Vi beskriver en ny experimentell teknik som vi kallar minimalt invasiva muskel inbäddning (MIME), som bygger på bevis att skelettmuskulaturen vävnad innehåller viabla myogenic celler som kan underlätta givare-cell-medierad myogenesis när implanteras i en värd muskel.
Skelettmuskulaturen äger regenerativ kapacitet på grund av vävnad-resident, muskel fiber-genererar (myogenic) satellit celler (SCs), som kan bilda nya muskelfibrer under rätt förutsättningar. Även om SCs kan skördas från muskelvävnad och odlade i vitro, är resulterande gorgina cellerna inte mycket effektiva för att främja myogenesis när transplanterade i värd muskel. Kirurgiskt utsätta värd muskeln och ympning segment av givare muskelvävnad eller isolerade muskelfibrerna med deras SCs på värd muskel, främjar bättre myogenesis jämfört med gorgina transplantation. Vi har utvecklat en ny teknik som vi kallar minimalt invasiva muskel inbäddning (MIME). MIME innebär passerar en kirurgisk nål genom värd muskeln, rita en bit givare muskelvävnad genom nålen spår och sedan lämnar givaren vävnaden inbäddade i värd muskeln så att den kan fungera som en källa till SCs för värd muskel. Här beskriver vi i detalj stegen involverade i att utföra MIME i ett nedsatt immunförsvar musmodell som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP) i alla dess celler. Immunbrist i värd musen minskar risken för immun avstötning av givarens vävnad och god Jordbrukarsed uttryck gör lätt identifiering av värd muskelfibrer (GFP +) och givare-cell-derived muskelfibrer (GFP-). Vår pilot data tyder på att MIME kan användas att implantera en extensor digitorum longus (EDL) muskel från en donator mus i tibialis anterior (TA) muskeln värd musklick. Våra data tyder också på att när ett myotoxin (bariumklorid, BaCl2) injiceras i värd muskeln efter MIME, finns det bevis för givare-cell-derived myogenesis i värd muskeln, med cirka 5%, 26%, 26% 43% av fibrerna i en enda värd TA muskel visar ingen värd bidrag, minimal värd bidrag, måttlig värd bidrag och maximal värd bidrag, respektive.
Friska skelettmuskulatur, även om efter mitotiska, äger utmärkta regenerativ kapacitet på grund av vävnad boförälder myogenic celler som kallas satellit celler (SCs)1,2; och recenserade i3,4. Dock under patologiska tillstånd som orsakas av muskeldystrofier, trauma eller påskyndat åldrande, muskel förnyelse kan inte hänga med muskelnedbrytning, och således, progressiv muskel fiber förlust uppstår5. Även om effektiva metoder har utvecklats för att isolera SCs från muskel och utöka dem i kulturen att generera stora mängder myoblasts (och senare myotubes), har försök att generera fysiologiskt relevanta antal muskelfibrer i värd muskel gav endast minimal framgång6. Som med många andra celltyper, när myoblasts injiceras ensam värd vävnad, de flesta av cellerna inte engraft7,8. Vi har visat att neuromuskulär elektrisk stimulering (NMES) underlättar givare-cell-derived myogenesis i regenerering-brist värd mus muskel som injicerades med mänskliga myoblasts8. Andra har visat att kirurgiskt ympning biopsier muskel- eller enda muskelfibrer med bifogade SCs, underlätta måttlig myogenesis även utan NMES, vilket tyder på att implantera hela muskelfibrer med SCs kan vara fördelaktigare än implantation Myogenic celler ensam9,10. Eftersom givaren eller konstruerade muskelvävnad ympade in värd muskeln ger bättre resultat än transplantation celler ensam, är det möjligt att vävnad eller vävnad strukturer kan ge viktiga ledtrådar för givare-cells engraftment; ett begrepp som blir allt mer uppenbart i cellterapi studier med olika cell typer10,11,12.
Senaste data tyder på att SCs erhållits från människor mer än 2 veckor efter slakt genererar myotubes kultur13. Vi har därför för avsikt att bedöma om implantation av muskel vävnad som skördas efter slakt till en levande värd kommer att vända muskel fiber förlust. Vi har utvecklat en ny teknik som kallas MIME för att implantatet givare muskelvävnad i skelettmuskulaturen vävnad i en levande värd för att främja givare-cell-derived myogenesis. MIME innebär passerar en kirurgisk nål genom värd muskeln att skapa en nål spår; Rita ett litet segment av givare muskelvävnad genom nålen spår; lämnar givaren vävnaden inbäddade i värd muskeln; och utgående nål hålen med vävnad tejp. Efter att öva tekniken i euthanized möss studerat i andra experiment, vi har nu utfört MIME i levande möss som är nedsatt immunförsvar ubiquitously express ett grönt fluorescerande protein (GFP) och uppföljning på 3 och 14 dagar efter MIME. På 3 dagar efter MIME bekräftar vi att givaren mus (GFP-) EDL muskel implanteras i värd mus (GFP +) TA muskel, förblir inbäddad i värd muskeln. På 14 dagar efter MIME, bekräftar efter BaCl2 myotoxin skada inducerar skador och myogenesis, vi att cirka 5% och 26%, 26% 43% av fibrerna i en enda värd TA muskel visar ingen värd bidrag, minimal värd bidrag, måttlig värd bidrag, och maximal hysa bidrag, respektive. Centrala kärnbildning (en markör för degeneration och efterföljande regeneration) ses hos cirka 95% av TA muskelfibrer efter MIME och myotoxin injektion.
Vi studerar TA muskler 14 dagar efter MIME + BaCl2 eftersom denna tidpunkt fångar det mellanliggande skedet av förnyelse, när en majoritet av den regenererade fibrer är centralt nucleated. Vi studera GFP + möss som värdar för MIME, så att när vi så småningom transplantera mänskliga avlidna muskel till värd möss, vi kommer att kunna enkelt skilja muskelfibrer av värd- och givare ursprung. Vi använder musen EDL muskel som experimentella givarens vävnad, eftersom enda fibrer från denna muskel har visat större myogenic potential än TA muskler9. EDL muskeln är också synergistisk till TA muskeln och har liknande fiber-typ sammansättning. Våra preliminära data tyder på att MIME är kan underlätta givare-cell-derived myogenesis i värd muskeln.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för romanen experimentell teknik känd som MIME, utvecklade i vårt laboratorium till implantatet givare muskelvävnad i värd muskelvävnad. Detta är en anpassning av en öppen muskel ympning teknik som redan har visat sig vara effektiva för att främja givare-cell-medierad myogenesis i en värd muskel9,10,17.
Målet med MIME är inte att aktivera engraftment av givare muskelvävnad själv värd muskel (för närvarande inte vet vi om detta inträffar), utan snarare att ge en källa till givaren SCs som kan bidra till myogenesis i värd muskeln under förhållanden som stimulerar m med förnyelse. Vår förhoppning är att efter MIME har optimerat och testas i grundläggande och prekliniska studier, det kan ge värdefulla insikter för att vägleda kliniska behandlingar som syftar till att öka muskel förnyelse i skelettmuskulaturen som genomgått myogenic muskelförlust.
Det finns många frågor som ännu inte har besvaras angående hur MIME skulle kunna översättas till en klinisk terapi, till exempel: Hur skulle vi kontrollera kvaliteten på givarens vävnad? Hur skulle vi kontrollera immun förkastande av givarens vävnad och celler? Rensas givare vävnaden efter att tillhandahålla celler för myogenesis eller lämnar det bakom en fibrotisk ärr? Påverkar den fiber typ av givare eller värd muskel de givare-cell-medierad myogenesis? Vilka muskler kan praktiskt nytta av MIME? Vi utökar nu våra studier för att bedöma om MIME är säkra och effektiva, identifiera tilläggsbehandling behandlingar som kan förstärka givare-härledda myogenesis, och svara på många av de frågor, som anges ovan.
Efter våra tester av mus-till-mouse allogen transplantation med MIME, är vårt nästa steg att utföra mänskliga-till-mouse MIME med mänsklig vävnad för att utvärdera myogenic potential av avlidna muskelvävnad. Vi räknar med att dessa experiment kommer att leda till en ny rad av grundläggande och translationell forskning, som innebär att muskelvävnaden från givare, som är registrerade i initiativ såsom kroppen Bequest programmet för utbildning och programmet Gift of Life för organdonation .
De representativa uppgifter som presenteras i detta manuskript föreslår att 14 dagar efter MIME, det finns flera livskraftiga myofibers som antingen saknar GFP eller har låga nivåer av GFP. Vår tolkning av dessa data är att GFP-donatorcellerna med satellit bidragit till myogenesis i värd muskeln. Vi utförde detta experiment i förberedelse för implantering av mänsklig vävnad i en värd mus muskel. För att demonstrera otvetydigt att satellit donatorcellerna bidra till myogenesis i värd muskeln efter MIME, vore det användbart att implantatet givarens vävnad som uttrycker en fluorescerande reporter, som kan lätt skiljas från GFP (t.ex., röd fluorescerande protein uttrycker givarens vävnad implanteras i GFP + värd muskel).
Denna teknik begränsas främst av arten av SCs i givarens vävnad. Om SCs i givaren vävnaden är livskraftiga, tekniken kommer sannolikt att underlätta givare-cell-medierad myogenesis, medan om de inte är livskraftiga, myogenesis kan inte inträffa. Eftersom SCs är mycket motståndskraftig och är lönsamt för ca 2 veckor efter slakt, är det emellertid troligt att givarens vävnad som implanteras inom några minuter efter skörden i experimentsyfte, kommer att underlätta givare-cell-medierad myogenesis13 . Dessutom, som antytts ovan, är det möjligt att eftersom hela muskelvävnad (som innehåller SCs, Mogen muskelfibrer, samt muskel-resident fibroblaster) bäddas in i värd muskeln, fibros kan uppstå. Detta antagande måste dock undersökas empiriskt. Litteraturen om muskelskada som härrör från skadevållande sammandragningar, cryoinjury och experimentell myotoxins, tyder på att immunceller (främst makrofager) kan effektivt rensa cellulära skräp från skadade fibrer och ombyggnad av extracellulär matrix18. Därför är det möjligt att efter MIME och BaCl2 injektion, så länge värd immuncellerna har tillgång till degenererande givare muskelfibrer, de kan rensa skräp, lämnar bakom bara givaren SCs. Slutligen, omfattningen av den givare-derived myogenesis är beroende av mängden givare muskelvävnad som är inbäddad i värd muskeln. För värd muskel facket att vara helt fylls av givare-cell-derived myofibers, skulle det kräva en metod som X – eller gamma-bestrålning att ablatera värd muskel SCs och också kräver upprepad MIME förfaranden.
Det har visats att kirurgiskt utsätta en värd muskel och suturering en bit givare vävnad på värd muskeln kan underlätta givare-cell-medierad myogenesis9,10,17. Detta öppna kirurgiska tillvägagångssätt har använts i förflutnan att spåra utvecklingen av myogenesis och generera musmodeller av mänskliga muskelsjukdomar. Den innovativa aspekten av MIME teknik är att det är minimalt invasiva och involverar inte kirurgiskt utsätta värd muskeln. Detta minskar risken för iatrogen infektion och graden av obehag i värddjuret, vilket gör det mer praktiskt att utföra MIME upprepade gånger på samma värd muskeln om det behövs.
Vi räknar med att den MIME-tekniken kan vara en lämplig förfining till den öppen kirurgisk metod som följs för närvarande för att implantatet givare muskelvävnad i en värd-mus. Detta kan påskynda generationen av humaniserad musmodeller, genom att bädda in biopsier mänskliga muskler i värd mus muskeln. Baserat på våra preliminära data från mus-till-mouse ympning, räknar vi dessutom att MIME kommer att vara effektiva för att uppnå givare-cell-medierad myogenesis från mänskliga avlidna givare vävnad så länge givaren SCs är livskraftiga. Slutligen, med ytterligare testning och validering hoppas vi att den MIME-tekniken kommer att hjälpa till att utveckla nya terapier för att underlätta givare-cell-medierad myogenesis hos människor med muskelsjukdomar.
Framgången för den MIME-tekniken är kritiskt beroende av just inbäddning givare vävnaden inom fascian facket (epimysium) av värd muskeln. Endast om givarens vävnad placeras inom värd muskel facket, kommer det att kunna ge SCs till värd muskeln på ett precist sätt. Om givaren vävnaden är placerad utanför värd muskeln, är det oklart vad som skulle vara dess öde. I våra experimentella modellen för MIME använder vi TA muskeln som värd muskeln, eftersom det är framstående och ytligt placerade i den anterolaterala delen av benet. Storlek, orientering och anatomisk position av TA muskeln, gör det enkelt att bekräfta att givaren vävnaden är korrekt placerad inom värd TA muskeln efter MIME. I detta papper, vi har gett experimentella bevis som givare vävnaden reelnätet är inbäddad i mottagande TA muskel på 3 dagar efter MIME, och att det är givare-cell-medierad myogenesis i värd muskeln på 14 dagar efter MIME.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har möjliggjorts genom ett Pilot-bidrag från alliansen för regenerativ rehabiliteringsforskning och utbildning (AR3T) och en fakultet start paketet från Wayne State University till burken. AR3T stöds av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och mänsklig utveckling (NICHD), nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (NINDS), och nationella institutet för biomedicinsk Imaging och bioteknik (NIBIB ) av de National institutionerna of Health under Award nummer P2CHD086843. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |