Summary
Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.
Abstract
İskelet kas doku yerleşik, kas lif üreten (myogenic) uydu doğru koşullar altında yeni kas lifleri oluşturan hücreleri (SCs), nedeniyle yeniden üretim kapasitesi sahiptir. SCs kas dokusundan hasat ve vitrokültürlü olsa da, elde edilen myoblast hücreler ana kas nakledilen zaman myogenesis teşvik çok etkili değildir. Cerrahi olarak ana kas teşhir ve segmentleri donör kas dokusu veya izole kas lifleri ile onların SCs ana kas, üzerine aşılama daha iyi myogenesis myoblast nakli için karşılaştırıldığında teşvik etmektedir. Minimal invaziv kas katıştırma (MIME) dediğimiz bir roman tekniği geliştirdik. MIME ana kas cerrahi bir iğne geçirerek, donör kas doku iğne parça ile bir parça çizim ve SCs ana kas için bir kaynak olarak hareket edebilir böylece ana kas gömülü donör doku bırakarak içerir. Burada biz ayrıntılı adımları yeşil flüoresan protein (GFP) ifade eder bir immünyetmezligi fare modelinde MIME gerçekleştirmede dahil onun hücrelerin tümünü tanımlamak. Ana bilgisayar Mouse immün yetmezlik bağışıklık donör Doku reddi riskini azaltır ve ana kas lifleri (GFP +) ve kas lifleri (GFP-) donör-hücre kaynaklı kolay tanımlanması GFP ifade sağlar. Bizim pilot verileri MIME ekstansiyon digitorum longus (EDL) kas bir donör fareden tibialis anterior (TA) kasına bir ana bilgisayar fare implant için kullanılabilir göstermektedir. Bizim veri aynı zamanda bir myotoxin (Baryum klorür, BaCl2) MIME sonra ana kas içine enjekte edildiğinde, orada olduğunu donör-hücre kaynaklı myogenesis yaklaşık % 5, % 26, % 26 ve % 43 tek konak TA liflerinin ana kas kanıtı göstermektedir hiçbir ana bilgisayar katkı, en az ana bilgisayar katkı, orta ana bilgisayar katkı ve maksimal ana bilgisayar katkı, sırasıyla gösteren kas.
Introduction
Sağlıklı kas iskelet, sonrası Mitotik olsa bile, doku yerleşik myogenic hücreleri uydu hücreleri (SCs)1,2olarak bilinen varlığı nedeniyle mükemmel rejeneratif kapasite sahip; ve gözden geçirilen3,4. Ancak, kas dystrophies, travma ya da hızlandırılmış yaşlanma tarafından neden olduğu patolojik şartlar altında kas rejenerasyon kas arıza ile tutmak değil ve bu nedenle5aşamalı kas lif kaybı oluşur. SCs kas yalıtmak ve kültür myoblasts (ve daha sonra myotubes) çok sayıda oluşturmak için bunları genişletmek için etkili yöntemler geliştirilmiştir rağmen ana kas kas liflerinin fizyolojik ilgili numara oluşturmak için girişimleri var Sadece çok az başarı6vermiştir. Myoblasts tek başına ana bilgisayar doku enjekte edildiğinde olarak birçok hücre tipleri ile hücrelerin çoğu7,8engraft değil. Nöromüsküler elektriksel stimülasyon (NMES) donör-hücre kaynaklı myogenesis insan myoblasts8ile enjekte rejenerasyon eksikliği ana bilgisayar fare kas kolaylaştırır göstermiştir. Diğerleri cerrahi olarak aşılama biyopsi kas veya tek kas lifleri ile ekli SCs, orta myogenesis bile NMES tüm kas lifleri ile SCs Reproduction yerleştirilmesi daha daha avantajlı olabilir düşündüren, olmadan kolaylaştırmak göstermiştir myogenic hücreleri tek başına9,10. Donör veya ana bilgisayar kasına aşılı mühendislik kas dokusu hücreleri yalnız nakli daha iyi sonuçlar üretir beri dokusu veya doku benzeri yapılar çok önemli ipuçları için donör hücreli engraftment sağlayabilir mümkündür; çeşitli hücre türleri10,11,12içeren hücre tedavisi çalışmalarda giderek belirgin hale geliyor bir kavram.
Son veriler SCs insanlardan elde daha fazla 2 hafta post mortem myotubes kültür13' te oluşturmak olduğunu göstermektedir. Bu nedenle kas doku hasat öldükten sonra implantasyon içine bir yaşam ana kas lif kaybı tersine çevirir olmadığını değerlendirmek istiyoruz. Donör-hücre kaynaklı myogenesis tanıtmak için bir yaşam ana iskelet kas dokusuna donör kas dokusu implant MIME adında bir roman teknik geliştirdik. MIME ile cerrahi iğne iğne parça oluşturmak için ana bilgisayar kas ile ilgilidir; donör kas doku iğne parça ile küçük bir parça çizme; donör doku bırakarak ana kas gömülü; ve doku yapıştırıcı ile iğne delikleri yaklaşıyor. Ötenazi farelerde tekniği uygulamak okudu sonra diğer deneylerde şimdi MIME immünyetmezligi canlı farelerde yapılan ve ubiquitously yeşil flüoresan protein (GFP) hızlı ve doğumdan 3 ve 14 gün sonra takip sonrası Mim. 3 gün sonrası MIME donör fare (GFP-) Edi kas (GFP +) TA kas, ana kas gömülü kalır ana bilgisayar fare implante onaylayın. 14 gün sonrası MIME hasar ve myogenesis, ikna etmek için BaCl2 myotoxin yaralanma sonra biz yaklaşık % 5, % 26, % 26 ve % 43 tek konak TA kas liflerinin göstermek hiçbir ana bilgisayar katkı, en az ana bilgisayar katkı, orta ana bilgisayar onaylamak katkı ve en büyük katkısı, sırasıyla ev sahipliği. Merkez çekirdekleşme (dejenerasyon ve sonraki rejenerasyon bir işaretleyici) TA kas lifleri yaklaşık % 95 MIME ve myotoxin enjeksiyon sonra görülür.
Rejenere lifler çoğunluğu merkezi olarak parçalanmayabilir zaman bu zaman noktası rejenerasyon, ara sahne yakalar çünkü MIME + BaCl2 ' den sonra 14 gün TA kas inceleriz. Böylece biz sonunda ana bilgisayar fare insan Kadavra kas nakli ne zaman biz kas lifleri ana bilgisayar ve donör kökenli kolayca ayırt edebilecektir için MIME, konukçu GFP + fare inceleriz. Bu kas lifleri tek TA kas9' dan büyük myogenic potansiyel göstermiştir bu yana fareyi Edi kas deneysel donör doku kullanın. Edi kas da TA kas sinerjik ve benzer fiber türü kompozisyon vardır. Ön verilerimiz MIME donör-hücre kaynaklı myogenesis ana kas kolaylaştırmak yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.
Protocol
canlı hayvanları içeren tüm çalışmaları kurum hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Wayne State Üniversitesi, Detroit, Michigan, ABD, tarafından onaylanır ve uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının (için rehber olarak vardır 8 edition, 2011, ulusal akademiler Press tarafından 500 beşinci Yayınlanan Street, NW, kasa 285, Washington, DC 20055, ABD). Onaylı IACUC protokolleri başı olarak, ağrı ve/veya sıkıntı içeren yordamlar indüklenen ve isoflurane inhalasyon (etkisi % 1,5-5) tarafından tutulan genel anestezi altında yapıldı. Anestezi doğrulanmadı çimdik baştan aşağı çekilmesi eksikliği ve palpebral eksikliği tarafından veya vibrissae yanıt (isoflurane yüzdesi artış oldu etkisi korumak için gerektiğinde). İletişim kuralları, minimal invaziv doğası gereği bir " steril ipuçları " Teknik takip edildi. Hayvanları anestezi altında iken, vazelin kuruluğu önlemek için gözler için uygulandı. Hiçbir özel tedaviler gerekli idi; Ancak, diyet jel hayvanlar için 24 h genel anestezi. araştırmacı prosedürü cerrahi ana açığa kapsamamaktadır beri MIME, takip analjezi saklamayı IACUC tarafından onaylanmıştır ilgili yordamı için sağlanan kas, çünkü o bir hindlimb için sınırlı olduğunu ve normal işlevini etkilemez ve birçok ortak analjezik ilaç normal kas rejenerasyon etkiler bilinmektedir çünkü.
1. Hayvan modelleri
- ana bilgisayar fareler için MIME
- konukçu kullanım NSG-GFP fareler (8-10 hafta, erkek) kas için greft çalışmalar.
Not: çünkü onlar Olgun T ve B lenfositler ve fonksiyonel doğal katil hücrelerin eksikliği, sitokin sinyal eksik ve başkaları tarafından allografting veya ksenografi olmayan kas hücreleri için kullanılan allojeneik kas greft için bu fareler ideal ev sahibi vardır < sup sınıf "xref" = > 14. Her yerde GFP ifade sağlar ana bilgisayar (GFP +) ve (GFP-) kas lifleri donör-hücre kaynaklı kolay tanımlanması için.
- konukçu kullanım NSG-GFP fareler (8-10 hafta, erkek) kas için greft çalışmalar.
- Donör fareler için MIME
- Kullanım C57BL/6J fareler (12-16 hafta) olarak donör fareler.
Not: çünkü onlar tam olarak eşlenen genom var, herhangi bir kas iskelet patoloji olduğu bilinmektedir değil, kolayca kullanılabilir ve ekonomik ve GFP ifade edemediği bu fareler uygun donör farelerin karışıyor.
- Kullanım C57BL/6J fareler (12-16 hafta) olarak donör fareler.
2. Donör kas dokusunun hazırlanması
- bağlayan yol gösterici dikişler ve hasat donör Edi kas
- ötenazi servikal çıkması ve bir masa tarafından yönetilen genel anestezi altında gerçekleştirilen Torakotomi tarafından donör fareler tıbbi oksijen (inhale isoflurane; etkisi % 2-5) tarafından tahrik isoflurane Buharlaştırıcı.
- Edi kasları erişmek için deri bacak ön yüzey üzerinde açmak için Cerrahi makas kullanın. TA kas ön bacak bulmak ve çıkarmak o TA kas yer alan Edi kas görselleştirmek için. Forseps Edi kas arkasında bir çift ucu slayt ve nazik çekiş ayak uzatmak Eğer görmek için geçerlidir (Bu kas Edi olduğunu onaylar).
Not: donör doku alan cerrahi olarak, hasat için aseptik hazırlandı önceki olmalıdır. - Kullanımı ~ 10 cm kesimleri 4-0 ipek, örgülü, absorbe olmayan, steril dikiş ve yol gösterici dikiş Edi kas proksimal ve distal tendon uygulamak için yapmak iki kişilik deniz mili. ( şekil 1A).
- Distal Edi tendon kesmek, EDL kas yansıtmak ve proksimal tendon kesti.
- Donör Edi kasları bir kabında yer fare zil çözüm ile dolu.
3. Ana bilgisayar fare MIME için hazırlık
- anestezi
- yer ana bilgisayar fare (inhale isoflurane; 1,5-%5 etkisi) tıbbi oksijen tarafından yönlendirilen bir masa üstü isoflurane Buharlaştırıcı tarafından yönetilen genel anestezi altında.
- Anestezi indüksiyon odasında teşvik ve sonra hayvan üzerinde diğer yordamları gerçekleştirirken anestezi korumak için bir burun konisi için fareyi aktarın. Hayvan anestezi altında iken yastık Isıtma izotermal bir jel ile termal destek.
- Cilt hazırlık
- hayvan kaldırmak için ' s kürk, sol arka bacak ön yönü üzerinde depilatory bir krem uygulayın. Sonraki yordamlar için bir denetim bacak sağ bacak görür.
- Bırak üzerinde depilatory krema için 2 dk. temiz depilatory krem ile birlikte müstakil kapalı kürk fosfat içinde batırılmış mendil ile serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış. Kürk kaldırıldıktan sonra üç alternatif mendil povidone-iyot temizlik çözüm ve % 70 etanol ile cildinizi fırçalayın.
- Bir iğne parça konak TA kas oluşturma
- ana Merkezi aracılığıyla bir 18'lik (1 içinde uzun) cerrahi iğne TA kas kas boyunca geçmek ' s uzun eksen ( şekil 1B). İğne TA kas ve kas göbek ( şekil 1B) Merkezi aracılığıyla uzunluğu boyunca bir cephalo Kaudal yön geçirin.
Not: Bu adımın amacı donör kas parçası içine gömülü olabilir bir iğne parça oluşturmaktır. Donör doku TA kas ortasına katıştırma olanak sağlayabilecek geçirin ve myogenesis tüm ana bilgisayar arasında kolaylaştırmak için donör dokusundan SCs TA kas.
- ana Merkezi aracılığıyla bir 18'lik (1 içinde uzun) cerrahi iğne TA kas kas boyunca geçmek ' s uzun eksen ( şekil 1B). İğne TA kas ve kas göbek ( şekil 1B) Merkezi aracılığıyla uzunluğu boyunca bir cephalo Kaudal yön geçirin.
- Konak TA kas iğne izini katıştırma donör doku
- cerrahi iğne konak TA kas içinde olduğunda, bir donör doku ile cerrahi iğnede Lümen ucundaki yol gösterici dikiş geçmek bir caudo Sefalik yön ( şekil 1 c).
- İğne konak TA kas caudo Sefalik yönde üzerinden çekilmiş olarak donör doku ile iğne parça çizmek.
- Yol gösterici dikiş donör doku Kaudal ve Sefalik ucunda donör doku yerleşimini ayarlamak için kullanın. Donör doku konak TA kas ( şekil 1 d) içinde yerleşmişti olun.
- Sonra donör doku yerleşimi en iyi duruma getirilmiş, yol gösterici dikiş, kesim herhangi bir son donör doku yerleşim ince uçlu Forseps ile ayarlamalar.
- Mühür Kutanöz iğne yaralar ( şekil 1E -F) yara kenarına Forseps ile yaklaşıldığıdır ve hayvan hastalıklarıyla ilgili doku yapıştırıcı 27 lik cerrahi bir iğne ucu ile uygulayarak.
4. Neden uyumlu kas dejenerasyon ve yenilenme için kas içi Myotoxin enjeksiyon
- sonra MIME, 50-60 µL % 1.2 BaCl 2 (myotoxin) ana kas kapsamlı kas lif hasar ikna etmek için ev sahibi TA kas içine enjekte ve donör doku içinde gömülü 15.
- Enjekte BaCl 2 konak TA uzunluğu boyunca 3 sitelerdeki kas (orta proksimal ve distal 1 / 3'kas göbek).
Not: myotoxins BaCl 2, cardiotoxins ve notexin gibi iskelet kas içine enjekte rejenerasyon 16 tarafından takip uyumlu kas lif hasar neden olmaktadır.
- Enjekte BaCl 2 konak TA uzunluğu boyunca 3 sitelerdeki kas (orta proksimal ve distal 1 / 3'kas göbek).
5. Sonrası yordam hayvan bakım
- sonra MIME ve BaCl 2 enjeksiyon, temiz ana bilgisayar fare ' s sol arka bacak ile etanol ve Vazelin cildi korumak için ince bir tabaka uygulayın.
- Sonrası yordam Cilt Bakımı sonra ana bilgisayar fare burun konisi kaldırmak.
- Yatak olmadan yalnız kurtarma kafeste fareyi getirin. İzotermal jel Isıtma yastığını aracılığıyla kurtarma hayvan için termal destek yerleştirilmiş küçük kurtarma kafes yarısı sağlamak.
Not: Bir yarısı değil ısıtmalı o hayvanı uzak Isıtma yastığını gerekirse hareket edebilir böylece.
Ana bilgisayar fare tamamen anesteziden dönüş hayvan için orijinal onun kafes kurtarıldı sonra - . İzleme denemeleri yapılmaktadır kadar hayvan arkadaki Hayvan tesiste koyun. İzlenmek üzere hazır olması ne kadar ana bilgisayar fare her gün izlemek – örnek: 3 veya 14 gün sonrası MIME adlı. MIME, hayvanlar izlenir laboratuar personeli tarafından de hayvan hastalıklarıyla ilgili personel tarafından – bu esas olarak hayvanlar parlak, uyarı ve duyarlı; ise değerlendirme içerir ve hayvanlar açık ağrı belirtileri gösteriyor veya taşıma, besleme, içme ve damat zorluk yaşıyorsanız Ayrıca değerlendirirken.
6. Doku koleksiyonu
- hasat ana kas
- ötenazi servikal çıkması ve tahrik tıbbi oksijen () tarafından bir masa üstü isoflurane Buharlaştırıcı tarafından yönetilen genel anestezi altında gerçekleştirilen Torakotomi tarafından ana bilgisayar fare inhale isoflurane; etkisi % 2-5). araştırmacı da hasat TA kaslara önce ötenazi. genel anestezi altında IACUC onayı vardır
- konak TA kas erişmek için Cerrahi makas deri bacak ön yüzey üzerinde açmak için kullanın. TA kas ön bacak bulun, distal tendon kesmek, kas yansıtmak ve proksimal kas ekleri (bakınız Bölüm 2.1) kesti.
- (Deneysel) sol ve sağ (kontrol) TA toplamak kaslar.
- Dondurucu hasat kasları snap
- yanında duvar ilanı hasat kasları tartmak kağıt tartmak ve ölçek ağırlığında.
- Kısa bir süre mineral yağ cryoprotection için kasları daldırma. Leke aşırı yağ. Alüminyum folyo ve ek
- yer kaslar kaslar tarafından hızlı bir şekilde onları sıvı azot içinde bir Dewar dolu çeker dondur. Örnekleri etiketli cryovials aktarın ve daha sonraki araştırmalar-80 ° C dondurucuda örnekleri depolayın.
7. Histolojik çalışmaları
- Cryosectioning kas dokusu seri kesitleri toplamak için
- örnekleri-80 ° C dondurucudan bir cryostat için sıvı azot içeren bir Dewar yerleştirerek Transfer.
- Cryostat bir örnek teker teker ele. Soğuk jilet ile (cryostat içinde depolanan bıçak), iki kez, 1-2 mm kalınlığında kas bir parçasını üretmeye TA kas orta göbek örnek kesti. Cryostat bölümleri yapmak için bu Segmentte tutmak ve kas kalan bölümlerini kendi cryovial için iade.
- Bileşik buz gibi optimum kesim sıcaklık ile (OCT), doku cryostat numune diske kalın parçasını güvenli. Örnek disk yer numune tutucu üzerinde.
- Kaba-yüz kesme 20 µm bölümler örnek. Cam slaytlara cryostat bölümler için bir kaç 20 µm bölümlerde toplamak.
- Kalitesi 20 µm bölümlerinin yeterli, değilse kesme kalınlığı 5 mikron değiştirmek ve kalitesini değerlendirmek için birkaç bölümlerde toplamak. 5 µm bölümler kalite tatmin edici ise, seri bölümler toplamak. Slayt başına 2-3 bölüm toplamak ve 3 slayt için yeterli bölümleri toplamak.
- Deneysel (sol) ve denetim (sağda) TA kas her hayvan--dan bölümler toplamak.
- Okuyan GFP ifade
Not: kas lifleri GFP ifadede çalışmaya hazırlıklı slaytların (Bölüm 7.1) bir seti belirtmek.- ~ 50 µL Anti-fade orta bölümlerinde uygulamak ve bir cam coverslip uygulayın. Coverslip kenarları açık oje ile mühür.
- Hafif ve floresan mikroskop kullanarak (bkz. Tablo malzemeler), 10 X amaç ve GFP görüntülenmesi için uygun bir filtre bölümlerle çalışma.
Çakışan alanları tüm kesit TA kas karşılamak için visual
- toplamak dijital görüntüler (~ 15). Faz kontrast görüntüler visual alanların her biri için faz kontrast tarz üstünde mikroskop Floresans geçerek toplamak.
- Tek bir bileşik görüntü; üretmek için tek tek görüntüleri döşeyebilirsiniz uygun görüntüleme yazılımı ile görüntüleri açın örneğin, kullanım " Fotoğraf Birleştir " görüntüleme yazılımı seçeneğinde Dosya menüsü altında listelenen Tablo reçetesi.
- Bir uygun görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ) GFP Floresans görüntüleri açın. Daire bireysel kas lifleri kullanarak " yatırım Getirisi aracı " ve demek floresan yoğunluğu her lif için kayıt.
- Demek floresan yoğunluğu yüksek GFP ifade gösteren ve normal morfoloji var 10 liflerinin ortalamasını alarak maksimum GFP (floresan) yoğunluk hesapla. Demek Variety yoğunluğu her lif için maksimum GFP yoğunluğu tarafından bölünüp 100 ile çarpımı her lif için maksimum GFP yoğunluğu % hesaplamak. Her TA kas için GFP analiz sonuçları şekil 3E içinde gösterildiği gibi çizelgeye geçirmek.
- 4 ve desmin immünfloresan etiketleme tarafından kas lif bütünlüğü ve myonuclear konum eğitim ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), sırasıyla.
Not: hazırlanan, yukarıda da belirtildiği gibi kas lifleri desmin etiketleme çalışmaya slaytların bir seti belirtmek. 10 dakika süreyle PBS içinde % 2 paraformaldehyde- düzeltme bölümlerle yıkama bölümlerle üç kez PBS.
Dikkat: Giymek uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) paraformaldehyde işlerken işlerken. - Blok bölümleri ile % 3 sığır serum albümin % 0,01 içeren PBS seyreltilmiş Triton-X100 30 dk için. Bu engelleme çözüm ahiret için denir birincil seyreltici.
- Birincil seyreltici (1: 200) tavşan anti-desmin immünoglobulin G (IgG) oranında seyreltin. Engelleme işlemi tamamlandıktan sonra
- ilgili bölümlerde seyreltilmiş birincil antikorlar uygulamak ve gecede %0,1 içeren PBS ile bölümleri bir kez (5 dk) ~ 4 ° c yıkama bir buzdolabında kuluçkaya Triton X-100. Bu çözüm ahiret ilk yıkama tampon olarak anılacaktır.
- Bölümleri PBS ile 3 kez (yıkama başına 5 dk) yıkayın.
- Keçi anti sulandrarak tarafından ikincil antikor tavşan (kırmızı floresan boya için Birleşik) IgG % 0,01 içeren PBS içinde hazırlama Triton X-100.
- Seyreltilmiş ikincil antikor bölümlerinde uygulamak ve oda sıcaklığında (~ 23 ° C) 60 dakika süreyle kuluçkaya
- Bölümleri bir kez (5 dk) ilk yıkama arabellek ile yıkayın. PBS ile 3 kez (yıkama başına 5 dk) bölümleri yıkayın.
- Uygula DAPI 3 dakika süreyle bölümleri 3 kez (yıkama başına 1 dk) PBS ile yıkayın. Geçerli ~ 50 µL Anti-fade orta bölümlerinde ve cam coverslip uygulayın. Coverslip kenarları açık oje ile mühür.
- Hafif ve floresan mikroskop kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), çalışma seri halinde bölümleri kırmızı 10 X amaç ve görüntülenmesi için uygun bir filtre ile floresan boya.
- Tüm kesit TA kas kapsayacak şekilde alanların örtüşen visual dijital görüntüler (~ 15) toplamak. DAPI visual alanların her biri için uygun filtre ayarına geçiş yaparak etiketleme, Floresans görüntüleri toplamak.
- Aç ve adımlarda 7.2.3 - 7.2.4 açıklandığı gibi uygun bir görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri analiz.
Not: Çalışma tanımlamak için hangi kas lifleri hasarlı (desmin negatif) olduğu, görüntüler, hangi kas lifleri Merkezi çekirdekleşme (dahili yerine periferik bulunan DAPI etiketli çekirdeği olan desmin pozitif lifleri) var ve hangi alanlarda bölümünün inflamasyon ve/veya fibrozis (birlikte kümelenmiş, DAPI etiketli birçok hücre çekirdeği, ancak kas lifleri yoksun olan alanlarda).
- düzeltme bölümlerle yıkama bölümlerle üç kez PBS.
Representative Results
3 gün sonrası MIME donör MIME tarafından implante Edi konak TA kas yuvası (şekil 2A-C) içinde yer alıyor. Beklendiği gibi kesit TA kas donör fareler, üzerinden Floresans optik altında okudu, GFP (şekil 2B) ifade değil çünkü yeşil Floresans gösteri değil. Buna ek olarak, kesit TA kas donör doku ile implante değil ana bilgisayar fare üzerinden göstermek Tekdüzen yeşil Floresans TA kas lifleri lifler GFP (şekil 2E) hızlı gibi. MIME tarafından donör kas dokusu ile implante kas kesit içinde sınır ana kas lifleri (GFP +) ve donör kas lifleri (GFP-) arasında bir çizgi vardır. Görsel şekil 2B-F içinde gösterilen alanları faz kontrast görüntülerini şekil 2Eiçinde sunulan '-F' ve gerçekten kas lifleri bölgelerde mevcut olduğunu göstermektedir yok GFP olduğu sinyal.
14 gün sonrası MIME ve BaCl2 enjeksiyon, kalan bölümleri TA kas etiketsiz veya desmin (şekil 3), antikorlar ile etiketlenir seri çapraz okuyan tarafından GFP sinyal içinde tüm kas lifleri tarafından ifade edilir öğrenin tedavi edilmemiş kas ana bilgisayar fare, ama (kırmızı desmin etiketleme kalıcı kas lifleri algılar) değil MIME tedavi kas. MIME ve BaCl2 enjeksiyonu ile tedavi konak TA kas donör-hücre kaynaklı myogenesis tespit GFP sinyal göstermek pek çok desmin(+) kas lifleri varlığı belirgindir (şekil 3 c-D, 3 C' -D'). Chimeric kas lifleri ev sahibi ve donör myogenic hücre füzyon olasılığı ortaya çıkan bu lifleri tarafından sergilenen GFP Floresans orta düzeyde düşük tarafından tespit edilebilir. Çok sayıda chimeric lifler TA kas düşündüren donör SCs birkaç yüz mikron ana kas epimysium içinde geçirme yeteneğine sahip tüm çapı arasında görünür. Nefelometri liflerinin GFP + şekil 3Eiçinde gösterilir. Şekil 4 seri kesitleri bir tüm MIME + BaCl tedavi2 TA kas yüksek büyütme görüntüleri gösterir.
Resim 1 . Minimal invaziv kas katıştırma (Mim) adımlar.
MIME genel anestezi altında gerçekleştirilir. ~ 10 mg donör kas (donör fare EDL) zil çözümde yerleştirerek ve uçlarından (A)için yol gösterici dikiş bağlama içerir. Bir 18'lik iğne ana kas (B) uzun eksen geçirilir ve donör doku iğne parça (C)ile çizilir. Donör doku sol ana kas (D)gömülü, yol gösterici dikiş kesilir ve iğne delikleri doku yapıştırıcı ile mühürlü (E). Mühürlü iğne yaralar (F)oklarla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . TA kas çalışmaları 3 gün sonra MIME.
Ana kas 3 gün sonra MIME toplanan; Not iğne izleri ana TA (oklar; A-B). Daha fazla veri Edi gömülü donör fare TA kas yuvası (ABC) içinde yerleşmişti onaylayın. Floresans görüntüleri TA kas yok yeşil Floresans vahşi tipi TA kas (D), parlak yeşil Floresans NSG GFP TA kas (E)ve ana bilgisayar ve donör arasında bir ayrım 3 gün NSG GFP TA kas kas kesitleri göster (F)sonrası Mim. D-F visual alanlarında faz kontrast görüntülerini D'-F içinde gösterilir ', anılan sıraya göre. Kırmızı çizgi panelleri F ve F' ev sahibi ve donör doku arasındaki sınır satır gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Çalışmalar TA kas 14 gün sonra MIME.
Toplanan verileri 14 gün sonrası MIME sunulmaktadır. Kırmızı sinyaldir immünfloresan desmin etiketleme üzerinden (desmin pozitif bir sinyal gösterir myofibers uygun), mavi sinyal DAPI (lekeleri çekirdeği) ve yeşil sinyal GFP. Denetim TA kas beklendiği gibi ana bilgisayar fare--dan hasat (değil hindlimb), neredeyse tüm myofibers bu myofibers uygun olduğunu düşündüren desmin için (A; kırmızı sinyal) olumludur. Ayrıca, DAPI boyama dayanarak, bu açıktır neredeyse tüm myofibers o myonuclei periferik bulunduğu, sağlıklı kas (A; mavi sinyal) beklenenden farklı olması gibi. Denetim TA kas seri bölümlerini neredeyse tüm kas lifleri parlak yeşil, GFP için pozitif olduklarını ima olduğunu göster. MIME + BaCl2 -TA kas (sol hindlimb), tedavi donör-Hücre-aracılı myogenesis yok algılanabilir GFP Floresans göstermek pek çok desmin(+) kas lifleri varlığı belirgindir (C-D, C'-D'). Desmin(+) kas lifleri ile düşük orta GFP floresan (chimeric kas lifleri) olarak MIME donör TA kas epimysium içinde göç ve teşvik SCs sağlar düşündüren tüm TA kas çapı mevcuttur donör-hücre kaynaklı myogenesis. A'-D' yüksek büyütme görüntülerdir mavi kutu A - d Berisi bölgeler GFP(+) lifleri ve merkezi olarak çekirdekli lifleri Nefelometri Eiçinde gösterilir. Ölçek çubukları = 100 µm (A-D) ve 50 µm (A'-D'). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
RC="/Files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / >
Şekil 4 . Yaygın hasar ve rejenerasyon MIME ve BaCl2 enjeksiyon sonra 14 gün.
Yüksek büyütme, seri kesitleri bir tüm MIME + BaCl tedavi2 TA kas sunulmaktadır. Birçok kas lifleri, orta derecede olan veya güçlü GFP + merkezi bir konuma sahip bu çekirdek verileri göstermek (A-B; kırmızı işaret a mi desmin, a mavi sinyal DAPI ise b yeşil sinyal GFP). Bu verileri bu dejenerasyon göstermektedir ve BaCl2 enjeksiyon GFP ifade etkilemez sonra yenilenme. Bu bağlamda, merkezi olarak çekirdekli kas lifleri ile hayır küçük GFP ifade, MIME + BaCl tedavi2 TA kas varlığı bu elyaf myogenesis (veya yeniden oluşturma), büyük olasılıkla sonucu olan önemli katkı ile öneriyor GFP - myogenic hücreleri. Bu gözlemler daha fazla seçili alanları (C-F; yüksek büyütme Albümdeki doğrulanabilir C ve D, E ve F, sırasıyla, seri kesitleri bölgelerden üst üste gelen; resim kenarlıklarının rengini renk kodlaması bölgelere a konumunu belirtmek ve B). Ölçek çubukları = 100 µm (A-B) ve 50 µm (C-F). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Burada, donör kas dokusu ana kas dokusuna implant MIME, bizim laboratuvarda geliştirilen olarak bilinen roman deneysel tekniği için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu zaten bir ana kas9,10,17myogenesis donör-Hücre-aracılı teşvik etkili olduğu kanıtlanmıştır tekniği aşılama açık bir kas bir uyarlamasıdır.
MIME donör kas dokusuna kendisi (biz şu anda bu oluşup oluşmayacağını bilmiyorum) ana kas engraftment etkinleştirmemeyi ama oldukça myogenesis m teşvik koşullar altında ana kas katkıda bulunabilir SCs donör kaynağı sağlamak için hedeftir uscle rejenerasyon. Umudumuz MIME en iyi duruma getirilmiş ve temel ve preklinik çalışmalarda test sonra klinik tedaviler myogenic kas kaybı geçirmiş iskelet kasları kas rejenerasyon artırmaya yönelik rehberlik için değerli bilgiler sağlayabilir.
Nasıl MIME klinik bir terapiye örneğin tercüme edilebilir ile ilgili olarak cevaplanması için henüz çok sayıda sorular: nasıl donör doku kalitesini denetlemek? Nasıl donör doku ve hücreleri bağışıklık reddi kontrol? Donör doku hücreleri myogenesis için sağladıktan sonra temizlenir veya fibrotik bir yara izi mi? Donör ve/veya ana kas lif türü donör-Hücre-aracılı myogenesis etkiler mi? Hangi kas pratik olarak MIME seçeneğinden yararlanabilir? Şu anda çalışmalarımız MIME güvenli ve etkili olup olmadığını değerlendirmek, donör kaynaklı myogenesis artırmak ve yukarıda listelenen soruları, birçoğu cevap ek tedaviler tanımlamak için arttırıyoruz.
Fare fare allojeneik nakli MIME testlerimiz tamamladıktan sonra sonraki adım kadavra kas dokusu myogenic potansiyelini değerlendirmek için insan fare MIME kadavra insan dokusu ile gerçekleştirmektir. Biz bu deneyler bağışçılardan eğitim için vücut miras programı ve organ bağışı hayat hediye programı gibi girişimleri içinde kayıtlı kas dokusu içeren temel ve translasyonel araştırma, yeni bir satır sağlayacaktır tahmin .
Bu el yazması sunulan temsilcisi verinin MIME sonra 14 gün GFP eksikliği veya GFP düşük düzeyine sahip birkaç uygun myofibers olduğunu düşündürmektedir. Bu veriler bizim yorum GFP-donör uydu hücrelerin ana kas myogenesis katkıda olduğunu. Bir ana bilgisayar fare kas içine insan Kadavra doku implantasyon için hazırlık Bu deney yapılır. Tümden donör uydu hücreleri MIME aşağıdaki ana kas myogenesis katkıda göstermek için (örneğinGFP kolayca ayırt edilebilir, floresan bir muhabir ifade donör doku implantı yararlı olacaktır Kırmızı floresan protein) donör doku GFP + ana kas içine implante ifade.
Bu teknik özellikle SCs donör dokuda mevcut doğası ile sınırlıdır. SCs donör doku tekniğidir donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştırmak için büyük olasılıkla uygun iseniz, eğer onlar are değil uygun, myogenesis gerçekleşemez tamamlayın. SCs çok esnektir ve yaklaşık 2 hafta otopsi için uygun beri Ancak, deneysel amaçlar için donör-Hücre-aracılı myogenesis13 hasat sonra birkaç dakika içinde implante donör doku kolaylaştıracaktır görüneno ki . Ayrıca, yukarıdaki için sorar gibiydi (içeren SCs, olgun kas lifleri yanı sıra kas yerleşik fibroblastlar) tüm kas dokusu beri fibrozis oluşabilir ana kas gömülü mümkündür. Ancak, bu varsayımı ampirik olarak incelenmesi gereken. Zararlı kasılmalar, cryoinjury ve deneysel myotoxins kaynaklanan kas hasarı edebiyat bağışıklık hücreleri (esas olarak makrofajlar) etkili bir şekilde hasarlı liflerinden hücresel enkaz açıklıkta ve remodeling yeteneğine olduğunu göstermektedir hücre dışı matriks18. Bu nedenle, ana bilgisayar bağışıklık hücreleri donör kas lifleri, oluşan bozucu erişiminiz olduğu sürece MIME ve BaCl2 enjeksiyon sonra onlar sadece donör SCs bırakarak enkaz, açık mümkündür. Son olarak, donör kaynaklı myogenesis ölçüde ana kas gömülü donör kas dokusu miktarına bağlıdır. Sırayla tamamen donör-hücre kaynaklı myofibers tarafından yeniden yerleştirilmesi ana kas yuvası, bir yöntem gibi X - veya gama-ana kas SCs ablate ve aynı zamanda tekrarlanan MIME yordamlar gerektirir için Işınlama gerektirecektir.
Cerrahi olarak ana kas teşhir ve donör doku ana kas üzerine bir parça dikiş donör-Hücre-aracılı myogenesis9,10,17kolaylaştırabilir kanıtlanmıştır. Bu açık cerrahi yaklaşım geçmişte myogenesis ilerlemesini izlemek ve insan kas hastalıkları fare modelleri oluşturmak için kullanılmıştır. MIME tekniğin yenilikçi fark minimal invaziv ve cerrahi olarak ana kas açığa anlamına gelmez yönüdür. Bu iyatrojenik enfeksiyon ve bu nedenle yapım o MIME tekrar tekrar gerekirse aynı ana kas üzerinde gerçekleştirmek için daha uygun konak hayvan rahatsızlık derecesine riskini azaltır.
Biz MIME tekniği uygun bir arıtma şu anda donör kas dokusu bir ana bilgisayar fare implant takip açık cerrahi yaklaşım olabilir tahmin. Bu ana bilgisayar fare kas biyopsi insan kas gömerek insanlaşmış fare modellerin üretimi hızlandırmak. Ayrıca, fare fare aşılama üzerinden bizim ön verilere dayanarak, MIME donör SCs olduğu sürece uygun donör-Hücre-aracılı myogenesis insan Kadavra donör dokusundan ulaşmada etkili olacaktır tahmin. Son olarak, ek sınama ve doğrulama ile biz MIME tekniği donör-Hücre-aracılı myogenesis kas hastalığı olan insanlarda kolaylaştırmak için yeni tedaviler geliştirmek yardımcı olacağını umuyoruz.
MIME teknik başarısı tam olarak donör doku ana kas Fasial yuvası (epimysium) içinde katıştırma üzerine eleştirel bağlıdır. Sadece donör doku ana kas bölme içinde yerleştirilmiş olması durumunda, kesin bir biçimde ana kas SCs sağlamak mümkün olacaktır. Donör doku dışında ana kas yerleştirilmiş olması durumunda, onun kaderi ne olurdu olarak belli değil. Ondan beri onun'önemli ve yüzeysel olarak yerleştirilmiş bacağın anterolateral yönüyle MIME için bizim deneysel modelinde, biz ana kas TA kas kullanın. Boyutunu, yönünü ve anatomik TA kas konumunu donör doku doğru MIME sonra konak TA kas içinde yerleştirilir onaylamak yapmayı kolaylaştırır. Bu yazıda, biz deneysel kanıt sağladı bu donör doku yenidendonör-Hücre-aracılı myogenesis ana kas 14 gün sonrası MIME, konak TA kas 3 gün sonrası MIME ve bu orada gömülü şebeke var.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Bu eser bir Pilot Grant tarafından İttifak'ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T) ve öğretim başlangıç paketi için Wayne State Üniversitesi kavanoz için mümkün yapıldı. AR3T Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü, Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB tarafından desteklenmektedir ), Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
| Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| 4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
| VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
| Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
| Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
| Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
- Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
- Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
- Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
- Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
- Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
- Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).
