Summary
Vi beskriver en ny experimentell teknik som vi kallar minimalt invasiva muskel inbäddning (MIME), som bygger på bevis att skelettmuskulaturen vävnad innehåller viabla myogenic celler som kan underlätta givare-cell-medierad myogenesis när implanteras i en värd muskel.
Abstract
Skelettmuskulaturen äger regenerativ kapacitet på grund av vävnad-resident, muskel fiber-genererar (myogenic) satellit celler (SCs), som kan bilda nya muskelfibrer under rätt förutsättningar. Även om SCs kan skördas från muskelvävnad och odlade i vitro, är resulterande gorgina cellerna inte mycket effektiva för att främja myogenesis när transplanterade i värd muskel. Kirurgiskt utsätta värd muskeln och ympning segment av givare muskelvävnad eller isolerade muskelfibrerna med deras SCs på värd muskel, främjar bättre myogenesis jämfört med gorgina transplantation. Vi har utvecklat en ny teknik som vi kallar minimalt invasiva muskel inbäddning (MIME). MIME innebär passerar en kirurgisk nål genom värd muskeln, rita en bit givare muskelvävnad genom nålen spår och sedan lämnar givaren vävnaden inbäddade i värd muskeln så att den kan fungera som en källa till SCs för värd muskel. Här beskriver vi i detalj stegen involverade i att utföra MIME i ett nedsatt immunförsvar musmodell som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP) i alla dess celler. Immunbrist i värd musen minskar risken för immun avstötning av givarens vävnad och god Jordbrukarsed uttryck gör lätt identifiering av värd muskelfibrer (GFP +) och givare-cell-derived muskelfibrer (GFP-). Vår pilot data tyder på att MIME kan användas att implantera en extensor digitorum longus (EDL) muskel från en donator mus i tibialis anterior (TA) muskeln värd musklick. Våra data tyder också på att när ett myotoxin (bariumklorid, BaCl2) injiceras i värd muskeln efter MIME, finns det bevis för givare-cell-derived myogenesis i värd muskeln, med cirka 5%, 26%, 26% 43% av fibrerna i en enda värd TA muskel visar ingen värd bidrag, minimal värd bidrag, måttlig värd bidrag och maximal värd bidrag, respektive.
Introduction
Friska skelettmuskulatur, även om efter mitotiska, äger utmärkta regenerativ kapacitet på grund av vävnad boförälder myogenic celler som kallas satellit celler (SCs)1,2; och recenserade i3,4. Dock under patologiska tillstånd som orsakas av muskeldystrofier, trauma eller påskyndat åldrande, muskel förnyelse kan inte hänga med muskelnedbrytning, och således, progressiv muskel fiber förlust uppstår5. Även om effektiva metoder har utvecklats för att isolera SCs från muskel och utöka dem i kulturen att generera stora mängder myoblasts (och senare myotubes), har försök att generera fysiologiskt relevanta antal muskelfibrer i värd muskel gav endast minimal framgång6. Som med många andra celltyper, när myoblasts injiceras ensam värd vävnad, de flesta av cellerna inte engraft7,8. Vi har visat att neuromuskulär elektrisk stimulering (NMES) underlättar givare-cell-derived myogenesis i regenerering-brist värd mus muskel som injicerades med mänskliga myoblasts8. Andra har visat att kirurgiskt ympning biopsier muskel- eller enda muskelfibrer med bifogade SCs, underlätta måttlig myogenesis även utan NMES, vilket tyder på att implantera hela muskelfibrer med SCs kan vara fördelaktigare än implantation Myogenic celler ensam9,10. Eftersom givaren eller konstruerade muskelvävnad ympade in värd muskeln ger bättre resultat än transplantation celler ensam, är det möjligt att vävnad eller vävnad strukturer kan ge viktiga ledtrådar för givare-cells engraftment; ett begrepp som blir allt mer uppenbart i cellterapi studier med olika cell typer10,11,12.
Senaste data tyder på att SCs erhållits från människor mer än 2 veckor efter slakt genererar myotubes kultur13. Vi har därför för avsikt att bedöma om implantation av muskel vävnad som skördas efter slakt till en levande värd kommer att vända muskel fiber förlust. Vi har utvecklat en ny teknik som kallas MIME för att implantatet givare muskelvävnad i skelettmuskulaturen vävnad i en levande värd för att främja givare-cell-derived myogenesis. MIME innebär passerar en kirurgisk nål genom värd muskeln att skapa en nål spår; Rita ett litet segment av givare muskelvävnad genom nålen spår; lämnar givaren vävnaden inbäddade i värd muskeln; och utgående nål hålen med vävnad tejp. Efter att öva tekniken i euthanized möss studerat i andra experiment, vi har nu utfört MIME i levande möss som är nedsatt immunförsvar ubiquitously express ett grönt fluorescerande protein (GFP) och uppföljning på 3 och 14 dagar efter MIME. På 3 dagar efter MIME bekräftar vi att givaren mus (GFP-) EDL muskel implanteras i värd mus (GFP +) TA muskel, förblir inbäddad i värd muskeln. På 14 dagar efter MIME, bekräftar efter BaCl2 myotoxin skada inducerar skador och myogenesis, vi att cirka 5% och 26%, 26% 43% av fibrerna i en enda värd TA muskel visar ingen värd bidrag, minimal värd bidrag, måttlig värd bidrag, och maximal hysa bidrag, respektive. Centrala kärnbildning (en markör för degeneration och efterföljande regeneration) ses hos cirka 95% av TA muskelfibrer efter MIME och myotoxin injektion.
Vi studerar TA muskler 14 dagar efter MIME + BaCl2 eftersom denna tidpunkt fångar det mellanliggande skedet av förnyelse, när en majoritet av den regenererade fibrer är centralt nucleated. Vi studera GFP + möss som värdar för MIME, så att när vi så småningom transplantera mänskliga avlidna muskel till värd möss, vi kommer att kunna enkelt skilja muskelfibrer av värd- och givare ursprung. Vi använder musen EDL muskel som experimentella givarens vävnad, eftersom enda fibrer från denna muskel har visat större myogenic potential än TA muskler9. EDL muskeln är också synergistisk till TA muskeln och har liknande fiber-typ sammansättning. Våra preliminära data tyder på att MIME är kan underlätta givare-cell-derived myogenesis i värd muskeln.
Protocol
alla studier med levande djur är godkända av den Institution djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Wayne State University i Detroit, Michigan, USA, och är förenliga med guiden för skötsel och användning av försöksdjur ( 8: e upplagan, 2011, utgiven av National Academies Press, 500 femte gatan, NW, Lockbox 285, Washington, DC 20055, USA). Enligt de godkända IACUC protokoll utfördes förfaranden som inbegriper smärta eller lidande under narkos, som är inducerad och underhålls av isofluran inandning (1,5-5% till effekt). Anestesi har verifierats med bristande uttag till tå nypa och bristande palpebrala eller vibrissae svaren (procentandelen av isofluran ökades som behövs för att behålla effekt). Minimalt invasiva pågrund av protokollen, en " sterila tips " teknik följdes. Medan djur var under narkos, tillämpades vaselin på ögonen för att förebygga torrhet. Inga särskilda behandlingar krävdes; dock lämnades kost gel till djuren under 24 h efter förfaranden som involverade allmän anestesi. prövaren är godkänd av IACUC att undanhålla analgesi efter MIME, eftersom förfarandet inte innebär kirurgiskt utsätta värden muskel, eftersom den är begränsad till ena bakbenet och påverkar inte normal funktion, och eftersom många vanliga smärtstillande läkemedel är kända att påverka normal muskel förnyelse.
1. Djurmodeller
- värd möss för MIME
- användning NSG-GFP möss (8-10 vecka, manliga) som värdar för muskel grafter studier.
Obs: Dessa möss är perfekta värdar för allogen muskel grafter eftersom de saknar mogna T- och B-lymfocyter och funktionella naturliga mördarceller, är bristfällig i cytokin signalering och har använts av andra för allografting eller xenografting icke-muskelceller < sup Class = ”xref” > 14. Allestädes närvarande GFP uttryck gör för enkel identifiering av värd (GFP +) och givare-cell-derived (GFP-)-muskelfibrer.
- användning NSG-GFP möss (8-10 vecka, manliga) som värdar för muskel grafter studier.
- Givare möss för MIME
- användning C57BL/6J möss (12-16 vecka) som givare möss.
Obs: Dessa möss är lämplig donator möss eftersom de har en fullt mappade genomet, är inte kända för att ha någon skelettmuskulaturen patologi, är lätt tillgängliga och ekonomiskt och inte uttrycker GFP.
- användning C57BL/6J möss (12-16 vecka) som givare möss.
2. Förbereda givare muskelvävnad
- knyta vägledande suturer och skörd givare EDL muskler
- Euthanize givare möss av cervikal dislokation och torakotomi utförs under narkos som administreras av en bordsskiva isofluran vaporizer drivs av medicinsk oxygen (inhalerad isofluran; 2-5% till effekt).
- Tillgång till EDL musklerna, använda ett par kirurgisk sax för att öppna huden över den främre ytan av benet. Leta upp TA muskeln i det främre benet och ta bort den för att visualisera EDL muskeln som ligger bakom TA muskeln. Skjut spetsen av ett par pincett bakom EDL muskeln och tillämpa mild dragkraft för att se om tårna utöka (detta bekräftar att muskeln är EDL).
Obs: givarområdet vävnad bör opereras, aseptiskt prepped förväg att skörda. - Användning ~ 10 cm segment 4-0 silk, flätad, sterila och icke-resorberbara suturer och göra två dubbla knutar att tillämpa de vägledande suturerna på proximala och distala senor av EDL muskeln. ( figur 1A).
- Skär distala EDL senan, återspeglar EDL muskeln och skär proximala senan.
- Plats givaren EDL muskler i en petriskål fylld med musen ringsignalen lösning.
3. Förbereda värd möss för MIME
- anestesi
- Placera värd musen under narkos (inhalerad isofluran; 1,5-5% till effekt) administreras av en bordsskiva isofluran vaporizer drivs av medicinsk syrgas.
- Inducerar anestesi i en induktion kammare och sedan överföra musen till en näsa-kon att upprätthålla anestesi medan du utför andra förfaranden på djuret. Stödja en isotermiska gel värmedyna medan djuret är under narkos termisk.
- Huden förberedelse
- ta bort djuret ' s päls, applicera en hårborttagningsprodukter kräm över den främre delen av den vänstra bakben. Höger ben fungerar som en kontroll ben för efterföljande förfaranden.
- Lämna hårborttagningsprodukter krämen på för 2 min. rena off hårborttagningsprodukter krämen tillsammans med de fristående päls med våtservetter indränkt i fosfat buffrad saltlösning (PBS). Efter borttagning av päls, skrubba huden med tre alternerande våtservetter povidonjod skurande lösningen och 70% etanol.
- Skapa en nål spår i värd TA muskeln
- passera en 18 gauge (1 i lång) kirurgiska nålen genom mitten av värden TA muskler längs muskeln ' s långa axeln ( figur 1B). Passera nålen i cephalo-kaudala riktning, längs längden av TA muskeln, och genom centrum av muskeln magen ( figur 1B).
Obs: Syftet med detta steg är att skapa en nål spår, som en bit av givare muskel kan vara inbäddade. Bädda in givaren vävnaden i mitten av TA muskeln potentiellt skulle tillåta SCs från givare vävnaden att migrera och underlätta myogenesis över hela värden TA muskel.
- passera en 18 gauge (1 i lång) kirurgiska nålen genom mitten av värden TA muskler längs muskeln ' s långa axeln ( figur 1B). Passera nålen i cephalo-kaudala riktning, längs längden av TA muskeln, och genom centrum av muskeln magen ( figur 1B).
- Inbäddning givarens vävnad i nålen spåret i mottagande TA muskel
- när kirurgiska nålen är inom mottagande TA muskel, passera de vägledande suturerna i ena änden av givarens vävnad genom lumen av kirurgiska nål i en caudo-cefaliska riktning ( figur 1 c).
- Dra givaren vävnaden genom nålen spår som kanylen dras tillbaka från värd TA muskeln i en caudo-cefaliska riktning.
- Använd vägledande suturerna i stjärtfenan och cefaliska ändarna av givarens vävnad för att justera placeringen av givaren vävnaden. Säkerställa att givare vävnaden är förskansat sig inom mottagande TA muskel ( figur 1 d).
- När givaren vävnad placeringen optimeras, avskurna vägledande suturerna, göra eventuella slutjusteringar till givarens vävnad placering med spetsig pincett.
- Tätning kutan nål sår ( figur 1E -F) genom att tillnärma såret kanten med pincett och tillämpa veterinärmedicinska vävnad lim med en 27-gauge kirurgiska nålspetsen.
4. Myotoxin injektion att inducera samordnade muskel Degeneration och Regeneration
- efter MIME, injicera den mottagande TA muskel att framkalla omfattande muskelfiber skador i värd muskeln 50-60 µL av 1,2% BaCl 2 (myotoxin) och givarens vävnad som är inbäddad i det 15.
- Injicera BaCl 2 på 3 platser längs längden av mottagande TA muskel (proximala, mitten och distala tredjedelen av muskeln magen).
Obs: Injicera myotoxins som BaCl 2, cardiotoxins och notexin i skelettmuskulaturen inducerar samordnade muskelfiber skada följt av regenerering 16.
- Injicera BaCl 2 på 3 platser längs längden av mottagande TA muskel (proximala, mitten och distala tredjedelen av muskeln magen).
5. Efter ingrepp djur hand
- efter MIME och BaCl 2 injektion, ren värd musen ' s vänster hind ben med etanol och applicera ett tunt lager vaselin att skydda huden.
- Efter efter ingrepp hudvård, ta bort värd musen från näsan konen.
- Placera musen i en enslig återhämtning bur utan sängkläder. Ger termiska stöd till återvinna djur genom en isotermiska gel värmedyna placeras under hälften av återhämtning buren.
Obs: En hälften är inte uppvärmd så att djur kan frångå värmedyna om behövs. - Efter värd musen har helt återhämtat sig från anestesi, tillbaka djuret till sin ursprungliga bur. Placera djur baksida i djuranläggningen tills uppföljande experiment utförs. Övervaka värd musen dagligen tills den är redo för uppföljning – exempel: vid 3 eller 14 dagar efter MIME. Efter MIME, djur övervakas av laboratoriepersonal samt av veterinärpersonal – detta innebär huvudsakligen att bedöma om djur är ljusa, alert och lyhörd; och också bedöma om djur visar uppenbara tecken på smärta eller har svårt att flytta, utfodring, dricka och grooming.
6. Vävnaden samling
- skörd värd muskel
- Euthanize värd möss av cervikal dislokation och torakotomi utförs under narkos som administreras av en bordsskiva isofluran vaporizer drivs av medicinsk oxygen ( inhalerade isofluran; 2-5% till effekt). prövaren har också IACUC godkännande till skörd TA muskler under narkos innan eutanasi.
- för att komma åt värd TA musklerna, använda ett par kirurgisk sax för att öppna huden över den främre ytan av benet. Leta upp TA muskeln i det främre benet, skär den distala senan, återspeglar muskeln och skär proximala muskel bilagor (se avsnitt 2.1).
- Samla både vänster (experimentell) och höger (kontroll) TA muskler.
- Snap frysning skördade muskler
- väger skördade musklerna genom att placera på väga papper och våg.
- Doppa kort musklerna i mineralolja för cryoprotection. Torka bort överflödig olja.
- Plats musklerna på aluminiumfolie och snap frysa musklerna genom snabbt doppa dem i flytande kväve fylld i en Dewar. Överföra proverna till märkta cryovials och förvaras proverna i-80 ° C frys för senare studier.
7. Histologiska studier
- kryosnitt muskelvävnad att samla seriell tvärsnitt
- överföra proverna från-80 ° C frysen till en kryostat genom att placera dem i en Dewar som innehåller flytande kväve.
- i kryostaten, hantera ett prov i taget. Med ett kallt rakblad (blad lagras i kryostaten), skära provet två gånger vid mitten av magen av TA muskeln att producera ett segment av muskler som är ca 1-2 mm tjock. Hålla detta segment för att göra avsnitten kryostaten och tillbaka de återstående delarna av muskeln till dess cryovial.
- Med optimal styckning temperaturen (ULT) frysning förening, säkra segmentet tjock vävnad på ett kryostaten objektbrickan. Placera Preparatskivan på preparathållaren.
- Grov-face provet av skära 20 µm sektioner. Samla några 20 µm sektioner på glasskivor för avsnitten kryostaten.
- Om kvaliteten på avsnitten 20 µm är tillfredsställande, ändra tjockleken skärning till 5 µm och samla några avsnitt för att bedöma kvaliteten. Om avsnitten 5 µm är tillfredsställande i kvalitet, samla seriell avsnitt. Samla 2-3 sektioner per bild och samla tillräckligt sektioner för 3 rutschkanor.
- Samla sektioner från både experimentella (vänster) och kontroll (höger) TA muskler varje djurs.
- Studera GFP uttryck
Obs: utse en uppsättning förberedda bilder (avsnitt 7.1) att studera GFP uttryck i muskelfibrerna.- Applicera ~ 50 µL anti fade medium på sektioner och applicera ett täckglas. Försegla täckglas kanterna med genomskinligt nagellack.
- Använda ljus och fluorescerande mikroskopet (se Tabell för material), studera avsnitten med en 10 X mål och ett lämpligt filter för att visualisera GFP.
- Samla digitala bilder (~ 15) av överlappande synfält för att täcka hela tvärsnittet av TA muskeln. Samla in fas kontrast bilderna för varje visual fält genom att byta från fluorescens till fas kontrast på mikroskopet.
- Öppna bilder med en lämplig bildhanteringsprogram som kan kakel enskilda bilder för att producera en enda sammansatt bild; t.ex., Använd den " photomerge " alternativ under Arkiv-menyn i avbildningsprogrammet som förtecknas i Tabell i material.
- Öppna GFP fluorescens bilderna med en lämplig bild analys programvara (t.ex., ImageJ). Cirkel enskilda muskelfibrer med hjälp av den " ROI-verktyg " och registrera fluorescensintensiteten menar för varje fiber.
- Beräkna maximal GFP (fluorescens) intensiteten genom att ta medelvärdet av menar fluorescensintensiteten hos 10 fibrer som visar hög GFP uttryck och har normal morfologi. Beräkna % maximal GFP intensitet för varje fiber av divideras GFP maximalstyrkan menar flourescens intensiteten för varje fiber och multiplicera med 100. TABULERA resultaten av GFP analysen för varje TA muskel som visas i figur 3E.
- Studerar muskelfiber integritet och myonuclear läge av Immunofluorescerande märkning av desmin och 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), respektive.
Obs: Utse en uppsättning bilder som ovan, beredd att studera av desmin märkning i muskelfibrerna.- Fix sektioner med 2% PARAFORMALDEHYD i PBS för 10 min. tvätta i avsnitt tre gånger med PBS.
FÖRSIKTIGHET: Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering vid hantering av PARAFORMALDEHYD. - Block sektioner med 3% bovint serumalbumin utspätt i PBS som innehåller 0,01% Triton-X100 för 30 min. Denna blockering lösning är härefter hänvisad till som primära spädningsvätskan.
- Späd den kanin anti-desmin immunglobulin G (IgG) i den primära spädningsvätskan (1: 200).
- Efter blockering är klar, applicera de utspädda primära antikropparna på sektioner och inkubera över natten i kylskåp vid ~ 4 ° C. Tvätta avsnitten en gång (5 min) med PBS som innehåller 0,1% Triton x-100. Denna lösning är härefter hänvisad till som den första tvättbufferten.
- Tvätta avsnitten 3 gånger (5 min per tvätt) med PBS.
- Förbereda den sekundära antikroppen genom att späda ut get anti kanin IgG (konjugerat till rött fluorescerande färgämne) i PBS som innehåller 0,01% Triton x-100.
- Applicera den utspädda sekundär antikroppen på avsnitten och inkubera vid rumstemperatur (~ 23 ° C) för 60 min.
- Tvätta avsnitten en gång (5 min) med första tvättbuffert. Tvätta i avsnitt 3 gånger (5 min per tvätt) med PBS.
- Tillämpa DAPI för 3 min. Tvätta avsnitten 3 gånger (1 min per tvätt) med PBS. Tillämpa ~ 50 µL anti fade mediets på sektioner och applicera täckglas. Försegla täckglas kanterna med genomskinligt nagellack.
- Använda ljus och fluorescerande mikroskopet (se Tabell för material), studien den seriella sektioner med en 10 X mål och ett lämpligt filter för att visualisera röd fluorescerande färgämnen.
- Samla digitala bilder (~ 15) av de överlappande synfält att täcka hela tvärsnittet av TA muskeln. Samla fluorescens bilder av DAPI märkning för varje visual fält genom att byta till lämpliga filterinställningen.
- Öppna och analysera bilderna med en lämplig bildhanteringsprogram som beskrivs i steg 7.2.3 - 7.2.4.
Obs: Studera bilder att identifiera vilka muskelfibrer är skadad (desmin negativa), vilka muskelfibrer har centrala kärnbildning (desmin positiva fibrer som har DAPI-märkt kärnor ligger internt i stället för perifert), och, vilka delar av avsnittet har inflammation eller fibros (områden som har många DAPI-märkt atomkärnor klustrade tillsammans, men saknar muskelfibrer).
- Fix sektioner med 2% PARAFORMALDEHYD i PBS för 10 min. tvätta i avsnitt tre gånger med PBS.
Representative Results
På 3 dagar efter MIME finns givaren EDL som implanteras av MIME inom värd TA muskel facket (figur 2A–C). Som förväntat, tvärsnitt av TA muskeln från givare möss, studerade under fluorescens optik, visar inte grön fluorescens eftersom de inte uttrycker GFP (figur 2D). Däremot visar tvärsnitt av TA muskeln från värd möss som inte implanteras med givarens vävnad, enhetlig grön fluorescens i TA muskelfibrerna, som fibrerna express GFP (figur 2E). I cross delar av musklerna implanteras av MIME med givare muskelvävnad, finns det en fodra av avgränsning mellan värd muskelfibrer (GFP +) och givare muskelfibrer (GFP-). Fas kontrast bilderna av de visuella fält visas i figur 2D–F presenteras i figur 2E'–F' och föreslår att det faktiskt finns muskelfibrer som är närvarande i regionerna där det finns ingen god Jordbrukarsed signalen.
På 14 dagar efter MIME och BaCl2 injektion, genom att studera seriell cross delar av TA muskeln som är kvar omärkt eller är märkta med antikroppar mot desmin (figur 3), vi lär oss att GFP signalen uttrycks av alla muskelfibrer i den obehandlade muskel från värd möss, men inte i MIME-behandlade muskeln (röda desmin märkning upptäcker livskraftig muskelfibrer). I värd TA muskeln behandlas med MIME och BaCl2 injektion, de givare-cell-derived myogenesis framgår av förekomsten av många desmin(+) muskelfibrer som visar ingen påvisbar GFP-signal (figur 3 c–D, 3 C' –D'). Chimära muskelfibrer uppkommer sannolikt fusion av värd- och givare myogenic cellerna kan upptäckas av låga till måttliga halter av GFP fluorescens utställda av dessa fibrer. Talrika chimära fibrer visas över hela diametern av den TA muskel vilket tyder på att givaren SCs klarar av att migrera flera hundratals mikrometer inom epimysium av värd muskeln. Kvantitering av GFP + fibrer visas i figur 3E. Figur 4 visar hög förstoring bilder av seriell tvärsnitt av en hela MIME + BaCl2 behandlade TA muskel.
Figur 1 . Stegen i minimalt invasiva muskel inbäddning (MIME).
MIME är utförs under narkos. Det innebär att placera ~ 10 mg givare muskel (givare mus EDL) i Ringer-lösning och knyta de vägledande suturerna för dess slut (A). En 18 gauge nål leds genom den långa axeln av värd muskeln (B) och givare vävnaden dras genom nålen spår (C). Givarens vävnad bäddas vänster i värd muskeln (D), vägledande suturerna skärs och nål hålen är förseglade med vävnad lim (E). De förseglade nål sår anges med pilar (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Studier av TA muskeln 3 dagar efter MIME.
Värd muskel samlat 3 dagar efter MIME; Obs nål märken på värd TA (pilarna; A-B). Data ytterligare bekräfta att musens inbyggda givare EDL är inbäddad inom TA muskel facket (B-C). Fluorescens bilder av TA muskel tvärsnitt visar ingen grön fluorescens i vildtyp TA muskel (D), ljust grön fluorescens i NSG-GFP TA muskel (E)och en åtskillnad mellan värd och givare muskeln i NSG-GFP TA muskel på 3 dagar efter MIME- (F). Fas kontrast bilderna av de visuella fält i D-F visas i D'-F', respektive. Den röda linjen i paneler F och F' visar fodra av avgränsning mellan värd och givare vävnaden. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . Studier av TA muskel 14 dagar efter MIME.
Uppgifter samlas in 14 dagar efter MIME presenteras. Röd signal är från Immunofluorescerande märkning av desmin (en positiv signal för desmin betecknar att myofibers är livskraftig), blå signalen är från DAPI (fläckar kärnor), och den gröna signalen från GFP. I kontroll TA muskel (högra bakbenet) skördas från värd musen, som förväntat, är nästan alla myofibers positivt för desmin, tyder på att dessa myofibers är livskraftig (A; röd signal). Dessutom, baserat på DAPI färgning, det är uppenbart att myonuclei av nästan alla myofibers är perifert belägna, som kan förväntas i friska muskler (A; blå signal). Seriell avsnitt av kontroll TA muskeln visar att nästan alla muskelfibrer är ljust gröna, vilket innebär att de är positiva för god Jordbrukarsed. I MIME + BaCl2 -behandlade TA muskel (vänstra bakbenet), donator-cell-medierad myogenesis framgår av förekomsten av många desmin(+) muskelfibrer som visar ingen påvisbar god Jordbrukarsed fluorescens (C-D, C'-D'). Desmin(+) muskelfibrer med låg till måttlig god Jordbrukarsed fluorescens (chimära muskelfibrer) förekommer över hela TA muskeln, vilket tyder på att MIME ger givaren SCs som kan migrera inom epimysium av TA muskeln och främja diameter givare-cell-derived myogenesis. A'-D' är hög förstoring bilder av regionerna inom de blå rutorna i A-D. Kvantitering av GFP(+) fibrer och centralt kärnförsedda fibrer visas i E. Skala barer = 100 µm (A-D) och 50 µm (A'-D'). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
RC="/Files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg” / >
Figur 4 . Bevis på omfattande skador och förnyelse 14 dagar efter MIME och BaCl2 injektion.
Hög förstoring, seriell tvärsnitt av en hela MIME + BaCl2 behandlade TA muskel presenteras. Data visar att många muskelfibrer, som är måttligt eller starkt GFP + har centralt atomkärnor (A-B; röd signal i A är från desmin, blå signal i A är från DAPI och grön signal i B är från GFP). Dessa data tyder på att degeneration och regeneration efter BaCl2 injektion inte påverkar GFP uttryck. I detta sammanhang föreslår närvaron av centralt kärnförsedda muskelfibrer i MIME + BaCl2 behandlade TA muskler, med liten till ingen GFP uttryck, att dessa fibrer är sannolikt resultatet av myogenesis (eller regenerering) med betydande bidrag från GFP - myogenic celler. Dessa observationer kan verifieras ytterligare i hög förstoring bilder av valda fält (C-F; C och D, och E och F, respektive överlappar regionerna från seriell tvärsnitt; färgkodning av bilden gränser betecknar platsen för dessa regioner i A och B). Skala barer = 100 µm (A-B) och 50 µm (C-F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för romanen experimentell teknik känd som MIME, utvecklade i vårt laboratorium till implantatet givare muskelvävnad i värd muskelvävnad. Detta är en anpassning av en öppen muskel ympning teknik som redan har visat sig vara effektiva för att främja givare-cell-medierad myogenesis i en värd muskel9,10,17.
Målet med MIME är inte att aktivera engraftment av givare muskelvävnad själv värd muskel (för närvarande inte vet vi om detta inträffar), utan snarare att ge en källa till givaren SCs som kan bidra till myogenesis i värd muskeln under förhållanden som stimulerar m med förnyelse. Vår förhoppning är att efter MIME har optimerat och testas i grundläggande och prekliniska studier, det kan ge värdefulla insikter för att vägleda kliniska behandlingar som syftar till att öka muskel förnyelse i skelettmuskulaturen som genomgått myogenic muskelförlust.
Det finns många frågor som ännu inte har besvaras angående hur MIME skulle kunna översättas till en klinisk terapi, till exempel: Hur skulle vi kontrollera kvaliteten på givarens vävnad? Hur skulle vi kontrollera immun förkastande av givarens vävnad och celler? Rensas givare vävnaden efter att tillhandahålla celler för myogenesis eller lämnar det bakom en fibrotisk ärr? Påverkar den fiber typ av givare eller värd muskel de givare-cell-medierad myogenesis? Vilka muskler kan praktiskt nytta av MIME? Vi utökar nu våra studier för att bedöma om MIME är säkra och effektiva, identifiera tilläggsbehandling behandlingar som kan förstärka givare-härledda myogenesis, och svara på många av de frågor, som anges ovan.
Efter våra tester av mus-till-mouse allogen transplantation med MIME, är vårt nästa steg att utföra mänskliga-till-mouse MIME med mänsklig vävnad för att utvärdera myogenic potential av avlidna muskelvävnad. Vi räknar med att dessa experiment kommer att leda till en ny rad av grundläggande och translationell forskning, som innebär att muskelvävnaden från givare, som är registrerade i initiativ såsom kroppen Bequest programmet för utbildning och programmet Gift of Life för organdonation .
De representativa uppgifter som presenteras i detta manuskript föreslår att 14 dagar efter MIME, det finns flera livskraftiga myofibers som antingen saknar GFP eller har låga nivåer av GFP. Vår tolkning av dessa data är att GFP-donatorcellerna med satellit bidragit till myogenesis i värd muskeln. Vi utförde detta experiment i förberedelse för implantering av mänsklig vävnad i en värd mus muskel. För att demonstrera otvetydigt att satellit donatorcellerna bidra till myogenesis i värd muskeln efter MIME, vore det användbart att implantatet givarens vävnad som uttrycker en fluorescerande reporter, som kan lätt skiljas från GFP (t.ex., röd fluorescerande protein uttrycker givarens vävnad implanteras i GFP + värd muskel).
Denna teknik begränsas främst av arten av SCs i givarens vävnad. Om SCs i givaren vävnaden är livskraftiga, tekniken kommer sannolikt att underlätta givare-cell-medierad myogenesis, medan om de inte är livskraftiga, myogenesis kan inte inträffa. Eftersom SCs är mycket motståndskraftig och är lönsamt för ca 2 veckor efter slakt, är det emellertid troligt att givarens vävnad som implanteras inom några minuter efter skörden i experimentsyfte, kommer att underlätta givare-cell-medierad myogenesis13 . Dessutom, som antytts ovan, är det möjligt att eftersom hela muskelvävnad (som innehåller SCs, Mogen muskelfibrer, samt muskel-resident fibroblaster) bäddas in i värd muskeln, fibros kan uppstå. Detta antagande måste dock undersökas empiriskt. Litteraturen om muskelskada som härrör från skadevållande sammandragningar, cryoinjury och experimentell myotoxins, tyder på att immunceller (främst makrofager) kan effektivt rensa cellulära skräp från skadade fibrer och ombyggnad av extracellulär matrix18. Därför är det möjligt att efter MIME och BaCl2 injektion, så länge värd immuncellerna har tillgång till degenererande givare muskelfibrer, de kan rensa skräp, lämnar bakom bara givaren SCs. Slutligen, omfattningen av den givare-derived myogenesis är beroende av mängden givare muskelvävnad som är inbäddad i värd muskeln. För värd muskel facket att vara helt fylls av givare-cell-derived myofibers, skulle det kräva en metod som X - eller gamma-bestrålning att ablatera värd muskel SCs och också kräver upprepad MIME förfaranden.
Det har visats att kirurgiskt utsätta en värd muskel och suturering en bit givare vävnad på värd muskeln kan underlätta givare-cell-medierad myogenesis9,10,17. Detta öppna kirurgiska tillvägagångssätt har använts i förflutnan att spåra utvecklingen av myogenesis och generera musmodeller av mänskliga muskelsjukdomar. Den innovativa aspekten av MIME teknik är att det är minimalt invasiva och involverar inte kirurgiskt utsätta värd muskeln. Detta minskar risken för iatrogen infektion och graden av obehag i värddjuret, vilket gör det mer praktiskt att utföra MIME upprepade gånger på samma värd muskeln om det behövs.
Vi räknar med att den MIME-tekniken kan vara en lämplig förfining till den öppen kirurgisk metod som följs för närvarande för att implantatet givare muskelvävnad i en värd-mus. Detta kan påskynda generationen av humaniserad musmodeller, genom att bädda in biopsier mänskliga muskler i värd mus muskeln. Baserat på våra preliminära data från mus-till-mouse ympning, räknar vi dessutom att MIME kommer att vara effektiva för att uppnå givare-cell-medierad myogenesis från mänskliga avlidna givare vävnad så länge givaren SCs är livskraftiga. Slutligen, med ytterligare testning och validering hoppas vi att den MIME-tekniken kommer att hjälpa till att utveckla nya terapier för att underlätta givare-cell-medierad myogenesis hos människor med muskelsjukdomar.
Framgången för den MIME-tekniken är kritiskt beroende av just inbäddning givare vävnaden inom fascian facket (epimysium) av värd muskeln. Endast om givarens vävnad placeras inom värd muskel facket, kommer det att kunna ge SCs till värd muskeln på ett precist sätt. Om givaren vävnaden är placerad utanför värd muskeln, är det oklart vad som skulle vara dess öde. I våra experimentella modellen för MIME använder vi TA muskeln som värd muskeln, eftersom det är framstående och ytligt placerade i den anterolaterala delen av benet. Storlek, orientering och anatomisk position av TA muskeln, gör det enkelt att bekräfta att givaren vävnaden är korrekt placerad inom värd TA muskeln efter MIME. I detta papper, vi har gett experimentella bevis som givare vävnaden reelnätet är inbäddad i mottagande TA muskel på 3 dagar efter MIME, och att det är givare-cell-medierad myogenesis i värd muskeln på 14 dagar efter MIME.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har möjliggjorts genom ett Pilot-bidrag från alliansen för regenerativ rehabiliteringsforskning och utbildning (AR3T) och en fakultet start paketet från Wayne State University till burken. AR3T stöds av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och mänsklig utveckling (NICHD), nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (NINDS), och nationella institutet för biomedicinsk Imaging och bioteknik (NIBIB ) av de National institutionerna of Health under Award nummer P2CHD086843. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
| Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| 4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
| VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
| Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
| Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
| Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
- Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
- Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
- Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
- Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
- Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
- Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).
