנים של מזרקים הערה במחשב מארח TA (חיצים; A-B). נתונים נוספים מאשרים כי העכבר התורם מוטבע אדי היא שהסתתר בתוך תא השריר TA (בג). קרינה פלואורסצנטית תמונות של שריר TA חתכי רוחב הצג אין קרינה פלואורסצנטית ירוק בשריר ת א (ד)של פראי-סוג קרינה פלואורסצנטית ירוק בהיר בשריר NSG-GFP TA (E), הפרדה בין המארח לבין התורם שריר בשריר TA NSG-GFP ב 3 ימים פוסט-באמצעות MIME (נ). התמונות חדות שלב של השדות visual D-F מוצגות באיור D'-F', בהתאמה. הקו האדום פאנלים F ו- F' מציגה את קו התיחום בין הרקמה מארח ושל התורמים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . מחקרים של שריר ת א 14 ימים לאחר MIME.
הנתונים שנאספו 14 ימים שלאחר MIME מוצגים. האות האדום הוא מ תיוג immunofluorescent של desmin (סיגנל חיובי desmin מציין כי myofibers הם קיימא), האות כחול הוא מדאפי (כתמי גרעינים), האות ירוק הוא מ- GFP. שליטה TA שריר (נכון hindlimb) שנקטפו העכבר המארח, כצפוי, myofibers כמעט כל הם חיוביים עבור desmin, רומז כי myofibers אלה הם קיימא (A; אדום). בנוסף, בהתבסס על דאפי מכתים, זה ברור זה myonuclei של כמעט כל myofibers ממוקמים באופן עקיף, כצפוי בשריר בריא (A; סימן כחול). טורי מקטעים של שריר שליטה TA מראים כי כמעט כל סיבי השריר בצבע ירוק בהיר, רומז כי הם חיוביים עבור ה-GFP. MIME + BaCl2 -מטופלים TA שרירים (hindlimb השמאלי), תורם-תאית myogenesis ניכרת מן הנוכחות של סיבי שריר desmin(+) רבים המציגים אין קרינה פלואורסצנטית GFP לזיהוי (C-D, C'-D'). Desmin(+) סיבי שריר נמוך בינוני GFP קרינה פלואורסצנטית (סיבי שריר chimeric) נמצאים לאורך הקוטר של השריר TA כולו, רומז כי MIME מספק התורם SCs יכול להעביר בתוך epimysium של השריר TA, לקדם התורם-תא-נגזר myogenesis. א '-D' ההגדלה גבוהה תמונות של האזורים בתוך הקופסאות הכחולות A - ממד. כימות של סיבי GFP(+) וסיבים מרכזי nucleated מוצגים ב- E. גודל ברים = 100 מיקרומטר (A-D) ו- 50 מיקרומטר (א '-יח '). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
rc="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / >
איור 4 . עדות לנזק נרחב והתחדשות 14 ימים לאחר ההזרקה2 MIME ו- BaCl.
בהגדלה, טורי חתכי רוחב כל שריר ת א2 מטופלים MIME + BaCl מוצגים. הנתונים מראים כי רבים סיבי השריר, אשר הם בינוני או חזק GFP + יש במיקום מרכזי גרעינים (א-ב; אדום האות א' הוא מ- desmin, כחול אות א' של דאפי, אות ירוק ב' מ- GFP). נתונים אלו מראים כי ניוון והתחדשות לאחר הזרקת2 BaCl אינו משפיע על הביטוי GFP. בהקשר זה, הנוכחות של סיבי השריר מרכזי nucleated בשריר ת א2 מטופלים MIME + BaCl, עם ביטוי GFP-קטן-לא, מרמז כי סיבים אלו הם כנראה תוצאה של myogenesis (או התחדשות) עם תרומה משמעותית מ GFP - תאים myogenic. תצפיות אלה יכולים לאמת יותר בתמונות בהגדלה של שדות נבחרים (C-F; C, D, ו- E ו- F, בהתאמה, חופפות אזורים של חתכי רוחב טורי; קודי הצבע של התמונה גבולות מציינות המיקום של אזורים אלה ב- A ו- B). גודל ברים = 100 מיקרומטר (A-B) ו- 50 מיקרומטר (C-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט הטכניקה ניסיוני הרומן המכונה MIME, שפותחו במעבדה שלנו, כדי השתל רקמת השריר התורם לתוך רקמת השריר המארח. זהו עיבוד של שריר פתוח הרכבה טכניקה כבר הוכיח כיעיל בקידום התורם-תאית myogenesis ב-10,179,שרירים המארח.
המטרה של MIME היא לא לאפשר engraftment של רקמת שריר התורם עצמו לתוך השריר המארח (כיום אין אנו יודעים אם מצב זה מתרחש), אלא לספק מקור של התורם SCs יכול לתרום myogenesis בשריר המארח תחת תנאים המעודדים m uscle התחדשות. תקוותנו היא כי לאחר MIME אופטימיזציה של נבדק במחקרים בסיסיים, פרה, זה יכולה לספק תובנות מדריך קליני טיפולים שמטרתם הגדלת שריר התחדשות בשרירי השלד שעברו אובדן שרירים myogenic.
ישנן שאלות רבות אשר טרם ענה לגבי איך MIME יכול להיות מתורגם טיפול קליני, לדוגמה: כיצד נוכל לשלוט האיכות של רקמה? איך נוכל לשלוט הדחייה החיסונית של התורם רקמות ותאים? הרקמה מנוקה לאחר מתן תאים myogenesis או מותיר מאחור שהותירה צלקת? משפיע סוג סיבי השריר התורם ו/או מארח את התורם-תאית myogenesis? אילו שרירים כמעט יכולים להפיק תועלת MIME? אנחנו כעת מתרחבים המחקרים שלנו כדי להעריך אם MIME הוא בטוח ויעיל, לזהות טיפולי משלים זה יכול להגדיל את התורם, נגזר myogenesis, וענה רבות מהשאלות, המפורטים לעיל.
לאחר השלמת הבדיקות שלנו של עכבר השתלת allogeneic עם פנטומימה, הצעד הבא הוא לבצע MIME האדם-כדי-עכבר עם רקמה אנושית cadaveric כדי להעריך את הפוטנציאל myogenic של רקמת השריר cadaveric. אנו צופים כי ניסויים אלה תוביל קו חדש של מחקר בסיסי והתרגום, שכרוך רקמת השריר מתורמים, הרשומים ביוזמות כגון התוכנית מעזבונו הגוף לחינוך, התוכנית מתנת החיים עבור תרומת איברים .
נציג הנתונים שהוצגו בכתב יד זה מציע כי ב 14 ימים לאחר MIME, ישנם מספר myofibers קיימא או חוסר GFP יש רמות נמוכות של GFP. הפרשנות שלנו של נתונים אלה היא כי תאים הלוויין GFP-תורם תרמו myogenesis בשריר המארח. ביצענו ניסוי זה לקראת ההשתלה של רקמה אנושית cadaveric לתוך שריר בעכבר המחשב המארח. כדי להדגים באופן חד משמעי כי התאים בלוויין התורם לתרום myogenesis בשריר מארח בעקבות MIME, זה יהיה שימושי כדי להשתיל רקמה שמבטא כתב פלורסנט, אשר ניתן בקלות להבדיל בין GFP (למשל, אדום חלבון פלואורסצנטי לבטא רקמה מושתל לתוך GFP + מארח שריר).
טכניקה זו מוגבל בעיקר עקב אופיה של ה-SCs נוכח הרקמה. אם ה-SCs ברקמה התורם קיימא, שהטכניקה סביר להקל על myogenesis התורם-תאית, בעוד אם הם לא להתקיים, myogenesis לא יכול להתרחש. עם זאת, היות SCs גמישים מאוד קיימא עבור בערך שבועיים פוסט-מורטם, סביר מאוד כי למטרות ניסוי, רקמה זה הוא מושתל בתוך דקות ספורות לאחר הקציר יקל על התורם-תאית myogenesis13 . בנוסף, כפי הנאמר לעיל, זה אפשרי כי מאז לרקמת שריר שלם (המכיל SCs, בוגרת סיבי השריר, כמו גם שרירים תושב fibroblasts) מוטבע לתוך השריר המארח, פיברוזיס יכול להתרחש. אולם, הנחה זו צריך להיבדק מדעית. הספרות על נזק שרירים הנובעים התכווצויות השתחררות, cryoinjury ו- myotoxins ניסיוני, מרמז כי תאים חיסוניים (בעיקר macrophages) מסוגלים ביעילות ניקוי פסולת הסלולר מסיבי פגום, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית18. לכן, זה אפשרי כי לאחר ההזרקה2 MIME ו- BaCl, כל עוד התאים החיסוניים של המארח יש גישה התורם המתנוונת סיבי השריר, הם יוכלו לנקות פסולת, משאיר מאחור רק התורם SCs. לבסוף, מידת myogenesis התורם, נגזר היא תלויה כמות רקמת השריר התורם שמוטבעת בתוך השריר המארח. על מנת תא שריר המארח יש לאכלס מחדש לחלוטין על ידי התורם-תא-derived myofibers, זה ידרוש שיטה כמו X - או גאמא-הקרנה ablate מארח שריר SCs, מחייבים הליכים MIME חוזרות ונשנות.
זה הוכח, כי בניתוח חשיפת שריר המארח, תפירת פיסת רקמה לתוך השריר המארח יכול להקל התורם-תאית myogenesis9,10,17. גישה כירורגית פתוחה זו שימש בעבר כדי לעקוב אחר ההתקדמות של myogenesis וכדי ליצור עכבר מודלים של מחלות שריר אנושי. ההיבט החדשני של הטכניקה MIME הוא זה היא פולשנית, אינה כרוכה בניתוח חשיפת השריר המארח. זה מפחית את הסיכון של זיהום iatrogenic את מידת אי הנוחות של הפונדקאי, לכן הפיכתה יותר ריאלי לביצוע MIME שוב ושוב על השריר המארח אותו במידת הצורך.
אנו צופים כי הטכניקה MIME עשוי להיות עידון מתאימים את הגישה כירורגי פתוח נוהגים כיום להשתיל רקמת השריר התורם לתוך עכבר המחשב המארח. זה יכול לזרז את הדור של העכבר humanized דגמים, על ידי שתילת הכוח האנושי ביופסיה בשריר בעכבר המחשב המארח. בנוסף, על סמך הראשוניים שלנו של עכבר הרכבה, אנו צופים כי MIME יהיה אפקטיבי להשגת התורם-תאית myogenesis מרקמה אנושית cadaveric כל עוד תורם SCs הם קיימא. לבסוף, עם בדיקות נוספות, אימות, אנו מקווים כי הטכניקה MIME יעזור לפתח טיפולים חדשים כדי להקל על התורם-תאית myogenesis אצל בני אדם במחלות שריר.
ההצלחה של טכניקת MIME הוא ביקורתי תלויים בדיוק הטבעה הרקמה בתוך תא fascial (epimysium) של השריר מארח. רק אם הרקמה ממוקם בתוך תא השריר מארח, הוא לא מסוגל לספק SCs לשריר המארח באופן מדויק. אם הרקמה התורם ממוקם מחוץ לשריר המארח, לא ברור מה יהיה גורלה. במודל ניסיוני שלנו עבור MIME, אנו משתמשים לשריר TA בתור השריר המארח, שכן הוא בולט ומוקם באופן שטחי בהיבט anterolateral של הרגל. הגודל, הכיוון והמיקום האנטומי של שריר TA, מקל לאשר כי הרקמה הוכנסה כהלכה בתוך השריר מארח ת א לאחר MIME. בנייר זה, שאנו מספקים ראיות זה הרקמה מחדשעיקריות מוטבע בתוך המארח שריר ת א ב- MIME שלאחר 3 ימים, וזה שם הוא תורם-תאית myogenesis בשריר מארח ב- פוסט-MIME 14 ימים.
Disclosures
המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו התאפשרה על ידי מענק טייס מהברית המחקר שיקום רגנרטיבית ו להכשרת (AR3T) ואת חבילת ההפעלה סגל מן ויין סטייט לכד. AR3T נתמך על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות, והתפתחות האדם (NICHD), המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, שבץ מוחי (NINDS), ואת הלאומית המכון של ביו הדמיה בביו-הנדסה (NIBIB ) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת P2CHD086843 מספר פרס. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
| Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| 4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
| VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
| Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
| Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
| Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
- Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
- Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
- Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
- Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
- Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
- Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).
