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Medicine

न्यूनतम इनवेसिव मांसपेशी embedding (MIME)-दाता सेल की मध्यस्थता Myogenesis की सुविधा के लिए एक उपंयास प्रयोगात्मक तकनीक

Published: August 24, 2017 doi: 10.3791/55731
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Health Care Sciences, Physical Therapy Program, College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University

Summary

हम एक उपंयास प्रयोगात्मक तकनीक का वर्णन है कि हम ंयूनतम इनवेसिव मांसपेशी embedding (MIME), जो सबूत है कि कंकाल की मांसपेशी ऊतक व्यवहार्य myogenic कोशिकाओं है कि दाता-सेल मध्यस्थता myogenesis की सुविधा जब में प्रत्यारोपित कर सकते है पर आधारित है कहते है एक मेजबान मांसपेशी ।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी ऊतक निवासी, मांसपेशी फाइबर पैदा (myogenic) उपग्रह कोशिकाओं (SCs) है, जो सही परिस्थितियों में नई मांसपेशी फाइबर फार्म कर सकते हैं के कारण अपक्षयी क्षमता के पास । हालांकि SCs मांसपेशी ऊतक और इन विट्रो मेंसंस्कृति से काटा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप myoblast कोशिकाओं जब मेजबान मांसपेशियों में प्रत्यारोपित myogenesis को बढ़ावा देने में बहुत प्रभावी नहीं हैं । शल्य चिकित्सा मेजबान मांसपेशी और दाता मांसपेशियों के ऊतकों, या मेजबान मांसपेशी पर उनके SCs के साथ अलग मांसपेशी फाइबर के भ्रष्टाचार क्षेत्रों को उजागर, myoblast ट्रांसप्लांटेशन की तुलना में बेहतर myogenesis को बढ़ावा देता है । हम एक उपंयास तकनीक है कि हम ंयूनतम इनवेसिव मांसपेशी embedding (MIME) फोन विकसित किया है । MIME मेजबान मांसपेशी के माध्यम से एक शल्य सुई गुजर शामिल है, सुई ट्रैक के माध्यम से दाता मांसपेशी ऊतक का एक टुकड़ा ड्राइंग, और फिर दाता मेजबान मांसपेशी में एंबेडेड ऊतक तो जा रहा है कि यह मेजबान मांसपेशी के लिए SCs के एक स्रोत के रूप में कार्य कर सकते हैं । यहां हम विस्तार से एक immunodeficient माउस मॉडल है कि अपनी कोशिकाओं के सभी में एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त में MIME प्रदर्शन में शामिल कदम का वर्णन । मेजबान माउस में इम्यूनो दाता ऊतक की प्रतिरक्षा अस्वीकृति के जोखिम को कम कर देता है, और GFP अभिव्यक्ति मेजबान मांसपेशी फाइबर (GFP +) और दाता कोशिका-प्राप्त मांसपेशी फाइबर (GFP-) की आसान पहचान सक्षम बनाता है । हमारे पायलट डेटा का सुझाव है कि MIME एक दाता माउस से tibialis पूर्वकाल (टा) एक मेजबान माउस की मांसपेशी में एक प्रसारक digitorum लंग्स (EDL) मांसपेशी प्रत्यारोपण किया जा सकता है । हमारे डेटा भी सुझाव है कि जब एक myotoxin (रयम क्लोराइड, BaCl2) MIME के बाद मेजबान मांसपेशी में इंजेक्शन है, वहां दाता का सबूत है सेल-मेजबान मांसपेशी में myogenesis व्युत्पंन, लगभग 5%, 26%, 26% और एक एकल मेजबान टा में तंतुओं का ४३% के साथ कोई मेजबान योगदान दिखा मांसपेशी, ंयूनतम मेजबान योगदान, मध्यम मेजबान योगदान, और अधिक से अधिक मेजबान योगदान, क्रमशः ।

Introduction

स्वस्थ कंकाल की मांसपेशी, भले ही पोस्ट-mitotic, उत्कृष्ट अपक्षयी ऊतक-निवासी myogenic कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है की उपस्थिति के कारण क्षमता के पास उपग्रह कोशिकाओं (SCs)1,2; और3,4में समीक्षा की । हालांकि, पेशी dystrophies, आघात या त्वरित उंर बढ़ने की वजह से रोग की स्थिति के तहत, मांसपेशी पुनर्जनन मांसपेशी टूटने के साथ नहीं रख सकते हैं, और इस प्रकार, प्रगतिशील मांसपेशी फाइबर नुकसान होता है5। हालांकि प्रभावी तरीकों को मांसपेशियों से SCs अलग विकसित किया गया है और उंहें संस्कृति में विस्तार के लिए myoblasts की बड़ी संख्या में उत्पंन (और बाद में myotubes), मेजबान मांसपेशी में मांसपेशी फाइबर के शारीरिक रूप से प्रासंगिक संख्या उत्पंन करने का प्रयास केवल ंयूनतम सफलता6झुकेंगे । कई अंय प्रकार के सेल के साथ के रूप में, जब myoblasts अकेले मेजबान ऊतक में इंजेक्ट कर रहे हैं, कोशिकाओं के अधिकांश नहीं engraft7,8। हमें पता चला है कि neuromuscular विद्युत उत्तेजना (NMES) दाता की सुविधा कोशिका-उत्थान में myogenesis व्युत्पंन-कमी मेजबान माउस मांसपेशी कि मानव myoblasts8के साथ इंजेक्शन था । दूसरों का प्रदर्शन किया है कि शल्य चिकित्सा biopsied मांसपेशी या संलग्न SCs के साथ एकल मांसपेशी फाइबर, NMES के बिना भी उदारवादी myogenesis की सुविधा, कि प्रत्यारोपन SCs के साथ पूरी मांसपेशी फाइबर आरोपण से अधिक लाभप्रद हो सकता है सुझाव myogenic कक्ष अकेले9,10। दाता या इंजीनियर मांसपेशी ऊतक मेजबान मांसपेशी में भ्रष्टाचारी के बाद से अकेले कोशिकाओं प्रत्यारोपण से बेहतर परिणाम का उत्पादन, यह संभव है कि ऊतक या ऊतक की तरह संरचनाओं दाता के लिए महत्वपूर्ण cues-सेल engraftment प्रदान कर सकता है; एक अवधारणा है जो सेल में तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है चिकित्सा विभिंन प्रकार के सेल10,11,12शामिल अध्ययन ।

हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि SCs मनुष्यों से अधिक से प्राप्त 2 सप्ताह पोस्ट मार्टम संस्कृति13में myotubes उत्पंन करते हैं । इसलिए हम अगर मांसपेशियों के ऊतकों के आरोपण के बाद एक जीवित मेजबान में काटा पोस्टमार्टम मांसपेशी फाइबर नुकसान रिवर्स जाएगा का आकलन करने के लिए इरादा है । हम एक उपंयास तकनीक का विकास किया है एक जीवित मेजबान के कंकाल की मांसपेशी ऊतक में दाता मांसपेशी ऊतक प्रत्यारोपण के लिए दाता को बढ़ावा देने के लिए-सेल-myogenesis व्युत्पंन बुलाया । MIME एक सुई ट्रैक बनाने के लिए मेजबान मांसपेशी के माध्यम से एक शल्य सुई गुजर शामिल है; सुई ट्रैक के माध्यम से दाता मांसपेशी ऊतक के एक छोटे से खंड ड्राइंग; दाता ऊतक छोड़ मेजबान मांसपेशी में एंबेडेड; और ऊतक चिपकने के साथ सुई छेद बंद । euthanized चूहों अंय प्रयोगों में अध्ययन में तकनीक का अभ्यास करने के बाद, हम अब जीना चूहों में mime प्रदर्शन किया है कि immunodeficient और बैरे एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त कर रहे हैं, और अनुवर्ती 3 और 14 दिनों के बाद-MIME । 3 दिन के बाद MIME, हम पुष्टि करते है कि दाता माउस (GFP-) EDL मांसपेशी मेजबान माउस (GFP +) टा मांसपेशी में प्रत्यारोपित, मेजबान मांसपेशी में एंबेडेड रहता है । 14 दिनों के बाद MIME, BaCl के बाद2 क्षति और myogenesis प्रेरित करने के लिए myotoxin चोट, हम पुष्टि करते है कि लगभग 5%, 26%, 26% और एक एकल मेजबान टा मांसपेशी में तंतुओं का ४३% कोई मेजबान योगदान दिखाने के लिए, ंयूनतम मेजबान योगदान, उदारवादी मेजबान योगदान, और अधिकतम मेजबान योगदान, क्रमशः । सेंट्रल nucleation (अध... और बाद के उत्थान के एक मार्कर) माइम और myotoxin इंजेक्शन के बाद टा मांसपेशी फाइबर के लगभग ९५% में देखा जाता है ।

हम टीए मांसपेशियों का अध्ययन 14 दिनों के बाद MIME + BaCl2 क्योंकि इस समय बिंदु के उत्थान के मध्यवर्ती चरण को दर्शाता है, जब पुनर्जीवित फाइबर के बहुमत केंद्रीय nucleated हैं । हम GFP + चूहों के रूप में MIME के लिए मेजबान के रूप में अध्ययन, ताकि जब हम अंततः मेजबान चूहों में मानव cadaveric मांसपेशी प्रत्यारोपण, हम आसानी से मेजबान और दाता मूल के मांसपेशी फाइबर भेद करने में सक्षम हो जाएगा. हम प्रयोगात्मक दाता ऊतक के रूप में माउस EDL मांसपेशी का उपयोग करें, इस मांसपेशी से एक फाइबर के बाद से अधिक से अधिक myogenic क्षमता टा मांसपेशियों9दिखाया गया है । EDL मांसपेशी भी टा मांसपेशी को synergistic है और इसी तरह फाइबर प्रकार की संरचना है । हमारे प्रारंभिक आंकड़ों का सुझाव है कि MIME दाता की सुविधा-सेल-मेजबान मांसपेशी में myogenesis प्राप्त करने में सक्षम है ।

Protocol

< p class = "jove_content" > सभी जीवित जानवरों को शामिल अध्ययन संस्था पशु देखभाल और उपयोग समिति (वेन राज्य विश्वविद्यालय, डेट्रायट, मिशिगन, संयुक्त राज्य अमेरिका में IACUC) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं, और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार कर रहे हैं ( 8 वीं संस्करण, २०११, राष्ट्रीय अकादमियों प्रेस, ५०० पांचवीं स्ट्रीट, Lockbox, २८५, वाशिंगटन, डीसी २००५५, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा प्रकाशित । अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार, दर्द और/या संकट शामिल प्रक्रियाओं सामांय संज्ञाहरण, जो प्रेरित और isoflurane सांस लेना (१.५-5% के प्रभाव को बनाए रखा है) के तहत प्रदर्शन किया गया । संज्ञाहरण पैर की अंगुली चुटकी के लिए वापसी की कमी से सत्यापित किया गया था, और palpebral या vibrissae प्रतिक्रियाओं की कमी (isoflurane का प्रतिशत के रूप में प्रभाव बनाए रखने की जरूरत बढ़ गया था) । प्रोटोकॉल की मिनिमली इनवेसिव प्रकृति के कारण, एक & #34; बाँझ नुस्खे & #34; तकनीक का पालन किया गया । जबकि जानवरों संज्ञाहरण के तहत किया गया था, पेट्रोलियम जेली सूखापन को रोकने के लिए आंखों के लिए लागू किया गया था । कोई विशेष उपचार की आवश्यकता थी; हालांकि, आहार जेल 24 एच निम्नलिखित प्रक्रियाओं है कि सामान्य संज्ञाहरण शामिल के लिए जानवरों के लिए प्रदान किया गया था । & #160; जांचकर्ता IACUC द्वारा अनुमोदित है MIME निंनलिखित analgesia रोक, के बाद से प्रक्रिया शल्य चिकित्सा मेजबान को उजागर शामिल नहीं करता है मांसपेशी, क्योंकि यह एक hindlimb तक ही सीमित है और सामांय समारोह को प्रभावित नहीं करता है, और क्योंकि कई आम एनाल्जेसिक दवाओं के लिए सामांय मांसपेशी पुनर्जनन प्रभावित जाना जाता है । & #160;

< p class = "jove_title" > 1. पशु मॉडल

  1. मेजबान चूहों के लिए MIME
    1. उपयोग एनएसजी-GFP चूहों (8-10 सप्ताह, पुरुष) के रूप में मांसपेशियों भ्रष्टाचार अध्ययन के लिए मेजबान के रूप में.
      नोट: इन चूहों allogeneic मांसपेशी भ्रष्टाचार के लिए आदर्श मेजबान हैं, क्योंकि वे कमी परिपक्व टी और बी लिम्फोसाइटों और कार्यात्मक प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, संकेतन cytokine में की कमी कर रहे हैं, और allografting या xenografting गैर मांसपेशी कोशिकाओं < समर्थन के लिए दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है class = "xref" > 14 . सर्वव्यापी GFP अभिव्यक्ति मेजबान की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है (GFP +) और दाता-कोशिका-व्युत्पंन (GFP-) मांसपेशी फाइबर ।
  2. दाता चूहों के लिए MIME
    1. का उपयोग C57BL/6J चूहों (12-16 सप्ताह) के रूप में दाता चूहों.
      नोट: इन चूहों उपयुक्त दाता चूहों रहे हैं, क्योंकि वे एक पूरी तरह से मैप जीनोम है, किसी भी कंकाल मांसपेशी विकृति है ज्ञात नहीं कर रहे हैं, आसानी से उपलब्ध है और किफायती, और GFP व्यक्त नहीं करते.
< p class = "jove_title" > 2. तैयारी दाता मांसपेशी ऊतक

  1. बांधने टांके और कटाई दाता EDL मांसपेशियों
    1. Euthanize गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन और thoracotomy द्वारा दाता चूहों एक तालिका के माध्यम से प्रशासित सामांय संज्ञाहरण के तहत प्रदर्शन किया isoflurane vaporizer चिकित्सा ऑक्सीजन द्वारा संचालित (सांस isoflurane; 2-5% प्रभाव के लिए).
    2. EDL मांसपेशियों का उपयोग करने के लिए, पैर की पूर्वकाल सतह पर त्वचा खोलने के लिए शल्य कैंची की एक जोड़ी का प्रयोग करें । पूर्वकाल पैर में टा मांसपेशी का पता लगाने और यह EDL मांसपेशी कि टा मांसपेशी के पीछे स्थित है कल्पना करने के लिए निकालें । EDL मांसपेशियों के पीछे संदंश की एक जोड़ी की नोक स्लाइड और कोमल कर्षण लागू देखने के लिए अगर पैर की उंगलियों का विस्तार (इस पुष्टि की है कि मांसपेशी EDL है) । & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160;
      नोट: दाता ऊतक क्षेत्र शल्य चिकित्सा, aseptically prepped पहले फसल के लिए किया जाना चाहिए ।
    3. का उपयोग करें ~ 4-0 रेशम, लट, गैर अवशोषित, बाँझ टांका के 10 सेमी क्षेत्रों, और दो डबल समुद्री मील बनाने के लिए समीपस्थ और EDL मांसपेशी के बाहर tendons के लिए मार्गदर्शक टांके लागू होते हैं । (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
    4. बाहर EDL पट्टा काट, EDL मांसपेशी को प्रतिबिंबित और समीपस्थ पट्टा काट ।
    5. जगह एक पेट्री माउस घंटी समाधान से भरा पकवान में दाता EDL की मांसपेशियों ।
< p class = "jove_title" > 3. MIME के लिए होस्ट चूहों की तैयारी

  1. संज्ञाहरण
    1. सामांय संज्ञाहरण के तहत मेजबान माउस प्लेस (सांस isoflurane; १.५-5% प्रभाव के लिए) एक तालिका के अनुसार isoflurane vaporizer चिकित्सा ऑक्सीजन द्वारा संचालित द्वारा प्रशासित ।
    2. एक प्रेरण कक्ष में संज्ञाहरण के लिए प्रेरित और फिर पशु पर अन्य प्रक्रियाओं प्रदर्शन करते हुए संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए एक नाक शंकु के लिए माउस हस्तांतरण । पशु संज्ञाहरण के तहत है, जबकि एक इज़ोटेर्माल जेल हीटिंग पैड के साथ थर्मल समर्थन प्रदान करें ।
  2. त्वचा वडा
    1. पशु & #39; एस फर, वाम हिंद पैर के पूर्वकाल पहलू पर एक लोमनाशक क्रीम लागू करें । दाहिना पैर बाद की प्रक्रियाओं के लिए एक नियंत्रण पैर के रूप में कार्य करता है ।
    2. 2 मिनट के लिए पर लोमनाशक क्रीम छोड़ दो । फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में लथपथ पोंछे के साथ अलग फर के साथ लोमनाशक क्रीम साफ । फर हटाने के बाद, तीन povidone के पोंछे-आयोडीन झाड़ी समाधान और ७०% इथेनॉल बारी के साथ त्वचा साफ़ ।
  3. मेजबान टा मांसपेशी में एक सुई ट्रैक बनाने
    1. एक 18 गेज (लंबी में 1) सर्जिकल सुई मांसपेशी & #39 साथ मेजबान टा मांसपेशी के केंद्र के माध्यम से पारित; एस लांग अक्ष (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ). एक cephalo-caudal दिशा में सुई पास, टा मांसपेशी की लंबाई के साथ, और मांसपेशी पेट के केंद्र के माध्यम से (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ).
      नोट: इस कदम का उद्देश्य एक सुई ट्रैक बनाने के लिए है, जिसमें दाता की मांसपेशी का एक टुकड़ा एंबेड किया जा सकता है । टा मांसपेशी के केंद्र में दाता ऊतक embedding संभावित दाता ऊतक से SCs की अनुमति के लिए पलायन और पूरे मेजबान टा मांसपेशी भर में myogenesis की सुविधा होगी ।
  4. मेजबान टा मांसपेशी
    1. की सुई ट्रैक में दाता ऊतक एंबेडिंग एक बार सर्जिकल सुई मेजबान टा मांसपेशी के भीतर है, एक में सर्जिकल सुई के लुमेन के माध्यम से दाता ऊतक के एक छोर पर मार्गदर्शक टांके पास caudo-cephalic दिशा (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
      2. सुई ट्रैक के माध्यम से दाता ऊतक ड्रा
    2. एक caudo-cephalic दिशा में मेजबान टा मांसपेशी से वापस ले लिया है के रूप में ।
    3. caudal और दाता ऊतक के cephalic सिरों पर मार्गदर्शक टांके का उपयोग करने दाता ऊतक के स्थान को समायोजित । सुनिश्चित करें कि दाता ऊतक मेजबान टा मांसपेशी के भीतर विराजमान है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 डी ).
    4. एक बार दाता ऊतक स्थान अनुकूलित है, बंद मार्गदर्शक टांके, ठीक-संदंश इत्तला दे दी के साथ दाता ऊतक स्थान के लिए किसी भी अंतिम समायोजन करना ।
    5. सील चमड़े के नीचे सुई घाव (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E -F ) approximating के साथ घाव धार और पशु चिकित्सा ऊतक एक 27 गेज सर्जिकल सुई की नोक के साथ चिपकने लगाने के द्वारा । संदंश
< p class = "jove_title" > 4. इंट्रामस्क्युलर Myotoxin इंजेक्शन को प्रेरित करने के लिए ठोस मांसपेशी अध और पुनर्जनन

  1. के बाद MIME, इंजेक्षन ५०-६० & #181; L के १.२% BaCl 2 (Myotoxin) मेजबान टा मांसपेशी में व्यापक मांसपेशी फाइबर क्षति प्रेरित करने के लिए मेजबान मांसपेशी में और इसके भीतर दाता ऊतक एंबेडेड < सुप वर्ग = "xref" > 15 .
    1. (समीपस्थ, मध्य और बाहर की मांसपेशी पेट की एक तिहाई) मेजबान टा मांसपेशी की लंबाई के साथ 3 साइटों पर BaCl 2 इंजेक्षन.
      नोट: BaCl की तरह myotoxins इंजेक्शन 2 , cardiotoxins और कंकाल की मांसपेशी में notexin के बाद पुनर्जनन की मांसपेशी फाइबर नुकसान लाती है < सुप वर्ग = "xref" > १६ .
< p class = "jove_title" > 5. पद-प्रक्रियात्मक पशु देखभाल

  1. के बाद MIME और BaCl 2 इंजेक्शन, होस्ट माउस को साफ करें & #39; एस इथेनॉल के साथ वाम हिंद पैर और पेट्रोलियम जेली की एक पतली परत लागू करने के लिए त्वचा की रक्षा ।
  2. बाद प्रक्रियात्मक त्वचा की देखभाल के बाद, नाक शंकु से मेजबान माउस को हटा दें ।
  3. बिस्तर के बिना एक एकांत वसूली पिंजरे में माउस जगह है । वसूली पिंजरे के आधे के तहत रखा एक इज़ोटेर्माल जेल हीटिंग पैड के माध्यम से उबरने जानवर के लिए थर्मल समर्थन प्रदान करें ।
    नोट: एक आधा इतना गर्म नहीं है कि पशु हीटिंग पैड से दूर कदम अगर जरूरत हो सकती है ।
  4. के बाद मेजबान माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया गया है, अपने मूल पिंजरे में पशु वापस । पशु सुविधा में पशु वापस प्लेस जब तक अनुवर्ती प्रयोगों प्रदर्शन कर रहे हैं । होस्ट माउस की निगरानी प्रतिदिन तब तक करें जब तक कि वह फ़ॉलो-अप के लिए तैयार न हो & #160; & #8211; उदाहरण: 3 या 14 दिनों के बाद MIME. MIME के बाद, पशु प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा निगरानी की जाती है के रूप में अच्छी तरह से पशु चिकित्सा स्टाफ & #8211; यह मुख्य रूप से अगर जानवरों उज्ज्वल, सतर्क और उत्तरदायी हैं का आकलन शामिल है; और यह भी आकलन अगर जानवरों के दर्द के प्रकट संकेत दिखा रहे है या कठिनाई बढ़ रहा है, खिला, पीने और सौंदर्य ।
< p class = "jove_title" > 6. ऊतक संग्रह

  1. संचयन मेजबान मांसपेशी
    1. Euthanize ग्रीवा अव्यवस्था और thoracotomy द्वारा मेजबान चूहों एक तालिका के अनुसार चिकित्सा ऑक्सीजन द्वारा संचालित isoflurane vaporizer द्वारा प्रशासित सामान्य संज्ञाहरण के तहत प्रदर्शन किया ( श्वास isoflurane; 2-5% को प्रभाव) । & #160; जांचकर्ता भी इच्छामृत्यु से पहले सामान्य संज्ञाहरण के तहत टा मांसपेशियों फसल को IACUC अनुमोदन किया है । & #160;
    2. होस्ट टा मांसपेशियों का उपयोग करने के लिए, पैर की पूर्वकाल सतह पर त्वचा को खोलने के लिए शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें । पूर्वकाल पैर में टा मांसपेशी का पता लगाएँ, बाहर का पट्टा काट, मांसपेशी को प्रतिबिंबित और समीपस्थ मांसपेशी संलग्नक में कटौती (२.१ अनुभाग देखें) ।
    3. दोनों वाम (प्रयोगात्मक) और सही (नियंत्रण) टा मांसपेशियों को इकट्ठा ।
  2. & #160; स्नैप जमने से काटी गई मांसपेशियां
    1. बकरों के कागज और वजनी स्केल पर रखकर काटी हुई मांसपेशियों को तौलना.
    2. संक्षेप में cryoprotection के लिए खनिज तेल में मांसपेशियों डुबकी । अतिरिक्त तेल बंद दाग ।
    3. एल्यूमीनियम पंनी पर जगह की मांसपेशियों, और तस्वीर तेजी से तरल एक देवर में भरा नाइट्रोजन में उंहें विसर्जित कर मांसपेशियों को फ्रीज । नमूनों को लेबल cryovials में स्थानांतरित करें और नमूनों को एक-८० & #176 में संग्रहित करें; C फ्रीजर बाद में अध्ययन के लिए.
< p class = "jove_title" > 7. ऊतकीय स्टडीज

  1. Cryosectioning मांसपेशी ऊतक धारावाहिक पार वर्गों को इकट्ठा करने के लिए
    1. से नमूनों का अंतरण-८० & #176; ग फ्रीजर एक cryostat को तरल नाइट्रोजन युक्त देवरी में रखकर.
      2. cryostat में
    2. , एक समय में एक नमूना संभाल । एक ठंडा उस्तरा ब्लेड (cryostat में संग्रहीत ब्लेड) के साथ, टा मांसपेशी के मध्य पेट में दो बार नमूना में कटौती के बारे में 1-2 mm मोटी है कि मांसपेशियों के एक खंड का उत्पादन । इस सेगमेंट को cryostat सेक्शन बनाने के लिए रखें और मांसपेशियों के बाकी हिस्सों को उसके cryovial पर लौटाएं.
      3. इष्टतम काटने के तापमान के साथ
    3. (OCT) ठंड यौगिक, एक cryostat नमूना डिस्क पर ऊतक के मोटी खंड सुरक्षित । नमूना धारक पर नमूना डिस्क प्लेस ।
    4. रफ-फेस कटिंग द्वारा नमूना 20 & #181; मी सेक्शन. लीजिए कुछ 20 & #181; cryostat अनुभागों के लिए ग्लास स्लाइड पर m अनुभाग.
    5. यदि 20 & #181; मी वर्गों की गुणवत्ता संतोषजनक है, तो कटिंग मोटाई को 5 & #181; m में बदलें और गुणवत्ता का आकलन करने के लिए कुछ अनुभागों को जमा करें । यदि 5 & #181; मी वर्गों गुणवत्ता में संतोषजनक रहे हैं, धारावाहिक वर्गों को इकट्ठा । प्रति स्लाइड 2-3 अनुभाग एकत्रित करें और 3 स्लाइड्स के लिए पर्याप्त अनुभागों को एकत्रित
    6. दोनों प्रयोगात्मक (बाएं) और नियंत्रण (दाएं) प्रत्येक जानवर के टा मांसपेशियों से वर्गों को इकट्ठा ।
  2. अध्ययनरत GFP अभिव्यक्ति
    नोट: स्नायु तंतुओं में GFP अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए तैयार स्लाइड (धारा ७.१) के एक सेट को नियत करें ।
    1. लागू ~ ५० & #181; वर्गों पर विरोधी फीका माध्यम के एल और एक गिलास coverslip लागू होते हैं । स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip किनारों सील ।
    2. प्रकाश और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग (सामग्री के तालिका देखें), एक 10x उद्देश्य और GFP visualizing के लिए एक उपयुक्त फिल्टर के साथ वर्गों का अध्ययन ।
      1. टा मांसपेशी के पूरे पार अनुभाग को कवर करने के लिए अतिव्यापी दृश्य क्षेत्रों के डिजिटल छवियों (~ 15) इकट्ठा । प्रतिदीप्ति से माइक्रोस्कोप पर चरण कंट्रास्ट मोड के लिए स्विचन द्वारा दृश्य क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए चरण कंट्रास्ट छवियों को इकट्ठा ।
    3. एक उपयुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर है कि व्यक्तिगत छवियों टाइल करने के लिए एक समग्र छवि का उत्पादन कर सकते है के साथ खुला छवियां; उदा , का उपयोग & #34;p hotomerge & #34; फ़ाइल मेनू के अंतर्गत विकल्प तालिका में सूचीबद्ध इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में सामग्री .
    4. एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( जैसे , ImageJ) के साथ GFP प्रतिदीप्ति छवियों को खोलने । सर्कल व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर का उपयोग कर & #34; ROI टूल & #34; और प्रत्येक फाइबर के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड.
      1. उच्च प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति दिखाने वाले 10 तंतुओं के माध्य GFP तीव्रता के औसत को लेकर अधिकतम GFP (प्रतिदीप्ति) तीव्रता की गणना और सामान्य आकृति विज्ञान है. अधिकतम GFP तीव्रता द्वारा प्रत्येक फाइबर के लिए मतलब Florescence तीव्रता विभाजित और १०० से गुणा करके प्रत्येक फाइबर के लिए% अधिकतम GFP तीव्रता की गणना. सारणीबद्ध प्रत्येक प्रादेशिक पेशी के लिए GFP विश्लेषण के परिणाम के रूप में दिखाया < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3E .
  3. का अध्ययन स्नायु फाइबर निष्ठा और myonuclear स्थान Immunofluorescent लेबलिंग के द्वारा desmin और 4 & #39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), क्रमशः.
    नोट: मांसपेशियों के तंतुओं में desmin लेबलिंग का अध्ययन करने के लिए, तैयार की गई स्लाइडों के एक सेट को नामित करें ।
    1. 10 मिनट के लिए पंजाब में 2% paraformaldehyde के साथ वर्गों को ठीक करें । पंजाबियों के साथ वर्गों को तीन बार धोएं ।
      चेतावनी: paraformaldehyde.
      2. हैंडलिंग जब हैंडलिंग जब उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनते हैं 30 मिनट के लिए ०.०१% ट्राइटन-X100 युक्त पंजाब में पतला 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ
    2. ब्लॉक वर्गों । इस अवरोध समाधान के लिए इसके बाद के रूप में संदर्भित है प्राथमिक मंदक.
    3. प्राथमिक मंदक (1:200) में खरगोश रोधी desmin immunoglobulin जी (आईजीजी) को पतला करते हैं.
    4. के बाद अवरुद्ध पूरा हो गया है, वर्गों पर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करते हैं और एक फ्रिज में रात भर में गर्मी ~ 4 & #176; C. खंड एक बार धो ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० युक्त पंजाबियों के साथ (5 मिनट) । यह समाधान पहले धोने बफ़र के रूप में संदर्भित है ।
    5. धो वर्गों 3 बार (वॉश प्रति 5 मिनट) पंजाबियों के साथ ।
    6. कमजोर बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार (लाल फ्लोरोसेंट डाई को संयुग्मित) ०.०१% ट्राइटन X-१०० युक्त पंजाबियों में ।
    7. वर्गों पर पतला माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें और कमरे के तापमान पर गर्मी (~ 23 & #176; C) ६० min.
      8. के लिए
    8. पहले धोने बफर के साथ एक बार (5 मिनट) वर्गों धो । पंजाबियों के साथ 3 बार (वॉश प्रति 5 मिनट) वर्गों धो लें ।
    9. 3 मिनट के लिए DAPI लागू करें वर्गों 3 बार (धो प्रति 1 मिनट) पंजाबियों के साथ धो लो । apply ~ ५० & #181; वर्गों पर विरोधी फीका माध्यम के एल और कांच coverslip लागू होते हैं । स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip किनारों सील ।
    10. प्रकाश और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग (सामग्री के तालिका देखें), एक 10x उद्देश्य और लाल फ्लोरोसेंट डाई visualizing के लिए एक उपयुक्त फिल्टर के साथ धारावाहिक वर्गों का अध्ययन.
    11. (15) अतिव्यापी दृश्य क्षेत्रों के डिजिटल छवियों को इकट्ठा करने के लिए टीए पेशी के पूरे पार अनुभाग को कवर । DAPI लेबलिंग के प्रत्येक दृश्य फ़ील्ड के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेटिंग में स्विच करके प्रतिदीप्ति छवियों को एकत्रित करें ।
    12. खोलें और एक उपयुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण के रूप में चरणों में वर्णित 7.2.3-7.2.4.
      नोट: अध्ययन छवियों की पहचान करने के लिए, जो मांसपेशी फाइबर (desmin नकारात्मक) क्षतिग्रस्त कर रहे हैं, जो मांसपेशी फाइबर केंद्रीय nucleation है (desmin सकारात्मक फाइबर कि DAPI-लेबल नाभिक आंतरिक रूप से स्थान पर बाह्य रूप से स्थित है), और, जो खंड के क्षेत्रों सूजन और/या फाइब्रोसिस (क्षेत्रों है कि कई DAPI-लेबल नाभिक संकुल एक साथ है, लेकिन मांसपेशी फाइबर से रहित हैं) ।

Representative Results

पर 3 दिन के बाद mime, दाता EDL कि mime द्वारा प्रत्यारोपित है मेजबान टा मांसपेशी डिब्बे (चित्रा 2a-सी) के भीतर निहित है । जैसा कि उंमीद थी, दाता चूहों से टा मांसपेशी के पार वर्गों, प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी के तहत अध्ययन किया, हरी प्रतिदीप्ति शो नहीं है क्योंकि वे GFP (चित्रा 2d) व्यक्त नहीं करते । इसके विपरीत, मेजबान चूहों है कि दाता ऊतक के साथ प्रत्यारोपित नहीं कर रहे है से टा मांसपेशी के पार वर्गों, टा मांसपेशी फाइबर में वर्दी हरी प्रतिदीप्ति दिखाने के लिए, फाइबर एक्सप्रेस GFP (चित्रा 2E) के रूप में । दाता मांसपेशियों के ऊतकों के साथ MIME द्वारा प्रत्यारोपित की मांसपेशियों के पार वर्गों में, वहां मेजबान मांसपेशी फाइबर (GFP +) और दाता मांसपेशी फाइबर (GFP-) के बीच सीमांकन की एक पंक्ति है । दृश्य क्षेत्रों के चरण कंट्रास्ट छवियों 2 डी-एफ में दिखाया गया है चित्रा 2E'-एफ' में प्रस्तुत कर रहे है और सुझाव है कि वहां वास्तव में मांसपेशी क्षेत्रों में मौजूद फाइबर जहां कोई GFP है सिग्नल.

14 दिनों के बाद MIME और BaCl2 इंजेक्शन, टा मांसपेशी कि छोड़ दिया जाता है या desmin को एंटीबॉडी के साथ लेबल कर रहे हैं के धारावाहिक पार वर्गों का अध्ययन करके (चित्रा 3), हम सीखते हैं कि GFP संकेत सभी मांसपेशी फाइबर द्वारा व्यक्त की है मेजबान चूहों से अनुपचारित मांसपेशी, लेकिन नहीं MIME-इलाज मांसपेशी में (लाल desmin लेबलिंग व्यवहार्य मांसपेशी फाइबर का पता लगाता है). मेजबान टा मांसपेशी में MIME और BaCl2 इंजेक्शन के साथ इलाज किया, दाता-कोशिका-व्युत्पंन myogenesis कई desmin की उपस्थिति से स्पष्ट है (+) मांसपेशी फाइबर कि कोई जासूस GFP संकेत (चित्र3 सी-डी, 3 सी शो) -D'). Chimeric मांसपेशी मेजबान और दाता myogenic कोशिकाओं की संभावना संलयन से उत्पंन फाइबर GFP प्रतिदीप्ति के मध्यम स्तर पर इन तंतुओं द्वारा प्रदर्शित की कम से पता लगाया जा सकता है । कई chimeric फाइबर टा मांसपेशी के पूरे व्यास में दिखाई देते है सुझाव है कि दाता SCs मेजबान मांसपेशी के epimysium के भीतर माइक्रोन के कई सैकड़ों पलायन करने में सक्षम हैं । GFP + फाइबर का Quantitation फिगर 3Eमें दिखाया गया है । चित्रा 4 एक पूरे MIME के धारावाहिक पार वर्गों के उच्च आवर्धन छवियों + BaCl2 टा मांसपेशी इलाज से पता चलता है ।

Figure 1
चित्र 1 . न्यूनतम इनवेसिव मांसपेशी embedding (MIME) में शामिल कदम.
MIME सामान्य संज्ञाहरण के तहत किया जाता है । यह रखने शामिल है ~ दाता मांसपेशी (दाता माउस EDL) के रिंगर समाधान में 10 मिलीग्राम और उसके सिरों को मार्गदर्शक टांके बांधने (A)। एक 18 गेज सुई मेजबान मांसपेशी की लंबी धुरी के माध्यम से पारित कर दिया है (ख) और दाता ऊतक सुई ट्रैक के माध्यम से तैयार की है (ग). दाता ऊतक मेजबान मांसपेशी में एंबेडेड छोड़ दिया है (घ), मार्गदर्शक टांके काट रहे हैं, और सुई छेद ऊतक चिपकने वाला (ई)के साथ बंद कर रहे हैं । सील सुई घावों तीर (एफ)के साथ संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . टीए पेशी 3 दिनों के बाद माइम की पढ़ाई ।
मेजबान मांसपेशी MIME के बाद 3 दिन एकत्र; नोट होस्ट टा पर सुई के निशान (तीर; A-B) । डेटा आगे की पुष्टि करें कि एंबेडेड दाता माउस EDL टा मांसपेशी डिब्बे (B-C) के भीतर विराजमान है । टा मांसपेशी पार वर्गों के प्रतिदीप्ति छवियों जंगली प्रकार टा मांसपेशी में कोई हरी प्रतिदीप्ति नहीं दिखा (डी), एनएसजी में तेज हरी प्रतिदीप्ति-GFP टा मांसपेशी (ई), और एनएसजी में मेजबान और दाता मांसपेशी के बीच एक अंतर-GFP टा मांसपेशी 3 दिन में पोस्ट-MIME (F)। D-f में दृश् य फ़ील् ड्स के चरण कंट्रास्ट छवियां क्रमश: D'-f ' में दर्शाए गए हैं । पैनलों में लाल रेखा एफ और एफ ' मेजबान और दाता ऊतक के बीच सीमांकन की रेखा से पता चलता है । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . टीए पेशी 14 दिनों के बाद माइम की पढ़ाई ।
डेटा एकत्र 14 दिनों के बाद MIME प्रस्तुत कर रहे हैं । लाल संकेत desmin के immunofluorescent लेबलिंग से है (desmin के लिए एक सकारात्मक संकेत है कि myofibers व्यवहार्य हैं), नीले संकेत DAPI से है (दाग नाभिक), और हरी संकेत GFP से है । नियंत्रण टा मांसपेशी (सही hindlimb) में मेजबान माउस से काटा, के रूप में की उंमीद है, लगभग सभी myofibers desmin के लिए सकारात्मक हैं, सुझाव है कि इन myofibers (A; लाल संकेत) व्यवहार्य हैं । इसके अतिरिक्त, DAPI धुंधला पर आधारित है, यह स्पष्ट है कि लगभग सभी myofibers के myonuclei में स्थित हैं, के रूप में स्वस्थ मांसपेशी (A; नीला संकेत) में अपेक्षित होगा । नियंत्रण टा मांसपेशी शो के धारावाहिक वर्गों है कि, लगभग सभी मांसपेशी फाइबर चमकीले हरे हैं, जिसका अर्थ है कि वे GFP के लिए सकारात्मक हैं । MIME + BaCl2 -इलाज टा मांसपेशी (बाएं hindlimb) में, दाता-कोशिका-मध्यस्थता myogenesis कई desmin की उपस्थिति से स्पष्ट है (+) मांसपेशी फाइबर कि कोई जासूसी GFP प्रतिदीप्ति (सी-डी, C'-डी 'शो). Desmin (+) के साथ मांसपेशी फाइबर उदारवादी GFP प्रतिदीप्ति (chimeric मांसपेशी फाइबर) पूरे टा मांसपेशी के व्यास के पार मौजूद हैं, सुझाव है कि, MIME दाता SCs कि प्रादेशिक मांसपेशी के epimysium के भीतर माइग्रेट कर सकते हैं प्रदान करता है और बढ़ावा देने के दाता-कोशिका-व्युत्पन्न myogenesis. A'-डी ' ए-डी में नीले बक्से के भीतर क्षेत्रों के उच्च आवर्धन छवियों हैं । Quantitation ऑफ GFP (+) फाइबर्स और सेंट्रली nucleated फाइबर्स को ईमें दिखाया गया है । स्केल पट्टियां = १०० µm (A-d) और ५० µm (A'-d ') । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4rc = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg"/>
चित्र 4 . व्यापक नुकसान और पुनर्जनन के सबूत 14 दिनों के बाद MIME और BaCl2 इंजेक्शन ।
उच्च आवर्धन, एक पूरे MIME के सीरियल क्रॉस वर्गों + BaCl2 इलाज टा मांसपेशी प्रस्तुत कर रहे हैं । डेटा दिखाने के लिए कि कई मांसपेशी फाइबर, जो मामूली या दृढ़ता से GFP + केंद्रीय नाभिक स्थित है (a-B; a में रेड सिग्नल desmin से है, एक में ब्लू सिग्नल DAPI से है, और B में ग्रीन सिग्नल GFP से है) । इन आंकड़ों का सुझाव है कि अध और पुनर्जनन के बाद BaCl2 इंजेक्शन GFP अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता है । इस संदर्भ में, मध्य nucleated मांसपेशी फाइबर की MIME + BaCl2 में उपस्थिति का इलाज टा मांसपेशी, छोटे-से-कोई GFP अभिव्यक्ति के साथ, पता चलता है कि इन तंतुओं से महत्वपूर्ण योगदान के साथ myogenesis (या पुनर्जनन) की संभावना परिणाम है GFP-myogenic कोशिकाओं । इन टिप्पणियों को चयनित फ़ील्ड्स की उच्च आवर्धन छवियों में आगे सत्यापित किया जा सकता है (C-F; सी और डी, और ई और एफ, क्रमशः, धारावाहिक पार वर्गों से अतिव्यापी क्षेत्रों रहे हैं; छवि सीमाओं के रंग कोडिंग एक और बी में उन क्षेत्रों के स्थान को निरूपित) । स्केल पट्टियां = १०० µm (A-B) और ५० µm (C-F) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां, हम उपंयास प्रयोगात्मक MIME के रूप में जाना जाता तकनीक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद, हमारी प्रयोगशाला में विकसित, मेजबान मांसपेशियों के ऊतकों में दाता मांसपेशी ऊतक प्रत्यारोपण के लिए । यह एक खुली मांसपेशी तकनीक है कि पहले से ही दाता को बढ़ावा देने में कारगर साबित हो गया है, एक मेजबान मांसपेशी9,10,17में myogenesis मध्यस्थता के एक अनुकूलन है ।

MIME के लक्ष्य के लिए दाता मांसपेशी ऊतक के engraftment मेजबान मांसपेशी में ही सक्षम नहीं है (हम वर्तमान में अगर यह होता है पता नहीं है), बल्कि दाता SCs का एक स्रोत है कि शर्तों के तहत मेजबान मांसपेशी में myogenesis योगदान कर सकते है प्रदान करने के लिए है कि एम उत्तेजित uscle उत्थान । हमारी आशा है कि MIME के बाद अनुकूलित किया गया है और बुनियादी और नैदानिक अध्ययन में परीक्षण, यह बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए नैदानिक चिकित्सा कंकाल की मांसपेशियों है कि myogenic मांसपेशी नुकसान आया है में मांसपेशियों पुनर्जनन बढ़ाने के उद्देश्य से मार्गदर्शन कर सकता है ।

वहां कई सवाल है कि अभी तक के बारे में कैसे MIME एक नैदानिक चिकित्सा में अनुवाद किया जा सकता है उत्तर दिया जा रहे हैं, उदाहरण के लिए: कैसे हम दाता ऊतक की गुणवत्ता पर नियंत्रण होगा? हम दाता ऊतक और कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अस्वीकृति कैसे नियंत्रित करेंगे? दाता ऊतक myogenesis के लिए कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के बाद मंजूरी दे दी है या यह एक fibrotic निशान के पीछे छोड़ देता है? दाता और/या मेजबान मांसपेशी के फाइबर प्रकार दाता-कोशिका-मध्यस्थता myogenesis को प्रभावित करता है? जो मांसपेशियों को व्यावहारिक रूप से MIME से लाभ कर सकते हैं? हम वर्तमान में हमारे अध्ययन का विस्तार कर रहे है आकलन अगर MIME सुरक्षित और प्रभावी है, सहायक उपचार है कि दाता-व्युत्पंन myogenesis वृद्धि कर सकते है की पहचान, और सवालों के कई जवाब, ऊपर सूचीबद्ध ।

के लिए माउस के हमारे परीक्षणों को पूरा करने के बाद MIME के साथ माउस allogeneic ट्रांसप्लांटेशन, हमारे अगले कदम के लिए मानव cadaveric मानव ऊतक के साथ माउस MIME करने के लिए cadaveric मांसपेशियों के ऊतकों की myogenic क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए है । हमें आशा है कि इन प्रयोगों बुनियादी और शोधों अनुसंधान की एक नई लाइन है, जो दाताओं, जो पहल में ऐसी शिक्षा के लिए शरीर वसीयत कार्यक्रम और अंग दान के लिए जीवन कार्यक्रम के उपहार के रूप में पंजीकृत है से मांसपेशी ऊतक शामिल है का नेतृत्व करेंगे .

प्रतिनिधि डेटा इस पांडुलिपि में प्रस्तुत सुझाव है कि 14 दिनों में MIME के बाद, वहां कई व्यवहार्य myofibers है कि या तो कमी GFP या GFP के निंन स्तर है । इन आंकड़ों की हमारी व्याख्या है कि GFP-दाता उपग्रह कोशिकाओं मेजबान मांसपेशी में myogenesis के लिए योगदान दिया । हम एक मेजबान माउस मांसपेशी में मानव cadaveric ऊतक के आरोपण के लिए तैयारी में इस प्रयोग किया । स्पष्ट है कि दाता उपग्रह कोशिकाओं को MIME निंनलिखित मेजबान मांसपेशी में myogenesis योगदान प्रदर्शित करने के लिए, यह दाता ऊतक कि एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर, जो आसानी से GFP से प्रतिष्ठित किया जा सकता है व्यक्त प्रत्यारोपण के लिए उपयोगी होगा (उदा. लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP + मेजबान मांसपेशी में प्रत्यारोपित दाता ऊतक व्यक्त) ।

इस तकनीक को मुख्य रूप से दाता ऊतक में वर्तमान SCs की प्रकृति द्वारा सीमित है । यदि दाता ऊतक में SCs व्यवहार्य हैं, तकनीक दाता-कोशिका मध्यस्थता myogenesis की सुविधा की संभावना है, जबकि यदि वे व्यवहार्य नहीं हैं, myogenesis नहीं हो सकता । हालांकि, के बाद से SCs बहुत लचीला कर रहे है और के बारे में 2 सप्ताह के पोस्टमार्टम के लिए व्यवहार्य हैं, यह बहुत संभावना है कि प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए, दाता ऊतक है कि फसल के बाद कुछ ही मिनटों के भीतर प्रत्यारोपित दाता-सेल-मध्यस्थता myogenesis की सुविधा होगी13 . इसके अतिरिक्त, के रूप में ऊपर alluded, यह संभव है कि पूरी मांसपेशी ऊतक के बाद से (जिसमें SCs, परिपक्व मांसपेशी फाइबर, साथ ही मांसपेशी निवासी fibroblasts) मेजबान मांसपेशी में एंबेडेड है, फाइब्रोसिस हो सकता है । हालांकि, इस धारणा को empirically की जांच की जरूरत है । मांसपेशी हानिकारक संकुचन, cryoinjury, और प्रयोगात्मक myotoxins से उत्पंन होने वाली क्षति पर साहित्य, पता चलता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं (मुख्य रूप से मैक्रोफेज) प्रभावी रूप से क्षतिग्रस्त फाइबर से सेलुलर मलबे समाशोधन और remodeling करने में सक्षम हैं extracellular मैट्रिक्स18. इसलिए, यह संभव है कि MIME और BaCl2 इंजेक्शन के बाद, के रूप में लंबे समय के रूप में मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दाता मांसपेशी फाइबर चूकने के लिए उपयोग किया है, वे मलबे स्पष्ट, बस दाता SCs पीछे जा सकता है । अंत में, दाता की हद myogenesis व्युत्पंन दाता मांसपेशी ऊतक है कि मेजबान मांसपेशी में एंबेडेड है की राशि पर निर्भर है । आदेश में मेजबान मांसपेशी डिब्बे के लिए पूरी तरह से दाता द्वारा repopulated-सेल-myofibers व्युत्पंन, यह एक्स या गामा-विकिरण ablate मेजबान मांसपेशी SCs और भी दोहराया MIME प्रक्रियाओं की आवश्यकता की तरह एक विधि की आवश्यकता होगी ।

यह दिखा दिया गया है कि शल्य चिकित्सा एक मेजबान मांसपेशी को उजागर करने और दाता ऊतक के एक टुकड़ा suturing मेजबान मांसपेशी पर दाता की सुविधा कर सकते है सेल-मध्यस्थता myogenesis9,10,17। इस खुले शल्य दृष्टिकोण myogenesis की प्रगति को ट्रैक करने के लिए और मानव मांसपेशियों की बीमारियों के माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए अतीत में इस्तेमाल किया गया है. MIME तकनीक का अभिनव पहलू यह है कि यह ंयूनतम इनवेसिव है और शल्य चिकित्सा मेजबान मांसपेशी को उजागर शामिल नहीं है । यह iatrogenic संक्रमण और मेजबान जानवर में असुविधा की डिग्री के जोखिम को कम कर देता है, इसलिए इसे और अधिक संभव बनाने के लिए एक ही मेजबान मांसपेशी पर बार-बार MIME प्रदर्शन करने की जरूरत है ।

हमें आशा है कि MIME तकनीक खुला शल्य दृष्टिकोण है कि वर्तमान में एक मेजबान माउस में दाता मांसपेशी ऊतक प्रत्यारोपण के बाद किया जाता है के लिए एक उपयुक्त शोधन हो सकता है । यह मानवीय माउस मॉडल की पीढ़ी को तेज कर सकता है, मेजबान माउस मांसपेशी में biopsied मानव मांसपेशी embedding द्वारा । इसके अतिरिक्त, माउस से हमारे प्रारंभिक डेटा के आधार पर करने वाली माउस को कलम लगाने, हम आशा है कि MIME दाता को प्राप्त करने में प्रभावी होगा सेल-मानव cadaveric दाता ऊतक से मध्यस्थता myogenesis के रूप में लंबे समय के रूप में दाता SCs व्यवहार्य हैं । अंत में, अतिरिक्त परीक्षण और सत्यापन के साथ, हम उम्मीद करते हैं कि MIME तकनीक मांसपेशियों की बीमारियों के साथ मानव में दाता-कोशिका-मध्यस्थता myogenesis की सुविधा के लिए नए उपचारों को विकसित करने में मदद करेगा ।

MIME तकनीक की सफलता पर गंभीर रूप से निर्भर है fascial डिब्बे (मेजबान मांसपेशी के epimysium) के भीतर ठीक दाता ऊतक एंबेडिंग । केवल अगर दाता ऊतक मेजबान मांसपेशी डिब्बे के भीतर रखा गया है, यह एक सटीक तरीके से मेजबान मांसपेशी को SCs प्रदान करने में सक्षम हो जाएगा । यदि दाता ऊतक मेजबान मांसपेशी के बाहर रखा गया है, यह क्या अपने भाग्य होगा के रूप में स्पष्ट नहीं है । MIME के लिए हमारे प्रयोगात्मक मॉडल में, हम मेजबान मांसपेशी के रूप में टा मांसपेशी का उपयोग करें, क्योंकि यह प्रमुख है और सतही पैर के अग्रपाश्विक पहलू में रखा है । आकार, अभिविंयास और प्रादेशिक मांसपेशी की संरचनात्मक स्थिति, यह आसान है कि दाता ऊतक सही ढंग से MIME के बाद मेजबान टा मांसपेशी के भीतर रखा जाता है की पुष्टि करने के लिए बनाता है । इस पत्र में, हमने प्रायोगिक प्रमाण प्रदान किया है कि दाता ऊतक पुनः3 दिनों के बाद mime में मेजबान टा मांसपेशी के भीतर एंबेडेड, और है कि वहां दाता है सेल-14 दिनों के बाद mime में मेजबान मांसपेशी में मध्यस्थता myogenesis ।

Disclosures

लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम एक प्रायोगिक पुनर्वास अनुसंधान और प्रशिक्षण (एआर3टी) और वेन राज्य विश्वविद्यालय से जार के लिए एक संकाय स्टार्टअप पैकेज के लिए एलायंस से एक पायलट अनुदान द्वारा संभव बनाया गया था । एआर3टी Eunice कैनेडी श्राइवर बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय संस्थान (niched), राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (NINDS), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग और जैव इंजीनियरिंग (NIBIB के संस्थान द्वारा समर्थित है ) के अंतर्गत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के पुरस्कार क्रमांक P2CHD086843. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NSG-GFP mice The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) Stock #021937 Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)  Stock #000664 Control donor mice
Tabletop isoflurane vaporizer  VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled anesthesia system
Magic depilatory crea Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) SUT106631 Guiding sutures for donor tissue
VetBond veterinary tissue adhesive 3M (Maplewood, MN) Catalog #1469Sb Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure
Barium chloride  Ricca Chemical Company (Arlington, TX) Product #R0854000-500A 854-16  Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration
Deltaphase isothermal gel heating pad  Braintree Scientific (Braintree, MA)  Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
HM525NX cryostat   ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX  Cryostat to make frozen sections of muscle
Vectashield Antifade Medium Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) Catalog Number: H-1000 Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples
Rabbit anti Desmin Antibody Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) RB9014P Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog#: A-21069 Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Seracare (Milford, MA) Catalog #5930-0006 or 71-03-01 Reagent for fluorescent labeling of nuclei
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA)  Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
Photoshop CS4 Adobe Systems (San Jose, CA) Photoshop CS4 Imaging Software for perform image tiling
Image J National Institutes of Health (Bethesda, MD) Image J for Windows 64-bit Operating System Imaging Software for quantitative fluorescence analysis

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References

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Roche, J. A., Begam, M., Galen, S. S. Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis. J. Vis. Exp. (126), e55731, doi:10.3791/55731 (2017).

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