Summary
우리는 우리가 전화 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME), 골격 근육 조직 기증자 세포 중재 하는 myogenesis로 이식 때 용이 하 게 수 있는 가능한 조직적 셀을 포함 하는 증거에 근거 하는 소설 실험 기법을 설명 호스트 근육입니다.
Abstract
골격 근육 조직-상주, 근육 섬유를 생성 (조직적) 위성 세포 때문 (SCs), 오른쪽 조건 하에서 새로운 근육 섬유를 형성할 수 있는 재생 능력을 소유한 다. SCs 근육 조직에서 수확 될 수 있다 생체 외에서배양 비록 결과 myoblast 셀 myogenesis 호스트 근육에 이식 때 홍보에 매우 효과적 되지 않습니다. 수술 호스트 근육을 노출 하 고 기증자 근육 조직, 또는 호스트 근육에 그들의 SCs와 함께 고립 된 근육 섬유의 세그먼트를 접목 myoblast 이식에 비해 더 나은 myogenesis를 승진 시킨다. 우리가 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME) 전화 새로운 기술을 개발 했습니다. MIME 전달 호스트 근육을 통해 수술 바늘, 바늘 트랙을 통해 기증자 근육 조직의 조각 그리고 다음 떠나 그것 호스트 근육에 대 한 SCs의 소스 역할을 할 수 있도록 호스트 근육에 포함 된 기증자 조직 포함 한다. 여기 우리는 세포의 모든에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 immunodeficient 마우스 모델에서 MIME을 수행에 단계가 자세히 설명. 호스트 마우스 면역 결핍 기증자 조직의 면역 거부 반응의 위험을 감소 하 고 GFP 식 호스트 근육 섬유 (GFP +) 및 기증자 세포 유래 근육 섬유 (GFP-) 쉽게 식별할 수 있습니다. 파일럿 데이터 호스트 마우스 tibialis 앞쪽 (TA) 근육에 기증자 마우스에서 신 근 digitorum longus (EDL) 근육을 이식 하 MIME를 사용할 수 있는 것이 좋습니다. 우리의 데이터는 또한 myotoxin (바 륨 염화, BaCl2) MIME 후 호스트 근육에 주입 하는 경우는 약 5%, 26%, 26% 및 단일 호스트 TA 섬유의 43%로 호스트 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis의 증거 건의 한다 근육 보여주는 아무 호스트 기여, 최소한의 호스트 기여, 중간 호스트 기여, 최대한 호스트 기여, 각각.
Introduction
건강 한 골격 근육, 비록 포스트 mitotic 위성 세포 (SCs)1,2;로 알려진 조직 상주 조직적 셀의 존재로 인해 우수한 재생 능력 보유 그리고3,4검토. 그러나, 근육 dystrophies, 외상 또는 가속된 노화에 의해 발생 하는 병 적인 조건 하에서 근육 재생 수 있습니다 하지와 유지할 근육 쇠 약, 그리고 따라서, 진보적인 근육 섬유 손실 발생5. 효과적인 방법은 근육에서 SCs를 격리 하 여 myoblasts (후와 myotubes)의 많은 수를 생성 하는 문화에서 그들을 확장 개발 되었습니다, 호스트 근육에 근육 섬유의 순수 관련 번호를 생성 하는 시도 최소한의 성공6만 나왔고. 로 다른 많은 세포 유형에 myoblasts 혼자 호스트 조직에 주입 하면 세포의 대부분 할 하지 engraft7,8. 우리는 신경 근육 학 전기 자극 (NMES) 인간의 myoblasts8주사 재생 불충분 한 호스트 마우스 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis을 용이 하 게 나타났습니다. 다른 이식 수술 biopsied 근육 또는 연결 된 SCs와 단일 근육 섬유 NMES, SCs와 함께 전체 근육 섬유를 이식할 것 이식 보다 더 유리한 제안 없이 적당 한 myogenesis 촉진 증명 조직적 셀 혼자9,10. 때문에 기증자 또는 호스트 근육으로 투입 조작된 근육 조직 세포만을 이식 하는 것 보다 더 나은 결과 생산, 조직 또는 조직 구조로 기증자 세포 engraftment;에 대 한 중요 한 단서를 제공할 수 있습니다 가능 하다 세포 치료 연구와 관련 된 다양 한 세포 종류10,,1112에 점점 더 분명 되 고 있다는 개념.
최근 데이터는 인간에서 얻은 SCs 이상 2 주 사후 생성 myotubes 문화13에 것이 좋습니다. 따라서 우리는 살아있는 호스트에 근육 조직 수확 사후의 이식 근육 섬유 손실을 반전 됩니다 경우 평가 하고자 하는. MIME 기증자 세포 유래 myogenesis를 홍보 하기 위해 살아있는 호스트의 골격 근육 조직으로 기증자 근육 조직을 이식 하 라는 새로운 기술을 개발 했습니다. MIME 수술 바늘 바늘 트랙;을 만들 호스트 근육을 통해 전달 하는 것을 포함 한다. 바늘 트랙;을 통해 기증자 근육 조직의 작은 세그먼트 그리기 호스트 근육;에 포함 된 기증자 조직 떠나 그리고 조직 접착제로 바늘 구멍을 닫는입니다. 공부 안락사 쥐에서 기술을 연습 후 다른 실험에 우리 지금 immunodeficient는 살아있는 쥐에 MIME 수행한 편 녹색 형광 단백질 (GFP), 표현 그리고 3 ~ 14 일에 후속 포스트 MIME. 3 일 후 MIME에서 우리는 기증자 마우스 (GFP-) EDL 근육 호스트 마우스에 이식 (GFP +) TA 근육, 남아 호스트 근육에 포함 된 확인 합니다. 14 일 후 MIME에서 BaCl2 myotoxin 부상 손상 및 myogenesis, 유도 후 우리 확인는 약 5%, 26%, 26%와 43% 단일 호스트 따 근육 섬유의 쇼 호스트 기여, 최소한의 호스트 기여, 적당 한 호스트 기여, 그리고 최대한 기여, 각각 호스트. 중앙 nucleation (변성 및 후속 중생의 표식) MIME 및 myotoxin 주입 후 따 근육 섬유의 약 95%에서 볼 수 있다.
우리 공부 따 근육 MIME + BaCl2 후 14 일 때문에이 시간 포인트 재생된 섬유의 대부분은 중앙 nucleated 때 중생의 중간 단계를 캡처합니다. 우리는 공부 하는 GFP + 마우스 그렇게 할 때 우리는 결국 호스트 쥐로 인간의 시체 근육 이식, 우리 호스트와 기증자의 근육 섬유를 쉽게 구별할 수 있을 것입니다에 MIME에 대 한 호스트. 우리는 사용 하는 마우스 EDL 근육이이 근육에서 단일 섬유 따 근육9보다 큰 조직적 잠재력 나타났습니다 때문에 실험 기증자 조직으로. EDL 근육 따 근육에 시너지도 이며 비슷한 섬유 유형 구성 했다. 우리의 예비 데이터 MIME는 호스트 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis를 촉진 수 것이 좋습니다.
Protocol
살아있는 동물을 포함 하는 모든 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨인 주립 대학, 디트로이트, 미시간, 미국에 의해 승인 되 고 관리 및 실험 동물의 사용 (에 대 한 가이드를 따라 8 판, 2011, 발행 국가 아카데미 압박, 500 5 거리, NW, Lockbox 285, 워싱턴, DC 20055, 미국). 승인된 IACUC 프로토콜에 의하여 통증 및 고통을 포함 하는 절차는 일반적인 마 취 유도 및 isoflurane 흡입 효과 (1.5-5%)에서 유지 관리 수행 했다. 마 취 및 종을의 부족 꼬집어, 발가락을 철수의 부족에 의해 확인 되었다 또는 털 응답 (isoflurane 비율 증가 효과 유지 하기 위해 필요에 따라). 프로토콜, 최소한 침략 적 특성상 한 " 멸 균 팁 " 기술 뒤를 이었다. 동물 마 취 동안, 석유 젤리 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 되었습니다. 아니 특별 한 치료 했다; 그러나, 다이어트 젤 일반 마 취. 조사 절차는 수술 노출 호스트를 포함 하지 않는 다음과 같은 MIME, 진통 하 IACUC에 의해 승인 절차를 다음 24 h에 대 한 동물을 제공 했다 근육, 그리고 많은 일반적인 진통 약물 정상적인 근육 재생에 영향을 미칠 것으로 알려진 한 hindlimb에 국한 하기 때문에 정상적인 기능에는 영향을 미치지 않습니다.
1. 동물 모델
- MIME에 대 한 호스트 마우스
- 호스트로 사용 NSG GFP 마우스 (8-10 주, 남성) 근육 이식 연구.
참고: 이러한 마우스는 이상적인 호스트 수용자 근육 이식 때문에 성숙한 T와 B 림프 톨과 기능성 천연 킬러 세포 부족, 부족 한 cytokine 신호, allografting 또는 xenografting 비 근육 세포에 대 한 다른 사람에 의해 사용 되었습니다 < sup 클래스 = "외부 참조" > 14. 유비 쿼터 스 GFP 식 호스트 (GFP +) 및 기증자 세포 유래 (GFP) 근육 섬유의 쉽게 식별할 수 있습니다.
- 호스트로 사용 NSG GFP 마우스 (8-10 주, 남성) 근육 이식 연구.
- MIME에 대 한 기증자 마우스
- 기증자 쥐로 사용 C57BL/6J 쥐 (12-16 주).
참고: 이러한 마우스는 적합 한 기증자 쥐 때문에 그들은 완전히 매핑된 게놈, 어떤 골격 근육 병 리를 알 수 없는, 쉽게 사용할 수 있고 경제적, GFP를 표현 하지 않습니다.
- 기증자 쥐로 사용 C57BL/6J 쥐 (12-16 주).
2. 기증자 근육 조직 준비
- 매 지도 봉합 및 수확 기증자 EDL 근육
- 경부 전위와 thoracotomy 탁상에 의해 관리 하는 일반적인 마 취하에 수행 하 여 기증자 마우스를 안락사 의료 산소 (흡입된 isoflurane; 2-5% 효과)에 의해 구동 isoflurane 기화.
- EDL 근육에 액세스 하려면 수술가 위를 사용 하 여 다리의 앞쪽 표면에 피부를 열고. 앞쪽 다리에 따 근육을 찾아서 EDL 근육 따 근육 뒤에 위치를 시각화 하기 위해 그것을 제거 합니다. EDL 근육 뒤에 집게의 쌍의 끝을 밀어 하 고 발가락 확장 보고 부드러운 견인을 적용 (이 근육은 EDL 인지 확인).
참고: 기증자 조직 지역 수술, aseptically 준비 전에 수확 해야. - 사용 ~ 10 cm의 세그먼트 4-0 실크, 꼰, 비 흡수, 무 균 봉합, 그리고 EDL 근육의 근과 원심 힘 줄을 지도 봉합을 적용 하 게 2 개의 두 배 매듭. ( 그림 1A).
- 원심 EDL 힘 줄을 잘라 EDL 근육을 반영 하 고 근 힘 줄을 잘라.
- 장소 기증자 EDL 근육 페 트리 접시에 가득 마우스 벨 솔루션.
3. MIME에 대 한 호스트 마우스를 준비
- 마 취
- 전신 마 취 (흡입된 isoflurane; 1.5-5% 효과) 의료 산소에 의해 구동 탁상 isoflurane 기화에 의해 관리 아래 호스트 마우스.
- 유도 실에서 마 취를 유발 하 고 동물에 다른 절차를 수행 하는 동안 마 취를 유지 하기 위해 코 콘을 마우스를 전송. 동물 마 취 동안 패드를가 열 하는 등온선 젤 열 지원.
- 피부 준비
- 동물을 제거 하려면 ' s 모피, 왼쪽된 뒷 다리의 앞쪽 측면 depilatory 크림을 적용. 후속 절차에 대 한 제어 다리는 오른쪽 다리 역할.
- 두고는 분리와 depilatory 크림을 2 분 클린에 depilatory 크림 모피 인산에 젖은 잎사귀와 버퍼링 식 염 수 (PBS). 털 제거 후 스크럽 povidone-요오드 제거 솔루션 및 70% 에탄올의 3 번갈아 잎사귀와 피부.
- 호스트 따 근육에 바늘 트랙을 만드는
- 전달 호스트의 센터를 통해 18 게이지 (1에 긴) 수술 바늘 따 근육 근육에 따라 ' s 긴 축 ( 그림 1B). TA 근육 및 근육 배꼽 ( 그림 1B)의 센터를 통해 길이 따라 cephalo 꼬리 방향으로 바늘을 통과.
참고:이 단계의 목적은 어떤 기증자 근육의 조각을 포함 수 바늘 트랙을 만드는 것입니다. TA 근육의 센터에 기증자 조직 포함 것 허용 하도록 마이그레이션 및 전체 호스트에서 myogenesis 촉진 기증자 조직에서 SCs 따 근육.
- 전달 호스트의 센터를 통해 18 게이지 (1에 긴) 수술 바늘 따 근육 근육에 따라 ' s 긴 축 ( 그림 1B). TA 근육 및 근육 배꼽 ( 그림 1B)의 센터를 통해 길이 따라 cephalo 꼬리 방향으로 바늘을 통과.
- 호스트 따 근육의 바늘 트랙에 소스 기증자 조직
- 수술 바늘 호스트 따 근육 내에서 일단 통과 한쪽 끝에 수술 바늘의 루멘을 통해 기증자 조직의 지도 봉합 한 caudo 두 부 방향 ( 그림 1C).
- 바늘 caudo 두 부 방향에서 호스트 따 근육에서 인출 됩니다 바늘 트랙을 통해 기증자 조직의 그립니다.
- 는 기증자 조직의 꼬리와 두 부 끝에 지도 봉합을 사용 하 여 조직 기증자의 배치를 조정. 기증자 조직 호스트 따 근육 ( 그림 1D) 내에서 누렸다는 확인 하십시오.
- 일단 기증자 조직 배치 최적화 지침 봉합 잘라 조정을 어떤 최종 기증자 조직 배치에 뾰족한 집게와.
- 물개 피부 바늘 상처 ( 그림 1E -F) 집게와 상처 가장자리에 가깝게 27 게이지 수술 바늘의 팁과 수의 조직 접착제를 적용 하 여.
4. 공동으로 행 한 근육 변성 유발 및 중생을 근육 Myotoxin 주사
- MIME 후 호스트 근육에 광범위 한 근육 섬유 손상 유도 호스트 따 근육 1.2% BaCl 2 (myotoxin)의 50-60 µ L 주입 및 기증자 조직 안에서 포함 된 15.
- 주사 BaCl 2 호스트 조교의 길이 따라 3 사이트
- 근육 (근, 중, 말 초-3 분의 1 근육 배).
참고: 재생 16 다음 공동된 근육 섬유 손상 유도 골격 근육에 주입 BaCl 2, cardiotoxins 및 notexin 같은 myotoxins.
5. 포스트 절차 동물 관리
- 후 MIME 및 BaCl 2 주입, 호스트 마우스 청소 ' s 왼쪽된 뒷 다리 에탄올과 다리와 피부를 보호 하기 위해 석유 젤리의 얇은 레이어를 적용.
- 절차 후 피부 관리, 후 코 콘에서 호스트 마우스 제거.
- 침구 없이 독방 복구에 마우스를 놓습니다. 등온선 젤 난방 패드를 통해 회복 동물에 열 지원 복구 장의 절반 아래 배치 제공.
참고: 하나의 절반은 하지 필요한 경우 그 동물 난방 패드에서 이동할 수 있도록가 열. - 호스트 마우스는 완전히 마 취에서 회복 후에 그것의 원래 감 금 소 동물을 반환 합니다. 동물 시설에 두고 동물 다시 후속 실험 수행 됩니다 때까지. 후속 준비 될 때까지 호스트 마우스를 매일 모니터링 – 예: 3 또는 14 일 후 MIME에. MIME, 다음 동물 모니터링 됩니다 실험실 직원에 의해 뿐만 아니라 수의 직원에 의해 –이 주로 동물, 경고 밝고 반응; 경우 평가 포함 또한 동물 고통의 명백한 조짐을 보이고 있다 또는 어려움을 이동, 먹이, 음주 및 정리는 데 평가.
6. 조직 컬렉션
- 수확 호스트 근육
- 경부 전위와 thoracotomy 의료 산소 (에 의해 구동 탁상 isoflurane 기화에 의해 관리 하는 일반적인 마 취하에 수행 하 여 호스트 마우스를 안락사 흡입된 isoflurane; 효과 2-5%). 탐정 IACUC 승인 전에 안락사. 전신 마 취 아래 수확 따 근육에 소재한
- 호스트 따 근육에 액세스 하려면를 사용 하 여 수술가 위 다리의 앞쪽 표면에 피부를 열고. 앞쪽 다리에 따 근육을 찾아 원심 힘 줄을 잘라, 근육을 반영 하 고 근 위 근육 첨부 파일 (섹션 2.1 참조) 잘라.
- 수집 (실험) 왼쪽 및 오른쪽 (제어) TA 근육.
- 얼어 수확된 근육 스냅
- 배치 하 여 수확된 근육 무게에 종이 무게와 규모를 무게.
- 간단히 근육 cryoprotection의 미네랄 오일에 찍어. 초과 석유 얼룩. 알루미늄 호 일, 그리고 스냅에
- 장소 근육 빠르게는 Dewar에 채워진 액체 질소에 그들을 immersing 하 여 근육을 고정 합니다. 레이블이 지정 된 cryovials을 샘플을 전송 하 고 나중 연구-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.
7. 조직학 연구
- Cryosectioning 근육 조직을 직렬 횡단면 수집
- 액체 질소를 포함 하는 Dewar에 그들을 배치 하 여 한 cryostat 샘플-80 ° C 냉동 고에서 전송.
- Cryostat에서 한 번에 하나의 샘플을 처리. 차가운 면도기 블레이드 (블레이드 cryostat에 저장)의 경우, 두 번 근육은 약 1-2 m m 두께의 세그먼트를 생산 하기 위해 TA 근육의 중간 배꼽에서 샘플을 잘라. Cryostat 섹션을 만들기 위한이 세그먼트를 유지 하 고 그것의 cryovial를 근육의 나머지 부분을 반환.
- 최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 동결, cryostat 견본 디스크에 조직의 두꺼운 세그먼트 확보. 견본 홀더에 견본 디스크를 놓습니다.
- 거친 얼굴 20 µ m 섹션 절단 샘플. Cryostat 섹션에 대 한 유리 슬라이드에 몇 가지 20 µ m 섹션을 수집.
- 20 µ m 섹션의 품질은 만족 하는 경우 5 µ m 절단 두께 변경 하 고 품질을 평가 하기 위해 몇 가지 섹션을 수집 합니다. 5 µ m 섹션 품질에 만족 하는 경우 직렬 섹션을 수집 합니다. 슬라이드 당 2-3 섹션을 수집 하 고 수집 3 슬라이드에 대 한 충분 한 섹션.
- 실험 (왼쪽)와 각 동물의 컨트롤 (오른쪽) TA 근육에서 섹션을 수집.
- GFP 공부 식
참고: 근육 섬유에 GFP 식 공부 준비 슬라이드 (섹션 7.1)의 1 세트를 지정. - 섹션에 반대로 퇴색 매체의 ~ 50 µ L을 적용 하 고 유리 coverslip 적용. 투명 매니큐어로 coverslip 가장자리를 밀봉.
- 빛과 형광 현미경을 사용 하 여 (재료의 표 참조) 10 배 목표와 GFP를 시각화에 대 한 적절 한 필터 섹션을 공부.
- 수집
- 디지털 (~ 15)의 이미지 따 근육의 전체 횡단면을 충당 하기 위해 시각 필드를 중복. 형광에서 현미경에 위상 대비 모드로 전환 하 여 각 visual 필드에 대 한 위상 대비 이미지 수집.
- . 각 섬유에 대 한 % 최대 GFP 강도 최대 GFP 강도 의해 각 섬유에 대 한 말은 개화 강도 나누어 100을 곱한 계산 합니다. 그림 3E와 같이 각 타 근육에 GFP 분석의 결과 집계.
참고: 슬라이드 준비, 위, 근육 섬유에 desmin 라벨 연구의 1 세트를 지정 합니다. 10 분에 대 한 PBS에 2 %paraformaldehyde
- 수정 섹션 세척 3 회 PBS 가진 섹션.
주의: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) 착용 paraformaldehyde 처리할 때 처리 될 때. - 블록 섹션 3% 소 혈 청 알 부 민 0.01%를 포함 하는 PBS에 희석 30 분 트리톤 X100. 이 차단 솔루션으로 향후 불린다 기본 희석제.
- 기본 희석 액 (1: 200)에서 토끼 안티 desmin 면역 글로불린 G (IgG) 희석.
- 완료 되 면 차단 섹션에 희석된 주 항 체를 적용 하 고 품 어 하룻밤 ~ 4 ° C. 세척에 냉장고에서 한 번 섹션 (5 분) 0.1%를 포함 하는 PBS와 트라이 톤 X-100. 이 솔루션 첫 번째 워시 버퍼 향후 불린다.
- 세척 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (5 분).
- 준비 안티 염소를 diluting 하 여 이차 항 체 IgG (빨간색 형광 염료를 활용) 0.01%를 포함 하는 PBS에 토끼 트라이 톤 X-100.
- 섹션에 희석된 이차 항 체를 적용 하 고 60 분에 대 한 실 온 (~ 23 ° C)에서 품 어
- 씻어 첫 번째 워시 버퍼 섹션 한 번 (5 분). 씻어 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (5 분).
- 적용 DAPI 3 분 세척 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (1 분). 적용 ~ 섹션에 반대로 퇴색 매체의 50 µ L 유리 coverslip 적용. 투명 매니큐어로 coverslip 가장자리를 밀봉.
- 빛과 형광 현미경을 사용 하 여 (참조 테이블의 자료), 연구 직렬 섹션 10 배 목표 및 시각화에 대 한 적절 한 필터를 빨간색 형광 염료.
- 따 근육의 전체 횡단면을 충당 하기 위해 겹치는 시각 필드의 디지털 이미지 (~ 15)를 수집 합니다. DAPI 적절 한 필터 설정으로 전환 하 여 각 visual 필드에 대 한 라벨의 형광 이미지 수집.
- 오픈 단계 7.2.3-7.2.4에에서 설명 된 대로 적절 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 하 고.
참고: 이미지를 식별 하 고, 어떤 근육 섬유 손상된 (desmin 부정적인)는, 연구는 근육 섬유는 중앙 nucleation (desmin 긍정적인 섬유 DAPI 표시 된 핵 내부 보다는 주변 위치를 있는), 그리고, 섹션의 영역 염증 또는 섬유 증 (와 많은 DAPI 표시 된 핵을가지고 하지만 근육 섬유 없는 분야).
Representative Results
3 일 후 MIME에서 기증자는 MIME에 의해 이식 EDL 호스트 따 근육 격실 (그림 2A-C) 안에 포함 되어 있습니다. 예상 했던 대로, 형광 광학 사사 기증자 쥐에서 TA 근육의 횡단면, GFP (그림 2D)를 표현 하지 않습니다 그들은 때문에 녹색 형광 표시 되지 않습니다. 반면, 기증자 조직으로 이식 하지 호스트 마우스에서 TA 근육의 횡단면 섬유 익스프레스 GFP (그림 2E)으로 따 근육 섬유에 균일 한 녹색 형광 표시. MIME에 의해 기증자 근육 조직으로 이식 하는 근육의 횡단면에서 호스트 근육 섬유 (GFP +)와 기증자 근육 섬유 (GFP-) 사이 경계 설정의 선이 있다. 그림 2D-F 에 표시 된 시각 필드의 위상 대비 이미지 그림 2E제공 됩니다 '-F' 고 근육 섬유는 지역에는 실제로 아무 GFP는 신호입니다.
14 일 후 MIME 및 BaCl2 주입, 직렬 크로스 섹션의 TA 근육 남아 있는 레이블 없음 또는 desmin (그림 3)에 항 체와 함께 표시를 공부 함으로써 우리가 배울 GFP 신호에 모든 근육 섬유에 의해 표현 된다는 호스트 마우스에서 하지만 (빨간색 desmin 라벨 감지 가능한 근육 섬유) MIME 처리 근육 치료 근육. MIME 및 BaCl2 주입으로 치료 호스트 따 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis 감지 GFP 신호를 보여 주는 많은 desmin(+) 근육 섬유의 존재에서 분명 하다 (그림 3C-D, 3 C' -D'). 호스트 및 기증자 조직적 셀의 가능성이 융합에서 발생 하는 공상 근육 섬유는 GFP 형광이이 섬유에 의해 전시의 적당 한 수준 낮은 의해 감지할 수 있습니다. 수많은 공상 섬유 기증자 SCs는 호스트 근육의 epimysium 내에서 미크론의 몇몇 수백을 마이그레이션할 수 있는 제안 따 근육의 전체 직경에 걸쳐 나타납니다. GFP + 섬유의 정량 그림 3E에 표시 됩니다. 그림 4 는 전체 MIME + BaCl2 치료 따 근육의 직렬 횡단면의 고배율 이미지를 보여준다.
그림 1 . 단계에 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME) 관련된.
MIME은 전신 마 취하에 수행 됩니다. 그것은 벨 솔루션에 기증자 (기증자 마우스 EDL)의 ~ 10 mg을 배치 하 고 (A)그것의 끝에 지도 봉합 매 포함. 18-게이지 바늘 호스트 근육 (B) 의 긴 축을 통해 전달 되 고 기증자 조직 바늘 트랙 (C)를통해 그려집니다. 기증자 조직 호스트 근육 (D)에 포함 된 왼쪽, 지도 봉합은, 자르고 바늘 구멍 조직 접착제로 밀봉 된다 (E). Sealed 바늘 상처 화살표 (F)표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 연구 조교 근육의 MIME 후 3 일.
호스트 근육 수집 MIME; 후 3 일 참고 호스트 TA (화살표;에 바늘 자국 A-B)입니다. 데이터는 임베디드 기증자 마우스 EDL 따 근육 격실 (B-C) 내에서 누렸다는 확인 합니다. TA 근육 횡단면 표시 야생-타입 따 근육 (D)에 있는 아무 녹색 형광, 밝은 녹색 형광 NSG GFP 따 근육 (E), 그리고 호스트와 기증자 간의 구별 3 일 NSG GFP 따 근육에 근육의 형광 이미지 -MIME ((F)입니다). D'-f에서 D f에서 시각 필드의 위상 대비 이미지 표시 됩니다 ', 각각. F와 F 패널에 레드 라인 ' 호스트 및 기증자 조직 사이 경계 설정의 라인을 보여줍니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 연구 조교 근육의 MIME 후 14 일.
데이터 수집 후 MIME 제시는 14 일. Desmin의 immunofluorescent 라벨에서 빨간색 신호는 (desmin에 대 한 긍정적인 신호를 myofibers는 가능한 나타냅니다), 파란색 신호 (얼룩 핵), DAPI에서 이며 녹색 신호는 GFP에서. 제어 따 근육 (오른쪽 hindlimb) 예상 대로 호스트 마우스에서 수확, 거의 모든 myofibers는 desmin,이 myofibers는 가능한 제안 (A; 빨간 신호)에 대 한 긍정적 이다. 또한, DAPI 얼룩을 바탕으로, 그것은 분명 그 myonuclei 거의 모든 myofibers의 건강 한 근육 (A; 푸른 신호)에서 예상 되는 것으로, 주변 위치 하 고 있습니다. 컨트롤 따 근육의 직렬 섹션 표시 거의 모든 근육 섬유는 GFP에 대 한 긍정적 다는 것을 암시 하는 밝은 녹색. MIME + BaCl2 -TA 근육 (왼쪽된 hindlimb), 치료 기증자 세포 중재 myogenesis 없음 감지 GFP 형광을 나타내는 많은 desmin(+) 근육 섬유의 존재에서 분명 하다 (C D, C'-D'). 낮은 중간 GFP 형광 (공상 근육 섬유)에 Desmin(+) 근육 섬유는 MIME 따 근육의 epimysium 내에서 마이그레이션할 수 있는 홍보 SCs 기증자를 제공, 제안 전체 따 근육의 직경에 걸쳐 존재 기증자 세포 유래 myogenesis입니다. A'-D' A. 에 파란색 상자 내의 영역의 고배율 이미지 GFP(+) 섬유 및 중앙 nucleated 섬유의 정량 E에 표시 됩니다. 바 규모 = 100 µ m (A-D)와 50 µ m (A'-D'). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
rc="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / >
그림 4 . 광범위 한 피해와 재생의 증거 MIME 및 BaCl2 주입 후 14 일.
높은 확대, 전체 MIME + BaCl2 치료 따 근육의 직렬 횡단면 표시 됩니다. 데이터 표시는 많은 근육 섬유는 온건 하 게 또는 강하게 GFP +가 위치한 핵 (A-B; 레드 a에서 신호 desmin에서, A에서 파란 신호, DAPI에서 이며 b에서 녹색 신호는 GFP에서). 이 데이터는 것이 좋습니다 그 변성 및 재생 후 BaCl2 주입이 GFP 식 영향을 주지 않습니다. 이러한 맥락에서 MIME + BaCl2 치료 따 근육, 아니 작은 GFP 식, 중앙 nucleated 근육 섬유의 존재 제안 이러한 섬유는 myogenesis (또는 재생)의 가능성이 결과에서 상당한 기여를 GFP-조직적 셀입니다. 이러한 관측 더 높은 확대 이미지의 선택 된 필드 (C F;에서 확인하실 수 있습니다. C와 D, 그리고 E와 F, 각각, 직렬 횡단면;에서 지역 겹치며 그 지역에서에서의 위치를 나타내는 이미지 테두리의 색 구분 및 B). 바 규모 = 100 µ m (A-B)와 50 µ m (C-F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기, 우리 호스트 근육 조직으로 기증자 근육 조직을 이식 하 우리의 실험실에서 개발 된 MIME로 알려진 새로운 실험 기법에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 이것은 호스트 근육9,,1017에 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 홍보 효과가 이미 입증 된 기술을 접목 한 오픈 근육의 적응 이다.
MIME의 목표는 (우리가 현재 알 수 없습니다이 발생 합니다) 호스트 근육으로 자체 기증자 근육 조직의 engraftment를 사용 하지만 오히려 SCs myogenesis m를 자극 하는 조건 하에서 호스트 근육에 기여할 수 있는 기증자의 소스를 제공 하기 uscle의 재생 우리의 희망은 MIME을 최적화 하 고 기본 및 전 임상 연구에서 테스트, 후 귀중 한 통찰력을 높이기 조직적 근육 손실을 받은 골격 근육 근육 재생 임상 치료 안내를 제공할 수 있는 그것.
어떻게 MIME 번역 될 수 있는 임상 치료로 예에 관한 답변 아직 수많은 질문이 있다: 어떻게 우리가 기증자 조직의 품질 제어 것? 어떻게 우리 기증자 조직 및 세포의 면역 거부를 제어할 것입니다? 기증자 조직 세포를 제공 하는 myogenesis에 대 한 후 지워지거나 fibrotic 흉터의 뒤에 떠나지 않는? 기증자 및/또는 호스트 근육의 섬유 종류에 기증자 세포 중재 하는 myogenesis 영향을 줍니까? 어떤 근육 MIME에서 실질적으로 혜택을 받을 수 있습니다.? 우리는 현재 우리의 연구 경우 MIME은 안전 하 고 효과적인 평가, 식별 기증자 파생 된 myogenesis를 보강 하 고 위에 나열 된 질문의 많은 답변 수 있는 대체 치료를 확대는.
MIME 마우스 마우스 수용자 이식의 테스트를 완료 한 후 우리의 다음 단계는 싱가포르로 근육 조직의 조직적 잠재력을 평가 하기 위해 싱가포르로 인간 조직으로 인간 마우스 MIME을 수행 하는. 우리는 이러한 실험 사업 교육을 위한 몸 유 증 프로그램 등 장기 기증에 대 한 생명의 선물 프로그램에에서 등록 된 기증자 로부터 근육 조직에 관련 된 기초 및 변환 연구의 새로운 라인으로 이어질 것입니다 기대 .
이 원고는 대표적인 데이터 MIME 후 14 일에는 여러 가능한 myofibers GFP 부족 하거나 GFP의 낮은 수준을는 것이 좋습니다. 이러한 데이터의 우리의 해석은 GFP 기증자 위성 세포 myogenesis 호스트 근육에서에 기여입니다. 우리는 호스트 마우스 근육으로 인간의 시체 조직의 이식에 대 한 준비에이 실험을 수행. 유용한 표현 (예:GFP에서 쉽게 구별 될 수 있다, 형광 기자 기증자 조직 이식 기증자 위성 세포 myogenesis MIME 다음 호스트 근육에 기여할 명백 하 게 입증, 일 것 이다 빨간 형광 단백질 GFP + 호스트 근육에 이식 기증자 조직 표현).
이 기술은 주로 SCs 기증자 조직에 존재의 본질에 의해 제한 됩니다. 기증자 조직에 SCs 가능한 기술은 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 촉진 것입니다 있다면, 있다면 그들은 가능한, myogenesis 발생할 수 없습니다 동안. 그러나, SCs 아주 탄력 있기 때문에 약 2 주 사후에 대 한 가능한, 그것은 매우 실험적인 목적을 위해 수확 후 몇 분 이내에 이식 기증자 조직 기증자 세포 중재 하는 myogenesis13 촉진 한다 . 또한, 위의 언급, 그것은 섬유 증이 발생할 수 있습니다 호스트 근육에 포함 된 전체 근육 조직 (SCs, 성숙한 근육 섬유 뿐만 아니라 근육 상주 fibroblasts 포함) 된 이후 가능 합니다. 그러나,이 가정은 실험적으로 시험 될 필요가 있다. 유해한 수축, cryoinjury, 그리고 실험 myotoxins에서 발생 하는 근육 손상에 문학 제안 면역 세포 (주로 대 식 세포)는 효과적으로 손상 된 섬유에서 세포질 파편을 삭제 하 고 개장 수는 세포 외 기질18. 따라서,는 MIME 및 BaCl2 주입 후 호스트 면역 세포가 악화 기증자 근육 섬유에 대 한 액세스로 그들은 수 분명 파편, 기증자 SCs 그냥 뒤에 남겨두고이 가능 하다. 마지막으로, 기증자 파생 된 myogenesis의 기증자 근육 조직의 호스트 근육에 포함 되는 금액에 따라 달라 집니다. 기증자 세포 유래 myofibers에 의해 완전히 채워야 하 호스트 근육 구획에 대 한 순서, 그것은 방법 같은 X-또는 감마-방사선 호스트 근육 SCs ablate 반복된 MIME 절차 필요 필요 합니다.
그것은 수술 호스트 근육을 노출 하 고 호스트 근육에 기증자 조직의 조각을 봉합 기증자 세포 중재 하는 myogenesis9,,1017을 촉진할 수 있다 시연 하고있다. Myogenesis의 진행을 추적 하 고 인간의 근육 질병 마우스 모델을 생성 하이 오픈 수술 방법은 과거에 사용 되었습니다. MIME 기술의 혁신적인 측면은 그것은 최소한 침략 적 수술 호스트 근육 노출은 포함 되지 않습니다. 이 의원 성 감염 및 호스트 동물, 따라서 더 필요한 경우 동일한 호스트 근육에 MIME를 반복적으로 수행 가능한 만들기에 불편의 정도의 위험을 줄여줍니다.
우리는 MIME 기술은 호스트 마우스에 기증자 근육 조직 이식 다음에 현재 오픈 수술 접근법에 적합 한 상세 것 예상. 인간 답게 된 마우스 모델의 생성을 신속 하 게 호스트 마우스 근육에 biopsied 인간의 근육을 포함 하 여 수이. 또한, 우리는 MIME로 기증자 SCs 가능한 인간 시체 기증자 조직에서 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 달성에 효과적일 것입니다 예상 마우스 마우스 접목에서 우리의 예비 데이터를 바탕으로. 마지막으로, 추가 테스트 및 유효성 검사, 우리 MIME 기술은 근육 질병 인간에서 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 치료법을 개발 도움이 되기를 바랍니다.
MIME 기술의 성공을 비판적으로 정확 하 게 호스트 근육의 fascial 격실 (epimysium) 내에서 기증자 조직 포함 따라 달라 집니다. 기증자 조직 호스트 근육 구획 내에 배치 하는 경우에 그것은 정확한 방식으로 호스트 근육에 SCs를 제공할 수 있게 됩니다. 기증자 조직 호스트 근육 이외의 경우, 그것은 어떤의 운명을 것으로 분명입니다. MIME에 대 한 우리의 실험 모델을 사용 하 여 TA 근육 호스트 근육으로 그것 때문에 유명 하 고 피상적으로 다리의 anterolateral 양상에 배치. 크기, 방향 및 TA 근육의 해부학 적 위치 쉽게 기증자 조직 배치 되도록 올바르게 호스트 따 근육 내에서 MIME 후 확인. 이 종이에 우리는 실험적 증거를 제공 하는 다시 기증자 조직메인 호스트 3 일 후 MIME에서 TA 근육 그리고에 거기 포함 14 일 이후 MIME에서 호스트 근육에 기증자 세포 중재 하는 myogenesis입니다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
이 작품이 되었습니다 조종사 교부 금에 의해 동맹에서 재생 재활 연구 및 교육 (AR3T)와 교수 시작 패키지에 대 한 웨인 주립 대학에서 병을. AR3T 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 아동 건강 및 인간 발달 (NICHD), 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 (NINDS), 그리고 생물 의학 이미징의 국가 연구소 고 바이오 (NIBIB에 의해 지원 됩니다. )의 수상 번호 P2CHD086843에서 건강의 국가 학회. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
| Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| 4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
| VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
| Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
| Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
| Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
- Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
- Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
- Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
- Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
- Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
- Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).
